專利名稱：：Ob折疊結(jié)構(gòu)域的制作方法OB折疊結(jié)構(gòu)域?qū)ο嚓P(guān)申請的交叉引用本申請要求2006年5月26日提交的名稱為"OB折疊結(jié)構(gòu)域"的美國臨時專利申請No.60/809,105的優(yōu)先權(quán)，該申請通過引用整體并入本文。
背景技術(shù)：
：分子識別對生物過程來說是重要的，所述生物過程從高親和性的蛋白質(zhì)-配體相互作用到信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑中更為瞬時的蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì)識別事件。此類事件依賴于隨著生物體進化而被改造為新作用的蛋白質(zhì)的多功能性(versatility)。舉例來說，為捕獲外來抗原，來自免疫系統(tǒng)幼稚(nalive)文庫(其含有大約107的變體)(1)的少量抗體識別抗原，并以中等親和性與其結(jié)合。然后選擇和成熟進一步引入突變，產(chǎn)生了清除抗原所需的緊密的、高度特異性的結(jié)合。以這種方式，可將結(jié)合模式的交錯(staggering)陣列移植到基礎(chǔ)抗體支架(scaffold)上，以隔離從小分子至整個細胞不等的靶標。該策略可在實驗室中復(fù)制，以產(chǎn)生非常大的抗體變體文庫(>l(T個不同克隆)(2,3),然后可針對與特定靶標的結(jié)合對所述文庫加以選擇。然后，擴增重復(fù)循環(huán)和針對結(jié)合進行的選擇可以"發(fā)現(xiàn)"具有緊密和特異性的分子結(jié)合特性的試管抗體(testtubeantibody)。這種體外手段還可用于其它支架。例如，通過噬菌體展示的隨機化和選擇已被用于研究和改善生長激素和生長因子調(diào)蛋白與其各自的受體的結(jié)合(4，5)，已經(jīng)從來自葡萄球菌A蛋白的三螺旋束(bundle)結(jié)構(gòu)域的文庫開發(fā)了"親和體(affibodies)"(6,7)。這種常見的區(qū)域已經(jīng)成為若干綜述的主題(8-10)。OB-折疊結(jié)構(gòu)域是發(fā)現(xiàn)于多種蛋白質(zhì)中的通常較小的結(jié)構(gòu)基序，它們最初因為其寡核苷^/寡糖結(jié)合性質(zhì)而得名。OB-折疊結(jié)構(gòu)域是五鏈封閉()桶，OB-折疊結(jié)構(gòu)域蛋白質(zhì)的大部分都是用同一面來進行配體結(jié)合或者作為活性位點。不同的OB-折疊結(jié)構(gòu)域使用該"折疊相關(guān)結(jié)合面"來結(jié)合寡糖、寡核苷酸、蛋白質(zhì)金屬離子和催化底物。在例如Arcus，Cwr.巻12:794-801(2002)和Theobald,一5/o附o/.巻，32:115-33(2003)中對OB-折疊結(jié)構(gòu)域進行了描述。加拿大專利公開文獻No.2,378,871描述了具有結(jié)合性質(zhì)的卩-折疊片蛋白質(zhì)。本文提到的所有專利、專利申請、專利申請公開文件、科學(xué)出版物和其它出版物都通過引用整體并入本文。
發(fā)明內(nèi)容本發(fā)明提供了具有想要的性質(zhì)的經(jīng)修飾的OB-折疊結(jié)構(gòu)域以及產(chǎn)生經(jīng)修飾的OB-折疊結(jié)構(gòu)域的文庫的方法。本發(fā)明還提供了通過此類方法產(chǎn)生的經(jīng)修飾OB-折疊結(jié)構(gòu)域的文庫以及針對想要的生物學(xué)活性對此類經(jīng)修飾OB-折疊結(jié)構(gòu)域的文庫加以篩選的方法。此外，本發(fā)明提供了從此類文庫鑒定的經(jīng)修飾的OB-折疊結(jié)構(gòu)域。本發(fā)明還提供了可從耐超高溫?zé)岚艟?i>ra^icw/Mmflera/j/7"/)獲得的、展示出經(jīng)修飾的結(jié)合相互作用的、經(jīng)4奮飾的OB-折疊結(jié)構(gòu)域。較之天然存在的OB-折疊結(jié)構(gòu)域，經(jīng)修飾的OB-折疊結(jié)構(gòu)域可與相同的底物結(jié)合，或者，較之天然存在的OB-折疊結(jié)構(gòu)域，經(jīng)修飾的OB-折疊結(jié)構(gòu)域可與不同的底物結(jié)合，或者，較之天然存在的OB-折疊結(jié)構(gòu)域，經(jīng)修飾的OB-折疊結(jié)構(gòu)域可與相同的底物和不同的底物結(jié)合。備選地，可制備這樣的經(jīng)修飾的OB-折疊結(jié)構(gòu)域，其中，沒有已知底物能與天然存在的OB-折疊結(jié)構(gòu)域結(jié)合，而經(jīng)j奮飾的OB-折疊結(jié)構(gòu)域能與底物結(jié)合。因此，在一個方面，本發(fā)明是經(jīng)分離的經(jīng)修飾OB-折疊結(jié)構(gòu)域，其可從天然存在的OB-折疊結(jié)構(gòu)域獲得，其中，經(jīng)修飾的OB-折疊結(jié)構(gòu)域包含a)較之天然存在的OB-折疊結(jié)構(gòu)域，在OB-折疊結(jié)構(gòu)域結(jié)合面的p-鏈中的至少一個經(jīng)修飾的氨基酸殘基，或b)在OB-折疊結(jié)構(gòu)域結(jié)合面的|3-鏈中的至少一個經(jīng)修飾的氨基酸殘基和在OB-折疊結(jié)構(gòu)域環(huán)區(qū)域的鏈中的至少一個經(jīng)修飾的氨基酸殘基，或c)在OB-折疊結(jié)構(gòu)域環(huán)區(qū)域的鏈中的至少一個經(jīng)修飾的氨基酸殘基，并且，其中，所述經(jīng)修飾的OB-折疊結(jié)構(gòu)域較之天然存在的OB-折疊結(jié)構(gòu)域而言具有改變的結(jié)合特性。在其中天然存在的OB-折疊結(jié)構(gòu)域的結(jié)合伴侶(bindingpartner)已知的一種實施方式中，本發(fā)明是這樣的經(jīng)修飾OB-折疊結(jié)構(gòu)域，其中，所述結(jié)構(gòu)域特異性地與較天然存在的OB-折疊結(jié)構(gòu)域不同的結(jié)合伴侶結(jié)合，或者與其天然存在的結(jié)合伴侶具有經(jīng)修飾的結(jié)合。在另一實施方式中，經(jīng)修飾的結(jié)合包含較之相應(yīng)的天然存在的OB-折疊結(jié)構(gòu)域而言，經(jīng)修飾的OB-折疊結(jié)構(gòu)域與其天然存在的結(jié)合伴倡的解離常數(shù)降低至少大約25%，大約50°/?；蛘叽蠹s75%。在另一實施方式中，經(jīng)修飾的結(jié)合包含較^目應(yīng)的天然存在的OB-折疊結(jié)構(gòu)域而言，經(jīng)修飾的OB-折疊結(jié)構(gòu)域與其天然存在的結(jié)合伴侶的解離常數(shù)以至少大約2、大約3、大約4、大約5、大約6、大約8、大約IO、大約15、大約20、大約25、大約50、大約100、大約200、大約500、大約1000、大約5000、大約IO，OOO、大約50,000或者大約IOO，OOO的因子減少。在另一實施方式中，本發(fā)明是這樣的經(jīng)修飾的OB-折疊結(jié)構(gòu)域，其中，天然存在的OB-折疊結(jié)構(gòu)域存在于蛋白質(zhì)或蛋白質(zhì)類中，其選自葡萄球菌核酸酶蛋白質(zhì)、細菌腸毒素、TIMP樣蛋白質(zhì)、血紅素分子伴侶CcmE蛋白質(zhì)、尾部-相關(guān)溶菌酶gp5、N末端結(jié)構(gòu)域蛋白質(zhì)、核酸結(jié)合蛋白質(zhì)、無機焦磷酸酶、Mop樣蛋白質(zhì)、CheW樣蛋白質(zhì)、tRNA—抗(OB-折疊核酸結(jié)合結(jié)構(gòu)域)、Tdo—結(jié)合(端粒-結(jié)合蛋白a亞基，中央結(jié)構(gòu)域)、SSB(單鏈結(jié)合蛋白質(zhì)家族OB-折疊結(jié)構(gòu)域)、DIJF338OB-折疊結(jié)構(gòu)域；DNA—連接酶—aden(NAD依賴性DNA連接酶OB-折疊結(jié)構(gòu)域)、Stap-Strp-毒素(葡萄球菌/鏈球菌毒素、OB-折疊結(jié)構(gòu)域)、EIF-5a(真核起始因子5A羥丁賴氨酸，DNA結(jié)合OB-折疊結(jié)構(gòu)域)、GP5—OB(GP5N末端OB-折疊結(jié)構(gòu)域)、CSD、DNA—連接酶—OB、DUF388、EFP、eIF-la、mRNA—cap—C、OB—RNB、噬菌體—DNA—結(jié)合(Phage—DNA—bind)、Rep-A—N、Rho—RNA—結(jié)合(Rho—RNA—bind)、核糖體—L2、核糖體S12;核^唐體—S17、RNA_pol—Rpb8、RuvAN、Sl、TOBE、TOBE—2和tRNA—8結(jié)合(tRNA—bind)。在另一實施方式中，本發(fā)明是這樣的經(jīng)修飾的OB-折疊結(jié)構(gòu)域，其中，天然存在的OB-折疊結(jié)構(gòu)域來自嗜熱生物。在又一實施方式中，本發(fā)明是這樣的經(jīng)修飾的OB-折疊結(jié)構(gòu)域，其中，所述嗜熱生物是耐超高溫?zé)岚艟Ｔ诹硪粚嵤┓绞街?，本發(fā)明是這樣的經(jīng)修飾的OB-折疊結(jié)構(gòu)域，其中，所述經(jīng)修飾的氨基酸殘基在結(jié)合面的p-鏈中。經(jīng)《f飾的OB-折疊結(jié)構(gòu)域的結(jié)合伴侶可選自核酸、寡糖、蛋白質(zhì)、激素和小有機分子。在另一方面，本發(fā)明是獲得經(jīng)修飾的OB-折疊結(jié)構(gòu)域的方法，所述方法包括a)獲得編碼天然存在的OB-折疊結(jié)構(gòu)域或者編碼包含結(jié)合面的鏈和/或環(huán)的鏈的其部分的核酸，以及b)改變所述核酸，使得其編碼較之天然存在的OB-折疊結(jié)構(gòu)域而言，在結(jié)合面的p-鏈上的至少一個經(jīng)修飾的氨基酸殘基和/或在環(huán)的鏈上的至少一個經(jīng)修飾的氨基酸殘基，其中，獲得經(jīng)修飾的OB-折疊結(jié)構(gòu)域，并且，其中，經(jīng)修飾的OB-折疊結(jié)構(gòu)域較之天然存在的OB-折疊結(jié)構(gòu)域，具有改變的結(jié)合。在其中天然存在的OB-折疊結(jié)構(gòu)域的結(jié)合伴侶已知的另一實施方式中，經(jīng)修飾的結(jié)合包含較^目應(yīng)的天然存在的OB-折疊結(jié)構(gòu)域而言，經(jīng)修飾的OB-折疊結(jié)構(gòu)域與其天然存在的結(jié)合伴侶的解離常數(shù)降低了至少大約25%,大約50%或者大約75%。在另一實施方式中，經(jīng)修飾的結(jié)合包含較^目應(yīng)的天然存在的OB-折疊結(jié)構(gòu)域而言，經(jīng)《奮飾的OB-折疊結(jié)構(gòu)域與其天然存在的結(jié)合伴侶的解離常數(shù)以至少大約2、大約3、大約4、大約5、大約6、大約8、大約10、大約15、大約20、大約25、大約50、大約100、大約200、大約500、大約1000、大約5000、大約10,000、大約50,000或者大約100，000的因子減少。在一種實施方式中，所述方法還包括改變編碼經(jīng)修飾的OB-折疊結(jié)構(gòu)域的核酸，和/或改變編碼包含經(jīng)修飾的OB-折疊結(jié)構(gòu)域的蛋白質(zhì)的至少一個氨基酸的核酸。在另一方面，本發(fā)明提供了產(chǎn)生用于展示的經(jīng)修飾的OB-折疊結(jié)構(gòu)域蛋白質(zhì)的文庫的方法，所述方法包括a)獲得編碼OB-折疊結(jié)構(gòu)域或其部分的核酸，以及b)對核酸進行隨機改變，由此產(chǎn)生編碼經(jīng)修飾的OB-折合，所述經(jīng)修飾的OB-折疊結(jié)構(gòu)域具有至少一個隨機化的氨基酸殘基。在一種實施方式中，本發(fā)明提供了產(chǎn)生用于展示的經(jīng)修飾的OB-折疊結(jié)構(gòu)域蛋白質(zhì)的文庫的方法，其中，所述核酸編碼OB-折疊結(jié)構(gòu)域結(jié)合面的鏈和/或OB-折疊結(jié)構(gòu)域環(huán)的鏈的至少一個氛基酸殘基。在另一實施方式中，所述方法還包括將編碼經(jīng)修飾的OB-折疊結(jié)構(gòu)域的經(jīng)改變的核酸的文庫放進能在其表面展示所述經(jīng)修飾的OB-折疊結(jié)構(gòu)域的宿主細胞或病毒顆粒的群中。在另一方面，本發(fā)明提供了經(jīng)分離的核酸，其編碼可從天然存在的OB-折疊結(jié)構(gòu)域獲得的經(jīng)修飾的OB-折疊結(jié)構(gòu)域，其中，所述經(jīng)修飾的OB-折疊結(jié)構(gòu)域包含a)較之天然存在的OB-折疊結(jié)構(gòu)域而言位于OB-折疊結(jié)構(gòu)域結(jié)合面的(3-鏈中的至少一個經(jīng)修飾的氨基酸殘基，或b)位于OB-折疊結(jié)構(gòu)域結(jié)合面的p-鏈中的至少一個經(jīng)修飾的氨基酸殘基和位于OB-折疊結(jié)構(gòu)域環(huán)區(qū)域的鏈中的至少一個經(jīng)修飾的氨基酸殘基，或c)位于OB-折疊結(jié)構(gòu)域環(huán)區(qū)域的鏈中的至少一個經(jīng)修飾的氨基酸殘基，并且，其中，所述經(jīng)修飾的OB-折疊結(jié)構(gòu)域較之天然存在的OB-折疊結(jié)構(gòu)域而言具有改變的結(jié)合特性。在其中天然存在的OB-折疊結(jié)構(gòu)域的結(jié)合伴侶已知的另一實施方式中，改變的結(jié)合特性包含較之相應(yīng)的天然存在的OB-折疊結(jié)構(gòu)域而言，經(jīng)修飾的OB-折疊結(jié)構(gòu)域與其天然存在的結(jié)合伴侶的解離常數(shù)降4氐了至少大約25%，大約50。/?；蛘叽蠹s75%。在另一實施方式中，改變的結(jié)合特性包含較^目應(yīng)的天然存在的OB-折疊結(jié)構(gòu)域而言，經(jīng)修飾的OB-折疊結(jié)構(gòu)域與其天然存在的結(jié)合伴侶的解離常數(shù)以至少大約2、大約3、大約4、大約5、大約6、大約8、大約10、大約15、大約20、大約25、大約50、大約100、大約200、大約500、大約1000、大約5000、大約10,000、大約50,000或者大約100,000的因子減少。在另一方面，本發(fā)明提供了包含下述核酸的宿主細胞或病毒顆粒，所述核酸編碼上文所述的經(jīng)修飾的OB-折疊結(jié)構(gòu)域的核酸。在又一方面，本發(fā)明提供了包含下述核酸的組合物，所述核酸編碼上文所述的經(jīng)修飾的OB-折疊結(jié)構(gòu)域的核酸。10在另一方面中，本發(fā)明提供了針對與結(jié)兮伴侶的結(jié)合對經(jīng)修飾OB-折疊結(jié)構(gòu)域的文庫加以篩選的方法，所述方法包括a)獲得在其表面展示經(jīng)修飾的OB-折疊結(jié)構(gòu)域的文庫的宿主細胞或病毒顆粒的群；b)將所述宿主細胞或病毒顆粒的群與結(jié)合伴侶在適于結(jié)合伴侶與經(jīng)修飾的OB-折疊結(jié)構(gòu)域結(jié)合的條件下接觸；以及c)確定結(jié)合伴侶與經(jīng)修飾的OB-折疊結(jié)構(gòu)域的結(jié)合。在一種實施方式中，宿主細胞或病毒顆粒是在其表面展示經(jīng)修飾的OB-折疊結(jié)構(gòu)域的噬菌體。在另一方面，本發(fā)明提供了經(jīng)修飾的OB-折疊結(jié)構(gòu)域的噬菌體文庫，其中，所述經(jīng)修飾的OB-折疊結(jié)構(gòu)域可從耐超高溫?zé)岚艟@得。在另一方面，本發(fā)明提供了在細胞或病毒顆粒表面展示的經(jīng)修飾的OB-折疊結(jié)構(gòu)域。在一種實施方式中，所述細胞或病毒顆粒是噬菌體、細菌或酵母。在另一方面，本發(fā)明提供了與固體支持物相連的經(jīng)修飾的OB-折疊結(jié)構(gòu)域。在一種實施方式中，所述支持物選自珠子(bead)、玻璃、玻片、芯片和明膠。在另一方面，本發(fā)明提供了具有附件II中列出的且名為Ul、U2、U3、U4、U5、U6、U7、U8、U9、S68、S81、pMB16、pMB17、pMB12、pMB18、pMB15、D05、D07、D09、D04、L14、L8、L4、L16、L34、L42、L6、L5或L44的序列的經(jīng)修飾的OB-折疊結(jié)構(gòu)域蛋白質(zhì)。在另一方面，本發(fā)明提供了與附件II中列出的且名為Ul、U2、U3、U4、U5、U6、U7、U8、U9、S68、S81、pMB16、pMB17、pMB12、pMB18、pMB15、D05、D07、D09、D04、L14、L8、L4、L16、L34、L42、L6、L5或L44的序列具有大約90%、大約95%、大約98%或大約99%的序列同源性的蛋白質(zhì)。在另一方面，本發(fā)明提供了與附件II中列出的且名為Ul、U2、U3、U4、U5、U6、U7、U8、U9、S68、S81、pMB16、pMB17、pMB12、pMB18、pMB15、簡、D07、D09、D04、L14、L8、L4、L16、L34、L42、L6、L5或L44的序列具有大約卯％、大約95%、大約98%或大約99%的序列同一性的蛋白質(zhì)。在上述所有方面，蛋白質(zhì)可以是經(jīng)分離的、經(jīng)純化的或者經(jīng)分離和純化的。在另一方面，本發(fā)明提供了下述核酸，其編碼附件II中列出的且名為Ul、U2、U3、U4、U5、U6、U7、U8、U9、S68、S81、pMB16、pMB17、pMB12、pMB18、pMB15、D05、D07、D09、D04、L14、L8、L4、L16、L34、L42、L6、L5或L44的序列所示的蛋白質(zhì)。在另一方面，本發(fā)明提供了下述核酸，其編碼與附件II中列出的且名為Ul、U2、U3、U4、U5、U6、U7、U8、U9、S68、S81、pMB16、pMB17、pMB12、pMB18、pMB15、D05、D07、D09、D04、L14、L8、L4、L16、L34、L42、L6、L5或L44的序列具有大約卯％、大約95%、大約98%或大約99%的序列同源性的蛋白質(zhì)。在另一方面，本發(fā)明提供了下述核酸，其編碼與附件II中列出的且名為U1、U2、U3、U4、U5、U6、U7、U8、U9、S68、S81、pMB16、pMB17、pMB12、pMB18、pMB15、D05、D07、D09、D04、L14、L8、L4、L16、L34、L42、L6、L5或L44的序列具有大約90%、大約95%、大約98%或大約99。/。的序列同一性的蛋白質(zhì)。在上述所有方面，核酸可以是經(jīng)分離的、經(jīng)純化的或者經(jīng)分離和純化的。附圖簡述圖1A-1C示出了來自鏈球菌超抗原SMEZ-2的OB-折疊結(jié)構(gòu)域(25)。圖1A展示了凹結(jié)合面。圖1B是沿著N和C末端標示出的具有P片層和環(huán)的示意結(jié)構(gòu)。()2、和b5是被打斷的()-鏈，它們在其組分間具有凸起或環(huán)。圖1C是該蛋白質(zhì)的相應(yīng)的拓樸圖(24)。殘基以圓圈表示，氬鍵以虛線表示。環(huán)被標示出，并且示出了剪切數(shù)S。圖2A-2B提供了用于aspRS-OB的文庫構(gòu)建的寡核苷酸的綜述。圖2A示出了aspRS-OB的二級結(jié)構(gòu)元件，如寡核苷酸上面的框所示。箭頭和下面的數(shù)字表示所用的引物。交叉字符表示隨機化的密碼子。片段l-4在第二個PCR步驟中被裝配起來。在該圖中示出了13mRL文庫的裝配(還見表4)。圖2B示出了對用于IF5A-OB的文庫構(gòu)建的寡核苷酸的總覽。針對llm、9m、2RL和2RL+2文庫，不同文庫的裝配以三種獨立方式進行。符號如圖2A所示。圖3展示了來自耐超高溫?zé)岚艟钠鹗家蜃覫F-5A(1BKB，(34))。IF-5A的該示意性連續(xù)剖面圖示出了C末端處的OB折疊，其通過接頭與N-末端結(jié)構(gòu)域分開。p-鏈和a-螺旋分別以箭頭和螺旋條帶表示。p-鏈1-3形成了提出的OB折疊的單鏈DNA結(jié)合面。圖4展示了大腸桿菌(￡.asp-tRNA合成酶的晶體結(jié)構(gòu)(1C0A，(37))。該示意性連續(xù)剖面圖示出了aspRS的結(jié)構(gòu)，其中示出了OB-折疊和C-末端酶結(jié)構(gòu)域之間的關(guān)系。p-鏈和a-螺旋分別以箭頭和螺旋條帶表示。示出了結(jié)合面(36)，其包含p-鏈l-3和位于p-鏈4和5之間的環(huán)4/5。圖5A-5C示出了對來自不同物種的aspRSOB折疊結(jié)構(gòu)域的序列比對。圖5A示出了OB折疊的二級結(jié)構(gòu)(示于序列下面)，p-鏈被標示出。具有箭頭的殘基是結(jié)合面上的保守殘基，它們已在一些文庫中被隨機化。應(yīng)當注意人和酵母序列具有長N-末端，在每種情況下都不從殘基l起始。右邊的數(shù)字表示每個蛋白質(zhì)中的JL&酸位置。圖5B示出了對來自不同物種的IF-5AOB折疊結(jié)構(gòu)域的序列比對。圖5C示出了對來自耐超高溫?zé)岚艟?Pflfco/;/M7M附)(P.a.)、i^rotwc"sA^flA^/wm^/y(P.kodak.)和大腸桿菌(0/Z)(E.coli)的aspRS-OB的序列比對。序列同一性由星號表示。OB-折疊的二級結(jié)構(gòu)在序列下面示出1=鏈4和5之間的環(huán)，環(huán)4/5。圖6是用于aspRS-OB及衍生物的噬菌體展示的pRPSP2的示意圖。示出了噬菌體休克啟動子(psp)、pelB前導(dǎo)序列、克隆位點(其含有iVco//AW/限制性位點)、用于Western分析的c-myc標簽以及編碼pIII蛋白質(zhì)的gIII基因。噬菌體展示的融合蛋白質(zhì)由插入進克隆位點的基因的基因產(chǎn)物、c-myc才示簽和pill蛋白質(zhì)構(gòu)成。pRPSP2還含有(5-內(nèi)酰胺酶基因，用于在氨千青霉素上進行選擇(圖6中未示出)。圖7是對噬菌體展示的aspRS-OB的Western分析。左道(無插入)僅代表pIII的情況，因為空載體pRPSP2被用于制備TDP;中間的道示出了在VCSM13上展示的與PIII融合的aspRS-OB;右道示出了在gIII缺失噬菌體Vd3上的aspRS-OB。在存在SDS和BME時，煮沸1011TDPs,通過10%SDS-PAGE進行分離，接著轉(zhuǎn)移到0.45um硝化纖維素膜上。使用小鼠抗c-myc抗體和HRP綴合的兔抗小鼠抗體來進行檢測。圖8示出了用展示aspRS-OB的TDP和野生型VCS-M13虔菌體進《亍的假(mock)噬菌體實驗，以通過與asp-tRNA的結(jié)合示出對來自aspRS的野生型OB折疊的功能性展示。將被固定的tRNA與VCS-M13(野生型噬菌體，無展示)和展示aspRS-OB的TDP—起孵育。VCS-M13:TDP之比>1000:1。洗滌之后，通過用RNaseA進行RNA消化來洗脫結(jié)合的顆粒。針對每種VCS-M13和TDP以及針對僅珠子的情況或被固定的tRNA的情況，通過除以輸出和輸入來計算回收因子。輸入和輸出數(shù)據(jù)見表6。圖9是從對asp-tRNA上的文庫RL(黑圏、實線)和asp-tRNA(黑圏、點線)或溶菌酶(白圈、虛線)上的文庫13mRL進行的第一輪至第六輪的選擇得到的噬菌體的富集(作為-log(輸出噬菌體/輸入噬菌體))。圖10是對在asp-tRNA上選擇的來自O(shè)BRL的選出克隆進行的序列分析的概覽。12個克隆中，IO個在第一位含有R或K，7個在第2位含有G,8個在第3位含有C，6個在第4位含有R。共有序列被認為是R/KGCR。圖11示出了通過單克隆噬菌體結(jié)合實驗對選出的克隆與asp-tRNA的結(jié)合的分析。生物素化的asp-tRNA被固定到包被有鏈親和素的磁珠上，與單克隆噬菌體樣品一起孵育。通過RNA消化特異性地洗脫RNA結(jié)合的顆粒，通過細菌感染對所述顆粒加以計數(shù)。Y軸示出了回收因子，這是用輸入噬菌體、僅來自珠子時的輸出噬菌體以及來自tRNA的洗脫噬菌體的數(shù)量來計算的。實驗一式兩份重復(fù)進行，誤差條代^i標準偏差。pIII:沒有融合；OB3wt=野生型aspRS-OB;D07、D09是asp-tRNA上選擇的來自13mRL的突變體；16、17是在asp-tRNA上選擇的來自aspRS-OBRL的突變體pMB16和pMB17;L6和L33是在溶菌酶上選擇的來自13mRL的突變體。圖12是對選擇前后的來自aspRS-OB文庫的序列的概覽。A.選擇前，14Ul-U6源自13mRL文庫，U8、U9來自RL文庫。B.來自13mRL的可溶未選擇突變體。C.在asp-tRNA上選擇的來自RL的突變體。D.在asp-tRNA上選擇的來自13mRL的突變體。E.在溶菌酶上選擇的突變體13mRL。asp-OB野生型序列在頂端給出，并且給出了殘基數(shù)和定位。圖13示出了針對溶菌酶的結(jié)合物的微篩(micropanning)預(yù)篩選。用溶菌酶(黑條帶)或BSA(白條帶)包被96孔板，將其與來自6輪選擇后檢出的克隆的單克隆噬菌體樣品一起孵育。洗脫結(jié)合的噬菌體，通過細菌感染進行計數(shù)。Y-軸上的數(shù)字表示回收的噬菌體數(shù)，x軸上示出了克隆數(shù)，pIII表示沒有融合(空載體)，OBwt表示展示的野生型aspRS-OB。圖14示出了通過ELISA對選出的克隆與溶菌酶的結(jié)合的分析。BSA(白)、RNaseA(陰影)和雌鳥卵白溶菌酶(heneggwhitelysozyme)(黑)被固定，并與單克隆噬菌體樣品一起孵育。通過小鼠抗M13—抗和HRP綴合的抗小鼠二抗來檢測結(jié)合的顆粒。實驗一式兩份進行，誤差條代表士標準偏差。pill:沒有展示融合，OBwt，野生型aspRS-OB折疊。圖15A-15B示出了用在溶菌酶上選擇的經(jīng)純化aspRS-OB突變體進行的下拉(pulldown)測定。圖15A:突變體作為GST-融合物被固定于谷胱甘肽珠上，并與溶菌酶一起孵育。洗滌之后，在SDS-PAGE上對珠子加以分析。道l:13mRL81(未選擇的突變體，陰性對照)，2:L5，3:L16,4:L4(L18)，5:L8(L21)，6:僅珠子(雙陰性對照)。圖15B:L6(道l中的可溶級分)被固定，并按照與上文相同的方式與溶菌酶一起將育。加載珠子，用TBS(道2)、TBS-T(道3)，TBS-T500mMNaCl(道4)洗涂之后在凝膠上加以分析。圖16示出了使用表面等離振子共振來測定選擇的OB-折疊結(jié)構(gòu)域L6與溶菌酶間結(jié)合的Irf的結(jié)合曲線。從該實驗計算的&為3.6xlO—5M。圖17示出了OBody-溶菌酶復(fù)合體的結(jié)構(gòu)。OBody以草圖示出(左邊)，其顯示了二級結(jié)構(gòu)元件。溶菌酶以草圖示出(右邊)。Arg39(來自O(shè)Body)顯示為棍并且指向溶菌酶活性位點。該殘基與溶菌酶的活性位點酸性殘基-Glu35和Asp52形成了氫鍵(見圖20)。15圖18示出了針對OBody-溶菌酶復(fù)合體的蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì)界面處的氬鍵相互作用的例子。殘基作為棍狀示出，并且被標示出(D36和Y37來自O(shè)body;W63、D101和N103來自'溶菌酶)。氪鍵作為點線示出。注意，D36至W63的H鍵在D36的主鏈羰基和W63的NH基團之間。圖19示出了OBodyL8成為溶菌酶抑制劑的潛能。E35和D52是針對溶菌酶的活性位點催化殘基，H60來自溶菌酶的天然抑制劑。His60制造了與溶菌酶Ghi35之間的氬鍵，由此抑制了該酶。來自O(shè)Body的R39以相似方式與E35和D52都形成氫鍵。OBody的主鏈和溶菌酶的天然抑制劑作為C-a痕跡示出。為清楚計，針對溶菌酶的C-a痕跡凈皮省略。序列表簡述<table>tableseeoriginaldocumentpage17</column></row><table>26.L4227,L628.29.L4430.寡聚體00531.寡聚體00632.寡聚體Oll33.寡聚體01234.寡聚體05035.寡聚體05436.寡聚體05537.寡聚體05638.寡聚體05739.寡聚體058-40.寡聚體05941.寡聚體06042.寡聚體06143.寡聚體06244.寡聚體06845.寡聚體02846.寡聚體02947,寡聚體03248.寡聚體03349.寡聚體03450,寡聚體03551.寡聚體07452.寡聚體07653.寡聚體07854.寡聚體0891855.寡聚體05156.寡聚體05257.寡聚體05358.寡聚體01859.寡聚體01960.寡聚體03061.寡聚體03162.寡聚體07363.寡聚體075發(fā)明詳述發(fā)明人發(fā)現(xiàn)，"OB-折疊結(jié)構(gòu)域"或"OB-折疊"或"OB-折疊蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)域"(最初得名于觀察到的其S^t-寡核苷酸結(jié)合性質(zhì))可用作為分子識別結(jié)構(gòu)域或支架，用于產(chǎn)生經(jīng)修飾的OB-折疊結(jié)構(gòu)域，以及用于制造經(jīng)i資飾的OB-折疊結(jié)構(gòu)域的文庫(可針對想要的生物學(xué)活性，例如，與想要的耙標結(jié)合以及改變的酶促性質(zhì)，對其加以篩選)。雖然OB-折疊結(jié)構(gòu)域最初得名于其寡糖-寡核苷酸結(jié)合性質(zhì)，但是也已經(jīng)在蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì)界面上觀察(Theobald等人，Annu.Rev.Biophys.Biomol.Struct"巻32:115-33(2003))。因此，本發(fā)明一部分涉及OB-折疊結(jié)構(gòu)域或其部分在產(chǎn)生具有想要的性質(zhì)的經(jīng)修飾的OB-折疊結(jié)構(gòu)域的方法中的用途；產(chǎn)生經(jīng)修飾的OB-折疊結(jié)構(gòu)域的文庫的方法；通過此類方法產(chǎn)生的經(jīng)修飾的OB-折疊結(jié)構(gòu)域的文庫；針對想要的生物學(xué)活性篩選經(jīng)修飾的OB-折疊結(jié)構(gòu)域的此類文庫的方法；以及從此類文庫鑒定得到的經(jīng)f爹飾的OB-折疊結(jié)構(gòu)域。例如，可對經(jīng)修飾的OB-折疊結(jié)構(gòu)域的此類文庫加以篩選，選出與特定目標靶(例如，核苷酸、蛋白質(zhì)或碳水化合物)的結(jié)合相互作用增加或減少或酶活性增加或減少的經(jīng)修飾的OB-折疊結(jié)構(gòu)域或其部分。在本文公開的一些闡釋性的實例中，發(fā)明人已經(jīng)證明了經(jīng)j務(wù)飾的OB-折疊結(jié)構(gòu)域的噬菌體展示文庫的產(chǎn)生(基于來自耐超高溫?zé)岚艟奶於彼醫(yī)RNA合成酶(AspRS)的tRNA反密碼子結(jié)合結(jié)構(gòu)域)；產(chǎn)生的AspRS經(jīng)修飾的OB-折疊結(jié)構(gòu)域的穩(wěn)定性；以及產(chǎn)生的AspRS經(jīng)修飾的OB-折疊結(jié)構(gòu)域的正確折疊。在本文公開的一些闡釋性的實例中，發(fā)明人已經(jīng)證明了AspRS經(jīng)修飾的OB-折疊結(jié)構(gòu)域在噬菌體表面上的功能性展示，由此允許針對具有想要的性質(zhì)的經(jīng)修飾OB-折疊結(jié)構(gòu)域來篩選文庫。如本文所表明的，發(fā)明人能夠通過使用本文公開的組合物和方法生產(chǎn)、篩選和選擇下述這樣的經(jīng)修飾的AspRSOB折疊結(jié)構(gòu)域，其從其天然存在的狀態(tài)的核酸結(jié)合結(jié)構(gòu)域被轉(zhuǎn)化為溶菌酶蛋白質(zhì)結(jié)合分子。在本文公開的其它一些闡釋性的實施方式中，來自耐超高溫?zé)岚艟暮蠴B-折疊結(jié)構(gòu)域的起始因子IF-5A凈皮用于產(chǎn)生經(jīng)修飾的OB-折疊結(jié)構(gòu)域的文庫。蛋白質(zhì)的OB-折疊結(jié)構(gòu)域可用作為平臺用于產(chǎn)生經(jīng)修飾OB-折疊結(jié)構(gòu)域或經(jīng)修飾OB-折疊結(jié)構(gòu)域的文庫以及用于篩選分子識別事件，這一發(fā)現(xiàn)在診斷和治療方法中可以應(yīng)用，并且，如本文所述，較之本領(lǐng)域中已知的使用抗體或其它蛋白質(zhì)支架的手段具有優(yōu)勢。如本領(lǐng)域技術(shù)人員能夠理解的，本文^S開的用于制備來自耐超高溫?zé)岵欧罹腁spRS或IF5A的經(jīng)修飾的OB-折疊結(jié)構(gòu)域的文庫的方法可應(yīng)用于本文所述和本領(lǐng)域已知的其它OB-折疊結(jié)構(gòu)域上。如本領(lǐng)域技術(shù)人員能夠理解的，本領(lǐng)域已知的其它展示和篩選方法可用于鑒定具有想要的性質(zhì)的經(jīng)修飾的OB-折疊結(jié)構(gòu)域。還應(yīng)想到，經(jīng)修飾的OB-折疊結(jié)構(gòu)域可被連到被固定的和/或固體表面上，并用于針對結(jié)合相互作用加以篩選。例如，OB-折疊蛋白質(zhì)可與被固定的表面共價偶聯(lián)，或者可使用親和標簽(例如，6xHis標簽)將其結(jié)合到表面上。將蛋白質(zhì)與表面共價偶聯(lián)的方法是本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的，可用于把蛋白質(zhì)粘附(affix)到表面上的親和標簽是本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的。此夕卜，OB-折疊蛋白質(zhì)可與固體表面(包括但不限于，珠子、玻璃、玻片、芯片和明膠)偶聯(lián)。因此，可使用本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的技術(shù)，使用一系列的OB-折疊蛋白質(zhì)來制造固體表面上的陣列。例如，美國專利申請公開文本No.2004/0009530公開了制備陣列的方法。一般性技術(shù)除非另有指明，本發(fā)明的實施將使用分子生物學(xué)(包括重組技術(shù))、-f效生物學(xué)、細胞生物學(xué)、生物化學(xué)和免疫學(xué)的傳統(tǒng)纟支術(shù)，這些都是本領(lǐng)域才支術(shù)人員已知的。此類才支術(shù)已在文獻，例如Afofecw/wC7o/w'"g:JAffl鼎flr/,第二版(Sambrook等人,1989)、CW/gowwc/eoftV/e5y"幼e5^(M.J.Gait，編著，1984)、Jm'附"/CW/C"ft"^(R.I.Freshney，編著，1987)、//aw必卯A;0/Ex/m'艦/ito//柳附"wo/ogj;(D.M.Weir&C.C.Blackwell，編著)、Ge膨7Wm^/^Fe"ora/orMa附附fl/Z朋CW/s(J.M.Miller&M.P.Calos,編著，1987)、Cw/re"ZiVotoco/51Mo/ecw/flr祝o/ogy(F.M.Ausubel等人，編著，1987)、尸C/:77^尸o(v附e,flweC7imrt及^f"/頭，(Mullis等人，編著，1994)、C"/r^/Votoco/s/"/附/ww/io/ogy(J.E.Coligan等人，編著，1991)、j^eT/m附"wo"s5^Fflw必卯A:(DavidWild,編著，StocktonPressNY，1994)和0//附附w朋/0g/ctf/^4""(vsZs(R.Masseyeff，W.H.Albert,和N.A.Staines,編著，Weinheim:VCHVerlagsgesellschaftmbH，1993)以及Gennaro，等人2000,Je/m'"gtow..ZAeiSWewce/VtfWce/^fl節(jié)flqy，第20版，LipincottWilliamsandWilkins:Baltimore,MD中被充分解釋。定義在本文中使用時，術(shù)語"包含"及其同義詞以其包括性的含義來使用，即，等同于術(shù)語"包括"及其相應(yīng)同義詞。除非另有指明，在本文中使用時，單數(shù)形式"一個/種，，和"這個/種"("a"、"an"和"the")包括復(fù)數(shù)指代。具有含OB-折疊結(jié)構(gòu)域這一特征的多種蛋白質(zhì)是本領(lǐng)域已知的，并在本文中有所描述。如本文中更詳細描述的，"OB-折疊結(jié)構(gòu)域"包括共享保守折疊和結(jié)合面的結(jié)構(gòu)特征的家族成員。OB-折疊結(jié)構(gòu)域成員還共享序列相關(guān)性。應(yīng)當考慮到，任何OB-折疊結(jié)構(gòu)域或其部分都可用于產(chǎn)生經(jīng)修飾的OB-折疊結(jié)構(gòu)域。在本文中使用時，"天然存在的"OB-折疊結(jié)構(gòu)域指沒有經(jīng)過遺傳i:造以含有核酸或氨基酸修飾的OB-折疊結(jié)構(gòu)域。在本文中使用時，"經(jīng){務(wù)飾的OB-折疊結(jié)構(gòu)域"較之天然存在的OB-折疊結(jié)構(gòu)域而言包含至少一處經(jīng)修飾的氨基酸殘基。修飾包括一個或多個殘基的缺失、取代或添加或其組合，只要經(jīng)修飾的OB-折疊結(jié)構(gòu)域保留了折疊相關(guān)的結(jié)合面使得其可與結(jié)合伴侶相互作用即可。并不需要"經(jīng)修飾的OB-折疊結(jié)構(gòu)域"保留天然存在的OB-折疊結(jié)構(gòu)域的精確結(jié)構(gòu)特征。經(jīng)修飾的OB-折疊結(jié)構(gòu)域可在任何氨基酸殘基處包含修飾，包括在結(jié)合面(結(jié)合面包括p-片層和鄰近的環(huán))、環(huán)鏈、核心區(qū)(蛋白質(zhì)沒有暴露給水性溶劑的疏水內(nèi)部中的區(qū)域)的M酸殘基處的修飾，并且還可包含在包含OB-折疊結(jié)構(gòu)域的蛋白質(zhì)的任何部分中的M酸修飾，只要經(jīng)修飾的OB-折疊結(jié)構(gòu)域保留了折疊相關(guān)的結(jié)合面使得其可與結(jié)合伴侶相互作用即可。在一些例子中，經(jīng)修飾的OB-折疊結(jié)構(gòu)域特征在于與天然存在的OB-折疊結(jié)構(gòu)域不能結(jié)合的結(jié)合伴侶相結(jié)合的能力。在其它一些例子中，經(jīng)修飾的OB-折疊結(jié)構(gòu)域具有與其天然存在的結(jié)合伴倡的經(jīng)修飾的結(jié)合。在一些例子中，OB-折疊結(jié)構(gòu)域被分離，即，從其中含有所述結(jié)構(gòu)域的天然存在的蛋白質(zhì)的至少一部分中移除。在其它一些例子中，經(jīng)修飾的OB-折疊結(jié)構(gòu)域與非天然存在的蛋白質(zhì)相聯(lián)結(jié)(associated)。在其它一些例子中，經(jīng)修飾的OB-折疊結(jié)構(gòu)域與天然或非天然存在的蛋白質(zhì)相聯(lián)結(jié)，所述蛋白質(zhì)不與天然存在的OB-折疊結(jié)構(gòu)域相結(jié)合或僅僅非特異性的與天然存在的OB-折疊結(jié)構(gòu)域相結(jié)合。在其它一些例子中，在天然存在的OB-折疊結(jié)構(gòu)域不具有已知結(jié)合伴倡的情況下，可產(chǎn)生經(jīng)修飾的OB-折疊結(jié)構(gòu)域。應(yīng)當知道，當針對與特定結(jié)合伴侶的結(jié)合來篩選經(jīng)〗務(wù)飾OB-折疊結(jié)構(gòu)域的文庫時，針對天然存在的OB-折疊結(jié)構(gòu)域的結(jié)合伴侶(如果有的話)可以并非在先已知的。經(jīng)修飾的OB-折疊結(jié)構(gòu)域可被制備為以改變的結(jié)合特性與天然存在的OB-折疊結(jié)構(gòu)域的天然底物結(jié)合。此類改變的結(jié)合特征可在與天然存在的OB-折疊結(jié)構(gòu)域相同的條件下顯示出來。備選地，改變的結(jié)合特性可以是下列的一種或多種(但不限于此)熱穩(wěn)定結(jié)合(例如，在升高的溫度下，較之天然存在的OB-折疊結(jié)構(gòu)域而言，經(jīng)修飾的OB-折疊結(jié)構(gòu)域展示出與天然底物的更強的結(jié)合)、熱不穩(wěn)定結(jié)合(例如，在升高的溫度下，22較之天然存在的OB-折疊結(jié)構(gòu)域而言，經(jīng)修飾的OB-折疊結(jié)構(gòu)^示出與天然底物的更弱的結(jié)合)、在不同pH條件下的經(jīng)修飾的結(jié)合(例如，經(jīng)修飾的OB-折疊結(jié)構(gòu)域較之天然存在的OB-折疊結(jié)構(gòu)域而言在高pH下展示出與天然底物的更強的結(jié)合，或者，較之天然存在的OB-折疊結(jié)構(gòu)域而言在高pH下展示出與天然底物的更弱的結(jié)合，或者，較之天然存在的OB-折疊結(jié)構(gòu)域而言在低pH下展示出與天然底物的更強的結(jié)合，或者，較之天然存在的OB-折疊結(jié)構(gòu)域而言在低pH下展示出與天然底物的更弱的結(jié)合)，或在不同離子強度條件下的經(jīng)修飾的結(jié)合(例如，經(jīng)修飾的OB-折疊結(jié)構(gòu)域較之天然存在的OB-折疊結(jié)構(gòu)域而言在高離子強度下展示出與天然底物的更強的結(jié)合，或者，較之天然存在的OB-折疊結(jié)構(gòu)域而言在高離子強度下展示出與天然底物的更弱的結(jié)合，或者，較之天然存在的OB-折疊結(jié)構(gòu)域而言在低離子強度下展示出與天然底物的更強的結(jié)合，或者，較之天然存在的OB-折疊結(jié)構(gòu)域而言在低離子強度下展示出與天然底物的更弱的結(jié)合)。經(jīng)修飾的結(jié)合或改變的結(jié)合特性可包含較之相應(yīng)的天然存在的OB-折疊結(jié)構(gòu)域而言，經(jīng)修飾的OB-折疊結(jié)構(gòu)域與其天然存在的結(jié)合伴侶的解離常數(shù)降低了大約至少25%，大約50%或者大約75%(即，經(jīng)修飾的OB-折疊結(jié)構(gòu)域可以以天然存在的OB-折疊結(jié)構(gòu)域的至少大約1.33、2或3倍強進行結(jié)合)。在一種實施方式中，經(jīng)修飾的結(jié)合包含較^目應(yīng)的天然存在的OB-折疊結(jié)構(gòu)域而言，經(jīng)修飾的OB-折疊結(jié)構(gòu)域與其天然存在的結(jié)合伴侶的解離常數(shù)以至少大約2、大約3、大約4、大約5、大約6、大約8、大約IO、大約15、大約20、大約25、大約50、大約100、大約200、大約500、大約1000、大約5000、大約10,000、大約50,000或者大約IOO，OOO的因子減少(即，經(jīng)f務(wù)飾的OB-折疊結(jié)構(gòu)域可以以天然存在的OB-折疊結(jié)構(gòu)域的至少大約2、大約3、大約4、大約5、大約6、大約8、大約10、大約15、大約20、大約25、大約50、大約100、大約200、大約500、大約1000、大約5000、大約10,000、大約50,000或者大約IOO，OOO倍強進行結(jié)合)。經(jīng)修飾的OB-折疊結(jié)構(gòu)域的"文庫，，表示較之天然存在的OB-折疊結(jié)構(gòu)域而言包括高比例的經(jīng)修飾OB-折疊結(jié)構(gòu)域的OB-折疊結(jié)構(gòu)域的集合。即，經(jīng)修飾OB-折疊結(jié)構(gòu)域的文庫并不暗示該集合僅含經(jīng)修飾的OB-折疊結(jié)構(gòu)域。經(jīng)修飾的OB-折疊結(jié)構(gòu)域的文庫可含有一定百分比的未經(jīng)修飾的或天然存在的OB-折疊結(jié)構(gòu)域。所述文庫可含有具有一個或更多或多個隨機化氨基酸殘基的OB-折疊結(jié)構(gòu)域。例如，經(jīng)修飾OB-折疊結(jié)構(gòu)域的文庫可含有在一個氨基酸殘基(所述修飾可以是單一類型的修飾，例如，單氨基酸取代，或多種不同的修飾，例如，用兩個或多個隨機M酸取代單個氨基酸)或兩個或多個氨基酸殘基處(可以在一個或多個結(jié)構(gòu)區(qū)域中，例如在結(jié)合面和/或環(huán)區(qū)域和/或核心區(qū)域中)的隨機修飾。經(jīng)修飾的OB-折疊結(jié)構(gòu)域可含有其它修飾，或者包含經(jīng)修飾的OB-折疊結(jié)構(gòu)域的蛋白質(zhì)可在氨基酸殘基中具有修飾，只要折疊相關(guān)結(jié)合面可與結(jié)合伴侶相互作用即可。經(jīng)修飾的OB-折疊結(jié)構(gòu)域的"文庫，，并不暗示對所述集合的成員數(shù)量的任何特定的大小限制。文庫可以含有少至大約IO個變體，并可延伸至超過102°個變體的范圍。在一些實施方式中，文庫將具有多達大約108個變體，并且在一些實施方式中，文庫將具有多達大約1012個變體。經(jīng)修飾的OB-折疊結(jié)構(gòu)域的"文庫"指通過核酸改變編碼的經(jīng)修飾OB-折疊結(jié)構(gòu)域的集合(即，在引入表達系統(tǒng)之前基因裝配階段)以及被引入表達系統(tǒng)、表達和/或展示的集合。術(shù)語"多核苷酸"和"核酸"在本文中可互換使用，它們指任何長度的核苷酸的聚合形式，所述核苷酸可以是核糖核香酸或脫氧核糖核苷酸。這些術(shù)語包括單鏈、雙鏈或三鏈DNA，基因組DNA,cDNA，RNA，DNA-RNA雜交體(hybrid)或包含噤呤和嘧咬堿基或者其它天然的、經(jīng)化學(xué)修飾的、經(jīng)生物化學(xué)修飾的、非天然的或衍生化的核苷酸堿基的聚合物。多核苦酸的主鏈可包^瞎和磷酸酯基團(如可在RNA或DNA中一H現(xiàn)的那樣)，或者經(jīng)修飾的或被取代的糖或磷酸酯基團。備選地，多核苷酸的主鏈可包含合成亞基，例如，氨基磷酸酯的聚合物，因此可以是寡脫氧核苷氨基磷酸酯(P-NH2)或混合的氨基磷酸酯-磷酸二酯寡聚物。Peyrottes等人(1996)7V"c/"c及es.24:1841-8、Chaturvedi等人(1996)iV"c/e/c及仏24:2318-23、Schultz等人(1996)iV"cfe/c^c,Vfo24:2966-73。硫代磷酸酯連接可用于替換磷酸二酯連接。Braun等人(1988)/./附附朋o/.141:2084-9、Latimer等人(1995)Mo/ec./附附"m/.32:1057-1064。此外，可通過合成互補鏈和在合適的條件下對鏈進行退火，或者通過使用DNA聚合酶用合適的引物從頭合成互補鏈，來從化學(xué)合成的單鏈多核苷酸產(chǎn)物獲得雙鏈多核苷酸。提到多核苷酸序列(例如提到SEQIDNO)還包括互補序列。下文是多核苷酸的非限制性例子基因或基因片段、外顯子、內(nèi)含子、mRNA、tRNA、rRNA、核酶、cDNA、重組多核普酸、帶支鏈的多核苷酸、質(zhì)粒、載體、經(jīng)分離的任何序列的DNA、經(jīng)分離的任何序列的RNA、核酸探針和引物。多核苷酸可包含經(jīng)修飾的核普酸，例如甲基化的核苦酸和核苷酸類似物、尿嘧啶(uracyl)、其它糖和連接基團(例如氟代核糖(fluororibosc)和硫代酯(thioate))以及核苷酸支鏈。核普酸序列可被非核苷酸組分打斷。多核苷酸可在多聚化后被進一步修飾，例如，通過與標記組分綴合來進行。該定義包括的其它類型的修飾是帽，類似物對一個或多個天然存在的核苷酸的取代以及引入將多核苷酸與蛋白質(zhì)、金屬離子、標記組分、其它多核苷酸或固體支持物連到一起的手段。優(yōu)選地，多核*酸是DNA。在本文中使用時，"DNA"不僅包括堿基A、T、C和G，其還包括任何它們的類似物或這些威基的經(jīng)修飾的形式，例如曱基化的核苷酸、核苷酸間修飾(例如不帶電荷的連接和疏代酯(thioate))、使用糖類似物以及經(jīng)修飾的和/或備選的主鏈結(jié)構(gòu)(例如聚酰胺)。"處于轉(zhuǎn)錄控制下"是本領(lǐng)域中廣泛知曉的術(shù)語，其表示多核苷酸序列(通常是DNA序列)的轉(zhuǎn)錄依賴于其與作用于轉(zhuǎn)錄起始或促進轉(zhuǎn)錄的元件的有效相連。"有效相連"指這樣的并列，其中元件處于允許它們發(fā)揮作用的排列中。"宿主細胞"包括下述各細胞或細胞培養(yǎng)物，其可以是或已經(jīng)是編碼OB-折疊結(jié)構(gòu)域(在一些例子中，經(jīng)修飾的OB-折疊結(jié)構(gòu)域)的核酸的接受體。宿主細胞包括單個宿主細胞的后代，并且所述后代可以因為天然的、偶然或刻意的突變和/或改變而不與最初的親本細胞完全相同(在形態(tài)上或在總的DNA互補上)。宿主細胞包括用編碼OB-折疊結(jié)構(gòu)域的核酸體內(nèi)或體外轉(zhuǎn)染或感染的細胞。在一些例子中，宿主細胞能在其表面表達和展示OB-折疊結(jié)構(gòu)域，例如，噬菌體展示。"表達，，包括轉(zhuǎn)錄和/或翻譯。"編碼，，OB-折疊結(jié)構(gòu)域或其部分的核酸是可被轉(zhuǎn)錄和/或翻譯以產(chǎn)生OB-折疊結(jié)構(gòu)域或其部分的核酸。此類核酸的反義鏈也被認為能編碼OB-折疊結(jié)構(gòu)域。I.OB-折疊蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)域在最一般的水平上，OB-折疊結(jié)構(gòu)域是五條鏈的混合I)桶。見，例如，Arcus，2002，Curr.Opin.Struct.Biol.巻12:794-801。OB-折疊結(jié)構(gòu)域在所有三種界中都被發(fā)現(xiàn)，如本文更詳細討論的，其在序列和結(jié)構(gòu)數(shù)據(jù)庫方面都被描繪過。一般而言，OB-折疊結(jié)構(gòu)域具有折疊和功能性結(jié)合面的保守性。不同的OB-折疊結(jié)構(gòu)域使用它們的折疊相關(guān)結(jié)合面，以多變地結(jié)合寡糖、寡核苷酸、蛋白質(zhì)、金屬離子和催化底物。OB-折疊結(jié)構(gòu)域具有大量特征，使得它們適合作為支架用于氨基酸位置的隨機化和對具有想要的性質(zhì)的經(jīng)修飾OB-折疊結(jié)構(gòu)域的選擇。OB-折疊結(jié)構(gòu)域通常是小且穩(wěn)定的蛋白質(zhì)，它們易于被生產(chǎn)和隨才幾化。上文提到的Theobald等人，2003公開了OB-折疊結(jié)構(gòu)域的長度范圍在70至150個M酸之間。此外，OB-折疊結(jié)構(gòu)域蛋白質(zhì)的面(已經(jīng)通過進化表明是多功能的(versatile))可用于隨機化。OB-折疊結(jié)構(gòu)域在全部三種界中普遍存在，因此，可能選擇OB-折疊結(jié)構(gòu)域適合特定應(yīng)用。例如，本文描述了來自熱穩(wěn)定^:生物的OB-折疊結(jié)構(gòu)域，用于生產(chǎn)經(jīng)修飾OB-折疊結(jié)構(gòu)域的文庫?？舍槍χ委煈?yīng)用對OB-折疊結(jié)構(gòu)域加以選擇，例如，可選出降d性O(shè)B-折疊結(jié)構(gòu)域，以生產(chǎn)具有新的酶活性的蛋白質(zhì)。這些特征提供了比較為傳統(tǒng)的抗體和蛋白質(zhì)支架更好的優(yōu)點。OB-折疊蛋白子結(jié)構(gòu)域的通常結(jié)構(gòu)為5條鏈的混合fc-桶，其展現(xiàn)出凹的fc-片層作為外結(jié)合面，其側(cè)翼有兩個可變環(huán)區(qū)域。在大多數(shù)情況下，所26述的桶具有希臘鑰匙拓樸結(jié)構(gòu)，桶的一個末端加有a-螺旋帽(23)。b-桶由其鏈的數(shù)量n以及剪切數(shù)S獨特描述(26,27)。剪切數(shù)描述了鏈從桶的軸傾斜的程度。圖1A-1C展示了S-10的()-桶。這是在形式上是fc-片層的一部分(由此排除卜凸起)的殘基的數(shù)量，并且是沿著從A至入*的鏈被計數(shù)。對于OB-折疊來說有兩種可能性(S-8或者S-10),這兩種都被觀察到。例如，與tRNA結(jié)合的天冬氨酰tRNA合成酶(aspRS)的OB-折疊結(jié)構(gòu)域具有S=10，而冷休克OB-折疊結(jié)構(gòu)域DNA結(jié)合結(jié)構(gòu)域則具有S=8。OB-折疊結(jié)構(gòu)域結(jié)合面在其中心具有fc鏈2和3,并且通過環(huán)1在底部左側(cè)結(jié)合，通過環(huán)4在頂部結(jié)合，以及通過環(huán)2在頂部右側(cè)結(jié)合(見圖1A-1C)。在不同的OB-折疊結(jié)構(gòu)域結(jié)構(gòu)中，環(huán)2和4展示出了長度和序列上的寬廣變化。見Arcus,2002，Curr.Opin.Struct.Biol.巻12:794-801。經(jīng)修飾的OB-折疊結(jié)構(gòu)域可在長度上有所變化。例如，環(huán)2通常在2至4個氨基酸之間變化，而環(huán)4則通常在3至10個M酸之間變化，在一些情況下，環(huán)4容納有更大長度的插入，所述插入多至大約30個氨基酸。對20種被測序基因組的調(diào)查表明OB-折疊結(jié)構(gòu)域處于最普遍的生物學(xué)構(gòu)造列表的笫28位(27)。已經(jīng)在多種不同的蛋白質(zhì)(包括人、酵母和細菌)中發(fā)現(xiàn)了OB-折疊結(jié)構(gòu)域。例如，在細菌超抗原(Sags)中，OB-折疊結(jié)構(gòu)域能介導(dǎo)細菌對人免疫系統(tǒng)的攻擊中的蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì)相互作用(21和22)。在這些蛋白質(zhì)中，其與寬范圍的配體(包括蛋白質(zhì)、寡核苷酸和寡糖)結(jié)合(23)。OB-折疊結(jié)構(gòu)域蛋白質(zhì)多樣性的例子包括在癌基因BRCA2中的單鏈DNA結(jié)合(YangH.等人，2002Science,巻.297,1837-1848)、針對酵母蛋白質(zhì)Cdcl3的在染色體上的端粒末端結(jié)合(LeiM.等人，2003Nature,巻426，198-203)以及在病原性細菌中的細胞表面S^t結(jié)合(SteinP.E.等人，1994，Structure,巻2，45-47)。如蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)分類數(shù)據(jù)庫(StructuralClassificationofProteinsdatabase)(SCOP)(將蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)分類進相關(guān)"家族"和"超家族"的標準)所確定的，在九個相關(guān)超家族中都發(fā)現(xiàn)了OB-折疊結(jié)構(gòu)域。屬于同一"家族"的這些OB-折疊結(jié)構(gòu)域在序列、結(jié)構(gòu)和功能水平上具有進化相關(guān)性，并且看起來是來自共同祖先的后代。屬于同一"超家族"的OB-折疊結(jié)構(gòu)域"家族"基于相似的結(jié)構(gòu)和功能特征(沒有明確的序列相似性)是進化相關(guān)的。SCOP數(shù)據(jù)庫包含已知結(jié)構(gòu)的蛋白質(zhì)(即，已經(jīng)使用X-射線晶體學(xué)或高分辨率NMR實驗確定了它們的結(jié)構(gòu))。本領(lǐng)域技術(shù)人員可基于結(jié)構(gòu)相關(guān)性(即存在折疊相關(guān)的結(jié)合面)，或者與本文描述的和本領(lǐng)域已知的已知OB-折疊結(jié)構(gòu)域的結(jié)構(gòu)相關(guān)性和序列相關(guān)性來確定其它的OB-折疊結(jié)構(gòu)域。在超家族和家族中存在序列相似性，它們可用于鑒定其結(jié)構(gòu)以前沒有被確定為OB-折疊范圍(OB-foldumbrella)內(nèi)的其它蛋白質(zhì)。見，例如，^A眾可獲得的Pfam數(shù)據(jù)庫(在〈sanger.ac.uk/Software/Pfam〉)。另一乂/S眾可獲得的數(shù)據(jù)庫是Superfamily(在〈supfam.mrclmb.cam.ac.uk/SUPERFAMILY〉)，其4吏用源自SCOP的隱藏Markov模型來將蛋白質(zhì)序列分類為超家族。例如，"核酸結(jié)合蛋白質(zhì)"包含SCOP數(shù)據(jù)庫中的超家族。在SCOP中的該超家族中目前有11個家族和66種單獨的蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)。從這11個家族和66種結(jié)構(gòu)，Superfamily數(shù)據(jù)庫已經(jīng)推理出了規(guī)則，以將21,158條蛋白質(zhì)序列歸為屬于"核酸-結(jié)合蛋白質(zhì)"超家族的OB-折疊蛋白質(zhì)。類似地，CheW樣超家族在SCOP中僅具有單個家族和兩種蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)，而在Superfamily數(shù)據(jù)庫中其已被擴展為包括898種蛋白質(zhì)。i.在SCOP對OB-折疊結(jié)構(gòu)域加以歸類對于SCOP表征為全部p、具有桶、封閉或部分開放(其中n=5，以及S40或S-8，希臘鑰匙)的OB-折疊結(jié)構(gòu)域的類而言，SCOP目前鑒定出了下述超家族(括號中的數(shù)字是SCOP參考號)1.葡萄球菌核酸酶(50199)對于葡萄球菌核酸酶而言，目前該家族僅有單個成員，雖然在數(shù)據(jù)庫中針對葡萄球菌核酸酶有很多種結(jié)構(gòu)。OB-折疊是封閉的p-桶，n=5，S=10。2.細菌腸毒素(50203)對于細菌腸毒素而言，該超家族中有兩個家族細菌AB5毒素(B亞基)和超抗原毒素的N-末端結(jié)構(gòu)域。細菌AB5毒素包括來自大腸桿菌的熱不穩(wěn)定毒素、霍亂毒素和百日咳毒素。所有這些都具有封閉的p-桶拓樸結(jié)構(gòu)，并且n-5，S=10，唯一例外在于霍亂毒素，其的桶略有開i文。超抗原毒素和超抗原樣毒素的N-末端結(jié)構(gòu)域全是來自金黃色葡萄球菌(5"似/)/^/ococcM51"w/rw51)和酉良膿鏈球菌(5^e/7tocwx"s/y;ogewes)的蛋白質(zhì)，具有典型的n-5、S-10的封閉桶拓樸結(jié)構(gòu)。這些生物基因組中編碼了大量的這些蛋白質(zhì)。近來根據(jù)"StandardNomenclaturefortheSuperantigensExpressedbyiS啤/r一cocc"51.，，GerardLina，GregoryA.Bohach，SeanP.Nair，KeiichiHiramatsu，EvelyneJouvin-Marche，和RoyMariuzza，fortheInternationalNomenclatureCommitteeforStaphylococcalSuperantigens77^/ow鼎//"/eWowsZ)/sefl5^s2004;189:2334-6對葡萄球菌蛋白質(zhì)進行了重新命名。3.TIMP樣(50242)TIMP樣蛋白質(zhì)是真核蛋白質(zhì)，其目前被分成三個家族，全部都具有n=5、S=10的封閉桶拓樸結(jié)構(gòu)a.金屬蛋白質(zhì)酶(metalloproteinase)的組織抑制劑，TIMP(50243)(在C-末端延伸中含有不規(guī)則的a+J5亞結(jié)構(gòu)域)b.導(dǎo)蛋白樣結(jié)構(gòu)域(NTR/C345C模塊)(89320)c.聚集蛋白的層粘連蛋白結(jié)合結(jié)構(gòu)域(63767)4.血紅素分子伴倡CcmE(82093)對于血紅素分子伴倡CcmE來說，在該超家族中標注了單個家族。代表性的結(jié)構(gòu)來自大腸桿菌和腐化鏈球菌(&/7W,f《/il"V"S)。5.尾部-相關(guān)溶菌酶gp5的N-末端結(jié)構(gòu)域(69255)對于尾部-相關(guān)溶菌酶gp5N-末端結(jié)構(gòu)域而言，有單種結(jié)構(gòu)代表家族和該超家族。蛋白質(zhì)來自噬菌體T4，且N-末端結(jié)構(gòu)域是形成噬菌體的細胞穿刺裝置(cell-puncturingdevice)的更大的蛋白質(zhì)復(fù)合體的一部分。6.核酸結(jié)合蛋白質(zhì)(50249)核酸結(jié)合蛋白質(zhì)是大的超家族，其包括很多蛋白質(zhì)。下述是家族劃分和描述符a.反密碼子結(jié)合結(jié)構(gòu)域(50250),桶；封閉；n=5，S=10b.RecG"楔"結(jié)構(gòu)域(69259)c.DNA解旋酶RuvA亞基，N-末端結(jié)構(gòu)域(50259),桶；封閉；n=5,d.單鏈DNA結(jié)合結(jié)構(gòu)域，SSB(50263)，桶；封閉；n=5，S-10e.Myf結(jié)構(gòu)域(50277)f.冷休克DNA結(jié)合結(jié)構(gòu)域樣(50282)，桶；封閉；n=5,S=8g.假設(shè)蛋白質(zhì)MTHl(MT0001)，插入結(jié)構(gòu)域(74955)h.DNA連接酶/mRNA加帽酶，結(jié)構(gòu)域2(50307)i.噬菌體ssDNA結(jié)合蛋白質(zhì)(50315)(4)，桶；開放；n*=5，S*=8，成員結(jié)構(gòu)比來自細胞生物的那些更多樣化j.DNA復(fù)制啟動子(cdc21/cdc54)N-末端結(jié)構(gòu)域(89332)k.RNA聚合酶亞基RBP8(50321),—式兩份；含有兩個不完全OB-折疊的串聯(lián)重復(fù)；形成單個桶；n=8，S=107.無機焦磷酸酶(50324)對于無機焦磷酸酶而言，該超家族中僅有一個家族。該家族具有非常深的諳系(lineage)，因為有來自細菌、古生菌和真核生物的例子。1.無才幾焦磷酸酶(50325)，桶，封閉；n=5，S=81.無才幾焦磷酸酶(50326)真核生物的酶在N-末端和C-末端都具有額外的二級結(jié)構(gòu)a.面包酵母(釀酒酵母(5Vzccto，cerev/wW))(50327)b.古細菌嗜酸熱^lt化葉菌(S"(/bfo6附fl"V/oc"/^in7w)(50328)c.大腸桿菌(50329)d.嗜熱棲熱菌(幼enwop/^7ws)(50330)8.MOP樣(50331)在MOP樣的分組中有三個家族，全部都具有相似的功能性，并且全部都來自細菌。a.鉬酸鹽/鴒酸鹽結(jié)合蛋白質(zhì)MOP(50332)b.BiMOP，一式兩份的鉬酸鹽結(jié)合結(jié)構(gòu)域(50335)一式兩份兩個具有交換的C-末端鏈的OB-折疊結(jié)構(gòu)域的串聯(lián)重復(fù)c.ABC轉(zhuǎn)運蛋白質(zhì)，額外的結(jié)構(gòu)域(50338)，可能從biMOP結(jié)構(gòu)域伸出(stemout)9.CheW樣(50341)其由具有來自海棲熱坤包菌(77^/7W0tog)的兩種結(jié)構(gòu)CheW和CheA的單個家族代表。ii.序列數(shù)據(jù)庫Pfam和Superfamily來自SCOP的描述與來自下述蛋白質(zhì)的OB-折疊結(jié)構(gòu)域相關(guān)，所述蛋白質(zhì)的三維結(jié)構(gòu)已經(jīng)通過X-射線晶體學(xué)或NMR確定?；谛蛄邢嗨菩栽跀?shù)據(jù)庫Pfam中以;S^于源自SCOP的序列情況在數(shù)據(jù)庫Superfamily中鑒定出的、隨后應(yīng)用到主序列數(shù)據(jù)上的額外OB-折疊蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)域也被本發(fā)明包括。本發(fā)明還包括本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的其它OB-折疊結(jié)構(gòu)域。如下文所述，Pfam中有很多家族，它們一起代表OB-折疊結(jié)構(gòu)域。才示注》口下所示家族名稱標注Pfam登錄號Pfam數(shù)據(jù)庫中該家族蛋白質(zhì)的總數(shù)OB-折疊核酸結(jié)合結(jié)構(gòu)域登錄號PF01336蛋白質(zhì)數(shù)量13517Wo—潛合fre/o一A/"^J端粒結(jié)合蛋白質(zhì)a亞基，中央結(jié)構(gòu)域登錄號PF02765蛋白質(zhì)數(shù)量3331單鏈結(jié)合蛋白質(zhì)家族登錄號PF00436蛋白質(zhì)數(shù)量415未知功能的結(jié)構(gòu)域(DUF388)登錄號PF04076蛋白質(zhì)數(shù)量49層^一遽孩麟一fl^NAD依賴性DNA連接酶OB-折疊結(jié)構(gòu)域登錄號PF03120蛋白質(zhì)數(shù)量l卯葡萄球菌/鏈J求菌毒素，OB-折疊結(jié)構(gòu)域登錄號PF01123蛋白質(zhì)數(shù)量180真核起始因子5A羥丁賴氨酸，DNA-結(jié)合OB折疊登錄號PF01287蛋白質(zhì)數(shù)量104Gp5N-末端OB結(jié)構(gòu)域登錄號PF06714蛋白質(zhì)數(shù)量6本文所述的、本領(lǐng)域已知的和以后鑒定的所有OB折疊結(jié)構(gòu)域可用作為支架，以制備經(jīng)修飾的OB-折疊結(jié)構(gòu)域，以及制備經(jīng)修飾OB-折疊結(jié)構(gòu)域的文庫，所述文庫可用于篩選改變的結(jié)合特性和改變的功能特征。iii.用于對氨基酸進行隨機化的OB-折疊結(jié)合面可基于任何OB-折疊結(jié)構(gòu)域(包括本文所述的、本領(lǐng)域已知的和以后鑒定的那些)的結(jié)構(gòu)，來制備經(jīng)修飾的OB-折疊結(jié)構(gòu)域和/或經(jīng)修飾的OB-折疊結(jié)構(gòu)域的文庫?？苫诒疚乃龊捅绢I(lǐng)域已知的方法來制備經(jīng)修飾的OB-折疊結(jié)構(gòu)域的文庫。例如，對于任何給定的OB-折疊結(jié)構(gòu)域而言，編碼一個或多個氨基酸殘基(例如，外結(jié)合面的鏈中的氨基酸殘基和/或環(huán)的鏈中的氨基酸殘基和/或含OB-折疊結(jié)構(gòu)域的蛋白質(zhì)的其它部分中的g酸殘基)的核酸可被靶向于氨基酸殘基隨機化(即，通過核酸修飾的M酸殘基的隨機突變)。在一些例子中，氨基酸殘基隨機化耙向OB-折疊結(jié)構(gòu)域外結(jié)合面的鏈中的氨基酸殘基。在其它一些例子中，氨基酸殘基隨機化靶向OB-折疊結(jié)構(gòu)域內(nèi)部的特定結(jié)構(gòu)。例如，隨才幾化可革巴向OB-折疊結(jié)構(gòu)域的結(jié)合面的鏈中存在的一個或多個氨基酸殘基。OB-折疊結(jié)構(gòu)域的結(jié)合面包括p-鏈l的C末端一半、p-鏈2、p-鏈3、|5-鏈4的C末端一半和p-鏈5。參見圖1A-1C。在另一例子中，核心OB-折疊結(jié)構(gòu)域的p-鏈間的環(huán)中的氨基酸殘基可被隨機突變所靶向。在另一例子中，其中OB-折疊核心結(jié)構(gòu)域(即，無機焦磷酸酶)側(cè)翼的環(huán)區(qū)域中有大的插入，這些插入的環(huán)上的氨基酸殘基可被選來進行隨機化。本發(fā)明還包括下述經(jīng)修飾的OB-折疊結(jié)構(gòu)域，其具有是經(jīng)修飾以產(chǎn)生蛋白質(zhì)穩(wěn)定性方面的改變的核心的部分(是氨基酸殘基)。II.生產(chǎn)經(jīng)修飾的OB-折疊結(jié)構(gòu)域以;S^艮示方法在實施例中本文所述的一些闡述性實施方式中，在其上引入了突變的兩個嗜熱OB-折疊蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)域——翻譯起始因子IF-5A(S=8)和天冬氨酰tRNA合成酶aspRS(S=10)被用于制備經(jīng)修飾OB-折疊結(jié)構(gòu)域的文庫，這通過對OB-折疊蛋白質(zhì)結(jié)合面中的氨基酸殘基進行隨機化來實現(xiàn)。這兩種蛋白質(zhì)都來自超嗜熱chrenarchaeon耐超高溫?zé)岚艟?。使用具有處于被隨機化的OB-折疊結(jié)構(gòu)域的結(jié)合面中的特定M酸位置的長寡核苷酸，接著使用PCR進行基因裝配，合成產(chǎn)生文庫。針對其編碼的蛋白質(zhì)過表達的速率來對文庫加以測試，估計文庫所編碼的可溶且熱穩(wěn)定的蛋白質(zhì)的比例。本文表明，aspRSOB-折疊結(jié)構(gòu)域(aspRS-OB)可在噬菌體表面展示并被選擇?；诒疚膶嵤├忻枋龅腶spRS支架，制備經(jīng)修飾OB-折疊結(jié)構(gòu)域的不同文庫，對其進行噬菌體展示方法，以證明可產(chǎn)生能與不同底物(包括tRNA、蛋白質(zhì)和纖維素配體)結(jié)合的經(jīng)修飾的OB-折疊結(jié)構(gòu)域。在本文公開的一種闡述性實施方式中，顯示了經(jīng)修飾的OB-折疊結(jié)構(gòu)域(在其天然狀態(tài)下是核酸結(jié)合結(jié)構(gòu)域)和溶菌酶之間的結(jié)合相互作用。如本領(lǐng)域技術(shù)人員將理解的，本領(lǐng)域中已知用于制備核酸修飾的多種方法可用于制備(編碼)在一處或多處氛基酸殘基處具有修飾的OB-折疊結(jié)構(gòu)域。可^f吏用本領(lǐng)域的標準方法，例如化學(xué)合成、重組方法來獲得編碼OB-折疊結(jié)構(gòu)域的核酸，和/或其可獲得自生物來源。感興趣的核酸可祐jt置于對于在任何特定宿主細胞中其表達所必需的一種或多種的元件的控制之下多種宿主細胞可用于拓展OB-折疊結(jié)構(gòu)域，并且可用于在其表面展示經(jīng)修飾的OB-折疊結(jié)構(gòu)域的展示方法也是本領(lǐng)域已知并在本文中描述的。展示方法包括但不限于噬菌體展示、細菌展示、酵母展示、核糖體展示和mRNA展示。i.展示方、法顯示技術(shù)包括用被固定的配體來篩選表達的蛋白質(zhì)的大文庫，以表征或發(fā)現(xiàn)各蛋白質(zhì)與靶配體之間的新的相互作用。展示沖支術(shù)的最重要的特征是能將被篩選的蛋白質(zhì)(表型)與編碼它們的遺傳信息(基因型)偶聯(lián)到一起。在所有展示技術(shù)中，遺傳信息都與被篩選的蛋白質(zhì)同時被分離。這通常通過在生物實體(例如噬菌體、酵母或細菌)的表面展示蛋白質(zhì)或34蛋白質(zhì)片段以及利用生物的復(fù)制系統(tǒng)以擴增文庫來實現(xiàn)。作為這些體內(nèi)系統(tǒng)的替代，還可體外進行整個過程，此類技術(shù)被稱為核糖體展示或mRNA展示。在這些情況下，體外產(chǎn)生的轉(zhuǎn)錄物在細胞提取物中被翻譯，在配體介導(dǎo)的對mRNA-核糖體-蛋白質(zhì)復(fù)合體的分離發(fā)生之后，用RT-PCR來擴增遺傳信息。a.噬菌體展示在絲狀噬菌體表面展示外來的肽和蛋白質(zhì)被稱為"噬菌體展示，，，現(xiàn)在這是研究分子相互作用的常用技術(shù)。通常待被篩選的蛋白質(zhì)文庫作為與位于噬菌體顆粒的一個末端的基因III蛋白質(zhì)產(chǎn)物的融合物(fusion)#^達，或者作為與噬菌體顆粒表面上的gVIII蛋白質(zhì)的融合物被表達。用此類噬菌體文庫感染細菌允許非常高效的文庫擴增(Griffith等人，1994)。典型的噬菌體展示方案包括在細菌宿主中生產(chǎn)噬菌體顆粒，每個顆粒都展示基因文庫的一個成員的基因產(chǎn)物(作為與其外殼蛋白的一種類型(gill或gVIII蛋白質(zhì))的融合物)。經(jīng)由用于與被固定的靶分子結(jié)合("生物淘選")的選擇過程來獲得噬菌體顆粒的文庫，所述過程包括噬菌體文庫與靶的結(jié)合，洗滌步驟以除去未結(jié)合的噬菌體以及對結(jié)合的顆粒的洗脫。通常需要若干輪淘選來選出具有想要的特性的分子，包括在細菌宿主中再擴增洗脫的噬菌體以及在被固定的耙上進行選擇。在本文實施例中公開的一些闡述性實施方式中，噬菌體展示方法被用于展示和篩選經(jīng)修飾的OB-折疊結(jié)構(gòu)域。b.細菌展示和酵母展示細菌展示和酵母展示技術(shù)允許重組蛋白質(zhì)在酵母細胞釀酒酵母(Boder和Wittrup，1997)或細菌(大腸桿菌、Staphylococcuscarnosus)(Daugherty等人，1998，Wernerus等人，2003)表面的表達，所述重組蛋白質(zhì)分別作為與a-凝集素酵母黏著受體或細菌外膜蛋白質(zhì)(OMP)的融合物表達。表達的融合蛋白質(zhì)還含有標簽序列，這允許通過流式細胞術(shù)對文庫表面表達加以定量。與對配體的間接熒光標記組合，抗標簽標記允許通過FACS(熒光激活細胞分選術(shù))的細胞分選以及對相互作用的結(jié)合親和性的測定(Feldhaus等人，2003，Wernerus等人，2003)。酵母表達載體較之其它展示技術(shù)有優(yōu)勢的特征在于正確的翻譯后修飾、對在細菌或體外展示系統(tǒng)中可能會遇到問題的哺乳動物蛋白質(zhì)的加工和折疊。c.核糖體展示和mRNA展示核糖體展示和mRNA展示是能在體外對大蛋白質(zhì)文庫進行選擇和進化(evolution)的技術(shù)。唯一所需的生物組分是含有體外產(chǎn)生的編碼蛋白質(zhì)序列的轉(zhuǎn)錄物翻譯所需因子的細菌細胞提取物。在核糖體展示中，基因型和表型通過核糖體復(fù)合體連到一起，所述復(fù)合體由信使RNA(mRNA)、核糖體和凈皮編碼的蛋白質(zhì)(用于選擇)構(gòu)成(Hanes和Pluckthun,1997)。mRNA展示方法利用嘌呤霉素來將mRNA連接到翻譯的蛋白質(zhì)上，因此允許純化出含有基因型和表型信息的mRNA-蛋白質(zhì)綴合物。選擇之后，通過RT-PCR擴增經(jīng)分離的mRNA或mRNA綴合物，它們可^皮轉(zhuǎn)錄和翻譯用于另一輪選擇(Lipovsek和Pluckthun，2004)。關(guān)于展示方法的參考文獻包括下面列出的這些，其整體通過引用并入本文BoderET和WittrupKD(1997)NatBiotechnol.15:553-7、FeldhausMJ等人(2003)NatBiotechnol.21:163-70、Griffiths,AD，等人(1994)EMBOJournal13,3245-3260、HanesJ,PluckthunA.，等人(1997)PNASMay13;94(10):4937-42和LipovsekD，PluckthunA.，(2004)J.ImmunologicalMeth.29051-67、WernerusH，等人(2003)ApplEnvironMicrobiol.69(9):5328-35。例如，展示方法公開在BoderET和WittrupKD(1997)NatBiotechnol.15:553-7;FeldhausMJ等人(2003)NatBiotechnol.21:163-70;Griffiths,AD等人(1994)EMBOJournal13，3245-3260;HanesJ，PluckthunA.，(1997)，PNASMay13;94(10):4937-42;LipovsekD等人(2004)丄ImmunologicalMeth.29051-67;和WernerusH等人(2003)ApplEnvironMicrobiol.69(9):5328-35。III.用于篩選經(jīng)修飾的OB-折疊結(jié)構(gòu)域的可能靼標天然存在的OB-折疊結(jié)構(gòu)域的配體是多種多樣的。對經(jīng)修飾的OB-折疊結(jié)構(gòu)域的文庫的生產(chǎn)擴展了針對OB-折疊結(jié)構(gòu)域的可能靶標的多樣性。用于針對經(jīng)修飾的OB-折疊結(jié)構(gòu)域的文庫進行篩選的可能耙標包括多種分子，包括，例如但不限于，核酸、蛋白質(zhì)、肽、多肽、碳水化合物、寡糖和激素。i.核酸大量的OB-折疊結(jié)構(gòu)域參與與單鏈DNA和RNA的結(jié)合。它們包括癌基因BRCA2的單鏈DNA結(jié)合結(jié)構(gòu)域、來自人復(fù)制蛋白質(zhì)A的若干結(jié)構(gòu)域以及天冬氨酰和賴氨酰-tRNA合成酶的反密碼子結(jié)合結(jié)構(gòu)域。因此，單鏈DNA和tRNA可用作為篩選經(jīng)修飾OB-折疊結(jié)構(gòu)域的文庫的配體靶標。ii.蛋白質(zhì)靶標多種蛋白質(zhì)可用于篩選經(jīng)修飾OB-折疊結(jié)構(gòu)域的文庫，例如，酶、調(diào)節(jié)蛋白質(zhì)、蛋白質(zhì)和肽激素、轉(zhuǎn)運蛋白質(zhì)等。在本文^Hf的一些闡述性的實施方式中，溶菌酶被用作為蛋白質(zhì)靶標。其它靶標包括但不限于泛素、補體成分C4、纖維蛋白溶酶原前體、脫脂載脂蛋白A-II、血漿蛋白酶C1抑制劑、運甲狀腺素蛋白和血清淀粉樣P-成分。iii.寡糖靶標S^唐在所有生物的生物學(xué)中是構(gòu)成整體所必需的部分。寡糖底物，例如但不P艮于，昆布己糖(laminarihexose)、甘露戊糖和木戊糖，可用作為靶標。iv.激素激素例如，類固醇激素(雌激素、睪酮和皮質(zhì)醇)、兒茶酚胺(例如腎上腺素)和其它此類分子可用于4f對OB-折疊結(jié)構(gòu)域的文庫進行篩選。目前沒有證據(jù)表明，OB-折疊結(jié)構(gòu)域用類固醇激素或其它輔因子作為天然配體。此外，傳統(tǒng)上難于產(chǎn)生針對類固醇的高特異性抗體，并且凹結(jié)合面，例如OB-折疊結(jié)構(gòu)域結(jié)合面在產(chǎn)生對特定激素的結(jié)合特異性方面可能被證明是更好的。37V.小有機分子小有機分子"皮定義為分子量等于或小于大約1000道爾頓的有機分子)也可用作為OB-折疊結(jié)構(gòu)域的靶標。小有機分子可以是天然存在的分子或者是自然界沒有發(fā)現(xiàn)過的合成分子。天然存在的小有機分子可與活的系統(tǒng)(例如類固醇激素；見上文)相關(guān)聯(lián)，或者可非生物性存在。小有機分子包括但不限于，污染物或其它不想要的物質(zhì)，例如DDT或多氯聯(lián)苯(PCB，s)。小有機分子包括但不限藥品和藥物，例如阿霉素和紫杉醇。IV.針對OB-折疊結(jié)構(gòu)域的應(yīng)用如本文所述，OB-折疊結(jié)構(gòu)域是多功能的分子識別平臺。多種OB-折疊結(jié)構(gòu)域是本領(lǐng)域已知、本文公開以及已在SCOP和其它數(shù)據(jù)庫(例如Pfam和Superfamily)中鑒定出來的。此類OB-折疊結(jié)構(gòu)域可用在下述方法中，所述方法用于制備經(jīng)修飾的OB-折疊結(jié)構(gòu)域以及經(jīng)修飾的OB-折疊結(jié)構(gòu)域的文庫，可針對靶標，例如，核酸、蛋白質(zhì)、激素、碳水化合物和寡糖對所述文庫加以篩選。此類篩選方法可用于鑒定具有想要的性質(zhì)的經(jīng)修飾的OB-折疊結(jié)構(gòu)域。例如，人OB-折疊結(jié)構(gòu)域可用作為支架，用于生產(chǎn)經(jīng)修飾的OB-折疊結(jié)構(gòu)域的文庫，可以針對可能在對人的治療方面具有應(yīng)用的人靶標對所述文庫加以篩選。在另一例子中，酵母OB-折疊結(jié)構(gòu)域可用作為支架，用于生產(chǎn)可能應(yīng)用于生物技術(shù)或發(fā)酵應(yīng)用的經(jīng)修飾的OB-折疊結(jié)構(gòu)域的文庫。在還一個例子中，酶性O(shè)B-折疊結(jié)構(gòu)域可用作為支架，用于生產(chǎn)具有新的酶性質(zhì)的經(jīng)修飾的OB-折疊結(jié)構(gòu)域的文庫。經(jīng)修飾的OB-折疊結(jié)構(gòu)域的可能應(yīng)用落入三個寬類別中診斷試劑；治療應(yīng)用；和工具。經(jīng)4務(wù)飾的OB-折疊結(jié)構(gòu)域可用于寬廣范圍的分子生物學(xué)工具，其包括，例如，作為蛋白質(zhì)純化試劑的用途，用于對來自重組來源或天然來源(例如血清)的蛋白質(zhì)進行親和性純化。在此類應(yīng)用中，針對所選用蛋白質(zhì)具有特異性結(jié)合親和性的OB-折疊結(jié)構(gòu)域?qū)⒈还潭ǖ街樽由?，然后用于對靶蛋白質(zhì)進4亍親和性純化。其它應(yīng)用包括在用于Western印跡中的蛋白質(zhì)檢測中的用途；使用熒光標記的OB-折疊結(jié)構(gòu)域進行的蛋白質(zhì)檢測；以及用于單鏈DNA和RNA的保護劑。在這些方面，OB-折疊結(jié)構(gòu)域較之抗體的主要好處在于，可定制經(jīng)修飾OB-折疊結(jié)構(gòu)域的穩(wěn)定性，以與試劑匹配。例如，熱穩(wěn)定OB-折疊結(jié)構(gòu)域，例如，可從耐超高溫?zé)岚魲U菌獲得的那些，可比作為親和性純化試劑的抗體更有效。經(jīng)修飾的OB-折疊結(jié)構(gòu)域的診斷應(yīng)用包括，例如在流體(例如血清、培養(yǎng)物上清液和被污染的水)中的蛋白質(zhì)檢測；基因型分型(很多OB-折疊蛋白質(zhì)是單鏈DNA結(jié)合蛋白質(zhì)，它們可被開發(fā)來檢測特異性DNA或RNA基序，用于基因型分型等方法中)以及在一些小分子檢測劑中。既然重組抗體及其片段目前代表了正經(jīng)歷臨床試驗以用于診斷和治療的所有生物蛋白質(zhì)的大部分，那么抗體文庫的替代品(例如經(jīng)修飾的OB-折疊結(jié)構(gòu)域的文庫)就很有作為治療劑的潛力。目前已經(jīng)上市的重組抗體的例子是腫瘤學(xué)治療劑赫賽汀(Herceptin)，抗HER2抗體；Rutuxan(Rutuximab)抗CD20抗體；以及阿瓦斯丁(Avastin)抗VEGF抗體。經(jīng)修飾OB-折疊結(jié)構(gòu)域的人源化文庫可被制備，可從中鑒定出具有合適的結(jié)合特性(能用于治療領(lǐng)域)的特定的那些。實施例實施例1:材料和方法化學(xué)物質(zhì)和生物化學(xué)物質(zhì)標準寡核苷酸購自英杰生命科學(xué)公司(Invitrogen)，所有的長隨機化寡核苷酸來自MWG(馬丁內(nèi)斯公司(Martinsried),德國)。戶/:c和to《聚合酶以及所有P艮制性酶來自英杰生命科學(xué)公司(Invitrogen)(Carlsbad,USA)。奸堿性磷酸酶(SAP)和T4連接酶來自羅切公司(Roche)(Basel,瑞士)。噬粒載體pRPSP2和噬菌體VCS-M13和VCSM-13d3(Vd3)來自J.Rakonjac博士(31,32)。包被有鏈親和素的磁珠和ProtectorRNase抑制劑來自羅切公司(Roche)，和雌鳥卵溶菌酶一樣。牛血清清蛋白來自西格瑪公司(Sigma)生物素化的轉(zhuǎn)移RNA是用來自安賓公司(Ambion)(USA)的MEGAscript體外轉(zhuǎn)錄試劑盒和來自羅切公司(Roche)的生物素RNA標記混合物來制備的。用于western分析的硝化纖維素膜來自絲萊澈&斯隆/^司(Schleicher&Schuell)(Dassel,德國)，所用的底物是來自皮爾斯乂A司(Pierce)(USA)的SuperSignal,生物信息學(xué)使用Swiss-pdbViewer和Pymol(在pymol.sourceforge.net上)對結(jié)構(gòu)進行觀察、分析，或?qū)⑵鋸腜DB文件(33)轉(zhuǎn)變?yōu)閳D。PDB進入(entry)lbkb(34)被用于對IF-5A的結(jié)構(gòu)分析。對aspRS而言，使用aspRS同源物lb8a(35)、leov(36)、lcoa(37)的PDB文件。aspRS-OB的結(jié)構(gòu)才莫型從SwissModd(38-40)獲得，這是通過提交來自耐超高溫?zé)岚艟腶spRS-OB的氨基酸序列來獲得的。經(jīng)由EBI服務(wù)網(wǎng)頁(<www.ebi.ac.uk/services/>)4吏用ClustalW(版本1.8)在線進行比對?？寺“凑誗ambrook和Russell(41)來進行一般的克隆。通過PCR,使用寡核苷酸005和006(用于aspRS-OB)以及011和012(用于IF5A-OB)，從耐超高溫?zé)岚艟?M2基因組DNA(NC003364，(42)),擴增出aspRS-OB(來自耐超高溫?zé)岚艟?M2的asp-tRNA合成酶，堿基1-327，氨基酸1-109，NCBI登錄號NP—558783)和IF5A-OB(來自耐超高溫?zé)岚艟?M2的IF-5A,NP—560668,堿基208-399，^i^酸76-139)的野生型基因。寡核苷酸序列列于附件1中。用5ffwH/和五c^R/消化用于it^達的所有PCR產(chǎn)物，將其連接進pProEx-Htb中。pProEx-Htb產(chǎn)生了作為N-末端加上His6標簽的融合蛋白質(zhì)的蛋白質(zhì)。為將aspRS-OB基因克隆進pJARA140中，通過PCR，使用寡核苷酸對050/044來擴增出aspRS-OB，用iVco/和A^/對其進行消化。在連接之前，還用同樣的酶對pJARA140進行消化并且去磷酸化。為進行亞克隆，使用載體特異性引物來擴增選用的突變體基因，將其插入供體載體pDONR221，隨后插入pDEST15,這二者均為GATEWAY逸克隆系統(tǒng)(英杰生命科學(xué)公司(Invitrogen))的部分。pDEST15允許蛋白質(zhì)作為與谷胱甘肽-S-轉(zhuǎn)移酶(GST)的融合物來表達。大腸桿菌大腸桿菌K12菌林XLl-blue(43)被用于對源自pProEx的所有構(gòu)建體進行克隆和質(zhì)粒制備以及用于小規(guī)模的蛋白質(zhì)合成，大腸桿菌JM101衍生物TG1用于克隆所有的pRPSP2構(gòu)建體以及用于用VCS-M13輔助噬菌體產(chǎn)生的所有噬菌體。用pJARA131和pJARA112轉(zhuǎn)化的大腸桿菌K561(產(chǎn)生大腸桿菌K1762，(44))用于制備VCS-M13d3輔助噬菌體，用于多價展示。大腸桿菌BL21(DE3)(諾華公司(Novagen))用于大M^莫蛋白質(zhì)生產(chǎn)和純化。基因文庫構(gòu)建通過在選定的位置摻入含有密碼子NNK(N=A、C、G或T，K=T或G)的誘變性寡核苷酸來構(gòu)建文庫。通過PCR產(chǎn)生攜帶摻入的突變的AspRS-OB基因片段，然后將其裝配成全長基因。引入隨機化位置的長寡核苷酸列于表l中。在笫一個PCR步驟中，使用相應(yīng)的側(cè)翼引物，并且摻入在選定位置隨機化的寡核苷酸，來產(chǎn)生基因片段(30個循環(huán)，94。Cl分鐘，52.5°C30秒，68°C1分鐘)。在第二個步驟中，通過重疊序列延伸PCR(25個循環(huán)，94。Cl分鐘，52.5。C30秒，68。C1分鐘)，將基因片段裝配成全長基因。通過分光光度法來計算裝配的產(chǎn)物的量，令其超過1011個分子，以確保在后續(xù)步驟中保持108的多樣性。針對aspRS-OB和IF5A-OB分別使用栽體特異性引物005/006或011/012，通過PCR(30個循環(huán)，94°Cl分鐘，52.5°C30秒，68。C1分鐘)來擴增裝配的產(chǎn)物，對所述產(chǎn)物進行消化，并連接進pProEx-Htb。對于aspRS-OB的嗟菌體文庫來說，使用引物050/044以克隆進pRPSP2(見下文)。將含有野生型基因或裝配的文庫的質(zhì)粒轉(zhuǎn)化進大腸桿菌XL1-Blue,在補充有氨節(jié)青霉素(50ng/ml)的LB瓊脂平板上于37°C培養(yǎng)過夜。通過撿出單個菌落并在4150nlLB/Amp中對其培養(yǎng)數(shù)小時來進行診斷性PCR。用1pl該培養(yǎng)物進行10piPCR擴增(25個循環(huán)，94°C1分鐘，52.5°C30秒，68°C1分鐘)，其中分別使用針對pProEx-Htb或pRPSP2的診斷引物。對所有制備性PCR反應(yīng)使用聚合酶，而似《聚合酶僅用于診斷性PCR反應(yīng)。圖2A和2B示出了概括用于每種OB-折疊基因的裝配策略的流程。從文庫的蛋白質(zhì)過表達情況對于每種文庫而言，將經(jīng)轉(zhuǎn)化的細菌涂布到瓊脂(含有LB-amp)上，撿出單個菌落，在EppendorfThermomixer中，以1200rpm振蕩，將所述菌落在96深-孔板中的100filLB-amp(50fig.ml")中于37。C培養(yǎng)過夜。通過加入900pl新鮮的LB-amp來稀釋培養(yǎng)物，再培養(yǎng)60分鐘，然后使用1mM異丙基-D-疏代半乳糖吡喃糖苷(IPTG)在37°C誘導(dǎo)4小時。通過離心收集細菌細胞，將其重新懸浮于150filTris緩沖的鹽水(TBS:50mMTris-HCl，pH7.5,150mMNaCl)中，通過SDS聚丙埽酰胺凝膠電泳進行分析(SDS-PAGE，15%聚丙烯酰胺)。表1是用于aspRS-OB和IF5A-OB文庫構(gòu)建的長寡核苷酸的列表。針對反義密碼子，通過NNK:N-A/T/G/C,K^T/G或MNN:M=A/C來定義每種隨機化的密碼子。還見圖3A和3B。表l<table>tableseeoriginaldocumentpage43</column></row><table>通過冷凍-解凍和加入溶菌酶(0.5mg.mr1)來裂解重新懸浮的細胞，并且在不可溶物質(zhì)沉降后，還通過SDS-PAGE對可溶級分進行分析。通過使用5piNi-NTA樹脂(強基因公司(Qiagen)，德國)結(jié)合可溶蛋白質(zhì)來進行小規(guī)模純化步驟。用TBS洗Ni-NTA珠子，使用SDS-PAGE鑒定結(jié)合的蛋白質(zhì)。蛋白質(zhì)表達和純化野生型OB-折疊結(jié)構(gòu)域、aspRS-OB、IF5A-OB以及突變體IF5A-OB/A2和aspRS-OB/13mRL以亳克^J^達并被純化。在LB-amp(50Hg.mr1)中的大腸桿菌XL1-Blue的25ml過夜培養(yǎng)物^皮用于接種500mlLB-amp培養(yǎng)基。培養(yǎng)物在37。C被培養(yǎng)至OD600=0.6，通過1mMIPTG誘導(dǎo)4小時。通過離心收集細菌，將其貯藏于-20。C。將細胞重新懸浮于15mlTBS+10mM咪唑中，通過超聲處理來裂解。在加熱步驟中處理源自1F-5A的OB-折疊蛋白質(zhì)，所述步驟包括在85°C溫育30分鐘。這使得大腸桿菌蛋白質(zhì)的大部分變性。在SorvallSS-34轉(zhuǎn)子中以16,000rpm對經(jīng)裂解的細胞加以30分鐘的離心。為進行純化，將裂解物上樣到Ni-NTAHigh捕獲柱(trapcolumn)(愛,默生藥物公司(AmershamPharmacia)，瑞典)上。使用咪哇梯度從柱進行洗脫。針對不含咪唑的20mMTris-HClpH7.5、150mMNaCl對經(jīng)純化的蛋白質(zhì)進行透析，濃縮并通過大小排阻來進行第二次純化步驟，其中使用Superdex200柱(愛默生公司(Amersham))。噬菌體文庫制備用于用噬菌體工作的一般流程按照Barbas等人(45)來進行。為制備噬菌體aspRS-OB-pIII-Vd3的貯備物(stock)用于選擇，用具有處于pJARA140中的aspRS-OB的~6><109個大腸桿菌TGI細胞來接種200ml,2xYT-amp(50ng.ml")。將該培養(yǎng)物在37°C下振蕩生長1小時，并且用大約lxl0"個單位的Vd3輔助噬菌體在37。C下(不振蕩)感染30分鐘。然后洗滌細胞，在2xYT-amp中對其再進行4小時的培養(yǎng)。然后通過聚乙二醇(PEG)沉淀從培養(yǎng)物上清液濃縮出噬菌體，將其重新懸浮于TBS中，并貯藏于4。C。噬茵體效價^皮確定為3.0xl011TDP.ml"。為將aspRS-OB基因文庫克隆進pRPSP2中，寡核香酸對050/044被用于對裝配的基因文庫的PCR擴增。通過7VcW和iVW/來消化PCR產(chǎn)物。使用大約10ug的經(jīng)A^//A^/消化的噬菌體載體pRPSP2和插入片段(摩爾比為1:5)在1ml反應(yīng)體系中進行連接，接著在旋轉(zhuǎn)柱(羅切公司(Roche)或強基因公司(Qiagen)，Hilden，德國)上純化。通過電穿孔，將50ul洗脫物轉(zhuǎn)化進10x50pl電感受態(tài)大腸桿菌TG1細胞，產(chǎn)生大約1><108個轉(zhuǎn)化體。在100mlSOC培養(yǎng)基中，于37。C對經(jīng)轉(zhuǎn)化的細胞進行1小時的培養(yǎng)，之后加入400mlLB/Amp,再在37。C培養(yǎng)1小時。取樣，以評估連44接和轉(zhuǎn)化效率，這通過在LB/Amp瓊脂平板上涂布系列稀釋液并通過診斷性PCR針對正確插入片段大小對各克隆加以分析來實現(xiàn)。隨機撿出菌落，從對各克隆的診斷性PCR來測量正確插入片段的大小。正確大小的插入片段的數(shù)量為89%,菌落的數(shù)量被計算為9xl07，從而產(chǎn)生了攜帶正確大小的插入片段的8xl0""個不同克隆的多樣性。一旦培養(yǎng)物達到OD6(){)=0.4,就用大約5xlO"pfuVCS-M13輔助噬菌體(斯萊特因公司(Stratagene))對培養(yǎng)物進行感染，在37。C無攪動下保持20分鐘，然后振蕩l小時。加入卡那霉素，至終濃度為50ug/ml培養(yǎng)物，并且將培養(yǎng)物在37。C培養(yǎng)過夜。沉降細菌，并且在溶解于20gPEG8000(西格瑪/>司(Sigma))和15gNaCI之后，將噬菌體在4°C沉淀過夜。通過離心沉淀噬菌體，將其溶解于5mlPBS中，濾經(jīng)0.45過濾器，用于淘選。制備生物素化的RNA靼標使用MEGAscript試劑盒(安賓公司(Ambion)，USA)和含有生物素-16-UTP的生物素RNA標記混合物(羅切7>司(Roche)，瑞士)，通過體外轉(zhuǎn)錄，來產(chǎn)生經(jīng)生物素標記的asp-tRNA。基于表達PCR(41)，通過PCR將覆蓋了來自耐超高溫?zé)岵欧罹?8bpasp-tRNA基因(基因—ID:1464263)和從pET28(英杰生命科學(xué)公司(Invitrogen))擴增出的150bp的DNA片段(在其3，端包括T7啟動子區(qū)域，根據(jù)近來針對T7的啟動子識別研究(42)，這之后是GG，用于最優(yōu)啟動子活性)的合成寡核苷酸裝配起來，來制造DNA模板。這導(dǎo)致產(chǎn)生了230bp的裝配產(chǎn)物，將其用乙醇沉淀、干燥，并重新懸浮于不含RNase的H20中，并且無需進一步克隆就用作為轉(zhuǎn)錄模板(41)。按照廠商手冊(安賓公司(Ambion))來進行體外轉(zhuǎn)錄，其從25pi的反應(yīng)體系產(chǎn)生了5jig生物素化的asp-tRNA。對aspRS-OB文庫的選擇生物素化的asp-tRNA在從文庫"RL，，和"13mRL，，進行選擇中被用作為耙標，雌鳥卵溶菌酶(羅切公司(Roche)，瑞士)被用于僅從"13mRL，，45進行選擇。為在RNA上進行選擇，通過與包被有鏈親和素的順磁珠結(jié)合來固定生物素化的asp-tRNA。用400ulPBS-T(PBS，0.1%Tween)對10pl珠子洗2次，將其與100ng生物素化的asp-tRNA在RT、攪動和偶爾翻轉(zhuǎn)下孵育30分鐘。用PBS-T對珠子洗3次，之后與lml的1011cfu噬菌體文庫RL或13mRL在PBS-T+0.5%BSA中一起孵育2小時。用PBS-T洗6次(對于第一輪淘選而言)和8次(對于隨后的淘選輪次而言)之后，用PBS對珠子再洗2次，并將其與1ug(5個Kunitz單位)RNaseA(來自牛胰腺(bovinepancrease),羅切公司(Roche))—起在37。C酵育30分鐘，以消化RNA以及洗脫RNA結(jié)合的噬菌體。通過細菌感染來對洗脫的噬菌體顆粒加以計數(shù)，將其用于感染3ml新鮮的TGl培養(yǎng)物，以生產(chǎn)TDP用于下一輪的淘選。令培養(yǎng)物在37°C放置20分鐘(其間不攪動)，在振蕩下孵育1小時，之后加入氨節(jié)青霉素并培養(yǎng)過夜。將過夜培養(yǎng)物用于接種500ml預(yù)熱的LB/Amp。輔助噬菌體感染和TDP生產(chǎn)按照與上文列出的噬菌體文庫制備的流程相同的流程來進行。4輪淘選之后，對各克隆加以分才斤。為在溶菌酶上進行選擇，于4°C用2.5ml溶菌酶溶液(10ug/ml)(處于20mMNaC03pH9.0中)對4mlImmuno管(南克公司(Nunc)，Denmark)進行包被過夜，并且在RT下用4ml處于PBS中的1%BSA封閉1小時。加入來自文庫13mRL的噬菌體(2.5xl0"cfu，在2.5ml中)，并且在RT下、輕柔攪動和偶爾翻轉(zhuǎn)下，孵育2小時。通過用PBS-T0.1%BSA進行的8個洗滌步驟(對于第一M擇而言，用PBS-T僅進行6次洗滌)和用PBS進行的2個洗滌步驟，在5分鐘快速洗滌。通過與2.5ml洗脫緩沖液(0.2M甘氨酸-HCl，pH2.2，溴酚蘭)一起孵育10分鐘來洗脫結(jié)合的噬菌體，并且立即使用500ul1MTris-HClpH9.0中和。對洗脫的噬菌體加以計數(shù)，用其去感染新鮮的3mlTG1，用于TDP擴增以及隨后的淘選輪次。以與上文所述在asp-tRNA上進4亍淘選相同的方式來培養(yǎng)培養(yǎng)物和生產(chǎn)TDP。6M擇和擴增之后，撿出并分析克隆。用于噬菌體展示蛋白質(zhì)檢測的Western印跡通過PEG沉淀將aspRS-OB的噬菌體樣品濃縮至lx1011TDP/ml,取10pi與凝膠上樣緩沖液(含有SDS和BME)組合，煮沸，并在10%SDS-PAGE凝膠上進行分離。轉(zhuǎn)到硝化纖維素膜(Protran，絲萊澈&斯隆公司(Schleicher&Schuell)，德國)上之后，使用小鼠抗c-myc—抗(Zymed,英杰生命科學(xué)公司(Invitrogen))以及與HRP相連的抗小鼠二抗(愛默生藥物/>司(Amersham陽Pharmacia),瑞典)來檢測aspRS-OB曙pIII融合蛋白質(zhì)。使用SuperSigna產(chǎn)底物(皮爾斯公司(Pierce)，USA)來觀察。噬菌體ELISA進行噬菌體EL1SA實驗，針對與溶菌酶的結(jié)合來分析選出的克隆。用5ug/ml雌鳥卵溶菌酶、5ug/mlRNaseA或1%BSA(在PBS中)中在4°C對96孑LELISA板包4皮過夜。用TBS洗兩次之后，用封閉緩沖液(TBS中的5%脫脂乳)在RT下對平板封閉1小時，之后加入處于2.5%脫脂乳-TBS-T中的噬菌體(109cfu/孔，源于VCS-M13d3)。在RT和攪動下對平板進行2小時孵育。用BbO洗10次后，加入在封閉緩沖液中稀釋的小鼠抗M13蛋白質(zhì)VIII，并且在RT孵育1小時。將平板用H20洗四次，向孔中加入在封閉緩沖液中的辣根過氧化物酶(HRP)偶聯(lián)的兔抗小鼠免疫球蛋白質(zhì)(皮爾斯>^司(Pierce)),并且在RT下孵育1小時。用H20洗四次孔，每孔加入50ul底物溶液(處于PBS0.030%H202中的1mg/ml鄰苯二胺)。大約15分鐘后通過加入25ul2.5MH2S04來終止反應(yīng)，在492nm記錄吸光度。為進行相對噬菌體定量(對展示的融合蛋白質(zhì)的定量)，直接用噬菌體樣品來包被平板。用封閉緩沖液封閉之后，按照上文所述的流程，使用小鼠抗c-myc—抗(Zymed，英杰生命科學(xué)7>司(Invitrogen))和HRP綴合的抗小鼠二抗來檢測噬菌體。單克隆噬菌體制備為進行噬菌體結(jié)合實驗，使用VCS-M13d3(Vd3)的gin缺失變體(RakonjaC等人,1999)作為輔助噬菌體，制備作為多價展示的單克隆噬菌體樣品。為進行微淘選預(yù)篩選，使用源自wtVCS-M13的單價噬菌體。按照通常的方案(BarbasIII等人2001),從單個噬菌斑來制備輔助噬菌體VCS-M13和Vd3貯備物，不同之處在于，在TG1上培養(yǎng)VCS-M13，在大腸桿菌K1762(經(jīng)質(zhì)粒pJARA131(camr)和pJARA112(ampr)轉(zhuǎn)化的K561)上的Vd3被用作為宿主菌林以提供pIII用于噬菌體裝配。在65°C對Vd3才羊品加熱20分鐘，以從細菌宿主殺死L溶源體。為制備在Vd3或VCS-M13上的噬菌體aspRS-OB的貯備物，在100mlLB/Amp上對經(jīng)相應(yīng)pRPSP2衍生物轉(zhuǎn)化的大腸桿菌TG1進行培養(yǎng)，至OD,=0.4，并且分別用1012pfuVd3或VCS-M13對其加以感染。在37。C無攪動下孵育20分鐘后，再在振蕩下孵育培養(yǎng)物1小時。加入卡那霉素(50ug/ml終濃度)，對培養(yǎng)物孵育過夜。沉降細胞，使用PEG/NaCl按照現(xiàn)有的方案(BarbasIII等人)以及如上文討論的通過沉淀來純化噬菌體。將TDPs重新懸浮于PBS中并用于分析。asp-tRNA上的單克隆噬菌體結(jié)合實驗為測試噬菌體展示的蛋白質(zhì)與asp-tRNA的結(jié)合，用單克隆噬菌體樣品來在Vd3上以多價模式展示融合蛋白質(zhì)。基本上按照上文所述的第一輪選擇那樣來進行該流程。將生物素化的aSp—tRNA與包被有鏈親和素的順磁珠結(jié)合，應(yīng)用TDP樣品(109cfu/管)。孵育和洗滌步驟之后，通過加入RNaseA來消化RNA，并且通過細菌感染來對洗脫的TDP加以計數(shù)。GST的"下拉"測定將在溶菌酶上選擇的突變體亞克隆進GATAWAYpDEST15，用于作為GST-融合蛋白質(zhì)表達。將構(gòu)建體轉(zhuǎn)化進大腸桿菌BL21(DE3)，并且在3mlLB/Amp上對培養(yǎng)物進行培養(yǎng)。通過加入IPTG至終濃度為1mM來誘導(dǎo)細胞，并在37°C對細胞再進行4小時的培養(yǎng)。將細胞沉降，重新48懸浮于300ul裂解緩沖液(Tris-HCl7.5150mMNaCl)中，并且通過超聲處理裂解。將不可溶物沉降，并且將可溶級分與10ul連有谷胱甘肽的瓊脂糖珠子(愛默生公司(Amersham))—起在4°C孵育1小時。2次用TBS-T洗滌步驟之后，將珠子與包括150ul溶菌酶(1mg/ml)和0.1%BSA的300ulTBS-T在4°C醉育1小時。使用不同的緩沖液來進行洗滌TS(50mMTris-HClpH7.5,150mMNaCl)、TBS-T(20mMTris-HClpH7.5，150mMNaCl，0.1%Tween20)、TBS-T-500(TBS-T，500mMNaCl)。將珠子重新懸浮于凝膠上樣緩沖液(含有SDS和BME)中，煮沸并通過SDS-PAGE來進行分析。生物傳感器結(jié)合分析通過蛋白質(zhì)的一級胺基團，將配體溶菌酶以30照/mL(處于pH4.3的乙酸鈉緩沖液中)偶聯(lián)至CM5Biacore傳感器芯片上。用35fiL的EDC:NHS的1:1混合物(可自柏克y〉司(Biacore)商購獲得)以5jiL/分鐘激活芯片上可用的四個流動室(flowcell)中的第二個。通過連續(xù)注射10-20pL直到看到足夠的反應(yīng)為止，將溶菌酶偶聯(lián)到被激活的表面上。通過注射乙醇胺-HCl來對芯片上留下的未偶聯(lián)的活性基團進行滅活。為進行分析，以1:2系列稀釋為6種濃度組織OB313mRLL6，所述稀釋從在運行緩沖液中的370nM開始，還要加上僅有緩沖液的空白。使用笫一個流動室作為參考，以隨機順序，25pL/分鐘，對七份樣品的每份都一式兩份進行1分鐘的分析。觀察反應(yīng)曲線，用B"ev"/"fl"卵(柏克/>司(Biacore))對其進行加工。對每種濃度的相對反應(yīng)取均值并繪圖，以使用S&附tf尸/W(希斯特軟件公司(SystatSoftware,Inc.))確定Rmax和kD。實施例2:來自耐超高溫?zé)岚艟腛B-折疊結(jié)構(gòu)域為研究OB-折疊結(jié)構(gòu)域是否可用作為支架以產(chǎn)生具有特定結(jié)合和g性質(zhì)的蛋白質(zhì)，對各OB-折疊結(jié)構(gòu)域蛋白質(zhì)對穿過提出的結(jié)合面的突變的耐受性加以研究。選用來自耐超高溫?zé)岚艟?，超嗜熱crenarchaea(Tmax=49104。C，r。p,=100°C)的兩種OB-折疊結(jié)構(gòu)域。使用Superfamily數(shù)據(jù)(版本1.65(46))，遵循數(shù)據(jù)庫搜索來進行該選擇，以找到耐超高溫?zé)岚艟蚪M中的OB-折疊蛋白質(zhì)(42)。該數(shù)據(jù)庫使用已知結(jié)構(gòu)已被歸入1294SCOP超家族(SCOP:蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)分類)的所有蛋白質(zhì)的文庫，以開發(fā)隱藏的Markov模型，然后將其作為概圖(profile)，以在被測序的基因組中搜索可能含有相似折疊的蛋白質(zhì)。該搜索產(chǎn)生了14個命中(hit)，它們代表來自耐超高溫?zé)岚艟鶭iW2的基因組的含有可能的OB-折疊結(jié)構(gòu)域的蛋白質(zhì)序列。對這些序列中的每一條加以分析，以找到空間上與其它結(jié)構(gòu)域分開并且因此預(yù)計獨立穩(wěn)定的OB-折疊蛋白質(zhì)。還將序列與代表超家族的三維模型進行比對，或與可獲得的同源三維蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)進行比對，以檢查來自所述序列的OB-折疊預(yù)測的可靠性。這14條序列中，有8條滿足標準(見表2)。八條候選序列中的六條屬于RNA結(jié)合蛋白質(zhì)的兩個功能類翻譯起始因子(IF)和氨酰-tRNA合成酶(aaRS)。兩條候選序列沒有功能標注，并且被歸類為"保守的假設(shè)蛋白質(zhì)"。克隆來自所選序列的OB-折疊結(jié)構(gòu)域。從序列比對來鑒定結(jié)構(gòu)域邊界，并針對在大腸桿菌中的表達和溶解性來對所述結(jié)構(gòu)域邊界加以測試。最初選用來自天冬氨酰tRNA合成酶的OB-折疊結(jié)構(gòu)域(aspRS-OB)和來自翻譯起始因子IF-5A的OB-折疊結(jié)構(gòu)域(IF5A-OB)，因為它們表達良好，并且可溶還是熱穩(wěn)定的。IF-5A蛋白質(zhì)的另一優(yōu)點在于Pfam凝:據(jù)庫中高分辨率三維結(jié)構(gòu)的可獲得性(34)，從中可可靠地選擇暴露于表面的殘基來進行隨機化。IF-5A的這種結(jié)構(gòu)(圖3)顯示了在C-末端具有OB-折疊并且被接頭區(qū)域空間上分離的兩個結(jié)構(gòu)域，由此滿足我們的選擇標準。提出的結(jié)合面(p-鏈l-3)背離蛋白質(zhì)中央并朝向溶劑。IF-5A的OB折疊具有S二8的剪切數(shù)，并且因此代表了OB-折疊結(jié)構(gòu)域的一個亞類。asp-tRNA合成酶的OB-折疊結(jié)構(gòu)域(aspRS-OB)被選用為具有S=10的性質(zhì)的OB-折疊蛋白質(zhì)第二亞類的代表。來自耐超高溫?zé)岚艟腶spRS的三維結(jié)構(gòu)尚不可獲得，但是PDB中有針對來自其它生物的aspRS蛋白質(zhì)的多種結(jié)構(gòu)。圖4展示了來自大腸桿菌的aspRS的晶體結(jié)構(gòu)(37)。對來自耐超高溫?zé)岚艟鷄spRS的OB-折疊結(jié)構(gòu)域及其大腸桿菌同源物的序列比對顯示，OB-折疊結(jié)構(gòu)域具有30。/。的序列同一性。aspRS蛋白質(zhì)在其全長上20%相同(序列水平)。OB-折疊位于N-末端，并且在空間上與更大的C-末端結(jié)構(gòu)域清楚地分開。結(jié)合面背離C-末端結(jié)構(gòu)域，朝向溶劑。盡管N-末端OB-折疊結(jié)構(gòu)域與tRNA結(jié)合并且構(gòu)成反密碼子識別結(jié)構(gòu)域，與天冬氨酰-tRNA反密碼子特異性結(jié)合(36)，而C-末端構(gòu)成蛋白質(zhì)的^成分。表2顯示了八條選自耐超高溫?zé)岚艟?、具有預(yù)測的OB折疊的序列。NP登錄號與預(yù)測的大小和提出的剪切數(shù)一起給出。IF-5A的三維結(jié)構(gòu)是可獲得的。保守的假設(shè)蛋白質(zhì)NP—559846的預(yù)測尺寸與完整蛋白質(zhì)相對應(yīng)。在這種情況下，難于精確預(yù)測OB-折疊結(jié)構(gòu)域的邊界。表2<table>tableseeoriginaldocumentpage51</column></row><table>這些OB-折疊結(jié)構(gòu)域中的每種在所有界中都具有同源體，這提供了應(yīng)用于不同生理學(xué)背景的機會(關(guān)于對來自不同物種的aspRS(圖5A)和IF-5A(圖5B)的序列比對，參見圖5A-5B)。圖5C顯示了對來自耐超高溫?zé)岚艟⑹?A^由A;fln^";s&和大腸桿菌的aspRS-OB的序列比對。序列中相同之處通過星號來表示。OB-折疊的二級結(jié)構(gòu)示于序列下方在鏈4和5之間的l+環(huán)，環(huán)4/5。實施例3:選擇用于隨機化的殘基基于其三維結(jié)構(gòu)，來選擇兩種OB-折疊結(jié)構(gòu)域中用于隨機化的殘基。IF-5A的結(jié)構(gòu)是可獲得的。使用SwissModel(38-40)，以及來自大腸桿菌(36，37)和i^nc(cc"sA:(w/flA:flrae";y/s(35)的可獲得的結(jié)構(gòu)作為結(jié)構(gòu)才莫4反，通過模造來產(chǎn)生來自耐超高溫?zé)岚艟腶spRS的OB折疊的結(jié)構(gòu)。在OB-折疊結(jié)構(gòu)域的結(jié)合面，從p-鏈l-3選擇暴露于表面的殘基。鑒于aspRS和IF5A的OB-折疊結(jié)構(gòu)域具有不同的剪切數(shù)，它們的結(jié)構(gòu)也略有不同。具體而言，p-鏈4和5與這些鏈之間的環(huán)在一起的排列有所不同。在aspRS-OB的情況下，鏈4和5之間的環(huán)也被包括進來，在文庫之一中用于隨機化。因此，對于aspRS-OB而言，位于p-鏈1-4上和鏈4和5之間的環(huán)中的13個暴露于溶劑的殘基被選用來進行隨機化。這給出了突變位點的最大數(shù)為17個以及20"^1.3xl(^個可能的突變體的理論可變性。為了評估此類突變的耐受性，構(gòu)建一組文庫獨立展現(xiàn)結(jié)合面的部分。對于IF5A-OB而言，構(gòu)建這樣的文庫，其在(3-鏈1-3(圖8)上的9或11處位置上隨機化，產(chǎn)生了兩個文庫，分別具有209=5.12xl011和20"=2xl0"個變體的經(jīng)計算的理論變異。生成兩個小文庫(每個400個變體)，其通過隨機化兩個引入的殘基(絲氨酸-天冬酰胺)(2RL)或通過使用另外的兩個殘基延伸環(huán)(2RL+2)來耙向鏈1和2之間的環(huán)。OB-折疊結(jié)構(gòu)域中具體的選擇的殘基和其位置見圖8和9。實施例4:OB-折疊文庫構(gòu)建一組文庫，它們展現(xiàn)了每種OB-折疊結(jié)構(gòu)域的被定義區(qū)域。對于aspRS-OB-折疊結(jié)構(gòu)域而言，對p-鏈進行各突變，并將它們互相組合。鏈4和5之間的環(huán)在野生型OB-折疊結(jié)構(gòu)域(即，天然存在的OB-折疊結(jié)構(gòu)域)中和在完全隨機化文庫中被分別隨機化。因此構(gòu)建了五個具有不同大小并且隨機化位置不同排列的文庫(見表3A-3B)。對于IF5A-OB而言，p-鏈l-3以及鏈l和2之間的環(huán)被耙向用于隨機化。該環(huán)(鏈1和2之間)被靼向用于隨機化，以評估其延伸隨機化表面區(qū)域的潛力。在該區(qū)域顯示出延伸的環(huán)的天然存在的OB-折疊蛋白質(zhì)有若干例子，這表明該環(huán)可被延伸。采用用于aspRS-OB-折疊結(jié)構(gòu)域的一種相似手段，通過PCR裝配具有不同突變組的文庫(見表3)，將其克隆#達載體，并在大腸桿菌中表達。撿出代表了攜帶突變的文庫成員的克隆，針對正確大小的插入片段、作為加HiS6-標簽的蛋白質(zhì)的表達、溶解性和與Ni-NTA-樹脂的結(jié)合對其加以分析。表3A<table>tableseeoriginaldocumentpage53</column></row><table>表3A-3B是針對aspRS-OB的基因文庫的列表。后綴"m，，表示覆蓋卩-鏈l-3的P-片層中的突變。后綴"RL，，表示隨機化的環(huán)區(qū)域(aspRS-OB的情況下是環(huán)4/5，IF5A-OB的情況下是環(huán)1/2)。實施例5:文庫裝配基本上基于重疊序列延伸PCR來裝配文庫，其中在想要的位置摻入了具有簡并密碼子的合成寡核苷酸。首先，通過普通PCR技術(shù)產(chǎn)生覆蓋整個基因并且含有重疊區(qū)域的基因片段。通過摻入相應(yīng)的含有隨機化密碼子的長寡核苷酸來產(chǎn)生隨機化片段。使用等摩爾的這些基因片段組合在基因側(cè)翼的引物，通過PCR來裝配片段，從而擴增出摻入了隨機化位置的全長基因。使用簡并寡核苷酸的不同組合，產(chǎn)生在結(jié)合面的不同區(qū)域含有隨機突變的若干文庫。在aspRS-OB中，在p片層W28、E29、R31、133、R35、V36、F38、V40、R42、F47、Q49、T51、K53上和環(huán)區(qū)域I85、A86、K87、S88中的殘基處，產(chǎn)生多樣性。文庫RL(隨機化的環(huán))在p鏈-4和5之間的環(huán)區(qū)域中含有4個隨機化的位置。RL文庫的理論多樣性是204=160000種不同的變體。轉(zhuǎn)化之后，文庫RL含有1(T個克隆，其中94%具有正確大小的插入片段，從而得到了對文庫多樣性的完全覆蓋。13mRL的理論多樣性非常高，其具有~5xl(P種變體。轉(zhuǎn)化之后獲得了108個克隆，其中89%具有正確的插入片段。在被測序的10個克隆中，8個具有想要的經(jīng)突變序列，而2個克隆具有移碼，這導(dǎo)致了無義翻譯。13mRL文庫中總的多樣性祐」估計為~8><107種變體。產(chǎn)生針對IF5A-OB的各文庫。"9m"和"llm"文庫每個都具有摻入基因中的不同的長寡核苷酸對。針對llm文庫而言，可對環(huán)l/2進行4個氨基酸的延伸(Ser-Asn-Gly-Ala)，以提供對隨機化片段的充分覆蓋。對于小文庫2RL和2RL+2而言，使用覆蓋相應(yīng)區(qū)域的、含有摻入到基因中的隨機化位置的一條寡核苷酸，來在環(huán)區(qū)域中產(chǎn)生隨機化位點。具有9和11處突變的IF-5A文庫的多樣性被估計為lxl(T種變體，小文庫的理論多樣性(400種變體)被完全覆蓋。實施例6:OB-折疊突變體蛋白質(zhì)的表達天然存在的OB-折疊結(jié)構(gòu)域在大腸桿菌(培養(yǎng)物的10-20mg.r1)中都表達良好，并且在細胞裂解之后絕大部分可溶。熱處理(85。C，15分鐘)后它們?nèi)员３挚扇?，并且與Ni-NTA珠子定量結(jié)合?？寺B-折疊文庫，并且將其作為N-末端加His6-標簽的蛋白質(zhì)表達。記錄了一組蛋白質(zhì)特性，它們展現(xiàn)了蛋白質(zhì)穩(wěn)定性和結(jié)構(gòu)完整性。將PCR文庫克隆i^達載體，效率為卯-95。/。(通過菌落PCR確定)，并且基因在大腸桿菌中作為多聚組氨酸融合蛋白質(zhì)表達。針對表達、溶解性和M-結(jié)合對48個或96個菌落進行了篩選。結(jié)果被概括于表4中。表4<table>tableseeoriginaldocumentpage55</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage56</column></row><table>對用于aspRS-OB的文庫構(gòu)建的概括示于表4中。對于每個文庫而言，列出了PCR產(chǎn)生的基因片段、寡核苷酸和模板。通過摻入寡核苷酸的PCR生成了基因片段。然后使用基因側(cè)翼引物(寡聚體005和006)通過重疊序列延伸PCR，將PCR產(chǎn)物裝配成全長基因。還見圖2A-2B。來自所有aspRS-OB文庫的克隆中有大約一半在大腸桿菌中表達良好。P-片層上隨機化的位置的數(shù)量(即，為了構(gòu)建文庫在結(jié)合面上被隨機化的氨基酸位置的數(shù)量)看起來與表達變體的百分比相關(guān)。對于具有13處突變的兩種文庫(13mRL和13m)而言，突變體蛋白質(zhì)中~45%表達良好。在j3-片層l和2上含有9處突變的文庫顯示在52%的克隆中表達。僅革G向環(huán)4/5用于隨機化的文庫具有非常高的表達克隆數(shù)量(81%)。但是，在所述面和延伸的環(huán)上被隨機化的位置的組合(13mRL+2)將表達克隆的數(shù)量降低至只有30%。在IF5A-OB的情況下，在P-片層上具有突變的文庫以相當?shù)偷乃奖磉_(12%),其中9-25%是可溶的。相反，僅在環(huán)1/2中含有隨機化位置的突變中的72-81%表達，其中70%是可溶的。裂解后在80。C對所有IF5AOB突變體進行熱處理。由此所有可溶的和Ni-結(jié)合的突變體也是熱穩(wěn)定的。撿出一些突變體用于制備性表達和純化。此外，還進行對aspRS-OB突變體的大M^莫純化。表5顯示了對表達、溶解性和Ni-NTA-結(jié)合實驗的概括。表5<table>tableseeoriginaldocumentpage58</column></row><table>對于每種文庫而言，針對表達、溶解性和與M-NTA的結(jié)合篩選了32至192個菌落。表5顯示了每種文庫的表達克隆的數(shù)量、計算出的表達克隆的比例，并且展示了對表達OB-折疊突變體的溶解性和Ni-NTA結(jié)合性質(zhì)的評估。實施例7:分析噬菌體展示的aspRS-OB對于作為支架用于文庫產(chǎn)生的蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)域的重要標準是其在選用的展示系統(tǒng)上功能性展示的能力。本文公開的實驗采用了噬菌體展示。為評估該技術(shù)用于選擇aspRS-OB突變體的有效能力，對在絲狀噬菌體M13表面上重組野生型aspRS-OB作為gIII融合物的展示進行了評估。通過Western印跡分析了在制備的噬菌體顆粒中plII-aspRS-OB融合物的存在。使用asp-tRNA作為靶標配體，通過噬菌體結(jié)合測定，來研究展示的aspRS-OB的功能性展示。將針對野生型aspRS-OB的基因克隆進嗟粒載體pRPSP2(gIII基因的上游)，產(chǎn)生了在N-末端與aspRS-OB并且在C-末端與pIII的融合蛋白質(zhì)(見圖6)。該噬粒載體含有處于噬菌體休克啟動子(psp)控制下的gIII，該啟動子會被輔助噬菌體對大腸桿菌宿主的感染而激活(31)。輔助噬菌體VCS-M13d3是glII缺失突變體(44),其被使用，允許靶標蛋白質(zhì)的多價展示。gill蛋白質(zhì)的所有拷貝(3-5個拷貝)將是與靶蛋白質(zhì)aspRS-OB的融合物。多價展示被用于在結(jié)合測定中增加敏感性(48)。將含有用于aspRS-OB的基因的構(gòu)建體pRPSP2轉(zhuǎn)化進大腸桿菌TG1細胞。通過Vd3輔助噬菌體來感染得到的培養(yǎng)物，產(chǎn)生轉(zhuǎn)導(dǎo)顆粒(TDP)。收獲這些重組噬菌體，使用位于aspRS-OB和pIII之間的c-myc抗原序歹'J的抗體，通過western分析，針對耙標蛋白質(zhì)的展示來對所述重組噬菌體加以測試(見下文中的圖)。這表明針對融合蛋白質(zhì)pUI-aspRS-OB的具有預(yù)計大小的強信號。為測試展示的野生型OB-折疊在噬菌體表面是否仍然具有功能性，對被固定的asp-tRNA與展示aspRS-OB的該噬菌體樣品進行噬菌體結(jié)合實驗。將展示aspRS-OB的TDP樣品與固定到磁珠上的asp-tRNA—起孵育。未結(jié)合的噬菌體被洗去，使用RNaseA通過tRNA消化來洗脫結(jié)合的噬菌體。然后通過細菌感染來對洗脫的噬菌體加以計數(shù)，將該數(shù)量與從僅與珠子一起孵育的樣品上洗脫下來的數(shù)量加以比較。為表明結(jié)合的特異性，向TDP樣品中加入〉1000倍過量的VCS-M13wt，對洗脫的顆粒的數(shù)量進行計數(shù)。對每份樣品來計算從tRNA洗脫的噬菌體與輸入的噬菌體的比例。輸入和結(jié)果被概括于下表中。表6<table>tableseeoriginaldocumentpage59</column></row><table>較之僅噬菌體的情況(5.7xl(T4,見圖8)，展示aspRS-OB的噬菌體(2.4xl0—2)的回收是大約200倍高。這表明了展示的aspRS-OB與固定的asp-tRNA之間的顯著親和性。在沒有展示的蛋白質(zhì)的VCS-M13的情況下，從僅珠子的情況洗脫的顆粒較^M皮固定的tRNA洗脫的顆粒的比例非常接近(1:1.42)，這表明噬菌體是非特異性結(jié)合的。對于展示aspRS-OB的顆粒而言，該比例要高得多(1:190.48)，這表明了該結(jié)構(gòu)域?qū)sp-tRNA的結(jié)合特異性。這些結(jié)果表明，aspRS-OB在噬菌體表面展示時功能上是完整的。實施例8:文庫選擇在asp-tRNA上的選擇在細菌aspRS反密碼子結(jié)合結(jié)構(gòu)域中p片層4和5之間的的環(huán)區(qū)域?qū)τ谂ctRNA的結(jié)合以及對反密碼子中堿基的特異性識別來說是重要的(49)。因此asp-tRNA被認為是用于測試aspRS-OB文庫有效能力的好的靶標。使用文庫aspRS-OBRL，因為其含有對理論多樣性的全部覆蓋，因此含有預(yù)計于tRNA靶標良好結(jié)合的野生型aspRS-OB折疊序列的拷貝。即使沒有突變體與tRNA結(jié)合，至少應(yīng)當通過生物淘選過程選出野生型。像以前那樣產(chǎn)生aspRS-OBRL基因文庫，將其克隆進pRPSP2，產(chǎn)生107個克隆，在噬菌體上單價展示。四輪淘選之后，觀察到顯著的富集，這由輸出噬菌體對輸入噬菌體的比例表示——這表明了靶特異性結(jié)合結(jié)構(gòu)域的富集(圖9)。從選擇的級分中隨機撿出克隆并對其進行測序。序列顯示了用于與asp-tRNA結(jié)合的、環(huán)區(qū)域中4個氨基酸的共有序列R/KGCR(圖10)。在12條序列克隆中，5條完全滿足該共有序列，剩下7條中有3條符合4個M酸位置中的3個。所述共有序列與野生型序列(IAKS)顯著不同，這表明，新的共有序列較之野生型結(jié)構(gòu)域而言更強地結(jié)合asp-tRNA。這在使用單克隆噬菌體制備物的噬菌體結(jié)合實驗中得到了驗證，其中，兩個克隆比野生型aspRS-OB對asp-tRNA的親和性更高(圖16)。對該實驗而言，將展示相應(yīng)的突變體結(jié)構(gòu)域的噬菌體與固定的asp-tRNA—起孵育。結(jié)合的噬菌體被RNaseA特異性洗脫并被計數(shù)。回收率R被計算為[(輸出/輸入)b/(輸出/輸入)RNA，其中(輸出/輸入)表示回收的噬菌體(輸出)除以輸入噬菌體的數(shù)量的比例，下標"B，，代表4叉珠子的情況，下標"RNA，，代表被固定的asp-tRNA的情況。結(jié)果表明我們已經(jīng)從源于aspRS-OB突變體的噬菌體文庫富集了對被固定的asp-tRNA的結(jié)合親和性增強的共有序列(圖lO和ll)。以同樣的方式，使用更大的文庫"13mRL，，(其較之"RL，，具有大得多的多樣性)，針對被固定的tRNA來進行選擇。富集模式示于圖9中，這表明了5輪淘選之后的顯著富集。序列分析被概括于圖12中。選出的序列含有高比例的帶正電荷氨基酸，這表明這些突變體是通過與帶負電荷的asp-tRNA主鏈結(jié)合而被選出的。具有最大堿基數(shù)量的突變體(D07)祐義現(xiàn)了三次，這表明了在選出的克隆庫中的高豐度。在從選出的克隆D07和D09制備的被固定的asp-tRNA單克隆噬菌體樣品上進行的噬菌體結(jié)合實驗表明，以比野生型aspRS-OB結(jié)構(gòu)域高數(shù)倍的數(shù)量回收了這些克隆，這表明了被展示的突變體與asp-tRNA的更強的結(jié)合。這些噬菌體結(jié)合實驗并非精確測量，但是這表明了成功的選擇過程，并且顯示aspRS-OB文庫可用于使用噬菌體展示針對被固定的乾標來進行選擇。圖12中選出的克隆的完整序列列于附件II中，它們浮皮命名為U1、U2、U3、U4、U5、U6、U7、U8、U9、S68、S81、pMB16、pMB17、pMB12、pMB18、pMB15、D05、D07、D09、D04、L14、L8、L4、L16、L34、L42、L6、L5或L44。實施例9:在溶菌酶上的選擇溶菌酶被選用為靶標，用于表明從幼稚(na'ive)文庫選擇與另一蛋白質(zhì)結(jié)合的OB-折疊突變體結(jié)構(gòu)域的原則驗證。雌鳥卵白溶菌酶是小且穩(wěn)定的蛋白質(zhì)，其可商業(yè)獲得，并且具有多種醫(yī)學(xué)上重要的人同源物。在被固定的溶菌酶上進行四輪淘選之后，觀察到結(jié)合的噬菌體的富集。再進行兩輪淘選，之后隨機撿出克隆，針對與溶菌酶的結(jié)合對其加以篩選。然后制備單克隆噬菌體樣品，并且進行研究以在"微淘選，，方案中表征在96孔ELISA板上固定的溶菌酶上的結(jié)合。對結(jié)合的噬菌體加以洗脫和計數(shù)。22個克隆中有9個表現(xiàn)出了超過pIII、OB野生型和BSA的背景的回收數(shù)(克隆L4、L5、L6、L8、L14、L15、L16、L18、L21，圖13)。對這些克隆加以測序。這些克隆中有一些的序列是相同的(L14和L15;L4和L18;L18和L21)，這將獨特克隆的數(shù)量縮小到六條。這種冗余性表明由于富集導(dǎo)致樣品中具有相同序列的克隆比例高。再進行兩輪淘選，對再6個克隆加以測序(L32、L33、L34、L42、L43、L44)。三條序列與以前的克隆的序列匹配(L32=L14=L15，L33=L8=L21=L43)，而L44與L5在p片層區(qū)域相同，但是在環(huán)區(qū)域卻顯示出不同的模式。L34和L42是新的序列。可假設(shè)6輪之后選出的庫中的克隆數(shù)量非常小，并且被圖12的圖E中顯示的9條序列很大程度上覆蓋。使用多價展示，以ELISA手段對克隆IJ4(L32、L15)、L8(L33、L21、L43)、L34、L4、和L6進行結(jié)合研究(圖14)。結(jié)果顯示，所有克隆與溶菌酶結(jié)合，而沒有展示的aspRS-OB的顆粒則不(pill)。其它陰性對照包括野生型aspRS-OB(OBwt)。所有被分析的克隆都以比RNaseA或BSA更高的數(shù)量(在ELISA實驗中是較高的OD值)與溶菌酶結(jié)合，這表明了與溶菌酶結(jié)合的特異性。如圖11所示，克隆L6和L33不結(jié)合tRNA。實施例10:對經(jīng)純化突變體的表達和分析將克隆L4(L18)、L5、L6、L16和L33(L21)亞克隆ii^達載體，并作為GST融合蛋白質(zhì)表達，用于在"下拉，，測定中針對溶菌酶結(jié)合加以分析。如圖15A-15B所示，被固定的突變體結(jié)合溶菌酶，而未選出的突變的13mRL81則不結(jié)合。這^了選出的突變體與溶菌酶的結(jié)合。在存在不同緩沖液的情況下，研究L6與溶菌酶的結(jié)合。圖15B顯示，在用500mMNaCl洗滌之后，L6與溶菌酶結(jié)合。克隆L6表達并被純化，使用表面等離振子共振(柏克公司(Biacore))來分析其在被固定的溶菌酶上的結(jié)合動力學(xué)。結(jié)合常數(shù)被計算為3Axl(T5M(圖l6)。這些實驗表明了含有隨機化的密碼子的大的合成的OB-折疊結(jié)構(gòu)域文庫的產(chǎn)生，并且表明，來自這些文庫的經(jīng)轉(zhuǎn)錄的突變體蛋白質(zhì)是穩(wěn)定的和折疊的。OB-折疊結(jié)構(gòu)域的功能性展示在噬菌體表面上顯示，由此允許針對選用的不同功能對文庫進行有效篩選。表明了使用噬菌體展示從OB-折疊文庫來選擇經(jīng)修飾的OB-折疊結(jié)構(gòu)域。這些變體必須具有想要的性質(zhì)，它們因為結(jié)合相互作用或酶活性被選出。如本文所表明的，來自耐超高溫?zé)岚艟奶於彼醫(yī)RNA合成酶(AspRS)的tRNA反密碼子結(jié)合結(jié)構(gòu)域#1選用為OB-折疊支架，以表明OB-折疊用作為多樣性載體的可應(yīng)用性。結(jié)果表明，可通過應(yīng)用本文公開的方法將該tRNA反密碼子結(jié)合結(jié)構(gòu)域轉(zhuǎn)化為特異性的蛋白質(zhì)結(jié)合分子。引入蛋白質(zhì)構(gòu)架的每種突變可能能影響其折疊并且由此影響到其穩(wěn)定性和溶解性。為理解蛋白質(zhì)構(gòu)架中對突變的耐受性，產(chǎn)生含有經(jīng)突變區(qū)域的不同組或組合的文庫，并且針對隨機撿出的突變體的表達和溶解性對其加以篩選。計劃并產(chǎn)生具有無限制多樣性的文庫。此類幼稚文庫含有隨機化導(dǎo)致的突變的所有可能組合。預(yù)計大量突變是無法被耐受的，這是因為在分子特定區(qū)域中不利的氨基酸組合導(dǎo)致的穩(wěn)定性、折疊或溶解性的理由造成的。產(chǎn)生源于aspRS-OB的文庫，其中在結(jié)合面中含有17個隨機氨基酸位置，在p片層(p鏈l-3)上含有13個，在鏈4和5之間的環(huán)中含有4個。產(chǎn)生了這樣的文庫，其包含僅顯示各p鏈或環(huán)區(qū)域的突變的組。在針對表達和溶解性對經(jīng)修飾的OB-折疊結(jié)構(gòu)域的文庫加以篩選之后，發(fā)現(xiàn)，在aspRS-OB的17-突變文庫中，所有突變體中的16%過表達并且可溶，并且通過NMR和CD鐠所表明的，一些選出的突變體被證明是正確折疊的。這表明，該文庫中有顯著的一部分可用于針對感興趣的耙標進行選擇。AspRS-OB文庫13mRL和RL作為噬菌體展示文庫被構(gòu)建。13mRL的實際多樣性為8xl(^個不同的克隆，這代表了17個隨機位置的5xl(P種可能組合(理論多樣性)的非常小的一部分。RL的多樣性僅為1.6xl05(4個隨機位置)，這預(yù)計轉(zhuǎn)化之后孝皮~1><107個克隆完全覆蓋。對隨機撿出的克隆的測序驗證了文庫的多樣性。噬菌體展示是最常用的展示技術(shù)，其因此是對aspRS-OB支架的展示有利的。沒有報道過在噬菌體表面對aspRS反密碼子結(jié)合結(jié)構(gòu)域的展示，也沒有一般性地報道過任何其它OB-折疊結(jié)構(gòu)域的展示。在噬菌體上展示蛋白質(zhì)需要若干步驟，這可能影響到展示的蛋白質(zhì)的完整性以及宿主細胞的生長。在細胞質(zhì)中合成之后，蛋白質(zhì)在細胞的還原環(huán)境中必須要是穩(wěn)定的，并且應(yīng)當不受與pIII噬菌體蛋白質(zhì)融合的影響。然后通過氧化周質(zhì)環(huán)境來靶向融合蛋白質(zhì)，用于噬菌體裝配，之后將整個噬菌體顆粒釋放進培養(yǎng)基。對于任何蛋白質(zhì)而言，這個過程包括在多個階段與環(huán)境的相互作用，并且，在源于反密碼子結(jié)合結(jié)構(gòu)域的支架的情況下，與宿主核酸的結(jié)合也必須要被考慮。對在M13噬菌體上展示的aspRS-OB的檢測(通過Western分析)表現(xiàn)出良好的表達。對aspRS-OB文庫RL和更大的13mRL的檢測(也是通過Western印跡)表明在噬菌體上的低效的多的展示。該觀察可解釋為在幼稚隨機文庫中高程度的不穩(wěn)定突變體。這些數(shù)據(jù)表明對大腸桿菌胞質(zhì)和周質(zhì)中不利突變體的蛋白水解降解，這種效果在以前對來自A蛋白的Z-結(jié)構(gòu)域的研究中也被觀察到(50)。這還與來自表達和溶解性篩選的結(jié)果相關(guān)。在其它支架(碳水化合物結(jié)合結(jié)構(gòu)域，(51);纖維素結(jié)合結(jié)構(gòu)域，(52))中觀察到了噬菌體展示文庫的較弱信號。對其它文庫的文庫設(shè)計需考慮該因素，以增加展示的融合與降解的比例。這是幼稚隨機文庫的通常問題，而不是僅在OB-折疊中觀察到的現(xiàn)象。在asp-tRNA上的選擇在天然靶標asp-tRNA上的噬菌體結(jié)合和選擇實驗表明在M13噬菌體上對asp-OB和源自其的文庫的成功的功能性展示。從小的RL文庫獲得了共有序列，其代表比野生型具有更高親和性的突變體，如在單克隆淘選實驗中所顯示的。得到的共有序列R/KGCR與野生型序列不同，其含有2個帶正電荷的氨基酸，表示了與帶負電荷的RNA主鏈的結(jié)合。該環(huán)區(qū)域中甘氨酸的存在可確保了環(huán)的柔性，但半胱氨酸的功能尚不清楚。未被選出的克隆的序列表現(xiàn)了aspRS-OBRL文庫的多樣性，來自選棒后與共有序列匹配的克隆的序列表現(xiàn)了相應(yīng)DNA密碼子的變化，這表明是對表型的選擇而非對基因型的選擇。由于對多樣性文庫13mRL的非常有限的覆蓋，不能從少量的在asp-tRNA上選出的克隆序列獲得共有序列。這是意料之中的，因為實際多樣性為大約108個克隆，而理論多樣性為大約1022。因此，噬菌體文庫的多樣性覆蓋僅是理論可能的極小部分。在所有被測序的克隆中都觀察到了顯著量的帶正電荷殘基(D07中9個，D05中5個，D09中6個)，這表明通過與帶負電荷的RNA主鏈的結(jié)合來針對帶正電荷的殘基進行的選擇。兩個突變體(D07、D04)中存在的基序RXGS表明環(huán)在tRNA結(jié)合中的重要作用，如對野生型aspRS-OB來說情況是這樣。與單克隆噬菌體樣品進行的結(jié)合實驗顯示了與asp-tRNA的更強的結(jié)合(較之野生型結(jié)構(gòu)域而言)。這支持了下述結(jié)論在與被固定的靶標結(jié)合的情況下，選擇存在并表明，我們的OB-折疊支架非常適合在噬菌體上展示以及生物淘選過程。在溶菌酶上的選擇在雌鳥卵溶菌酶選擇13mRL文庫。數(shù)輪淘選之后，分離出多個克隆，針對序列以及針對與耙標分子的結(jié)合對它們加以分析。在預(yù)篩選中，22個克隆中有6個在噬菌體ELISA實驗中最終表現(xiàn)出可被檢測到的與溶菌酶的結(jié)合。對14個克隆的序列的檢查揭示，兩條被檢測了兩次，一條甚至被檢測了四次。這表明選用的部分中不同克隆的數(shù)量相當?shù)匦　?個不同克隆的序列指示出它們組成中的相似性。一些位置顯示了一些令人感興趣的相似性，例如，位置29，其在9個克隆的6個中都是酸性殘基(D或E)，而位置31在9條序列中的5條中都是纈氨酸，在位置35中有4個克隆中都出現(xiàn)了帶正電荷的殘基，而位置38在5種情況下都是芳香族殘基(Y、F、W)，最后，位置85在5個克隆中都是甘氨酸。此外，在p鏈3中，克隆L16和克隆L34中存在顯而易見的ETET和PETE模式，在(5鏈1中，L32、L2、L6、L5、L44中存在DV/LA/L。還注意到了L5和L44在P片層中形同，而環(huán)區(qū)域不同。除了L6之外，其它所有突變體都沒有半胱氨酸。但是，沒有獲得更為明顯的共有序列，這可能是由于對非常大的文庫的覆蓋較窄并且獲得的序列數(shù)量很小。若干克隆被表達，并作為GST融合蛋白質(zhì)被純化，通過下拉實驗對它們進行了分析，表明克隆與溶菌酶的結(jié)合?？寺6甚至在存在500mM氯化鈉時結(jié)合，這表明了相當?shù)慕Y(jié)合親和性?？寺6被表達并被純化，通"面等離振子共振，分析了其結(jié)合的動力學(xué)和熱力學(xué)，顯示出3.6xlO-5M的^?？紤]到該幼稚文庫的較小尺寸和組成，結(jié)合常數(shù)在jiM的范圍是非常顯箸的結(jié)果，其為通過親和成熟流程來進行優(yōu)化提供了優(yōu)秀的起點。實施例11:在與溶菌酶的復(fù)合體中OBodyL8的三維結(jié)構(gòu)使用Gateway(英杰生命科學(xué)7>司(Invitrogen))將L8克隆進pDONR221,然后將其亞克隆進表達栽體pDEST15，所迷pDEST15被轉(zhuǎn)化進BL21(DE3)大腸桿菌細胞。這些細胞被接種進500mL自-裔導(dǎo)培養(yǎng)基，并且在2L帶擋板的瓶中于37°C振蕩。使用GSG親和柱(GE生物科學(xué)公司(GEBiosciences))從細菌裂解物純化出融合蛋白質(zhì)GST-L8。使用rTEV蛋白酶除去GST標簽，并通過大小排阻層析(S7516/60，制備級，GE生物矛牛學(xué)^^司(GEBiosciences))將其與L8分開。然后再次通過大小排阻(S7510/300，分析級，GE生物科學(xué)7^司(GEBiosciences)),對L8進行第三次純化，以改善在溶液中的單M性。將經(jīng)純化的蛋白質(zhì)與原雞(G"http://sg"Z/附)卵白溶菌酶(羅切公司(Roche))以大約1:1的摩爾比在TBS(25mMTRIS,pH7.5,137mMNaCl，3mMKCl)中組合，至L8的終濃度為37.5mg/mL，溶菌酶的終濃度為42.9mg/mL。4吏用定制篩選和沉滴(sittingdrop)形式，針對480結(jié)晶條件來歸選溶液中的復(fù)合物。單個大晶體從沉淀劑(7%MPEG5K，0.2MHEPESpH7.8)和TBS中蛋白質(zhì)的等混合物中生長出來。然后在尼龍環(huán)中收集該晶體，將其包被上cyro保護劑(cyroproteetant)，在冷的N2氣流(110K)下冷凍。使用旋轉(zhuǎn)陽極X-射線發(fā)生器和給出2.8A衍射的Mar345檢測器，收集700張圖像的數(shù)據(jù)組。使用DENZO來對圖像加以索引，使用Scalepack來衡量數(shù)據(jù)。關(guān)于數(shù)據(jù)收集統(tǒng)計，參見表。使用分子置換(AMoRe)來解答結(jié)構(gòu)，所述分子置換中包括溶菌酶(PDB進入號193L)和來自7Vwocc附A^rfa/^re朋/s天冬氨酰tRNA合酶(PDB進入號1B8A)的OB-折疊密碼子識別結(jié)構(gòu)域二者作為模型。在非對稱單元中發(fā)現(xiàn)了兩個溶菌酶分子以及一個OB-折疊結(jié)構(gòu)域?；诘诙€溶菌酶分子的位置，在非對稱單元中復(fù)制復(fù)合體，從而放置第二個OB-折疊。使用COOT、CCP4和PHENIX將結(jié)構(gòu)迭代建立并且精修。使用相同的晶體在SSRL收集第二數(shù)據(jù)集，至2.69A分辨率。在同樣的空間組中對其加以索引，使用來自前一結(jié)構(gòu)的完整晶胞，通過分子置換來定相。使用COOT、CCP4和PHENIX來進行建立和精修。表7.對于與溶菌酶的復(fù)合物中L8的X-射線晶體學(xué)結(jié)構(gòu)的統(tǒng)計<table>tableseeoriginaldocumentpage67</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage68</column></row><table>慕凝茅^,^f尸Of^增4《耐超專溫;^舉,^"^^5和/F-5」W野顛05浙#。<table>tableseeoriginaldocumentpage69</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage70</column></row><table>參考文獻1.Rajewsky,K.1996.Clonalselectionandlearningintheantibodysystem.7V"f,381:751-758.2.Griffiths,A.D.,S.C.Williams,O.Hartley,I.M.Tomlinson，P.Waterhouse,W.L.Crosby,R.E.Kontermann，P.T.Jones,N.M.Low,T.J.Allison,等人1994.Isolationofhighaffinityhumanantibodiesdirectlyfromlargesyntheticrepertoires./owmfl/13:3245-3260.3.Nissim，A.，H.R.Hoogenboom，I.M,Tomlinson，G.Flynn，C.Midgley,D.Lane和G.Winter.1994.Antibodyfragmentsfroma'singlepot，phagedisplaylibraryasimmunochemicalreagents.J5M^(/owm/13:692-698.4.Atwel1，S.，M.Ultsch，A.M.DeVos和J.A.Wells.1997.Structuralplasticityinaremodelledprotein-proteininterface.iSWewce278:1125-1128.5.Ballinger,M.D.,J.T.Jones,J.A.Lofgren，W.J.Fairbrother，R.W.Akita,M.X.Sliwkowski,andJ.A.Wells.1998.Selectionofheregulinvariantshavinghigheraffinityfortheerbb3receptorbymonovalentphagedisplay.cfl/Ote柳is吵273:11675-11684.6.Gunneriusson，E.，K.Nord，M.Uhlen,和P.A.Nygren.1999.AffinitymaturationofataqDNApolymerasespecificaffibodybyhelixshuffling.iVote/w￡>igiwewVig12:873-878，7.Nord,K.,J.Nilsson，B.Nilsson,M.Uhlen，和P.A.Nygren.1995.Acombinatoriallibraryofanalpha-helicalbacterialreceptordomain.P,她/"8:601-608.8.Binz，H.K.，P.Amstutz，和A.Pluckthun,2005.EngineeringnovelbindingproteinsfromnonimmunoglobuUndomains.J/他cAwo/ogy23:1257-1268.9.Binz,H.K.，和A.Pluckthun.2005.Engineeredproteinsasspecificbindingreagents.C"rmifOj5/m》《,Vi說^c/ewo/ogy16:459-469.10.Hosse,R.J.，A,Rothe，和B.E,Power.2006.Anewgenerationofproteindisplayscaffoldsformolecularrecognition.iV她/"<SWece15:14-27.11.Sidhu,S.S.,H.B.Lowman，B.C.Cunningham,和J.A.Wells.2000.Phagedisplayforselectionofnovelbindingpeptides.!E"z，0/ogv328:333-363.12.Stemmer，W.P.C.1994.DNAshufflingbyrandomfragmentationandreassembly:Invitrorecombinationformolecularevolution.iVweeW"^s幼e7Vflrt》腦/</^SWewc^yt/幼eC//i/W淑酵/爿膨Wcff91:10747-10751.13.Sidhu，S.S.2000.Phagedisplayforselectionofnovelbindingpeptides.iVfe幼0fil!szVi五w^v附o/o^y328:333-363.14.Stemmer,W.P.C.1994.RapidevolutionofaproteininvitrobyDNAshuffling.脂騰370:389-391.15.Zhao,H.，和F.H.Arnold.1997.OptimisationofDNAshufflingforhighfidelityrecombination.他c/e/c4"VfcJesefl/r/r25:1307-1308.16.Zhao,H"L.Giver,Z.Shao，J.A.Affholter,和F.H.Arnold.1998.Molecularevolutionbystaggeredextensionprocess(step)invitrorecombination.[見注釋].A^wre5zVtecAwofo^);16:258-261.17.Volkov,A.A.，和F.H.Arnold.2000.Methodsfor,Viv加tfDNArecombinationandrandomchimeragenesis.,ViJ5""^y/m/c^328:447-456.18.Coco,W.M.，W.E.Levinson，M.J.Crist,H.J.Hektor,A.Darzins,P.T.Pienkos，C.H.Squires,和D.J.Monticello.2001.DNAshufflingmethodforgeneratinghighlyrecombinedgenesandevolvedenzymes.[seecomment].7Vafwei5/tftec/r朋/ogv19:354-359.19.Hemminki,A.，S.Niemi,A.M.Hoffren，L.Hakalahti，H.Soderlund，和K.Takkinen，1998.Specificityimprovementofarecombinantanti-testosteroneFabfragmentbyCDRIIImutagenesisandphagedisplayselection./Vote/w￡""gzWm>g11:311-319.20.Jermutus，L.，A.Honegger,F.Schwesinger,J.Hanes，和A.Pluckthun.2001.Tailoringinvitroevolutionforproteinaffinityorstability.iVocee^/Z"gst/說eiVartV""/」cflw/e附j(luò);6>/5Wewc^s幼e(//tefif<SV"too/JwimVflr98:75-80.21.Hanes，J.，L.Jermutus,和A.Pluckthun.2000.Selectingandevolvingfunctionalproteinsinvitrobyribosomedisplay.328:404-430.22.Boder,E.T.,和K.D.Wittrup.2000.Yeastsurfacedisplayfordirectedevolutionofproteinexpression,affinityandstability.五"z戸o/柳328:430-445.23.Altamirano,M.M.，J.M.Blackburn,C.Aguayo，和A.R,Fersht.2000.Directedevolutionofanewcatalyticactivityusingthea/b-barrelscaffold.TVa似M403:617-622.24.Arcus，V.2002.Ob-folddomains:Asnapshotoftheevolutionofsequence,structureandfunction.C"rm^O/w'mVm,ViSVn/"w/""/12:794-801.25.Arcus，V.L"T.Proft，J.A.Sigrell，H.M.Baker,J.D.Fraser,和E.N.Baker.2000.Conservationandvariationinsuperantigenstructureandactivityhighlightedbythethree-dimensionalstructuresoftwonewsuperantigensfromstreptococcuspyogenes.Mo/ec/r299:157-168.26.Murzin，A.G.1993.Ob(oligonucleotide/oligosaccharidebinding)曙fold:Commonstructuralandfunctionalsolutionfornon-homologoussequences.￡"Mfi(912:861-867.27.Qian，J.，B.Stenger，C.A.Wilson,J.Lin，R.Jansen，S.A.Teichma叫J.Park,W.G.Krebs，H.Yu，V.Alexandrov，N.Echols,和M.Gerstein.2001.Partslist:Aweb-basedsystemfordynamicallyrankingproteinfoldsbasedondisparateattributes,includingwhole-genomeexpressionandinteractioninformation.7V"c/e/c爿"Vfei^eflrc/i29:1750-1764.28.Zhang,C.，和S.H.Kim.2000.Acomprehensiveanalysisofthegreekkeymotifsinproteinbeta-barrelsandbeta-sandwiches./Vote/Vw40:409-419.29.Murzin，A.G.，A.M.Lesk,和C.Chothia.1994.Principlesdeterminingthestructureofbeta-sheetbarrelsinproteins.I.Atheoreticalanalysis.Ji9","a/0/Af0/ecw/rw236:1369-1381.30.Murzin，A.G.，A.M.Lesk，和C.Chothia.1994.Principlesdeterminingthestructureofbeta-sheetbarrelsinproteins.Ii.Theobservedstructures./ow/7itf/o/Mio/ecw/fl/*5zV,6^236:1382-1400.31.Beekwilder，J.，J.Rakonjac，M.Jongsma，和D.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)利要求2的經(jīng)修飾的OB-折疊結(jié)構(gòu)域，其中所述天然存在的OB-折疊結(jié)構(gòu)域來自嗜熱生物。5.權(quán)利要求4的經(jīng)修飾的OB-折疊結(jié)構(gòu)域，其中所述嗜熱生物是耐超高溫?zé)岚艟?i^n^flrcw/M附flm/;MM附)。6.權(quán)利要求l-5中任意一項的經(jīng)修飾的OB-折疊結(jié)構(gòu)域，其中所述經(jīng)修飾的氨基酸殘基在折疊相關(guān)結(jié)合面的p-鏈中。7.權(quán)利要求1-6中任意一項的經(jīng)修飾的OB-折疊結(jié)構(gòu)域，其中所述經(jīng)修飾的OB-折疊結(jié)構(gòu)域的結(jié)合伴侶選自核酸、寡糖、蛋白質(zhì)、激素和小有機分子。8.獲得權(quán)利要求1-7中任意一項的經(jīng)修飾的OB-折疊結(jié)構(gòu)域的方法，其包括a)獲得編碼天然存在的OB-折疊結(jié)構(gòu)域或者編碼包含結(jié)合面的鏈和/或環(huán)的鏈的其部分的核酸，以及b)改變所述核酸，〗吏得其編碼較之所述天然存在的OB-折疊結(jié)構(gòu)域而言，在結(jié)合面的p-鏈上的至少一個經(jīng)修飾的氨基酸殘基和/或在環(huán)的鏈上的至少一個經(jīng)修飾的氨基酸殘基，其中，獲得經(jīng)修飾的OB-折疊結(jié)構(gòu)域，并且，其中，所述經(jīng)修飾的OB-折疊結(jié)構(gòu)域較之所述天然存在的OB-折疊結(jié)構(gòu)域，具有改變的結(jié)合。9.權(quán)利要求8的方法，其還包括改變編碼所述經(jīng)修飾的OB-折疊結(jié)構(gòu)域的核酸，和/或改變編碼下述蛋白質(zhì)的至少一個氨基酸的核酸，所述蛋白質(zhì)包含所述經(jīng)修飾的OB-折疊結(jié)構(gòu)域。10.產(chǎn)生用于展示的經(jīng)修飾的OB-折疊結(jié)構(gòu)域蛋白質(zhì)的文庫的方法，所述方法包括a)獲得編碼OB-折疊結(jié)構(gòu)域或其部分的核酸，以及b)對所述核酸進行隨機改變，由此產(chǎn)生編碼經(jīng)〗資飾的OB-折疊結(jié)構(gòu)域的經(jīng)改變的核酸的集合，所述經(jīng)修飾的OB-折疊結(jié)構(gòu)域具有至少一個隨機化的氨基酸殘基。11.權(quán)利要求10的方法，其中所述核酸編碼所述OB-折疊結(jié)構(gòu)域結(jié)合面的鏈和/或OB-折疊結(jié)構(gòu)域環(huán)的鏈的至少一個氬基酸殘基。12.權(quán)利要求10或權(quán)利要求11的方法，其還包括將編碼經(jīng)修飾的OB-折疊結(jié)構(gòu)域的經(jīng)改變的核酸的文庫放進能在其表面展示所述經(jīng)修飾的OB-折疊結(jié)構(gòu)域的宿主細胞群中。13.經(jīng)分離的核酸，其編碼權(quán)利要求1-7中任意一項的經(jīng)修飾的OB-折疊結(jié)構(gòu)域。14.宿主細胞，其包含編碼權(quán)利要求1-7中任意一項的經(jīng)修飾的OB-折疊結(jié)構(gòu)域的核酸。15.噬菌體，其包含編碼權(quán)利要求1-7中任意一項的經(jīng)修飾的OB-折疊結(jié)構(gòu)域的核酸。16.組合物，其包含編碼權(quán)利要求1-7中任意一項的經(jīng)修飾的OB-折疊結(jié)構(gòu)域的核酸。17.針對與結(jié)合伴侶的結(jié)合對經(jīng)修飾OB-折疊結(jié)構(gòu)域的文庫加以篩選的方法，所述方法包括a)獲得在其表面展示經(jīng)修飾的OB-折疊結(jié)構(gòu)域的文庫的宿主細胞或病毒顆粒的群；b)將所述宿主細胞或病毒顆粒的群與所述結(jié)合伴侶在適于所述結(jié)合伴倡與所述經(jīng)修飾的OB-折疊結(jié)構(gòu)域結(jié)合的條件下接觸；以及e)確定所述結(jié)合伴侶與所述經(jīng)修飾的OB-折疊結(jié)構(gòu)域的結(jié)合。18.權(quán)利要求17的方法，其中所述宿主細胞或病毒顆粒是在其表面展示經(jīng)修飾的OB-折疊結(jié)構(gòu)域的噬菌體。19.權(quán)利要求1-7中任意一項的經(jīng)修飾的OB-折疊結(jié)構(gòu)域的噬菌體文庫，其中，所述經(jīng)修飾的OB-折疊結(jié)構(gòu)域可從耐超高溫?zé)岚艟@得。20.在細胞或病毒顆粒表面展示的權(quán)利要求1-7中任意一項的經(jīng)修飾的OB-折疊結(jié)構(gòu)域。21.權(quán)利要求20的經(jīng)修飾的OB-折疊結(jié)構(gòu)域，其中所述細胞或病毒顆粒是噬菌體、細菌或酵母。22.<image>imageseeoriginaldocumentpage5</image>23.與固體支持物相連的權(quán)利要求1-7中任意一項的經(jīng)修飾的OB-折疊結(jié)構(gòu)域。24.權(quán)利要求23的經(jīng)修飾的OB-折疊結(jié)構(gòu)域，其中所述支持物選自珠子、玻璃、玻片、芯片和明膠。全文摘要本發(fā)明提供了具有想要的性質(zhì)的經(jīng)修飾的OB-折疊結(jié)構(gòu)域；生產(chǎn)經(jīng)修飾的OB-折疊結(jié)構(gòu)域的文庫的方法；通過此類方法生產(chǎn)的經(jīng)修飾的OB-折疊結(jié)構(gòu)域的文庫；針對想要的生物學(xué)活性對此類經(jīng)修飾的OB-折疊結(jié)構(gòu)域的文庫加以篩選的方法；以及從此類文庫鑒定出的經(jīng)修飾的OB-折疊結(jié)構(gòu)域。本文提供了可從耐超高溫?zé)岚艟?Pyrobaculumaerophilum)獲得的、展示出經(jīng)修飾的結(jié)合相互作用的經(jīng)修飾的OB-折疊結(jié)構(gòu)域。文檔編號G01N33/68GK101506227SQ200780028107公開日2009年8月12日申請日期2007年5月25日優(yōu)先權(quán)日2006年5月26日發(fā)明者J·D·斯蒂姆森,M·巴克,V·L·阿爾庫斯申請人:懷卡托靈科有限公司