專利名稱：三碘甲腺原氨酸磁微?；瘜W(xué)發(fā)光免疫分析測(cè)定試劑盒及其制備方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及免疫分析領(lǐng)域，特別涉及到一種定量測(cè)定三碘甲腺原氨酸的磁微 粒化學(xué)發(fā)光免疫分析試劑盒。本發(fā)明試劑盒結(jié)合了生物素一親和素免疫放大技 術(shù)、免疫磁微粒分離技術(shù)和化學(xué)發(fā)光免疫分析技術(shù)。
背景技術(shù)：
甲狀腺是內(nèi)分泌系統(tǒng)中重要的組成部分，是人體內(nèi)最大的內(nèi)分泌腺，平均生 理重量約為20-25g，甲狀腺分泌兩種具有生理活性的激素，即甲狀腺素(T4)和 三碘甲腺原氨酸(T3)。它們?cè)谌梭w生長(zhǎng)發(fā)育、細(xì)胞代謝和體內(nèi)激素平衡，對(duì)維 持代謝、骨骼肌和各器官系統(tǒng)的發(fā)育都起著重要的調(diào)節(jié)作用。然而，三碘甲腺原 氨酸(T3)，是不具有明顯的生物活性的，血液中3。/。以下的T3是由甲狀腺分泌的， 97y。以上都是由甲狀腺素(T4)代謝脫碘而來(lái)的，在血液循環(huán)中絕大部分與血漿中 甲狀腺結(jié)合球蛋白(TBG)結(jié)合。在臨床上，檢測(cè)血液中T3的含量有助于了解人體 的碘代謝及其甲狀腺功能狀況，另外，血清中T3的測(cè)定不僅可作為診斷甲狀腺 機(jī)能亢進(jìn)癥(甲亢)和甲狀腺機(jī)能減退癥(甲低)的參考指標(biāo)，而且還有助于低 T3綜合癥和甲低的鑒別診斷，同時(shí)還可以作為觀察影響甲狀腺激素代謝的藥物胺 碘酮副作用的一種手段。因此，發(fā)明一種快速、高靈敏和高特異性檢測(cè)人血液中 T3具有一定的價(jià)值和深遠(yuǎn)意義。
目前，免疫分析法作為一種重要的分析方法已廣泛應(yīng)用于臨床診斷和生物化 學(xué)等方面的研究。常用三碘甲腺原氨酸檢測(cè)的方法有放射免疫分析法 (radioimmunoassay, RIA)、酶聯(lián)免疫分析法(enzyme linked immunoassay, ELIA) 和時(shí)間分辨熒光免疫分析法(time resolved fluoroimmunoassay, TRFIA)等。這 些方法均有著不足之處放射免疫法不可避免地用到放射性元素1251，對(duì)人和環(huán) 境都有一定的影響；酶聯(lián)免疫分析法有著較低的靈敏度；熒光免疫分析法需要昂 貴的儀器和試劑。而化學(xué)發(fā)光免疫分析法是一種基于化學(xué)發(fā)光分析的高靈敏度和 免疫分析的高特異性的分析方法，該法具有特異性高、靈敏度高、快速、簡(jiǎn)便及 無(wú)放射性污染等優(yōu)點(diǎn)，已受到廣大醫(yī)學(xué)、生物和化學(xué)工作者的關(guān)注。
在實(shí)際的免疫檢測(cè)中，由于待測(cè)樣品中所含的雜質(zhì)成分較多， 一定程度上影 響了檢測(cè)靈敏度和準(zhǔn)確性，所以從復(fù)雜的樣品基質(zhì)中快速分離、純化出目的待測(cè)物，是臨床檢驗(yàn)工作者面臨的難題之一。免疫磁微粒技術(shù)是利用高分子材料合成 一定粒度大小的磁性固相微粒作載體，以物理吸附、化學(xué)偶聯(lián)等方法包被上具有 特異性親合力的各種免疫活性物質(zhì)(抗原或抗體)，使其致敏為免疫磁微粒，具 有分離速度快、效率高、可重復(fù)性好；操作簡(jiǎn)單；不影響被分離細(xì)胞或其它生物 材料的生物學(xué)性狀和功能等特點(diǎn)，在外加磁場(chǎng)作用下定向運(yùn)動(dòng)，使得某些特殊成 分得以分離、濃集或純化。采用免疫磁微粒技術(shù)與化學(xué)發(fā)光免疫分析技術(shù)結(jié)合檢 測(cè)待測(cè)物，可大大提高檢測(cè)的靈敏度和準(zhǔn)確性。該技術(shù)的新穎之處有(l)采用 微小的磁微粒作為固相載體，可增加包被表面積，從而增加了抗體的有效包被量， 增加了抗原、抗體的接觸面積及底物發(fā)光面積，提高反應(yīng)的靈敏度；(2)使用單 克隆抗體，提高了反應(yīng)的特異性。
本發(fā)明采用競(jìng)爭(zhēng)法測(cè)定血清中的三碘甲腺原氨酸，通過(guò)抗體分別與抗原和酶 標(biāo)抗原或是生物素化的抗原競(jìng)爭(zhēng)，從而可以迅速的從血清中高度特異的識(shí)別相應(yīng) 的抗原。單純利用物理吸附把單克隆抗體包被到固相載體上會(huì)存在抗體用量大， 活性損失大等缺點(diǎn)，而采用生物素-親和素系統(tǒng)(biotin-avidin system, BAS) 就可以避免這樣的缺點(diǎn)。該系統(tǒng)具有多級(jí)的信號(hào)放大作用，并且不增加非特異性 干擾，且具有靈敏度高、特異性好、穩(wěn)定性高、適用性強(qiáng)和實(shí)驗(yàn)成本低等特點(diǎn)。 待測(cè)反應(yīng)體系可以利用生物素化的抗原，使得親和素-生物素系統(tǒng)與免疫分析檢 測(cè)體系偶聯(lián)，放大終反應(yīng)先將針對(duì)不同抗原決定簇的固相抗體和生物素化的抗 原與抗原(標(biāo)準(zhǔn)抗原和待測(cè)抗原)同時(shí)競(jìng)爭(zhēng)反應(yīng)，在固相載體表面形成免疫復(fù)合 物，再加入親和素與復(fù)合物中的生物素結(jié)合，最終使反應(yīng)信號(hào)放大，從而提高了 免疫分析的靈敏度。本發(fā)明就是利用鏈親和素標(biāo)記堿性磷酸酶(ALP)和生物素 化的抗原以適當(dāng)?shù)谋壤旌希瑢⒀鍢悠泛蜆?biāo)準(zhǔn)加入固相抗體，再加入兩種標(biāo)記 物的混合液，鏈親和素迅速與生物素結(jié)合，生物素化的抗原和ALP標(biāo)記鏈親和素 與血清中的蛋白分子競(jìng)爭(zhēng)形成特異性的結(jié)合，然后加入化學(xué)發(fā)光底物，利用化學(xué) 發(fā)光儀檢測(cè)相對(duì)發(fā)光強(qiáng)度，就可以定量分析人血清中的三碘甲腺原氨酸。
本發(fā)明的化學(xué)發(fā)光免疫分析結(jié)合生物素-親和素系統(tǒng)體系是一種檢測(cè)T3的先 進(jìn)而有效的方法，無(wú)需昂貴的儀器，還可以大大提高靈敏度，并且操作簡(jiǎn)便、適 用性廣，既可應(yīng)用于開放式的半自動(dòng)化學(xué)發(fā)光測(cè)量?jī)x，也可用于全自動(dòng)的測(cè)量系 統(tǒng)，更加有助于促進(jìn)化學(xué)發(fā)光免疫分析技術(shù)在臨床檢驗(yàn)、檢測(cè)中的應(yīng)用與發(fā)展。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是提供一種生物素一親和素免疫放大技術(shù)和免疫磁微粒技術(shù) 結(jié)合化學(xué)發(fā)光免疫分析定量測(cè)定T3的磁微?；瘜W(xué)發(fā)光免疫分析測(cè)定試劑盒。
根據(jù)本發(fā)明的試劑盒包括T3校準(zhǔn)品、抗異硫氰酸酯熒光素(FITC)單克隆抗 體包被的磁微粒溶液、生物素標(biāo)記的T3與FITC標(biāo)記的T3單克隆抗體的混合液、 堿性磷酸酶標(biāo)記的鏈親和素液、上述酶所作用的化學(xué)發(fā)光底物液、以及20倍濃 縮洗滌液。*
本發(fā)明的再一 目的是提供一種制備上述試劑盒的方法。 根據(jù)本發(fā)明制備上述試劑盒的方法包括以下步驟
1) 以T3純品配制校準(zhǔn)品；
2) 制備抗FITC單克隆抗體包被的磁微粒溶液；
3) 制備生物素標(biāo)記的T3;
4) FITC標(biāo)記的T3單克隆抗體；
5) 以堿性磷酸酶標(biāo)記鏈親和素；
6) 配制堿性磷酸酶所作用的化學(xué)發(fā)光底物液；
7) 配制20倍濃縮洗滌液；
8) 分裝上述校準(zhǔn)品、抗體包被的磁微粒、生物素標(biāo)記物、FITC標(biāo)記物、酶
標(biāo)記物、化學(xué)發(fā)光底物液和20倍濃縮洗滌液；以及
9) 組裝為成品。 '
根據(jù)本發(fā)明的方法，在所述制備抗FITC單克隆抗體包被的磁微粒步驟2)
中
所述磁微粒為2 3um粒徑、四氧化三鐵內(nèi)核、表面包裹帶有活性基團(tuán)的聚 合物，其使用濃度為3 8mg/mL;
所述抗體包被磁微粒是通過(guò)戊二醛兩步法以抗FITC單克隆抗體包被磁微粒。
所述制備生物素標(biāo)記的T3步驟3)中
所述生物素標(biāo)記的T3是通過(guò)生物素琥珀酰亞胺酯在微堿性條件下與抗原發(fā)
生偶聯(lián)反應(yīng)而實(shí)現(xiàn)的。根據(jù)本發(fā)明的方法，在所述以堿性磷酸酶標(biāo)記鏈親和素的步驟5)中，采 用改良的戊二醛法以堿性磷酸酶標(biāo)記鏈親和素。
根據(jù)本發(fā)明的方法，所述化學(xué)發(fā)光底物液1, 2-二氧乙垸類衍生物為(金 剛烷)-1，2-二氧乙垸、3-(2'-螺旋金剛垸)-4-甲氧基-4-(3"-磷酰氧基) 苯基-1， 2-二氧乙烷(AMPTO)。
所述20倍濃縮洗滌液包含2.4% Tris、 16% NaCl、 0.4% KC1、 1.5% HC1， pH值為7.4。
具體的上述試劑盒可以包括校準(zhǔn)品、磁微粒溶液、生物素標(biāo)記物、FITC標(biāo) 記物、酶標(biāo)記物、化學(xué)發(fā)光底物液與洗滌緩沖液等。其中，所述校準(zhǔn)品的原料為 標(biāo)準(zhǔn)級(jí)，純度不低于90%;抗FITC抗體包被于磁微粒上；FITC標(biāo)記的是單克隆 抗體；生物素標(biāo)記的抗原；標(biāo)記鏈親和素的酶為堿性磷酸酶；化學(xué)發(fā)光底物液為 1,2-二氧乙烷類衍生物為(金剛垸)-l,2-二氧乙垸、3-(2'-螺旋金剛 烷)-4-甲氧基-4-(3"-磷酰氧基)苯基-l， 2-二氧乙垸(AMPPD)溶液；洗 滌緩沖液為Tris-HCl緩沖液。
本發(fā)明"三碘甲腺原氨酸磁微?；瘜W(xué)發(fā)光免疫分析測(cè)定試劑盒"可以簡(jiǎn)便快 捷、高靈敏、高重現(xiàn)性地檢測(cè)出人血清中三碘甲腺原氨酸的含量，可以根據(jù)三碘 甲腺原氨酸含量的多少判斷病情及治療效果。本發(fā)明的試劑盒(化學(xué)發(fā)光法、生 物素-親和素免疫放大技術(shù)與免疫磁微粒結(jié)合)提供了一種高靈敏、寬范圍、簡(jiǎn) 便快速、穩(wěn)定地定量檢測(cè)T3的測(cè)定試劑盒，該試劑盒適于產(chǎn)業(yè)化，具有良好的
市場(chǎng)應(yīng)用前景，特別適合廣大的中小醫(yī)院推廣使用，為臨床診斷和科研工作提供 一種非常有價(jià)值的檢測(cè)手段。
本發(fā)明采用"競(jìng)爭(zhēng)法"的反應(yīng)模式，有效地利用了化學(xué)發(fā)光技術(shù)結(jié)合磁微粒 和生物素-親和素免疫放大技術(shù)原理，定量檢測(cè)人體血清、血漿樣品中T3的含量， 確保了檢測(cè)的靈敏度。本發(fā)明的試劑盒結(jié)構(gòu)簡(jiǎn)單，使用方便，價(jià)格便宜，攜帶便 利，與市場(chǎng)上的酶免疫試劑盒相比，線性表現(xiàn)均很好，并且臨床符合率也大大提 高，可為診斷人體甲狀腺機(jī)能亢進(jìn)癥(甲亢)和甲狀腺機(jī)能減退癥(甲低)提供 更為特異、快速、可靠的依據(jù)。


圖1為實(shí)施例1所制備的試劑盒中的校準(zhǔn)品線性圖(logit-log標(biāo)準(zhǔn)曲線)。圖2為本發(fā)明的試劑盒同ELISA試劑盒臨床血樣測(cè)值比對(duì)的相關(guān)曲線。
具體實(shí)施例方式
實(shí)施例1制備本發(fā)明的T3磁微?；瘜W(xué)發(fā)光免疫分析測(cè)定試劑盒
一、 T3校準(zhǔn)品的制備
用去激素人血清將T3純品稀釋成校準(zhǔn)品，分裝O、 0.5、 1.0、 2.5、 7.5、 15 ng/mL共6瓶。
二、 抗FITC單克隆抗體包被磁微粒溶液的制備
將粒徑為2 3um的磁微粒用戊二醛進(jìn)行活化，室溫?cái)嚢?，混?小時(shí)后， 加磁場(chǎng)，靜置20 25min，倒出上清，用pH值為7. 4的0. Olmol/L磷酸鹽緩沖液 清洗三次，并用該溶液進(jìn)行懸浮，濃度為50~100mg/mL;每毫升懸浮液中加入抗 FITC單克隆抗體60 100y g，在4。C下攪拌過(guò)夜后，加磁場(chǎng)，靜置10 15min，倒 出上清，用含有0.2%~1.0%牛血清白蛋白、0.5%~1.0%酪蛋白、0.02mol/L的磷 酸緩沖液(pH為7.2)于室溫封閉3~4小時(shí)；最后用pH值為7.4、含吐溫-20 和疊氮化鈉防腐劑的磷酸鹽洗滌緩沖液清洗3~5次，并用該溶液配制成5~10 mg/mL的工作液。磁微粒溶液在4'C保存，不應(yīng)凍存，用時(shí)輕輕搖勻。
三、 生物素標(biāo)記物和FITC標(biāo)記物的制備
1、 生物素標(biāo)記的T3的制備
生物素標(biāo)記T3以生物素琥珀酰亞胺酯在微堿性條件下與抗原發(fā)生偶聯(lián)反應(yīng)，
對(duì)PBS充分透析，生物素標(biāo)記物以去激素人血清^釋，加入H的proclin 300， 一2(TC以下保存。
2、 FITC標(biāo)記的T3單克隆抗體的制備
FITC可以與抗體的伯氨基直接反應(yīng)。將適量抗T3單克隆抗體置于透析袋在 50 mmol L—1 NaHC03緩沖液(pH 9.3)中過(guò)夜透析后，置入溶有適量FITC的50 mraol化"碳酸鹽緩沖液(pH9.5)中，在4。C下攪拌反應(yīng)16~20小時(shí)。更換透析液， 以0. 01 mol L"PBS液(pH 7. 4)為透析液，每隔4~6小時(shí)更換一次，共更換4~5 次。之后提取反應(yīng)液于離心管中，3000rpm離心30min，棄去沉淀。標(biāo)記物中加 入等體積甘油后，置-2CTC下保存待用。
四、 堿性磷酸酶標(biāo)記的鏈親和素的制備
以堿性磷酸酶標(biāo)記鏈親和素采用改良的戊二醛，具體標(biāo)記過(guò)程如下稱取2. 0 mg堿性磷酸酶和4. 0 mg加入用碳酸鹽緩沖液配制的鏈親和素分別 溶解于生理鹽水中至1. 5 mL。加入新鮮配制的0. 5 mL的戊二醛，室溫磁力攪拌 15min，避光反應(yīng)4 h;加入l.O mol/L的乙醇胺0. 1 mL，室溫振蕩2 h。 4。C條 件下用PBS加磁力攪拌10 h透析，更換透析液兩次。離心去除沉淀；加等體積 甘油，分裝后，一2(TC以下保存。采用方陣法選擇酶標(biāo)記物的工作濃度范圍為 1:2000~4000。
五、化學(xué)發(fā)光底物液的配置
本發(fā)明所使用的堿性磷酸酶(ALP)的化學(xué)發(fā)光底物液的配制方法
Tris 24g
NaCl 160g
KC1 4g
HC1 15mL
雙蒸水 1000mL
Proclin 300 lmL
AMPPD 200mL 六、20倍濃縮洗滌緩沖液
Tris 24g
NaCl 160g
KC1 4g
HC1 15mL
去離子水 1000mL pH值為7.4。
七、半成品及成品組成
上述步驟所得產(chǎn)品分裝即為半成品。隨機(jī)抽出幾份經(jīng)過(guò)特異性、精密性、靈 敏度及穩(wěn)定性檢定合格才能組裝成三碘甲腺原氨酸磁微粒化學(xué)發(fā)光免疫分析測(cè) 定試劑盒，組裝成試劑盒后還需抽檢合格后才能出廠。
實(shí)施例2本發(fā)明的試劑盒的使用方法
一、樣品前處理
取人的空腹晨血清樣品，3000 rpm離心5min，取上層血清進(jìn)行分析。二、檢測(cè)方法
使用本試劑盒按照如下步驟操作
1) 洗漆緩沖液配制將試劑盒提供的洗滌液緩沖液加蒸餾水20倍稀釋；
2) 將校準(zhǔn)品、抗體包被的磁微粒、生物素標(biāo)記物、FITC標(biāo)記物和酶標(biāo)記物
從4'C冰箱中取出，放置15min，平衡至室溫；
3) 將實(shí)驗(yàn)需要的圓底聚苯乙烯試管編號(hào)后固定在板架上；
4) 反應(yīng)孔中分別加待測(cè)樣品和各濃度校準(zhǔn)品每孔加0、 0. 5、 1. 0、 2. 5、 7. 5、 15 ng/mL各50 " L，每次試驗(yàn)設(shè)空白1管，然后除空白管外各管加標(biāo)記物、堿 性磷酸酶標(biāo)記的親和素和磁微粒溶液各100uL， 37'C振蕩反應(yīng)45 min;
5) 將試管架置于磁分離器上分離5min，然后棄去管中溶液，用Tris洗液， 洗滌5次，在吸水紙上拍干；
6) 每管加化學(xué)發(fā)光底物300ixL，充分混勻，37'C溫育10 min，置于磁分離 器內(nèi)，暗處放置10 min;
7) 在化學(xué)發(fā)光測(cè)量?jī)x上依序測(cè)量各孔的發(fā)光強(qiáng)度(RLU)，測(cè)量時(shí)間1秒/
管；
8) 分別對(duì)校準(zhǔn)品濃度和對(duì)應(yīng)RLU取對(duì)數(shù)，在雙對(duì)數(shù)坐標(biāo)圖上建立標(biāo)準(zhǔn)曲線， 以校準(zhǔn)品濃度的Log值為橫坐標(biāo)，RLU的Logit值為縱坐標(biāo)繪出標(biāo)準(zhǔn)曲線，以各 待測(cè)血清RLU值在標(biāo)準(zhǔn)曲線上查出該血清三碘甲腺原氨酸的濃度，其中，RLU為 發(fā)光強(qiáng)度，Concentration為T3濃度(單位為ng/mL)見附圖1;
9) 打印檢測(cè)結(jié)果報(bào)告。
實(shí)施例3本發(fā)明的試劑盒的方法學(xué)檢定
按照本領(lǐng)域中常規(guī)的檢定規(guī)程對(duì)實(shí)施例1中制備的試劑盒進(jìn)行檢定，本發(fā)明 對(duì)試劑盒的精密度、準(zhǔn)確度、靈敏度、特異性以及穩(wěn)定性等都進(jìn)行了具體的實(shí)驗(yàn) 操作，結(jié)果如下
1、試劑盒精密度測(cè)定
將實(shí)施例1中制備的試劑盒分別取三批進(jìn)行精密度實(shí)驗(yàn)，分別測(cè)定低、中、 高三種不用濃度的血清，8孔平行測(cè)定，重復(fù)3次，得出每次分析的批內(nèi)和多次 分析的批間變異(表1)。其批內(nèi)和批間變異系數(shù)均小于10%。表1方法精密度考察
樣品測(cè)定次數(shù) T3濃度(ng/mL)CV (%)
180.57.3
批內(nèi)變異282,54. 2
38102. 8
1240. 59. 5
批間變異2242. 58. 7
324107. 4
2、試劑盒準(zhǔn)確度測(cè)定
準(zhǔn)確性是指測(cè)量值接近真值的程度，通常用回收率表示。選用三份人血清， 在最佳實(shí)驗(yàn)條件下測(cè)定濃度，然后分別向血清內(nèi)加入濃度為0.5、 2.5、 10rig/mL 的T3校準(zhǔn)品，按照實(shí)施例1的方法對(duì)每個(gè)濃度做3個(gè)平行，計(jì)算回收率。結(jié)果 如表2所示，表明T3的加標(biāo)回收率在93. 5%~106. 2%之間。
表2樣品回收率測(cè)定 已知值(ng/mL)加入濃度值(ng/mL) 測(cè)得濃度(ng/mL) 回收率(%)
1.44 0.5 2.06 106.2
3.85 2.5 5.94 93.5
17.61 10 28.71 104
3、試劑盒靈敏度實(shí)驗(yàn)
靈敏度是在一給定的顯著性水平上可與零劑量相區(qū)別的劑量，是指分析方法 的最小檢出量(記為零標(biāo)準(zhǔn)點(diǎn)的平均減去2SD)。平均測(cè)定10個(gè)S。標(biāo)準(zhǔn)點(diǎn)，計(jì)算 其發(fā)光強(qiáng)度的平均值和標(biāo)準(zhǔn)偏差，帶入線性方程，計(jì)算出對(duì)應(yīng)的濃度值，并重復(fù) 該操作5次，得到該方法的最低檢出限為0.06 ng/mL。并與其它方法比對(duì)，見 表3。
表3方法靈敏度實(shí)驗(yàn)
方法靈敏度(ng/mL)
RIA0.15
ELISA0.21
本發(fā)明方法0.064、試劑盒穩(wěn)定性實(shí)驗(yàn)
將固相抗體、酶結(jié)合物、標(biāo)準(zhǔn)品、發(fā)光底物液等在4'C和37'C下放置3d、 7d、 10d后進(jìn)行實(shí)驗(yàn)，結(jié)果見表3。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，結(jié)果表明實(shí)施例l的試劑盒 指標(biāo)均在正常范圍之內(nèi)，不同條件對(duì)實(shí)驗(yàn)結(jié)果均沒(méi)有明顯的影響，則說(shuō)明該產(chǎn)品 的穩(wěn)定性很好。
表4試劑盒穩(wěn)定性的考察結(jié)果
溫度(°c)時(shí)間(d)S/S。 (％)相關(guān)系數(shù)靈敏度 (ng/mU變異系數(shù) cv (%)
386. 40. 99840. 063. 78
4785. 10. 99930. 087. 37
1087.00.99910. 064. 22
387. 50. 99850. 066. 39
37786. 70. 99900. 092, 16
1085. 60. 99890. 074.5
經(jīng)過(guò)大量的實(shí)驗(yàn)證明，本發(fā)明的試劑盒方法學(xué)指標(biāo)如下
檢測(cè)范圍0~16 ng/tnL;
靈敏度最小檢出限為0.06 ng/mL;
精密度小于10% (n = 5);
準(zhǔn)確性平均回收率在93. 5%~106. 2%之間；
特異性與T4、 FT3、 FT4等其他類似物的交叉反應(yīng)率小于1.0。/o;
穩(wěn)定性各試劑組分置4'C和37"C，考察3d、 7d、 10d后，各組分仍穩(wěn)定。 以上結(jié)果說(shuō)明"三碘甲腺原氨酸磁微?；瘜W(xué)發(fā)光免疫分析測(cè)定試劑盒"的臨 床檢測(cè)范圍、靈敏度、精密度、準(zhǔn)確性、特異性和穩(wěn)定性是完全合格的。
利用本發(fā)明方法進(jìn)行檢測(cè)，靈敏度高，特異性強(qiáng)，檢測(cè)范圍寬，操作簡(jiǎn)單， 無(wú)放射性污染，試劑盒成本低，臨床適用性強(qiáng)，更適用于我國(guó)臨床檢測(cè)實(shí)驗(yàn)。因 此本發(fā)明試劑盒為診斷甲狀腺機(jī)能亢進(jìn)癥(甲亢)和甲狀腺機(jī)能減退癥(甲低)， 以及對(duì)甲狀腺機(jī)能的早期預(yù)警和動(dòng)態(tài)監(jiān)測(cè)，提供了一種靈敏、準(zhǔn)確、快捷、特異 的方法。實(shí)施例4本發(fā)明的試劑盒同ELISA試劑盒臨床血樣測(cè)值比對(duì)
用本發(fā)明的試劑盒和ELISA試劑盒對(duì)40份臨床血清樣品同時(shí)進(jìn)行檢測(cè)。其 檢測(cè)結(jié)果見附圖2，以本發(fā)明方法測(cè)定的血樣T3結(jié)果為橫坐標(biāo)，以ELISA測(cè)定的 結(jié)果為縱坐標(biāo)作回歸分析，相關(guān)方程為Y=0. 7858X+0. 1697 ，相關(guān)系數(shù)r = 0. 9835 。 經(jīng)統(tǒng)計(jì)學(xué)處理結(jié)果表明，本發(fā)明方法同國(guó)外試劑盒臨床血樣測(cè)值相關(guān)性良好。
權(quán)利要求
1、一種三碘甲腺原氨酸(T3)磁微?；瘜W(xué)發(fā)光免疫分析測(cè)定試劑盒，其特征在于，所述試劑盒包括T3校準(zhǔn)品、抗異硫氰酸熒光素(fluoresceinisothiocyanate，F(xiàn)ITC)單克隆抗體包被的磁微粒溶液、生物素標(biāo)記的T3、FITC標(biāo)記的T3單克隆抗體、堿性磷酸酶標(biāo)記的鏈親和素、上述堿性磷酸酶所作用的化學(xué)發(fā)光底物液、以及20倍濃縮洗滌液。
2、 如權(quán)利要求1所述的試劑盒，其特征在于，所述化學(xué)發(fā)光底物液l，2-二 氧乙垸類衍生物為(金剛烷)-1,2-二氧乙垸、3-(2'-螺旋金剛垸)-4-甲氧基 -4-(3"-磷酰氧基)苯基-1， 2-二氧乙烷(AMPPD)。
3、 如權(quán)利要求1所述的試劑盒，其特征在于，所述20倍濃縮洗滌液包含 2.4% Tris、 16% NaCl、 0.4% KC1、 1.5% HC1， pH值為7, 4。
4、 一種制備權(quán)利要求1所述試劑盒的方法，其特征在于包括以下步驟 1)以T3純品配制校準(zhǔn)品；2)制備抗FITC單克隆抗體包被的磁微粒溶液；3)制備生物素標(biāo)記的T3; 4) FITC標(biāo)記的T3單克隆抗體；5)以堿性磷酸酶標(biāo)記鏈親和素；6)配制堿性磷酸酶所作用的化學(xué)發(fā)光底物液；7)配制20倍濃縮洗 滌液；8)分裝上述校準(zhǔn)品、抗體包被的磁微粒、生物素標(biāo)記物與FITC標(biāo)記物的 混合液、酶標(biāo)記物、化學(xué)發(fā)光底物液和20倍濃縮洗滌液；以及9)組裝為成品。
5、 如權(quán)利要求4所述的方法，其特征在于，在所述制備抗FITC單克隆抗體 包被的磁微粒步驟2)中所述磁微粒為2-3ym粒徑、四氧化三鐵內(nèi)核、表面包裹帶有活性基團(tuán)的聚 合物，其使用濃度為3 8mg/mL;所述抗體包被磁微粒是通過(guò)戊二醛兩步法以抗FITC單克隆抗體包被磁微粒。
6、 如權(quán)利要求4所述的方法，其特征在于，在所述制備生物素標(biāo)記的T3步驟3)中所述生物素標(biāo)記的T3是通過(guò)生物素琥珀酰亞胺酯在微堿性條件下與抗原發(fā) 生偶聯(lián)反應(yīng)而實(shí)現(xiàn)的。
7、 如權(quán)利要求4所述的方法，其特征在于，在所述以堿性磷酸酶標(biāo)記鏈親 和素的步驟5)中，采用改良的戊二醛法以堿性磷酸酶標(biāo)記鏈親和素。
8、 如權(quán)利要求4所述的方法，其特征在于，所述化學(xué)發(fā)光底物液1， 2-二氧乙烷類衍生物為(金剛垸)-1，2-二氧乙烷、3-(2'-螺旋金剛烷)-4-甲氧基 -4-(3〃 -磷酰氧基)苯基-1， 2-二氧乙垸(AMPPD)。
9、如權(quán)利要求5所述的試劑盒，其特征在于，所述制備20倍濃縮洗滌液包 含2. 4% Tris、 16% NaCl、 0. 4% KC1、 1. 5% HC1， pH值為7. 4。
全文摘要
本發(fā)明提供了一種定量檢測(cè)三碘甲腺原氨酸(T₃)磁微?；瘜W(xué)發(fā)光免疫分析測(cè)定試劑盒及其制備方法。主要由三碘甲腺原氨酸系列校準(zhǔn)品、抗異硫氰酸酯熒光素(FITC)單克隆抗體包被的磁微粒溶液、生物素標(biāo)記的T₃抗原、FITC標(biāo)記的T₃單克隆抗體、堿性磷酸酶標(biāo)記的鏈親和素、化學(xué)發(fā)光底物液以及20倍濃縮洗滌液組成。本發(fā)明采用“競(jìng)爭(zhēng)法”的反應(yīng)模式，有效地利用了化學(xué)發(fā)光技術(shù)結(jié)合磁微粒和生物素-親和素免疫放大技術(shù)原理，定量檢測(cè)人體血清、血漿樣品中T₃的含量，確保了檢測(cè)的靈敏度。本發(fā)明的試劑盒具有簡(jiǎn)便、快速、靈敏、穩(wěn)定等優(yōu)點(diǎn)，為臨床診斷和科研工作提供一種非常有價(jià)值的檢測(cè)手段。
文檔編號(hào)G01N33/74GK101545913SQ200810102670
公開日2009年9月30日 申請(qǐng)日期2008年3月25日 優(yōu)先權(quán)日2008年3月25日
發(fā)明者應(yīng)希堂, 林金明, 梁淑軒, 胡國(guó)茂, 辛天兵, 鄭金來(lái) 申請(qǐng)人:北京科美東雅生物技術(shù)有限公司