專利名稱：：乙肝表面抗體磁微?；瘜W發(fā)光免疫測定試劑盒及其制備方法
技術領域：
：本發(fā)明涉及一種乙肝表面抗體磁微?；瘜W發(fā)光免疫測定試劑盒及其制備方法。本發(fā)明的試劑盒結(jié)合了磁微粒分離技術、生物素-親和素放大技術和化學發(fā)光免疫分析:汰術。
背景技術：
：乙型肝炎是一種嚴重的常見的肝臟疾病，在全球影響到數(shù)百萬人。目前全球人口中，超過20億人已經(jīng)在其生命中的某個時期感染過乙型肝炎病毒(HBV)，其中，大約3.5億仍然為慢性感染者，成為病毒的攜帶者。全世界四分之三的人口生活在感染的高發(fā)區(qū)。每年HBV急性臨床病例超過4百萬，攜帶者中大約25%，也就是每年IOO萬人死于慢性活動性肝炎、肝硬化或原發(fā)性肝癌。感染HBV后，第一個出現(xiàn)的感染指標是HBsAg,在暴露于HBV后1至3個月出現(xiàn)。大約1-2個月后，出現(xiàn)第一個抗體，即針對HBV核心抗原(HBcAg)的IgM抗體(抗-HBcIgM),在此時附近，血清中AST和ALT的活性上升。當出現(xiàn)黃疰時，大多數(shù)患者既有HBsAg,又有抗-HBcIgM。隨著病毒的清除，抗-HBs將可以檢出。較少比例的患者中，可能會出現(xiàn)HBsAg和抗-HBs都無法檢出的情況，此時通?？梢?全出的指標為IgM抗-HBc，這種狀況稱之為"核心窗口期"，這樣的患者通?？?HBe多為陽性。HBV感染康復后，絕大多數(shù)人抗-HBc和抗-HBs將終身陽性。目前用于檢測乙肝病毒血清標志物的免疫方法主要有酶免疫測定(enzymeimmunoassay,EIA)、》文射免疫測定(radioimmunoassay,RIA)、免疫熒光測定(fluoroimmunoassay，F(xiàn)IA)以及化學發(fā)光免疫分析(chemiluminescenceimmunoassay,CLIA)等。放射免疫分析技術因其使用放射性元素作為標記物，因此對環(huán)境有一定污染性，并存在儀器成本貴，靈敏度不高，操作復雜，測定結(jié)果不穩(wěn)定，試劑保存時間短等缺點。酶免疫分析法靈敏度低，影響因素較多，易造成假陰性和假陽性?；瘜W發(fā)光免疫分析法是一種較先進而有效的方法，可使檢測靈敏度達到10"8摩爾水平，而且檢測范圍可達6個數(shù)量級，又因為酶標記物穩(wěn)定，可長期使用，因而得到了越來越多的關注。免疫磁微粒技術是利用高分子材料合成一定粒度大小的磁性固相微粒作載體，以物理吸附、化學偶聯(lián)等方法包被上具有特異性親合力的各種免疫活性物質(zhì)(抗原或抗體)，使其致敏為免疫磁微粒，具有分離速度快、效率高、可重復性好；不影響被分離細胞或其它生物材料的生物學性狀和功能等特點，在外加磁場作用下定向運動，使得某些特殊成分得以分離、濃集或純化。作為用于化學發(fā)光免疫分析檢測技術的一種通用固相分離方法，磁微粒可大大提高有效包被量從而節(jié)省原料，同時可拓寬檢測的線性范圍，從而有效避免彎鉤效應的發(fā)生。將免疫磁微粒技術與化學發(fā)光免疫分析技術結(jié)合檢測待測物，可大大提高檢測的靈敏度和準確性，它以微米級磁微粒為載體，利用表面有機物提供的羧基活性基團與蛋白質(zhì)氨基共價結(jié)合，釆用抗體進行"搭橋"成免疫磁微粒，可進行抗原、抗體反應。該技術的新穎之處有(l)利用順磁鐵微粒為固相載體，外包被基因工程抗原，增加抗原、抗體的接觸面積及底物發(fā)光面積，提高反應的靈敏度，并采用旋轉(zhuǎn)磁場使磁微粒起攪拌作用及分離結(jié)合抗原-抗體與游離抗體的作用；(2)在液相反應中，使用發(fā)光增強劑，將水分子從發(fā)光底物的發(fā)光位點排開，同時還可縮短發(fā)光的達峰時間；(3)使用基因工程抗原，提高了反應的特異性。生物素-親和素系統(tǒng)(biotin-avidinsystem,BAS)具有多級的信號放大作用，并且不增加非特異性干擾，且具有靈敏度高、特異性好、穩(wěn)定性高、適用性強和實驗成本低等特點?；瘜W發(fā)光免疫分析結(jié)合生物素-親和素系統(tǒng)和免疫磁微粒固相分離體系是一種檢測乙肝表面抗體的先進而有效的方法，有助于促進化學發(fā)光免疫分析技術在臨床檢驗、檢測中的應用與發(fā)展。
發(fā)明內(nèi)容本發(fā)明同時解決了上述問題，綜合了生物素一親和素免疫放大技術和磁微粒免疫分離技術和化學發(fā)光免疫分析技術的有點，開發(fā)了一種簡便、快速、穩(wěn)定、線性范圍寬的乙肝表面抗體測定試劑盒。本發(fā)明的目的是提供一種生物素一親和素免疫放大技術和免疫磁微粒技術結(jié)合化學發(fā)光免疫分析測定乙肝表面抗體的磁微粒化學發(fā)光免疫測定試劑盒。本發(fā)明的試劑盒包括a)乙肝表面抗原包被的磁微粒和生物素標記的乙肝表面抗原的混合液；b)辣根過氧化物酶標記的鏈親和素；c)乙肝表面抗體校準品；d)上述辣根過氧化物酶所作用的化學發(fā)光底物魯米諾或異魯米諾；以及e)濃縮洗滌液；f)反應管。本發(fā)明的再一目的是提供一種制備上述試劑盒的方法。本發(fā)明試劑盒的制備方法包括以下步驟a)配制乙肝表面抗原包祐J茲」微粒和生物素標記乙肝表面抗原的混合液；b)以辣根過氧化物酶標記鏈親和素；e)以乙肝表面抗體配制校準品；d)配制辣根過氧化物酶所作用的化學發(fā)光底物液；e)配制濃縮洗滌液；f)分裝上述校準品、親和素包被磁微粒和生物素標記抗原的混合液、酶標記物、化學發(fā)光底物魯米諾或異魯米諾和反應管；g)組裝為成品試劑盒。根據(jù)本發(fā)明的方法，在所述制備抗原包被磁微粒和生物素標記抗原的混合液的步驟a)中所述的混合液是由乙肝表面抗原包被的磁微粒和生物素標記的乙肝表面抗原以體積比為1:1混合，以10~30%的新生牛血清、0.1~1%Tween20的磷酸鹽緩沖液配制而成；所述磁微粒為l~10nm粒徑、四氧化三鐵內(nèi)核、表面包裹帶有活性基團如氨基(NH2-)、羧基(-COOH)的聚合物，其使用濃度為l~10mg/mL;所述抗體包被磁微粒是通過戊二醛兩步法將乙肝表面抗原包被于磁微粒上；以封閉液封閉包被的磁微粒，所述封閉液為含有0.5%~2.0%牛血清白蛋白、10~20%新生牛血清的pH值為7.2的0.02mol/L磷酸緩沖液；所述生物素標記乙肝表面抗原是通過生物素琥珀酰亞胺酯在微堿性條件下與抗體游離賴氨酸發(fā)生偶4關反應而實現(xiàn)的。根據(jù)本發(fā)明的方法，在所述以辣根過氧化物酶標記鏈親和素的步驟b)中，采用改良過捵酸鈉法以辣根過氧化物酶標記鏈親和素。根據(jù)本發(fā)明的方法，所述化學發(fā)光底物包含A液和B液，其中，A液是包含10mM魯米諾、0.3mM4-雍基聯(lián)苯、0.05mM4-碘苯硼酸的0.2MpH8.7硼酸-硼砂緩沖液，其pH值為8.0~10.0。B液是包含3.5mM過氧化脲、0.1%Tween20的0.2MpH7.2磷酸鹽緩沖液，其pH值為7.0~7.6。在根據(jù)本發(fā)明制備上述試劑盒的方法中，使用透明塑料或者玻璃作為反應管材料。具體的上述試劑盒可以包括抗體包被磁微粒和生物素標記抗體的混合液、酶標記物、校準品、化學發(fā)光底物與洗滌緩沖液等。其中，所述校準品的原料為標準級，純度不低于90%;抗體包被于磁微粒上，與生物素標記的抗體形成混合液；標記鏈親和素的酶為辣根過氧化物酶；化學發(fā)光底物為魯米諾；洗滌緩沖液為磷酸鹽緩沖液。根據(jù)本發(fā)明的試劑盒，乙肝表面抗原包被的磁微粒、待測樣品中的乙肝表面抗體與生物素標記的乙肝表面抗原結(jié)合，形成"雙抗原夾心"復合結(jié)構(gòu)，之后酶標記的鏈親和素再與該復合結(jié)構(gòu)結(jié)合，形成"磁微粒-抗原-待測抗體-抗原-生物素-親和素-酶"復合物，最后與化學發(fā)光底物作用而產(chǎn)生并^:大光信號，在管式發(fā)光儀中對乙肝表面抗體進行高靈敏、高特異檢測。本發(fā)明采用"雙抗原直接夾心兩步法"反應模式，有效地利用了化學發(fā)光技術結(jié)合磁微粒和生物素-親和素免疫放大技術原理，定量檢測人體血清、血漿樣品中乙肝表面抗體，確保了檢測的靈敏度。使用的磁微粒具有超順磁、高分散、表面積大的特點。對樣品的前處理要求低，樣品前處理過程簡單可靠，可快速、高通量檢測大批樣品，便于操作和生產(chǎn)。本發(fā)明"乙肝表面抗體磁微?；瘜W發(fā)光免疫分析測定試劑盒"可以準確地檢測出人乙肝表面抗體的含量。本發(fā)明的試劑盒(化學發(fā)光法、生物素-親和素免疫放大技術與免疫磁微粒結(jié)合)檢測快速、測值線性范圍寬，校準品用國家線性參考品進行標定，可以準確地檢測出人血清乙肝表面抗體的含量，且各項指標均達到進口同類試劑盒的水平。圖1為本發(fā)明試劑盒與國外知名公司進口HBsAb化學發(fā)光試劑臨床血樣測值比對的相關曲線。具體實施例方式實施例1制備本發(fā)明的乙肝表面抗體磁微?；瘜W發(fā)光免疫分析測定試劑盒一、乙肝表面抗原包被磁微粒與生物素標記乙肝表面抗原的混合液的制備1、乙肝表面抗原包被的磁微粒的制備將粒徑為l-10nm的磁微粒用戊二醛進行活化，室溫攪拌，混勻3小時后，加磁場，靜置30min,倒出上清，用pH值為7.4的0.01mol/L磷酸鹽緩沖液清洗三次，并用該溶液進行懸浮，濃度為50100mg/mL;每毫升懸浮液中加入乙肝表面抗原40~100嗎，在4。C下攪拌過夜后，加磁場，靜置30min，倒出上清，用含有0.2%~1.0%牛血清白蛋白、10~20%新生牛血清的0.02mol/L的磷酸緩沖液(pH為7.2)于室溫封閉3~4小時；最后用pH值為7.4、含新生牛血清、Tween20和生物防腐劑的磷酸鹽洗滌緩沖液清洗3~5次，并用該溶液配制成l~10mg/mL的工作液。磁微粒在28。C保存。2、生物素標記的乙肝表面抗原的制備生物素標記乙肝表面抗原以生物素琥珀酰亞胺酯在微堿性條件下與抗原發(fā)生偶聯(lián)反應，對PBS充分透析，生物素標記物以新生牛血清稀釋，加入Proclin300,-20。C以下保存。3、混合液的制備將乙肝表面抗原包被的磁微粒與生物素標記的乙肝表面抗原以體積比為1:1混合，以含10~30%小牛血清、0.1-1%Tween20的磷酸鹽緩沖液配制而成。二、辣根過氧化物酶標記的鏈親和素的制備以辣根過氧化物酶標記鏈親和素采用改良過碘酸鈉法，具體標記過程如下溶解4.4mgHRP于ImL蒸餾水中，加入0.4mL過碘酸鈉(50mmol/L)室溫攪拌20min,經(jīng)lmmol/L醋酸鈉緩沖液，pH4.4透析后加入8mg鏈親和素，攪拌2h，最后用200mmol/LNaBH4進行還原，經(jīng)0.02MPBS緩沖液透析后，加等體積甘油，-20。C以下保存。三、乙肝表面抗體校準品的制備用馬血清將乙肝表面抗體稀釋成校準品，濃度分別為OmlU/mL、6mlU/mL、20mIU/mL、60mIU/mL、200mIU/mL、600mIU/mL，共6瓶。四、酶標記物的制備先配制酶稀釋液，每1000ml酶稀釋液中含Tris12.12g，BSA5g，甘油100ml,Proclin300lml，加雙蒸水至900ml,用鹽酸調(diào)pH至7.4,再用雙蒸水定容至1000ml,配成酶稀釋液。采用方陣法選擇酶標記物的工作濃度范圍為1:1000-5000。五、配制化學發(fā)光底物液本發(fā)明所使用的辣根過氧化物酶(HRP)的化學發(fā)光底物液的配制方法A液含10mM魯米諾、0.3mM4-輕基聯(lián)苯、0.05mM4-碘苯硼酸的pH8.0~10.0的硼酸鹽緩沖。B液含3.5mM過氧化脲、0.1%Tween20的pH7.0~7.6磷酸鹽緩沖液。使用方法A、B液雙組分試劑，在使用前根據(jù)使用量等體積混合。六、配制洗滌緩沖液洗滌緩沖液是含有0.10.5%吐溫-20、0.1。/。生物防腐劑的磷酸鹽緩沖液，pH值為7.4。使用時用蒸餾水稀釋20倍。七、半成品及成品組成上述步驟所得產(chǎn)品分裝即為半成品。抽出三份經(jīng)靈過特異性、精密性、敏度及穩(wěn)定性檢定合格才能組裝成乙肝表面抗體磁微?；瘜W發(fā)光免疫測定試劑盒，組裝成試劑盒后還需抽檢合格后才能出廠。實施例2本發(fā)明的試劑盒的使用方法一、樣品的準備采用正確醫(yī)學方法收集病人血清用于檢測。二、；險測方法使用本試劑盒進行實驗前，需先取出抗原包被磁微粒與生物素標記抗原的混合液、校準品/待測樣品、酶標記的親和素在室溫放置15~30分鐘，使它們平衡到室溫；之后，將恒溫溫箱或者水浴鍋調(diào)至37°C;再后，準備好合適的微量加樣器及對應吸頭并且檢查化學發(fā)光儀是否正常工作。使用本發(fā)明試劑盒按照實施例2的方法進行實驗的具體操作步驟如下將圓底聚苯乙烯試管編號后，向試管中加入50laL血清樣品或系列校準品溶液，校準品每管加OmlU/mL、6mlU/mL、20mlU/mL、60mlU/mL、200mlU/mL、600mIU/mL各50nL,再加入抗原包被磁微粒與生物素標記抗原的混合液50pL，37。C振蕩反應30min。用洗滌液清洗三遍后，加入辣根過氧化物酶標記的鏈親和素50pL，37。C振蕩反應15min。之后，將試管架置于磁分離器上分離5min，然后倒轉(zhuǎn)分離器倒出上清液，將倒轉(zhuǎn)的試管放在濾紙上吸干，拍擊分離器以除去掛壁液體。每管加入洗滌液500nL,充分混勻，置于磁分離器上分離5min,倒出上清液，將倒轉(zhuǎn)的試管放在濾紙上吸干，拍擊分離器以除去掛壁液體，重復3次。各管加入化學發(fā)光底物200~400pL,充分混勻，置于磁分離器內(nèi)，待磁微粒富集于底部后，暗處放置5min，而后在管式化學發(fā)光測量儀上依序測量各管的發(fā)光強度(RLU)。以校準品濃度的Log值為橫坐標，RLU的Log值為縱坐標繪出標準曲線(雙對數(shù)曲線)，以各待測血清RLU值在標準曲線上查出該血清的HBsAb的濃度。實施例3本發(fā)明的試劑盒的方法學檢定按照本領域中常規(guī)的制造及檢定規(guī)程對實施例1中制備的試劑盒進行檢定，結(jié)果如下1、試劑盒精密度測定(1)校準品精密度實驗將實施例1中制備的試劑盒分別取三批進行精密度實驗，每批抽取5個試劑盒。以實施例1中所抽取的試劑盒測定80mIU/mL的抗-HBs校準品10次。計算測定濃度的變異系數(shù)，結(jié)果表明變異系數(shù)在3.0%8.5%之間。2、試劑盒準確性測定用國家線性參考品進行檢測，8個濃度點的測值偏差小于10%，結(jié)果如表1。<table>tableseeoriginaldocumentpage12</column></row><table>3、試劑盒靈敏度、特異性實驗與HAV、HCV、類風濕、系統(tǒng)性紅斑狼瘡等疾病未見交叉反應。用國家參考品進行檢測，其中20份陰性國家參考品全部檢出陰性，符合率100%(20/20),三份靈敏度參考血清檢測，結(jié)果如表2。表2靈敏度國家參考品檢測結(jié)果<table>tableseeoriginaldocumentpage13</column></row><table>4、試劑盒穩(wěn)定性實驗對實施例1的試劑盒進行37。C6天加速實驗后，與4'C放置試劑盒平行檢測高、中、低值質(zhì)控品，結(jié)果表明37°C6天后質(zhì)控血清測值偏差均小于15%,對實施例1試劑盒進行28。C8個月的跟蹤實驗，結(jié)果表明各項指標完全符合臨床要求。該試劑盒在37'C放置6天和2~8'C放置8個月均能通過國家參考品標準，穩(wěn)定性良好，完全符合臨床需要。實施例4本發(fā)明的試劑盒同國外試劑盒臨床血樣測值比對用本發(fā)明試劑盒和國外知名公司的進口抗-HBs化學發(fā)光試劑盒對512份的臨床血清樣品同時進行檢測，其檢測結(jié)果見附圖1，以本發(fā)明方法測定的血樣抗-HBs結(jié)果為橫坐標，以對照試劑盒測定的結(jié)果為縱坐標作回歸分析，相關方程為y=0.8413x+58.743,相關系數(shù)1=0.9376。經(jīng)統(tǒng)計學處理結(jié)果表明，本發(fā)明方法同國外試劑盒臨床血樣測值相關性良好。權利要求1、一種乙肝表面抗體磁微粒化學發(fā)光免疫測定試劑盒，其特征在于，所述試劑盒包括以下組分乙肝表面抗原包被的磁微粒和生物素標記的乙肝表面抗原的混合液、辣根過氧化物酶標記的鏈親和素、乙肝表面抗體校準品、上述辣根過氧化物酶所作用的化學發(fā)光底物液、濃縮洗滌液和反應管。2、如權利要求1所述的試劑盒，其特征在于，所述乙肝表面抗原包被的磁微粒與生物素標記的乙肝表面抗原的混合比例為1:1。3、如權利要求1所述的試劑盒，其特征在于，所述化學發(fā)光底物包含A液和B液，其中，A液包括10mM魯米諾、0.3mM4-羥基聯(lián)苯、0.05mM4-碘苯硼酸、0.2MpH8.7硼酸-硼砂緩沖液，其pH值為8.0~10.0;B液包括3.5mM過氧化脲、0.1%Tween20、0.2MpH7.2磷酸鹽緩沖液，其pH值為7.0~7.6。4、如權利要求1所述的試劑盒，其特征在于，所述試劑盒使用的反應管材料為透明塑料或玻璃。5、一種制備權利要求1所述試劑盒的方法，其特征在于包括以下步驟1)配制乙肝表面抗原包被磁微粒和生物素標記乙肝表面抗原的混合液；2)以辣才艮過氧化物酶標記鏈親和素；3)以乙肝表面抗體多克隆抗體配制校準品；4)配制辣根過氧化物酶所作用的化學發(fā)光底物魯米諾或異魯米諾；5)濃縮洗滌液6)分裝上述校準品、抗原包被磁微粒和生物素標記抗原的混合液、酶標記物、化學發(fā)光底物魯米諾或異魯米諾、濃縮洗滌液和反應管；以及7)組裝為成品試劑盒。6、如權利要求5所述的方法，其特征在于，在所述配制抗原包被磁微粒和生物素標記抗原的混合液的步驟1)中所述磁樣先粒為l~l(Vm粒徑、四氧化三鐵內(nèi)核、表面包裹帶有活性基團的聚合物，其使用濃度為l~10mg/mL;所述抗體包被》茲微粒是通過戊二醛兩步法將乙肝e抗體包被于^茲樣"立上，以含有0.5%~2.0%牛血清白蛋白、pH值為7.2的0.02mol/L磷酸緩沖液為封閉液封閉包被的磁」微粒；所述生物素標記乙肝表面抗原是通過生物素琥珀酰亞胺酯在微堿性條件下與抗體賴氨酸殘基發(fā)生偶聯(lián)反應而實現(xiàn)的；所述的混合液是由乙肝表面抗原包被的磁微粒和生物素標記的乙肝表面抗原以體積比為1:1混合，以含10~30%的新生牛血清、0.1~1%Tween20的磷酸鹽緩沖液配制而成。7、如權利要求6所述的方法，其特征在于，所述活性基團為氨基或羧基。8、如權利要求5所述的方法，其特征在于，在所述以辣根過氧化物酶標記鏈親和素的步驟2)中，采用改良過碘酸鈉法以辣根過氧化物酶標記鏈親和素。9、如權利要求5所述的方法，其特征在于，所述化學發(fā)光底物液包含A液和B液，其中，A液包括lOmM魯米諾、0.3mM4-羥基聯(lián)苯、0.05mM4-碘苯硼酸、0.2MpH8.7硼酸-硼砂緩沖液，其pH值為8.0~10.0;B液包括3.5mM過氧化脲、0.1%Tween20、0.2MpH7.2磷酸鹽緩沖液，其pH值為7.0~7.6。10、如權利要求5所述的方法，其特征在于，使用透明塑料或玻璃作為反應管材料。全文摘要本發(fā)明公開了一種乙肝表面抗體磁微粒化學發(fā)光免疫測定試劑盒及其制備方法，該試劑盒可以快速、準確地檢測人血清中的乙肝表面抗體含量。本發(fā)明試劑盒包括乙肝表面抗原包被磁微粒和生物素標記乙肝表面抗原的混合液、辣根過氧化物酶標記的鏈親和素、乙肝表面抗體校準品、化學發(fā)光底物、濃縮洗滌液和反應管。本發(fā)明試劑盒采用雙抗原夾心法原理，結(jié)合磁微粒免疫技術、生物素-親和素和化學發(fā)光免疫分析技術，其檢測快速、曲線線性范圍寬，校準品用國家線性參考品進行標定，可以準確地檢測出人血清乙肝表面抗體的含量，具有重要的臨床應用價值。文檔編號G01N33/576GK101592662SQ200810113810公開日2009年12月2日申請日期2008年5月30日優(yōu)先權日2008年5月30日發(fā)明者于尚永,唐寶軍,宋勝利,應希堂,胡國茂,詹先發(fā)申請人:北京科美東雅生物技術有限公司