專利名稱：：一種采用吖啶酯標記抗原或抗體分析方法
技術(shù)領(lǐng)域：
：本發(fā)明涉及一種化學(xué)發(fā)光免疫測定方法，特別涉及一種采用吖啶酯標記抗原或抗體分析方法以及用該方法制備一種免疫測定試劑盒。
背景技術(shù)：
：化學(xué)發(fā)光免疫測定(ChemiluminesentImmunoassay,CLIA)是免疫測定技術(shù)繼酶免技術(shù)(EIA)、放免技術(shù)(RIA)、熒光免疫技術(shù)(FIA)和時間分辨熒光免疫技術(shù)(TRFIA)之后發(fā)展的一項新興測定技術(shù)?；瘜W(xué)發(fā)光技術(shù)是近二、三十年來發(fā)展起來的一種測定方式，其利用化學(xué)反應(yīng)釋放的自由能激發(fā)中間體(常用堿性磷酸酶一金剛垸胺)，使其從激發(fā)態(tài)回到基態(tài)，當中間體從激發(fā)態(tài)回到基態(tài)時會釋放等能級的光子，對光子進行測定而進行定量分析?；瘜W(xué)發(fā)光具有熒光的特異性，同時不需要激發(fā)光，就避免了熒光分析中激發(fā)光雜散光的影響有很高的靈敏度，并且不像放射分析那樣存在強烈的環(huán)境污染和健康危害，是一種非常優(yōu)秀的定量分析方法。雖然化學(xué)發(fā)光具備很高的特異性和很小的干擾，但化學(xué)分析本身的不特異性，制約了整個方法的使用。因此，如同RIA、FIA等一樣利用免疫反應(yīng)的特異性和化學(xué)發(fā)光本身的信號特異性形成了目前所說的化學(xué)發(fā)光免疫測定(CLIA)技術(shù)?；瘜W(xué)發(fā)光免疫測定技術(shù)是一種高度敏感的微量測定技術(shù)，凡具有抗原性的物質(zhì)(包括半抗原)都可以用化學(xué)發(fā)光免疫測定技術(shù)測定。其具備以下特點-①高度敏感，極限達10-17—10-19M/L，遠高于RIA、EIA,與TRFIA相當?shù)萒RFIA便宜。②特異性強，重復(fù)性好C.V.<5%。③測定范圍寬，可達7個數(shù)量級。④試劑穩(wěn)定性好，無污染有效期6—12月。⑤操作簡單，易于自動化。化學(xué)發(fā)光免疫分析分為化學(xué)發(fā)光酶免疫分析和閃光型化學(xué)發(fā)光免疫分析兩種。其中化學(xué)發(fā)光酶免疫分析屬于酶免疫測定的一種類型，只是最后一步酶促反應(yīng)所用的底物為發(fā)光劑，通過發(fā)光反應(yīng)的光在特定的儀器上進行測定的。在標記方面常用的標記酶有辣根過氧化物酶(horseradishperoxidase,冊P)和堿性磷酸酶(alkalinephosphatse，AP)，而閃光型化學(xué)發(fā)光免疫分析是采用吖啶酯標記抗原或抗體。辣根過氧化物酶是一種分子量達44000的糖蛋白，由無色的酶蛋白和深棕色的鐵卟啉結(jié)合而成。辣根過氧化物酶的發(fā)光底物是魯米諾(Lumimol)。魯米諾屬于苯肼類的化合物。在堿性條件下，過氧化物酶對魯米諾與過氧化氫反應(yīng)起催化作用。堿性磷酸酶是一種磷酸酯水解酶，從大腸桿菌提取的AP分子量為80kDa,最適pH值為8.0;從小腸粘膜提取的AP分子量為100kDa，最適pH值為9.6.AMPPD是堿性磷酸酶的發(fā)光底物。AMPPD的分子結(jié)構(gòu)中由兩個重要部分一個是連接苯環(huán)和金剛烷的二氧環(huán)，它可以斷裂并發(fā)射光子另一個是磷酸基團，它維持整個分子結(jié)構(gòu)的穩(wěn)定。在堿性磷酸酶的作用下，這種底物迅速脫去磷酸基團，生成不穩(wěn)定的中間體AMPD。AMPD很快自行分解，從高能激發(fā)態(tài)回到低能穩(wěn)定態(tài)，同時發(fā)出光子。冊P和AP在化學(xué)發(fā)光技術(shù)中，用于標記抗體(抗原)形成酶標記抗體(抗原)結(jié)合物，此結(jié)合物既保留抗體(抗原)的免疫活性，又保留的酶對底物的催化活性。酶標抗體(抗原)與抗原(抗體)的免疫反應(yīng)進行后，利用其對發(fā)光底物催化作用而直接發(fā)光，通過發(fā)光強度的測定而直接進行定量。目前酶促化學(xué)發(fā)光診斷產(chǎn)品均停留在半自動化水平，操作時間較長，檢測結(jié)果重復(fù)性差，誤檢率高。如T4酶促化學(xué)發(fā)光診斷試劑至少1個小時出結(jié)果，而且為了降低成本往往需要集合一定樣本量后才進行檢測，這樣最早來體檢的病人少則等待2天，多則半月。本發(fā)明的開展目的就是使得用戶能夠更簡便、快捷、準確的獲得檢測數(shù)據(jù)。本發(fā)明主要利用抗原和抗體免疫反應(yīng)的特異性和親合性，通過在抗原或抗體標記可以用來示蹤的能發(fā)生化學(xué)發(fā)光的有機小分子來確定待測抗原的濃度的一種微量物質(zhì)診斷技術(shù)。另外，本發(fā)明還結(jié)合目前先進的磁性微粒子技術(shù)來達到快速自動化診斷的目的。
發(fā)明內(nèi)容本發(fā)明的目的在于提供一種閃光型化學(xué)發(fā)光免疫分析方法，特別涉及采用吖啶酯標記抗原或抗體分析方法。吖啶酯標記物在化學(xué)結(jié)構(gòu)上有產(chǎn)生發(fā)光的特殊基團，在發(fā)光免疫分析過程中直接參與發(fā)光反應(yīng)。通常這類物質(zhì)沒有本底發(fā)光，在反應(yīng)中能用于檢測低濃度或微量濃度的樣品，是一類發(fā)光效率很高的發(fā)光劑。吖啶酯I、II分子和吖啶酰胺III均可與抗體(或抗原)結(jié)合，生成具有化學(xué)發(fā)光活性強、免疫反應(yīng)特異性高的標記抗體。吖啶酯標記在抗原(抗體)的氨基上，抗體上與抗原反應(yīng)的可變區(qū)，主要由有幾個氨基組成，這幾個氨基決定了免疫反應(yīng)的特異性和親和性。由于吖啶酯標記抗體時有將可變區(qū)上的氨基屏蔽的可能，這樣將導(dǎo)致抗體失去生物活性、失去特異性。我們采用一種特殊工藝，能夠避開可變區(qū)，將吖啶酯標記在抗體的固定區(qū)上，使其既保持應(yīng)有的特性，又不易失活。本發(fā)明采用閃光型化學(xué)發(fā)光物質(zhì)吖啶酯作為標記物，吖啶酯是有機小分子，發(fā)光信號與分子個數(shù)一一對應(yīng)，不受環(huán)境影響，因此檢測結(jié)果的重現(xiàn)性好。本發(fā)明的另一個目的在于提供一種包被技術(shù)。本發(fā)明采用目前國際上先進的聚苯乙烯包被技術(shù)，可以使得參與免疫反應(yīng)的抗體濃度大大增加，進而提高檢測靈敏度和反應(yīng)速率。由于在聚苯乙烯表面進行免疫反應(yīng)近似于液相反應(yīng)，與目前國內(nèi)包被板技術(shù)相比，微觀反應(yīng)過程不需要反應(yīng)物由液相主體擴散至固液界面后再進行分子碰撞，因此大大減少了液體環(huán)境中的干擾物質(zhì)對整個免疫反應(yīng)過程干擾的幾率，使得檢測結(jié)果更準確。為了提高化學(xué)發(fā)光免疫分析測定的敏感性，出現(xiàn)了眾多的測定放大系統(tǒng)，以生物素-親和素反應(yīng)為基礎(chǔ)的放大系統(tǒng)便是其中之一。在包被技術(shù)方面，我們利用的生物素-親和素反應(yīng)基礎(chǔ)的放大系統(tǒng)。生物素通過噻吩環(huán)戊酸側(cè)鏈上的羧基與多種大分子偶連活化后，可用于標記各種蛋白質(zhì)(包括抗原、抗體、酶等)，形成生物素化蛋白質(zhì)衍生物。一個蛋白質(zhì)分子可以與多個生物素分子結(jié)合，從而具有較高的比活性。生物素化大分子的多價性是生物素-親和素系統(tǒng)多級放大作用的物質(zhì)基礎(chǔ)。親和素一生物素系統(tǒng)在化學(xué)發(fā)光技術(shù)中的應(yīng)用有多種形式，亦可用于間接包被。可以在固相上預(yù)先包被親和素，原用吸附法包被固相的抗體或抗原與生物素結(jié)合，通過親和素一生物素反應(yīng)而使生物素化的抗體或抗原與親和素結(jié)合。這種包被法不僅可增加吸附的抗體或抗原量，而且使其結(jié)合點充分暴露。生物素(biotin，B)分子量為244.3kDa，等電點為pH值3.5.生物素結(jié)構(gòu)中的咪唑酮環(huán)是與親和素結(jié)合的主要部位，噻吩環(huán)戊酸側(cè)鏈末端羧基是與抗體和酶等蛋白質(zhì)結(jié)合的主要部位。利用生物素的羧基加以化學(xué)修飾后可制成各種活性基團的衍生物(活化生物素)，以適合與各種生物大分子結(jié)合的需要。親和素(avidin，A)分子量68kDa，等電點為PH值10-10.5.親和素富含色氨酸，借助色氨酸殘基與生物素的咪唑酮環(huán)結(jié)合。親和素與生物素之間的親和力極強，比抗原與抗體的親和力至少高l萬倍，且具有高度特異性和穩(wěn)定性。由生物素-親和素反應(yīng)建立放大系統(tǒng)為基礎(chǔ)，是用生物素標記包被抗體，與固相抗原結(jié)合后標記物混合后，再加入親和素-結(jié)合物聚苯乙烯固相，由于一個抗體可以連接多個生物素分子，因此在一個生物素化的抗體在反應(yīng)時可與多個親和素分子結(jié)合，親和素性質(zhì)極為穩(wěn)定，每分子可結(jié)合4個生物素衍生物，其作為生物素化的分子之間的橋接物，起放大作用。同時，它又是糖蛋白，可直接與各種生物分子如IgG及茶堿、苯妥英、蛋白質(zhì)等耦連，從而使測定的反應(yīng)放大。我們已經(jīng)將此方法用于包被板上，并取得了良好的效果生物素與親和素結(jié)合具有高度的親和力，且均能偶連抗體、抗原和辣根過氧化物酶而不影響生物活性。在接下來技術(shù)優(yōu)化的過程中，我們要將生物素-親和素系統(tǒng)技術(shù)應(yīng)用于磁顆粒的包被中，借助所形成的親和素-生物素-酶復(fù)合物抗體與磁顆粒結(jié)合，追蹤生物素酶或吖啶酯標記的抗原或抗體，通過酶催化底物顯色，可檢出相應(yīng)的抗體或抗原。此方法的好處在于在不同的項目可以共用試劑，使其具有更特異、靈敏、簡便、快速的特點。本發(fā)明的工藝創(chuàng)新在于包被技術(shù)中采用新型的反應(yīng)放大系統(tǒng)——采用鏈霉親和素一生物素包被技術(shù)。這是一種新型反應(yīng)放大系統(tǒng)。以磁性微球或聚苯乙烯固相作為載體，在表面上最大量的包被上鏈霉親和素，與標記了生物素的抗原或抗體反應(yīng)形成鏈霉親和素一生物素包被抗體，再與標記物一起形成高親合力的牢固結(jié)合及多級放大效應(yīng)，使得檢測更加靈敏，可達到檢測濃度小于lPmol/L的超微量物質(zhì)的目的。鏈霉親和素是一種略偏酸性蛋白，其分子量為65000，由4條序列相同的亞基構(gòu)成，每個亞基可以結(jié)合l個生物素分子，因此1個鏈霉親和素分子具有4個可與生物素分子結(jié)合的位點。鏈霉親合素不含糖基，在與組織細胞、DNA結(jié)合時，不易產(chǎn)生非特異性結(jié)合.它的活性可達18u.在化學(xué)發(fā)光免疫分析中，磁性微球或聚苯乙烯固相作為載體，能夠包被最大量的鏈霉親和素，并有效的與生物素試劑結(jié)合，大大加快免疫反應(yīng)速度。生物素又稱維生素H，呈環(huán)形結(jié)構(gòu)，分為I環(huán)和II環(huán)，I環(huán)是鏈霉親和素結(jié)合的主要部位，II環(huán)是標記抗體和酶的唯一結(jié)構(gòu)，可有效結(jié)合不同的抗原和各種酶，用于測定多種蛋白、激素、抗原和多種藥物，抗體標記了生物素后，其結(jié)合抗原的活性不受影響，多種酶結(jié)合生物素后其催化力基本上保持不變，所以采用生物素與多種標記物結(jié)合起到有效地放大作用；其生物素化形成的許多"觸腳"的多價試劑，使整個反應(yīng)系統(tǒng)出現(xiàn)多級放大反應(yīng)，對待測物的檢測具有極高的靈敏性，而且反應(yīng)速度比較快，滿足臨床和科研需求。本發(fā)明的工藝大大加快了反應(yīng)速度。在測試過程中，溫育時間為9~18min，20min可以出結(jié)果，較放射免疫分析法大大縮短了時間，提高了工作效率。高特異性和高親和力的抗體試劑可以吸附更多的抗原或抗體。發(fā)光信號檢測的寬線性加上和鏈霉親和素-生物素包被技術(shù)的信號放大作用，使化學(xué)發(fā)光檢測的線性范圍更寬。本發(fā)明的包被工藝，并將其合理運用在實際生產(chǎn)中。這不僅保證了按照整個工藝流程生產(chǎn)出來的產(chǎn)品消耗降至最低，也保證了產(chǎn)品質(zhì)量的安全可靠。當產(chǎn)品項目繁多并成為一個系列時，產(chǎn)品都將進行不同抗體(抗原)的包被，避免生產(chǎn)過程時的混淆及污染。新型工藝的包被技術(shù)，可統(tǒng)一固相載體組分，避免不必要的誤差，使得檢測更簡潔、方便。本發(fā)明進一步的是利用本發(fā)明的技術(shù)進行生物醫(yī)藥體外診斷，開發(fā)的產(chǎn)品主要應(yīng)用于臨床醫(yī)療診斷的試劑盒，優(yōu)選的如制備甲狀腺素(T4)體外免疫診斷試劑盒。最主要受眾是各級醫(yī)院，其他受眾還包括食品安全監(jiān)督系統(tǒng)，公安系統(tǒng)，從事與檢驗相關(guān)的科研系統(tǒng)。化學(xué)發(fā)光技術(shù)作為免疫診斷檢測手段最有前途的技術(shù)方向，具有廣闊的市場前景。與其它免疫診斷方法如放射免疫分析、酶免疫分析和時間分辨熒光免疫分析相比較，本發(fā)明的化學(xué)發(fā)光免疫分析擁有靈敏度高、特異性強、檢測范圍寬、產(chǎn)品有效期長、重現(xiàn)性好、成本相對低廉等優(yōu)勢，可用于半定量和定量分析。此方法在使用方面其快速，全部檢測時間只需l-3分鐘。操作簡便可隨時隨地進行。目前成為在免疫診斷領(lǐng)域目前全球使用最廣泛的分析方法，也是免疫試劑重要的發(fā)展方向之一。國家"863"計劃中對于該領(lǐng)域重點支持該技術(shù)的開發(fā)與應(yīng)用推廣。表l為項目技術(shù)優(yōu)勢圖，表2為各分析方法的對比。表l、項目技術(shù)優(yōu)勢圖<table>tableseeoriginaldocumentpage10</column></row><table>表2、各分析方法的對比<table>tableseeoriginaldocumentpage10</column></row><table>__化，檢測時間短__本發(fā)明的閃光型化學(xué)發(fā)光主要是用吖啶酯直接標記抗原(抗體)的技術(shù)組成，靈敏度高是閃光型化學(xué)發(fā)光分析技術(shù)優(yōu)越性的關(guān)鍵，其能夠檢測出放射免疫分析和酶聯(lián)免疫分析等方法無法檢出的物質(zhì)，對疾病的早期診斷具又重要的意義。吖啶酯標記試劑有效期長，性質(zhì)穩(wěn)定，可達一年。閃光型化學(xué)發(fā)光技術(shù)中吖啶酯作為標記物，我們做到用戶不用重復(fù)測定標準曲線，可以兩點定標，并快速、準確得到數(shù)據(jù)。目的就是在使其系統(tǒng)化的同時使得患者能夠更簡便、快捷、準確的獲得檢測數(shù)據(jù)。具體實施例方式以下通過實施例進一步說明本發(fā)明，但不作為本發(fā)明的限制。實施例1在吖啶酯的標記技術(shù)中，本發(fā)明采用一種特殊工藝，避開抗體上與抗原反應(yīng)的可變區(qū)，將吖啶酯標記在抗體的固定區(qū)上，使其既保持應(yīng)有的特性，又不易失活。在進一步的發(fā)展中，要將辣根過氧化物酶、堿性磷酸酶、吖啶酯同時標記于抗原(抗體)上，做到在不影響抗原(抗體)活性，不影響酶活性，不互相干擾影響的情況下聯(lián)合標記。本發(fā)明采用以生物素-親和素反應(yīng)為基礎(chǔ)的包被技術(shù)，此技術(shù)可以使得參與免疫反應(yīng)的抗體濃度大大增加，進而提高檢測靈敏度和反應(yīng)速率。將生物素-親和素系統(tǒng)技術(shù)應(yīng)用于磁顆粒的包被中是公司在此項目中的技術(shù)優(yōu)化，借助所形成的親和素-生物素-抗體與磁顆粒結(jié)合，追蹤酶或吖啶酯標記的抗原或抗體，可檢出相應(yīng)的抗體或抗原。本發(fā)明具體的實施例是用于制備甲狀腺素(T4)診斷的試劑盒，該試劑盒主要指標為(1)對國家質(zhì)控品的檢測誤差在正負20%范圍，靈敏度《5ng/ml，精密性分析內(nèi)變異系數(shù)cvy?！磇5y。；(2)分析間變異系數(shù)CV%<20%。線性相關(guān)系數(shù)絕對值IrI》0.9900批內(nèi)變異系數(shù)和批間便宜系數(shù)小于15%。對300例以上的正常人檢測結(jié)果誤檢率小于15%，與進口同類產(chǎn)品檢測結(jié)果的相關(guān)分析的相關(guān)系數(shù)大于0.9。(3)產(chǎn)品貨架期大于12個月。實施例2甲狀腺素(T4)免疫診斷試劑盒采用鏈霉親和素一生物素反應(yīng)放大系統(tǒng),結(jié)合聚苯乙烯包被技術(shù)，辣根過氧化物酶標記抗原(抗體)利用鏈霉親和素一生物素反應(yīng)放大系統(tǒng)，使得參與免疫反應(yīng)的抗體濃度大大增加，進而提高檢測靈敏度和反應(yīng)速率。在利用聚苯乙烯包被，吖啶酯標記抗原(抗體)的技術(shù)組成中，將吖啶酯標記在抗體的固定區(qū)上，使其在聚苯乙烯固相的包被技術(shù)中，其標記抗體既保持應(yīng)有的特性，又不易失活采用吖啶酯標記工藝對T4抗原進行標記并純化。在磁顆粒的包被技術(shù)中，用辣根過氧化物酶標記，借助抗體與磁顆粒的結(jié)合，追蹤辣根過氧化物酶標記的抗原或抗體，可檢出相應(yīng)的抗體或抗原。用包被有抗熒光素抗體或抗羊二抗的磁性微粒子，將羊抗T4多抗標記熒光素后預(yù)先與包被有抗熒光素抗體的磁性微粒子反應(yīng)或直接將T4羊抗與包被有抗羊二抗的磁性微粒子反應(yīng)，最終實現(xiàn)間接將羊抗T4多抗包被在磁性微粒子上，并通過洗滌分離后保存。利用生物素-親和素系統(tǒng)，將羊抗T4多抗標記生物素，借助所形成的親和素-生物素-抗體與磁顆粒結(jié)合，與辣根過氧化物酶標記的抗原或抗體反應(yīng)，檢出相應(yīng)的抗體或抗原。將抗體包被在磁顆粒上，采用閃光型化學(xué)發(fā)光物質(zhì)吖啶酯作為標記物，標記抗體(抗原)，與樣本中的抗原(抗體)三者結(jié)合，直接發(fā)光進行定性和定量分析。采用磁板吸附后洗滌分離的方法來實現(xiàn)分離。實施例31.吖啶酯標記物的制備吖啶酯標記物在化學(xué)結(jié)構(gòu)上有產(chǎn)生發(fā)光的特殊基團，在發(fā)光免疫分析過程中直接參與發(fā)光反應(yīng)。通常這類物質(zhì)沒有本底發(fā)光，在反應(yīng)中能用于檢測低濃度或微量濃度的樣品，是一類發(fā)光效率很高的發(fā)光劑。吖啶酯I、II分子和吖啶酰胺III均可與抗體(或抗原)結(jié)合，生成具有化學(xué)發(fā)光活性強、免疫反應(yīng)特異性高的標記抗體。吖啶酯標記在抗原(抗體)的氨基上，抗體上與抗原反應(yīng)的可變區(qū)有幾個氨基，這幾個氨基決定了免疫反應(yīng)的特異性和親和性。所以要想既能比較高效率的標記上吖啶酯又不能損傷抗體活性，一個很好的途徑就是將吖啶酯標記在抗體的固定區(qū)上，使其既保持應(yīng)有的特性，又不易失活。2.將抗體包被在磁顆粒上微粒子是由高分子單體聚合成的微球或顆粒，直徑多為微米或毫米級。微粒子帶有能與蛋白質(zhì)結(jié)合的功能團(如-冊2、-C00H、-OH、-CHO等)，易于抗體(抗原)形成化學(xué)偶聯(lián)，且結(jié)合容量大。此外，在反應(yīng)時，微粒子可以均勻的分散到整個反應(yīng)溶液中，使反應(yīng)面積增加，反應(yīng)速度加快。磁性顆粒在液相中可使反應(yīng)物(抗體)迅速有效的結(jié)合到其表面，在這里也可應(yīng)用親和素-生物素放大系統(tǒng)。3.親和素-生物素發(fā)大系統(tǒng)的應(yīng)用生物素通過噻吩環(huán)戊酸側(cè)鏈上的羧基與多種大分子偶連活化后，可用于標記各種蛋白質(zhì)(包括抗原、抗體、酶等)，形成生物素化蛋白質(zhì)衍生物。一個蛋白質(zhì)分子可以與多個生物素分子結(jié)合，從而具有較高的比活性。生物素化大分子的多價性是生物素-親和素系統(tǒng)多級放大作用的物質(zhì)基礎(chǔ)。親和素一生物素系統(tǒng)在化學(xué)發(fā)光技術(shù)中的應(yīng)用有多種形式，亦可用于間接包被?？梢栽诠滔嗌项A(yù)先包被親和素，原用吸附法包被固相的抗體或抗原與生物素結(jié)合，通過親和素一生物素反應(yīng)而使生物素化的抗體或抗原與親和素結(jié)合。這種包被法不僅可增加吸附的抗體或抗原量，而且使其結(jié)合點充分暴露。另外，在常規(guī)化學(xué)發(fā)光技術(shù)中的酶標抗體也可用生物素化的抗體替代，然后連接親和素一酶結(jié)合物，以放大反應(yīng)信號。1)首先利用公司現(xiàn)成的T4CLEIA技術(shù)成熟的方法學(xué)、配方以及原料，這樣至少可以保證免疫反應(yīng)過程是合理可信的，這樣可以最大可能的減少后面研究的變量。2)采用我已經(jīng)作過摸索的并取得成功的吖啶酯標記工藝對T4抗原進行標記并純化。3)采購意大利某公司的包被有抗熒光素抗體或抗羊二抗的磁性微粒子，將羊抗T4多抗標記熒光素后預(yù)先與包被有抗熒光素抗體的磁性微粒子反應(yīng)或直接將T4羊抗與包被有抗羊二抗的磁性微粒子反應(yīng)，最終實現(xiàn)間接將羊抗T4多抗包被在磁性微粒子上，并通過洗滌分離后保存。4)在早期儀器不能實現(xiàn)自動將反應(yīng)完成后的磁性微粒子與反應(yīng)液分離前提下，公司采取用磁板吸附后洗滌分離的方法來實現(xiàn)分離。5)待穩(wěn)定地建立起T4的CLIA方法學(xué)以后再逐步改良操作步驟，實現(xiàn)自動化。權(quán)利要求1、一種采用吖啶酯標記抗原或抗體分析方法，其特征在于，將吖啶酯與抗體或抗原結(jié)合，生成標記抗體。2、根據(jù)權(quán)利要求1所述的方析方法，其特征在于，吖啶酯標記在抗原或抗體的氨基上，抗體上與抗原反應(yīng)的可變區(qū)，主要由有幾個氨基組成，這幾個氨基決定了免疫反應(yīng)的特異性和親和性。3、根據(jù)權(quán)利要求1所述的方析方法，其特征在于，其中還包括一種包被技術(shù)，利用聚苯乙烯包被，吖啶酯標記抗原或抗體的技術(shù)組成中，將吖啶酯標記在抗體的固定區(qū)上，使其在聚苯乙烯固相的包被技術(shù)中，其標記抗體既保持應(yīng)有的特性，又不易失活。4、根據(jù)權(quán)利要求1所述的方析方法，其特征在于，還包括一種反應(yīng)放大系統(tǒng)，其特征在于，采用生物素-親和素的反應(yīng)建立放大系統(tǒng)。5、根據(jù)權(quán)利要求4所述的方析方法，其特征在于，所述的反應(yīng)放大系統(tǒng)，其特征在于，用生物素標記包被抗體，與固相抗原結(jié)合后標記物混合后，再加入親和素-結(jié)合物聚苯乙烯固相。6、根據(jù)權(quán)利要求4所述的方析方法，其特征在于，所述的反應(yīng)放大系統(tǒng)，其特征在于，采用鏈霉親和素一生物素的反應(yīng)方法系統(tǒng)。7、根據(jù)權(quán)利要求4所述的方析方法，其特征在于，所述的反應(yīng)放大系統(tǒng)，以磁性微球或聚苯乙烯固相作為載體，在表面上最大量的包被上鏈霉親和素，(1)與標記了生物素的抗原或抗體反應(yīng)形成鏈霉親和素一生物素包被抗體，(2)再與標記物一起形成高親合力的牢固結(jié)合及多級放大效應(yīng)，可達到檢測濃度小于1Pmol/L的超微量物質(zhì)。8、根據(jù)權(quán)利要求4所述的方析方法，其特征在于，所述的反應(yīng)放大系統(tǒng)，生物素-親和素反應(yīng)放大系統(tǒng)應(yīng)用于磁顆粒的包被中，用所形成的親和素-生物素-酶復(fù)合物抗體與磁顆粒結(jié)合，追蹤生物素酶或吖啶酯標記的抗原或抗#:，通過酶催化底物顯色，可檢出相應(yīng)的抗體或抗原。9、一種利用權(quán)利要求l的方法制備的甲狀腺素(T4)免疫診斷試劑盒，其特征在于，該試劑盒采用吖啶酯標記工藝對T4抗原進行標記并純化，在磁顆粒的包被技術(shù)中，用辣根過氧化物酶標記，借助抗體與磁顆粒的結(jié)合，追蹤辣根過氧化物酶標記的抗原或抗體，可檢出相應(yīng)的抗體或抗原，用包被有抗熒光素抗體或抗羊二抗的磁性微粒子，將羊抗T4多抗標記熒光素后預(yù)先與包被有抗熒光素抗體的磁性微粒子反應(yīng)或直接將T4羊抗與包被有抗羊二抗的磁性微粒子反應(yīng)，最終實現(xiàn)間接將羊抗T4多抗包被在磁性微粒子上，并通過洗滌分離后保存，利用生物素-親和素系統(tǒng)，將羊抗T4多抗標記生物素，借助所形成的親和素-生物素-抗體與磁顆粒結(jié)合，與辣根過氧化物酶標記的抗原或抗體反應(yīng)，檢出相應(yīng)的抗體或抗原，將抗體包被在磁顆粒上，采用閃光型化學(xué)發(fā)光物質(zhì)吖啶酯作為標記物，標記抗體(抗原)，與樣本中的抗原(抗體)三者結(jié)合，直接發(fā)光進行定性和定量分析。10、根據(jù)權(quán)利要求9的甲狀腺素(T4)免疫診斷試劑盒，其特征在于，包括以下內(nèi)容吖啶酯標記物的制備吖啶酯標記物在化學(xué)結(jié)構(gòu)上有產(chǎn)生發(fā)光的特殊基團，在發(fā)光免疫分析過程中直接參與發(fā)光反應(yīng)，通常這類物質(zhì)沒有本底發(fā)光，在反應(yīng)中能用于檢測低濃度或微量濃度的樣品，是一類發(fā)光效率很高的發(fā)光劑，吖啶酯I、II分子和吖啶酰胺III均可與抗體(或抗原)結(jié)合，生成具有化學(xué)發(fā)光活性強、免疫反應(yīng)特異性高的標記抗體，吖啶酯標記在抗原(抗體)的氨基上，抗體上與抗原反應(yīng)的可變區(qū)有幾個氨基，這幾個氨基決定了免疫反應(yīng)的特異性和親和性，所以要想既能比較高效率的標記上吖啶酯又不能損傷抗體活性，一個很好的途徑就是將吖啶酯標記在抗體的固定區(qū)上，使其既保持應(yīng)有的特性，又不易失活，將抗體包被在磁顆粒上微粒子是由高分子單體聚合成的微球或顆粒，直徑多為微米或毫米級，微粒子帶有能與蛋白質(zhì)結(jié)合的功能團(如-朋2、-C00H、-0H、-CH0等)，易于抗體(抗原)形成化學(xué)偶聯(lián)，且結(jié)合容量大，此外，在反應(yīng)時，微粒子可以均勻的分散到整個反應(yīng)溶液中，使反應(yīng)面積增加，反應(yīng)速度加快，磁性顆粒在液相中可使反應(yīng)物(抗體)迅速有效的結(jié)合到其表面，在這里也可應(yīng)用親和素-生物素放大系統(tǒng)，親和素-生物素發(fā)大系統(tǒng)的應(yīng)用生物素通過噻吩環(huán)戊酸側(cè)鏈上的羧基與多種大分子偶連活化后，可用于標記各種蛋白質(zhì)(包括抗原、抗體、酶等)，形成生物素化蛋白質(zhì)衍生物，一個蛋白質(zhì)分子可以與多個生物素分子結(jié)合，從而具有較高的比活性，生物素化大分子的多價性是生物素-親和素系統(tǒng)多級放大作用的物質(zhì)基礎(chǔ)。全文摘要本發(fā)明涉及一種化學(xué)發(fā)光免疫測定方法，特別涉及一種采用吖啶酯標記抗原或抗體分析方法以及用該方法制備一種免疫測定試劑盒，吖啶酯標記物在化學(xué)結(jié)構(gòu)上有產(chǎn)生發(fā)光的特殊基團，在發(fā)光免疫分析過程中直接參與發(fā)光反應(yīng)，通常這類物質(zhì)沒有本底發(fā)光，在反應(yīng)中能用于檢測低濃度或微量濃度的樣品，是一類發(fā)光效率很高的發(fā)光劑，吖啶酯I、II分子和吖啶酰胺III均可與抗體(或抗原)結(jié)合，生成具有化學(xué)發(fā)光活性強、免疫反應(yīng)特異性高的標記抗體。文檔編號G01N33/53GK101609090SQ20081012704公開日2009年12月23日申請日期2008年6月19日優(yōu)先權(quán)日2008年6月19日發(fā)明者斯林申請人:北京華科泰生物技術(shù)有限公司