專利名稱：：一種檢測還原糖濃度的電化學(xué)方法一種檢測還原糖濃度的電化學(xué)方法所屬領(lǐng)域本發(fā)明涉及一種測定還原性單糖濃度的分析方法。技術(shù)背景還原糖是發(fā)酵、食品領(lǐng)域最基本的工業(yè)原料，還原糖快速、準(zhǔn)確的測定對生產(chǎn)過程控制和食品質(zhì)量檢驗(yàn)具有重要的意義。還原糖的測定方法很多，目前工業(yè)生產(chǎn)中普遍采用的是費(fèi)林試劑滴定法[2]。該方法要求在測定液沸騰狀態(tài)下滴定，操作不便，干擾因素多，人為誤差較大，給生產(chǎn)過程控制和產(chǎn)品質(zhì)量檢驗(yàn)帶來不便。儀器分析方法有液相色譜法、放射測定、氣質(zhì)聯(lián)用、紫外及紅外光譜分析、核磁共振等，由于操作條件要求高，樣品需經(jīng)衍生或其它處理后才能測定，測定時間長，測定和維護(hù)成本較高等原因，不適于大批量杼品的糖類化合物含量檢測，在我國實(shí)際生產(chǎn)和科研領(lǐng)域一般不被采用。分光光度法可用于檢測蜂蜜中的還原糖，但對于渾濁和有不同顏色的樣品實(shí)用性則較差。國家知識產(chǎn)權(quán)局1997年2月12日公開了一項(xiàng)發(fā)明專利申請"電化學(xué)測量方法和儀器"(公開號CN1142867A)該申請釆用薄層電化學(xué)測量裝置，優(yōu)選毛細(xì)填充裝置，進(jìn)行電化學(xué)測定溶液中的還原糖含量，該發(fā)明專利方法所測定的還原糖含量在25mmo1約合0.45%以下并需要制作專用的分析裝置，難以推廣應(yīng)用；2004年5月11日公開的一項(xiàng)發(fā)明專利申請"一種測定還原糖濃度的方法"，該申請方法是將樣品溶液與過量氯化四氮唑藍(lán)在pH為7.5—8.5條件下反應(yīng)，反應(yīng)液經(jīng)脫水、振蕩下加入乙酸乙酯至沉淀物溶解，取上清液測定吸光度得出還原糖含量，該法測定還原糖最高為2.5pig/mL，此方法分析少驟繁多、費(fèi)時長，尤其不適用于大量樣品分析。
發(fā)明內(nèi)容本發(fā)明的目的是提供一種快速、準(zhǔn)確、操作簡便的測定還原糖濃度的方法。本發(fā)明所提供的測定還原糖濃度的方法，包括如下步驟l)將樣品溶液與過量鐵氰化鉀(K3Fe(CN)6)和氫氧化鈉(NaOH)混勻80'C保溫1.0min，2)反應(yīng)液冷卻至室溫后用Ag/AgCl參比電極、玻碳工作電極和Pt片輔助電極構(gòu)成三電極系統(tǒng)，測定還原糖與K3Fe(CN)6反應(yīng)生成的還原產(chǎn)物亞鐵氰化鉀(K4Fe(CN)6)的氧化電流，據(jù)此測得還原糖含量。技術(shù)方案1實(shí)驗(yàn)原理還原糖在堿性溶液中能將鐵氰化鉀(K3Fe(CN)6)還原為亞鐵氰化鉀(K4Fe(CN)6)，以葡萄糖為例，其反應(yīng)式為C6H1206-6K3Fe(CN)6十6KOH=(CHOH)4.(COOH)2+6K4Fe(CN)6+4H20在反應(yīng)中K3Fe(CN)6過量，還原糖含量與生成的K4Fe(CN)6的濃度呈等摩爾關(guān)系，而K4Fe(CN)6是一種電化學(xué)氧化還原活性物質(zhì)，當(dāng)工作電極上加一定正電位，K4Fe(CN)6能夠被氧化牛.成K3Fe(CN)6。由于K4Fe(CN)6的氧化電流與還原糖濃度呈一定摩爾關(guān)系，因此可以根據(jù)測得的K4Fe(CN)6的氧化電流信號計算還原糖的含量。2測定電位的選擇移取lmL5.00mg/mL葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)溶液于20mL具塞刻度試管中，加入K3Fe(CN)6和NaOH溶液，稀釋至20mL。水浴加熱反應(yīng)1.0min，取出冷卻至室溫。將反應(yīng)液置于100mL燒杯中，將Ag/AgCl參比電極、玻碳工作電極和Pt片輔助電極構(gòu)成三電極系統(tǒng)，使用電化學(xué)分析儀的循環(huán)伏安分析程序記錄工作電極在0+0.45V間的循環(huán)伏安曲線，如圖1所示。由于K3Fe(CN)6和K4Fe(CN)6是一對可逆的氧化還原物質(zhì)，所以此圖為溶液中過量的K3Fe(CN)6與反應(yīng)生成的K4Fc(CN)fi共同在玻碳工作電極上反應(yīng)產(chǎn)斗:的循環(huán)伏安圖。從圖上看出K4Fe(CN)6從十0.1VUv.Ag/AgCl)開始被氧化為K3Fe(CN)6，電位為+0.26V時氧化電流達(dá)到峰值。當(dāng)用安培法測定K4Fe(CN)6的氧化電流時，工作電極的檢測電位必須設(shè)定為高于+0.26V的正電位，綜合考慮各項(xiàng)影響因素本研究選擇+0.4V為工作電極的檢測電位。3水浴加熱溫度和反應(yīng)時間選擇目前國家標(biāo)準(zhǔn)中"鐵氰化鉀滴定法"檢測還原糖要求溶液在微沸狀態(tài)下進(jìn)行滴定，而"鐵氰化鉀分光光度法"也需要還原糖與鐵氰化鉀在沸水浴中反應(yīng)20min，對反應(yīng)溫度和時間都有較高的要求。本實(shí)驗(yàn)只需保證還原糖含量與K4Fe(CN)6的氧化電流有良好的線性關(guān)系，不必使反應(yīng)完全進(jìn)行，可以適當(dāng)降低反應(yīng)溫度、縮短反應(yīng)時間。圖2是葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)溶液與K3Fe(CN)6在IO(TC水浴中反應(yīng)不同時間后測得的K4Fe(CN)6的氧化電流Z，可見0.5l.Omin電流大幅增加，l.Omin后電流增大幅度變小。圖3是葡萄糖溶液在不問溫度下反應(yīng)l.Omin所測得的電流，由圖可見6080'C電流增加迅速，在8010(TC電流增加趨緩。通過實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)在不同反應(yīng)溫度和時間條件下，葡萄糖濃度(1.008.00mg/20mL)與K4Fe(CN、的氧化電流均有很好的線性關(guān)系。綜上所述，本專利選擇還原糖與K3Fe(CN)6反應(yīng)的水浴溫度為80°C,時間控制在l.Omin。有益效果l)本發(fā)明較目前與還原糖測定相關(guān)的專利中的測定溫度有較大幅度下降(從100'C沸騰降為8(TC保溫)，使得反應(yīng)更加溫和、易于控制，為采用本專利技術(shù)后續(xù)開發(fā)還原糖分析儀器打下了堅實(shí)的基礎(chǔ)；2)提高了還原糖的分析速度，電極實(shí)際測定時間30秒，加上前處理也不超過4mm尤其適用于大量樣品的分機(jī)；3)本發(fā)明的方法學(xué)研究采用了三種以上的回收率測定樣品，均符合化學(xué)分析要求(上述專利中均只采用了一種回收率測定樣品)，表明本專利方法的抗T擾性能優(yōu)于上述專利；4)本分析方法的線性范圍寬，還原糖濃度40.(Vg/20mL20.0mg/20mL范圍內(nèi)有良好的線性關(guān)系，線性相關(guān)系數(shù)為0.9999;5)方法最低檢出限為2.0(^g/mL，分析靈敏度較高。圖1示玻碳工作電極在待測溶液中的循環(huán)伏安曲線；圖2示K4Fe(CN)6的氧化電流與不同反應(yīng)吋間的關(guān)系，其中葡萄糖溶液濃度3.00mg/20mL;反應(yīng)溫度IOO'C;反應(yīng)時間0.5、1.0、1.5、2.0min;圖3示K4h'e(CN)fi的氧化電流與不同反應(yīng)溫度的關(guān)系，其中葡萄糖溶液濃度3.00mg/20mL;反應(yīng)時間l.Omin;反應(yīng)溫度60、70、80、卯、100。C;圖4示K4Fe(CN)6氧化反應(yīng)的W曲線；圖5示葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)溶液工作曲線。具體實(shí)施方式實(shí)施例1電化學(xué)安培法測定橙汁、馬鈴薯粉、味精發(fā)酵液、糖化液中還原糖含量1儀器與試劑CHI614c電化學(xué)分析儀(上海辰華儀器公司)，HH-S恒溫水浴鍋(江蘇國勝實(shí)驗(yàn)儀器廠)，電化學(xué)三電極體系由Ag/AgCl參比電極(lmol/LKCl)、玻碳工作電極(直徑4mm)和Pt片輔助電極組成。5.00mg/mL葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)溶液，4.00%K3Fe(CN)6溶液，10.0。/。NaOH溶液，所用試劑均為分析純。2樣品溶液的配制橙汁樣液取10.0mL橙汁飲料(市售某品牌)至50mL容量瓶，加蒸餾水定容。配制成稀釋5倍的橙汁待測液。馬鈴薯粉待測樣液稱取某廠家的馬鈴薯全粉2.00g于10mL水中，攪拌溶解30min，離心后取上清液。發(fā)酵液取5.00mL山東濟(jì)寧市菱花集團(tuán)味精發(fā)酵液上清液至10mL容量瓶，加蒸餾水定容。配制成稀釋2倍的發(fā)酵液待測液。糖化液將山東魯洲集團(tuán)提供的7份糖化液(1#7#)離心后取上清液，分別按照1:15、1:15、1:20、1:20、1:20、1:30、l:40的比例稀釋，配制成待測液。3葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)溶液工作曲線的繪制分別取O、0.2、0.5、1、2、3、4mL5.00mg/mL葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)溶液于20mL具塞刻度試管中，加入8mL4.00%K3Fe(CN)6和2.5mL10.0%NaOH溶液，用蒸餾水稀釋至20mL，混勻。將試管置于80'C水浴中反應(yīng)1.0min，取出冷卻至室溫。將反應(yīng)液分別倒入100mL燒杯中，進(jìn)行電化學(xué)安培法檢測。將Ag/AgCl參比電極、玻碳工作電極和Pt片輔助電極置于盛有待測液的燒杯中，分別與CHI614c電化學(xué)分析儀對應(yīng)的電極夾相連。選擇儀器軟件中的安培技術(shù)進(jìn)行檢測，恒定工作電極電位0.4V，記錄K4Fe(CN)6被氧化的電流-時間曲線，如圖4所示。取30s時的穩(wěn)定電流/，繪制電流-葡萄糖濃度(!'-C)工作曲線。4樣品的測定分別取lmL配制好的橙汁、發(fā)酵液、糖化液和馬鈴薯粉待測樣液于20mL具塞刻度試管中，以下操作同標(biāo)準(zhǔn)工作曲線的繪制。將W曲線中30s時的穩(wěn)定電流/數(shù)值代入工作曲線，從而計算出待測樣液中還原糖的百分含量(以葡萄糖計)。5線性范圍及最低檢出限圖5是由020.0mg/20mL葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)溶液繪制的標(biāo)準(zhǔn)工作曲線，線性回歸方程為,=1.1641+4.388C。！'為K4Fe(CN)6的穩(wěn)定氧化電流(pA)，C為還原糖濃度(mg/20mL)，相關(guān)系數(shù)r=0.9999。可見此體系還原糖濃度在40.0ng/20mL20.0mg/20mL范圍內(nèi)，與IQFe(CN)6的氧化電流之間有良好的線性關(guān)系。該方法的最低檢出限為2.00pg/mL。6精密度試驗(yàn)取5.00mg/mL葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)溶液LOmL連續(xù)測定7次，方法同"樣品的測定"，由所測得的K4Fe(CN)6氧化電流Z計算出對應(yīng)的葡萄糖濃度，結(jié)果見表1表1精密度試驗(yàn)(n=9)<table>tableseeoriginaldocumentpage6</column></row><table>由上表計算得相對標(biāo)準(zhǔn)偏差(RSD)為0.841%,可見此方法的精密度良好。7樣品的測定及加樣回收試驗(yàn)按照"樣品的測定"方法檢測四種待測杼，并在被測樣品中加入己知含量的葡萄糖溶液，進(jìn)行不同樣品的回收試驗(yàn)，結(jié)果見表2。表2加樣回收試驗(yàn)(n=3)<table>tableseeoriginaldocumentpage6</column></row><table>*:三次測定結(jié)果的均值結(jié)果表明，該檢測方法測定不同類型樣品的回收率在98.0102.0%之間，說明此種分析方法抗干擾性能良好，能滿足測定不同類型樣品的需要。8對比測定試驗(yàn)對按照"樣品溶液的配制"方法配制的山東魯洲集團(tuán)提供的1#7#糖化液的稀釋待測液進(jìn)行電化學(xué)安培法測定，同時用常規(guī)斐林氏法進(jìn)行對比，結(jié)果見表3。表3對比試驗(yàn)測定結(jié)果mg/20mL(n=3)<table>tableseeoriginaldocumentpage7</column></row><table>t檢驗(yàn)，P>0.05表明兩種分析方法無顯著差異。權(quán)利要求1.一種測定還原糖濃度的方法，包括如下步驟1)將樣品溶液與過量鐵氰化鉀(K3Fe(CN)6)與氫氧化鉀(KOH)溶液混勻后在80℃水浴中反應(yīng)1min；2)反應(yīng)液經(jīng)冷卻后置燒杯中，用Ag/AgCL參比電極、玻碳工作電極和Pt片輔助電極構(gòu)成的三電極系統(tǒng)進(jìn)行測定。2.根據(jù)權(quán)利要求l所述方法，其特征在于步驟l)所述是將反應(yīng)液加熱至80。C反應(yīng)1.Omin:。3.根據(jù)權(quán)利要求l所述方法，其特征在于步驟2)所述反應(yīng)液應(yīng)冷卻至室溫再進(jìn)行測定。4.根據(jù)權(quán)利要求13所述方法，其特征在于步驟2)所述三電極測定系統(tǒng)中工作電極的檢測電位設(shè)定為+O.45V。全文摘要本發(fā)明涉及一種測定還原糖濃度的電化學(xué)分析方法，屬生物電化學(xué)領(lǐng)域，具體方法是將樣品溶液與鐵氰化鉀與氫氧化鉀溶液在80℃水浴中反應(yīng)1min，反應(yīng)液經(jīng)冷卻后用電化學(xué)安培法檢測。本發(fā)明方法操作簡便、反應(yīng)條件溫和易于控制、分析靈敏度高、分析速度快、抗干擾能力強(qiáng)，可廣泛應(yīng)用于各種樣品中還原糖的測定。文檔編號G01N27/416GK101231261SQ20081001417公開日2008年7月30日申請日期2008年2月20日優(yōu)先權(quán)日2008年2月20日發(fā)明者史建國,孫士青,孟慶軍,張利群,李雪梅,艷楊,楊俊慧,王丙蓮,趙曉華,馬耀宏申請人:山東省科學(xué)院生物研究所