專利名稱：測量設(shè)備、方法和計(jì)算機(jī)程序的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及用于計(jì)數(shù)顆粒的測量設(shè)備和方法，所述顆粒是諸如血樣這 樣的樣本中的白血細(xì)胞。本發(fā)明還涉及用于分析樣本的計(jì)算機(jī)程序。
背景技術(shù)：
有時，確定白血細(xì)胞數(shù)量對患者的治療而言非常重要。這種分析常常 是診斷例如白血病、或者傳染性或炎癥性疾病或者對治療進(jìn)行監(jiān)視所需要 的。希望能夠盡可能快地獲得分析結(jié)果以使患者的等待時間最短和使醫(yī)師 在對患者進(jìn)行首次檢查時就能夠直接決定療法和作出診斷。因此提供一種 可由醫(yī)師或護(hù)士快速執(zhí)行而無需送去實(shí)驗(yàn)室化驗(yàn)的分析方法是優(yōu)選的。確 定白血細(xì)胞數(shù)量是在形成診斷時對患者執(zhí)行的最常見的測試之一。因此， 具有 一種快速且簡單的執(zhí)行這種分析的方法是非常有利的。
目前，白血細(xì)胞數(shù)量通常是通過對血樣進(jìn)行染色且在特殊的計(jì)數(shù)室(例
如Biirker室)中顯微觀察該樣本而經(jīng)由手工操作程序來獲得。該計(jì)數(shù)室 設(shè)有將腔室劃分成邊界明確的小體積的柵格。白血細(xì)胞可沉淀在計(jì)數(shù)室的 底部以使顯孩吏鏡能夠聚焦于腔室中的所有細(xì)胞，因而有助于計(jì)數(shù)。因此， 在可以執(zhí)行計(jì)數(shù)之前樣本需要沉淀數(shù)分鐘。然后可以通過計(jì)數(shù)柵格中的每 個格子內(nèi)的血細(xì)胞數(shù)量而確定白血細(xì)胞數(shù)。白血細(xì)胞數(shù)由分析化驗(yàn)員手工 獲得，其中所述分析化驗(yàn)員需要在執(zhí)行這種分析方面富有經(jīng)驗(yàn)以便能夠執(zhí) 行可靠的分析。
這種分析是費(fèi)時的。另外，由于它要手動執(zhí)行，因此分析結(jié)果會因執(zhí) 行這種分析的人員不同而發(fā)生變化。
現(xiàn)有少數(shù)幾種用于確定白血細(xì)胞數(shù)的自動分析方法。白血細(xì)胞數(shù)可以
8通過Coulter原理來確定，所述原理基于通過檢測阻抗確定細(xì)胞尺寸且由 此確定細(xì)胞類型。在US 5,262,302中描述了用于通過Coulter原理計(jì)數(shù)白 血細(xì)胞的方法。根據(jù)Coulter原理的測量設(shè)備非常昂貴，因此它是一種相 當(dāng)可觀的投資。因而，醫(yī)院或?qū)嶒?yàn)室不愿意投資多臺設(shè)備。這意味著這種 分析將必須在集中的場所內(nèi)執(zhí)行，且患者將需要等待分析結(jié)果。
Coulter原理是當(dāng)前正在使用的主要的自動分析方法。然而，還存在描 述過的一些其它方法。在US 5,585,246中公開了這樣一種用于確定白血細(xì) 胞數(shù)的方法。在此處，血樣必須通過與標(biāo)記白血細(xì)胞的熒光染料和配位絡(luò) 合物混合而得到制備。該樣本被引入毛細(xì)管且被對毛細(xì)管中的整個樣本進(jìn) 行掃描的激光源輻照。熒光被測量以確定白血細(xì)胞的數(shù)量。在WO 97/02482 中公開了類似的方法，其使用熒光染料和對整個毛細(xì)管進(jìn)行掃描的激光源。 該方法適于含有少量白血細(xì)胞的單采產(chǎn)品(apheresis products )中的白血 細(xì)胞計(jì)數(shù)。在此處，毛細(xì)管非常厚，且在可以對毛細(xì)管進(jìn)行掃描之前必須 等待直至白血細(xì)胞已經(jīng)沉淀在毛細(xì)管底部。
在WO 99/45384中，示出了具有變化厚度的樣本保持室。這種變化厚 度使血液的不同化合物分離。用著色劑對血樣進(jìn)行染色以分類突出血樣中 的至少三種不同的白血細(xì)胞類型。白血細(xì)胞可通過用光學(xué)掃描儀器觀察該 腔室的一部分而得到計(jì)數(shù)。
在WO 98/50777中，公開了一種用于估計(jì)乳液中的體細(xì)胞數(shù)量的方法。 該方法包括將一定體積的樣本施加到樣本隔室中，和將從樣本隔室傳來 的電磁信號傳送到檢測元件陣列上。檢測到的電磁信號的強(qiáng)度受到處理， 且結(jié)果與存在于樣本中的細(xì)胞數(shù)量相關(guān)聯(lián)。
仍然需要加速和簡化用于確定白血細(xì)胞數(shù)的現(xiàn)有自動方法以便能夠由 任意用戶執(zhí)行這種分析而無需特別培訓(xùn)，以及使測量設(shè)備相對便宜些。這 意味著這種分析可在護(hù)理地點(diǎn)提供。另外，由于白血細(xì)胞計(jì)數(shù)是一種常用 分析，因此對該分析方法的任何改進(jìn)都對患者的看護(hù)具有積極作用。能夠 在護(hù)理地點(diǎn)獲得結(jié)果的分析方法將特別有利。
而且，獲得白血細(xì)胞分類計(jì)數(shù)、即檢查血樣中的不同類型的白血細(xì)胞的分布是有利的。白血細(xì)胞分類計(jì)數(shù)可以揭露細(xì)胞分布是否正常、或者某 種細(xì)胞是增加還是減少了。這些信息可用于"^斷特殊類型的疾病。例如， 嗜中性白血細(xì)胞的增加表明受到細(xì)菌感染，然而淋巴細(xì)胞的增加常見于急 性病毒感染。
白血細(xì)胞分類計(jì)數(shù)還可以通過顯微j(見察和人工計(jì)數(shù)Btirker室中的經(jīng) 染色的血細(xì)胞而獲得。還存在一些自動方法。例如，分類計(jì)數(shù)可以利用 Coulter原理通過分析細(xì)胞穿過電場所產(chǎn)生的電脈沖的形狀和尺寸而獲得。 脈沖的形狀和尺寸會與正被檢測的白血細(xì)胞的類型有關(guān)。在US 4,528,274 中描述了這樣一種方法。
在US 5,123,055中公開了另一種用于識別不同類型的白血細(xì)胞的方 法。該方法要求順序分析數(shù)個尺寸和顏色參數(shù)以區(qū)分白血細(xì)胞類型。
仍然希望能夠加快和簡化用于確定白血細(xì)胞分類計(jì)數(shù)的已有自動方 法。提供快速、簡單且相對便宜的分析方法以便能夠在護(hù)理地點(diǎn)提供這種 分析將會是特別有利的。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目標(biāo)是提供了一種簡單分析方法，其用于確定樣本(諸如血 樣)中的顆粒(諸如白血細(xì)胞)的體積計(jì)數(shù)(volumetric enumeration )和 確定顆粒分類計(jì)數(shù)(諸如白血細(xì)胞分類計(jì)數(shù))。
因此，根據(jù)本發(fā)明的一個方面，提供了一種用于計(jì)數(shù)顆粒的測量設(shè)備， 其中所述顆粒諸如是血樣這樣的樣本中的白血細(xì)胞。
該設(shè)備包括設(shè)置成接收包括保持樣本的測量腔的樣本獲取裝置的保持 器，和適于獲取至少一幅樣本的放大數(shù)字圖像的成像系統(tǒng)。該設(shè)備還包括 圖像分析器，其4皮設(shè)置成分析所獲取的至少一幅數(shù)字圖像以識別顆粒和確 定樣本中的顆粒數(shù)量，其中圖像分析器被設(shè)置成分析所獲取的至少一幅數(shù) 字圖像以識別在焦點(diǎn)上成像的顆粒和確定這些顆粒的類型和數(shù)量，其中通 過顆粒的物理特征來辨別類型，從而確定樣本中不同類型的顆粒的比值。
成像系統(tǒng)可以包括放大裝置和至少 一個數(shù)字圖像獲取裝置。
10根據(jù)一個實(shí)施例，該設(shè)備適于計(jì)數(shù)血樣中的白血細(xì)胞，測量腔適于保 持經(jīng)染色和溶血的血樣，其中圖像分析器被設(shè)置成分析所獲取的至少一幅 數(shù)字圖像以識別經(jīng)染色的白血細(xì)胞和確定樣本中的白血細(xì)胞數(shù)量，其中圖 像分析器被設(shè)置成分析所獲取的至少一幅數(shù)字圖像以識別在焦點(diǎn)上成像的 白血細(xì)胞和確定這些白血細(xì)胞的類型和數(shù)量，其中通過白血細(xì)胞的幾何特 征來辨別類型，從而確定樣本中不同類型的白血細(xì)胞的比值。
根據(jù)本發(fā)明的另 一方面，提供了 一種用于計(jì)數(shù)樣本中的顆粒的方法，
所述方法包括將樣本采集到樣本獲取裝置的測量腔中；獲取至少一幅測 量腔中的受輻照樣本的放大數(shù)字圖像；數(shù)字分析所述至少 一幅數(shù)字圖像以 識別顆粒和確定樣本中的顆粒數(shù)量；和數(shù)字分析所述至少一幅數(shù)字圖像以 識別在焦點(diǎn)上成像的顆粒和確定這些顆粒的類型和數(shù)量，其中通過顆粒的 幾何特征來辨別類型，從而確定樣本中不同類型顆粒的比值。
根據(jù)一個實(shí)施例，該方法適于血樣中的白血細(xì)胞計(jì)數(shù)。該方法包括將 血樣采集到樣本獲取裝置的測量腔中。將血樣與試劑混合，其中所述試劑
染色的染色劑。染色劑優(yōu)選選擇性地對白血細(xì)胞進(jìn)行染色，且不會對血樣 中的其它細(xì)胞進(jìn)行染色。該方法還包括獲取至少 一幅測量腔中的樣本的放 大數(shù)字圖像。該方法還包括數(shù)字分析所述至少 一幅數(shù)字圖像以識別被染色 的白血細(xì)胞和確定樣本中的白血細(xì)胞數(shù)量，以及數(shù)字分析所述至少一幅數(shù) 字圖像以識別在焦點(diǎn)上成像的白血細(xì)胞和確定這些白血細(xì)胞的類型和數(shù) 量，其中類型通過被染色的細(xì)胞的幾何特征來辨別，從而確定血樣中不同 類型的白血細(xì)胞的比值。
本發(fā)明的測量設(shè)備和方法都能實(shí)現(xiàn)對全血樣本的簡單分析。為此，測 量設(shè)備被設(shè)置成獲取至少一幅血樣數(shù)字圖像，其中所述樣本已混合了用于 對白血細(xì)胞進(jìn)行染色的染色劑。白血細(xì)胞的染色意味著白血細(xì)胞可以在數(shù) 字圖像中被辨別出，且不同類型的白血細(xì)胞可以在同一或另外的數(shù)字圖像 中通過細(xì)胞的幾何特征辨別。
測量設(shè)備和方法因此被設(shè)置成既確定血樣中的所有白血細(xì)胞的體積計(jì)數(shù)，又確定白血細(xì)胞的分類計(jì)數(shù)。
然而很多現(xiàn)有方法也能夠?qū)Σ煌?xì)胞和甚至血細(xì)胞的亞族群進(jìn)行計(jì) 數(shù)，但是根據(jù)本發(fā)明的測量設(shè)備特別適于分析白血細(xì)胞。試劑包括將溶解 血樣中的紅血細(xì)胞的溶血劑。這消除了對樣本中的紅血細(xì)胞進(jìn)行計(jì)數(shù)的可 能性。另一方面，紅血細(xì)胞的溶解簡化了對血樣中的白血細(xì)胞的區(qū)分和識 別。
另外，該測量設(shè)備特別適于分析所述至少 一幅數(shù)字圖像以識別在焦點(diǎn) 上成像的細(xì)胞。這允許對相對較厚的樣本進(jìn)行成像，而只有處于焦點(diǎn)上的 細(xì)胞被計(jì)數(shù)?？紤]到對白血細(xì)胞總數(shù)進(jìn)行計(jì)數(shù)要比識別白血細(xì)胞類型容易 的多(因?yàn)榉诸愋枰猑皮分析的細(xì)胞的更多細(xì)節(jié))，這種特征特別有用。因 此，通過確保只對處于焦點(diǎn)上的細(xì)胞進(jìn)行計(jì)數(shù)，可以識別樣本中的白血細(xì) 胞類型，而所述樣本同時可被用于確定樣本中的白血細(xì)胞的統(tǒng)計(jì)上可靠的 體積計(jì)數(shù)。
本發(fā)明的測量設(shè)備和方法提供了對全血樣本的簡單分析。這種分析不 需要復(fù)雜的測量設(shè)備或者要由操作人員執(zhí)行的先進(jìn)步驟。因此，它可以直 接與對患者的檢查一同執(zhí)行，而無需有資質(zhì)的技術(shù)人員。僅僅需要獲^Uk 樣并且將其與染色劑混合。然后將血樣放入測量設(shè)備的保持器中，且測量 設(shè)備直接對此作出響應(yīng)給出分析結(jié)果。
事實(shí)上，血樣可以在測量腔內(nèi)與試劑混合。因此將不必手工進(jìn)行樣本 制備。在幾分鐘或更短的時間內(nèi)，血樣與試劑的反應(yīng)將溶解紅血細(xì)胞和將 白血細(xì)胞染色，使得樣本可用于光學(xué)測量以獲取所述至少一幅數(shù)字圖像。 血樣可以例如通過讓試劑分歉或擴(kuò)散到血樣中、或者通過主動振動或移動 樣本獲取裝置以在測量腔中形成攪動而與試劑混合。
測量設(shè)備還可以包括電磁輻射源，其被設(shè)置成對保持在樣本獲取裝置 的測量腔中的樣本進(jìn)行輻照。
成像系統(tǒng)可以被設(shè)置成利用不同的光學(xué)配置獲取多幅樣本數(shù)字圖像， 其中圖像分析器被設(shè)置成分析所獲取的各幅數(shù)字圖像以識別顆?；蛘弑蝗?色的白血細(xì)胞，和確定樣本中的顆粒或白血細(xì)胞數(shù)量，其中圖像分析器被設(shè)置成分析所獲取的各幅數(shù)字圖像以識別在焦點(diǎn)上成像的顆?；虬籽?xì) 胞，和確定這些顆?；虬籽?xì)胞的類型和數(shù)量，其中類型通過顆?；虮蝗?色的白血細(xì)胞的幾何特征來辨別，從而確定樣本中不同類型的顆?；虬籽?細(xì)胞的比值。
通過在樣本中的景深方向上的不同平面上獲取多幅數(shù)字圖像，甚至在 采用高放大率的時候也能夠分析相對較大的樣本體積。高放大率因得到較 小景深而使得難以在一幅圖像中觀察到整個體積。由于放大水平影響景深， 因此獲取多幅數(shù)字圖像的步驟允許使用更大的放大率，這繼而使得能夠在 各幅圖像中依靠核的形狀、數(shù)量或尺寸區(qū)分不同種類的白血細(xì)胞。
根據(jù)另 一 實(shí)施例，成像系統(tǒng)被設(shè)置成在所獲取的圖像中提供與光方向 有關(guān)的信息以方便聚焦，從而能夠在所獲取的圖像中轉(zhuǎn)移焦點(diǎn)。這意味著 單幅圖像既可用于通過一次分析樣本的整個深度而計(jì)數(shù)樣本中的白血細(xì)胞 總數(shù)，又可用于通過當(dāng)圖像在血樣的厚度的一部分位于焦點(diǎn)上的情況下被 示出時對圖像中的細(xì)胞進(jìn)行分析而確定血樣中的不同類型的白血細(xì)胞的比 值。通過使用小透鏡的陣列(例如復(fù)透鏡)提供在所獲取的圖像中追蹤光 線的能力從而使得可以將圖像的不同部分放在焦點(diǎn)上，可以獲得包含光進(jìn) 入圖像的方向的信息的圖像。
成像系統(tǒng)可被設(shè)置成利用不同光學(xué)配置獲取樣本的第 一和第二數(shù)字圖 像，且其中圖像分析器被設(shè)置成分析所獲取的第一圖像以確定樣本中的顆 ?；虬籽?xì)胞數(shù)，且圖像分析器被設(shè)置成分析所獲取的第二數(shù)字圖像以確 定樣本中不同類型的顆粒或白血細(xì)胞的比值。
因此，該測量設(shè)備特別適于利用不同的光學(xué)配置獲取兩幅數(shù)字圖像。 這意味著光學(xué)配置可得到優(yōu)化，且適于首先確定體積內(nèi)的白血細(xì)胞數(shù)量， 和其次確定不同類型的白血細(xì)胞的比值。
成像系統(tǒng)可以包括兩個至少部分獨(dú)立的部分，其將光從受輻照的樣本 引至成像系統(tǒng)的第一和第二部分。
用于確定白血細(xì)胞是否位于焦點(diǎn)上的動作可以通過利用細(xì)胞的細(xì)胞質(zhì) 可用作使光折射的透鏡這一事實(shí)來執(zhí)行。對于在焦點(diǎn)上成像的白血細(xì)胞，
13胞核顯示為黑暗陰影，而周圍的細(xì)胞質(zhì)則幾乎不可見。胞核顯示為其光強(qiáng) 相當(dāng)?shù)偷膮^(qū)域，而細(xì)胞質(zhì)不對光強(qiáng)產(chǎn)生影響。
對于離成像系統(tǒng)過近(過近以致于不在焦點(diǎn)上)地成像的白血細(xì)胞而 言，胞核顯示為黑暗陰影，而周圍的細(xì)胞質(zhì)則用作透鏡且使光發(fā)生折射， 這形成環(huán)繞胞核的暗圏。胞核顯示為其光強(qiáng)相對于胞核的聚焦圖像低很多 的區(qū)域，細(xì)胞質(zhì)顯示出具有低光強(qiáng)。
對于離成像系統(tǒng)過遠(yuǎn)(過遠(yuǎn)以致于不在焦點(diǎn)上)地成像的白血細(xì)胞， 胞核顯示為黑暗陰影，而周圍的細(xì)胞質(zhì)用作透鏡且使光發(fā)生折射，這形成 環(huán)繞胞核的亮圏。胞核顯示為其光強(qiáng)相對于胞核的聚焦圖4象低很多的區(qū)域， 而細(xì)胞質(zhì)顯示出具有高的光強(qiáng)。
可選的是，對在焦點(diǎn)上成像的細(xì)胞的識別可以通過對成像細(xì)胞的邊緣 進(jìn)行分析以基于強(qiáng)度在該邊緣上的斜率估計(jì)該細(xì)胞是否在焦點(diǎn)上成像來執(zhí) 行。不在焦點(diǎn)上的細(xì)胞的強(qiáng)度在這些邊緣上表現(xiàn)出緩慢的下降，而位于焦 點(diǎn)上的細(xì)胞將成像成具有明顯的邊緣，因?yàn)槠鋸?qiáng)度將在細(xì)胞邊緣上出現(xiàn)較 大的下降。因此，通過分析強(qiáng)度在成像細(xì)胞的邊緣上如何變化，可以確定 細(xì)胞是否是在焦點(diǎn)上成像。
用于確定細(xì)胞類型的 一種可選方式是通過在圖<象分析器中，針對特定 的顆?；蚣?xì)胞確定所述顆?；蚣?xì)胞成像于其中的所述圖像的數(shù)量，其中該 數(shù)量從其中顆粒或細(xì)胞被確定是沿第 一方向離開焦點(diǎn)的圖像到其中顆?；?細(xì)胞被確定是沿第二方向離開焦點(diǎn)的圖像計(jì)數(shù)。
圖像分析器可被設(shè)置成基于所述計(jì)數(shù)出的圖像數(shù)，確定與所述顆?；?細(xì)胞的尺寸有關(guān)的幾何特征。
具有用于獲取所述至少 一幅數(shù)字圖像的光學(xué)配置的成像系統(tǒng)可以具有
l-50x、更優(yōu)選l-20x、更優(yōu)選3-20x、更優(yōu)選5-20x且更優(yōu)選約為10x的放 大率。
成像系統(tǒng)可以被設(shè)置成用其范圍為2-60微米、更優(yōu)選2-30微米、更 優(yōu)選約為8-10微米的景深獲取所述至少一幅數(shù)字圖像。
當(dāng)用于本文中時，"景深"將指光軸方向上的長度，其在得到充分聚焦的情況下成像以允許圖像分析識別出位于該長度內(nèi)的細(xì)胞。該"景深，， 可以比由光學(xué)配置定義的常規(guī)景深大。隨著放大率變大，該景深變小。
電磁輻射源可以被設(shè)置成發(fā)射與染色劑的吸收峰相對應(yīng)的波長。因此， 通過在數(shù)字圖像中顯示出低透光率，積聚有染色劑的經(jīng)染色的白血細(xì)胞將 孚皮檢測出。
電磁輻射源可以包括激光源。該激光源可提供具有精確定義的波長的 光，所述波長與染色劑的吸收率相配。另外，激光源可以提供準(zhǔn)直光以使 雜散光的干擾最小，從而使得能夠清楚地辨別出具有低透光率的點(diǎn)。
可選的是，電磁輻射源可以包括發(fā)光二極管。這種輻射源仍然可以提 供足以將白血細(xì)胞與樣本中的其它物質(zhì)區(qū)分開的輻照條件。
圖像分析器可以被設(shè)置成識別具有高的光吸收率的區(qū)域，以確定樣本 中的顆?；虬籽?xì)胞的數(shù)量。圖像分析器可以^皮進(jìn)一步設(shè)置成識別圖像中 的黑點(diǎn)或暗點(diǎn)。由于染色劑會積聚在白血細(xì)胞的胞核中，因此光吸收率會 在獨(dú)立的點(diǎn)上出現(xiàn)峰值。這些點(diǎn)將形成數(shù)字圖像中的黑點(diǎn)，且可以被分類 成白血細(xì)胞。
圖像分析器可以被設(shè)置成通過分析在所述至少 一幅數(shù)字圖像中識別出 的光吸收率高的區(qū)域的形狀和尺寸而辨別不同類型的顆?；虬籽?xì)胞。由 于不同類型的白血細(xì)胞具有不同的尺寸，因此白血細(xì)胞的類型可以通過確 定血細(xì)胞尺寸而得到辨別。另外，不同的類型會受到不同地染色，從而使 得在數(shù)字圖像中識別出的區(qū)域具有不同形狀。這也可以被用于識別白血細(xì) 胞的類型。說明三種不同類型的白血細(xì)胞的比值的白血細(xì)胞分類計(jì)數(shù)可通 過分析血細(xì)胞尺寸而獲得。辨別五種不同類型的白血細(xì)胞的白血細(xì)胞分類 計(jì)數(shù)需要被調(diào)查的血細(xì)胞的更多特征。例如，可以檢查各細(xì)胞的胞核數(shù)、 穿透該血細(xì)胞的輻射強(qiáng)度或者血細(xì)胞的形狀。
染色劑可以被設(shè)置成選擇性地對白血細(xì)胞的胞核進(jìn)行染色。這意味著 白血細(xì)胞可以作為彩色點(diǎn)而被識別，且因此容易在數(shù)字圖像中得到辨別和 計(jì)數(shù)。另外，染色點(diǎn)的尺寸可用于識別白血細(xì)胞類型，因?yàn)椴煌愋偷陌?血細(xì)胞具有不同尺寸。染色劑可以是蘇木精、亞甲藍(lán)、亞甲繹、亞甲天藍(lán)、乙酸甲苯酯紫、 甲苯胺藍(lán)、龍膽紫、蘇丹類似物、掊花青、或品紅類似物、或者它們的任
意組合的組中的任何一種。然而應(yīng)意識到染色劑并不局限于這個組，而 是可以想到;f艮多其它的物質(zhì)。
溶血劑可以是季銨鹽、皂草苷、膽汁酸(諸如脫氧膽酸)、毛地黃毒 苷、蛇毒、吡喃葡萄糖苷或者Triton型非離子洗滌劑。然而應(yīng)意識到溶 血劑并不局限于這個組，而是可以想到很多其它的物質(zhì)。
測量設(shè)備還可以包括由不同光學(xué)配置共享的物鏡。這意味著數(shù)字圖像 可以通過沿同一光路進(jìn)行成像而獲得，以使得這些圖像的中心在測量腔的 同一點(diǎn)上。這使測量設(shè)備變得緊湊。
根據(jù)一個實(shí)施例，成像系統(tǒng)可以包括兩個至少部分獨(dú)立的部分，其將 光從受輻照的樣本引至成像系統(tǒng)的第一和第二部分。這意味著從樣本到成 像系統(tǒng)的光路可以被定義在固定的光學(xué)配置中。因此，測量設(shè)^^是堅(jiān)固 耐用且對沖擊不敏感的。
成像系統(tǒng)還可以包括分束器，其用于將光從物鏡^ 1向成像系統(tǒng)的第一 或第二部分。這意味著可同時獲得第一和第二數(shù)字圖像，從而分析可非常 快地被執(zhí)行。
成像系統(tǒng)的第 一部分可以被設(shè)置成直接從分束器處接收光，即在成像 系統(tǒng)的第一部分與分束器之間未設(shè)置光學(xué)元件?；蛘?，光可以被設(shè)置成直 接從物鏡傳至成像系統(tǒng)的第一部分。然后為了獲取第二數(shù)字圖像，作為替 代可以在光路中插入反射鏡以將光偏轉(zhuǎn)到成像系統(tǒng)的第二部分上。
成像系統(tǒng)還在分束器和成像系統(tǒng)的適于獲取數(shù)字圖像的部分之間包括 目鏡。該目鏡因此可以進(jìn)一步放大樣本以辨別不同類型的白血細(xì)胞。優(yōu)選 使用透鏡組，然后目鏡組將在物鏡組的范圍內(nèi)移動虛主平面以改變像平面 和物鏡組之間的關(guān)系，從而允許得到更多的放大率。
成像系統(tǒng)還可以在分束器和成像系統(tǒng)的適于獲取數(shù)字圖像的部分之間 包括光學(xué)元件，其用于影響不處于成像系統(tǒng)的焦點(diǎn)上的細(xì)胞，從而便于識 別在焦點(diǎn)上成像的白血細(xì)胞。該光學(xué)元件允許獲取比成像系統(tǒng)的景深大很多的樣本厚度的圖像。該 光學(xué)元件確保不考慮位于焦點(diǎn)之外的細(xì)胞從而提高測量結(jié)果的確定性。由 于該光學(xué)元件影響位于焦點(diǎn)之外的細(xì)胞的成^^因此位于焦點(diǎn)上的細(xì)胞將 易于識別。該光學(xué)元件可以實(shí)現(xiàn)為空間濾波器，其對細(xì)胞的成像產(chǎn)生作用
以使細(xì)胞邊緣包括比背景強(qiáng)度大的過調(diào)(overshoot)強(qiáng)度，其中細(xì)胞通過 吸收光線而被成像。
根據(jù)可選實(shí)施例，成像系統(tǒng)還可以在分束器和成像系統(tǒng)的第二部分之 間包括波前編碼元件。該波前編碼元件通過讓光線經(jīng)過鞍形波片而故意使 光線扭曲，其中所述鞍形玻片在中間相對平坦，但是具有裙?fàn)钸叀＿@引起 特殊的光學(xué)像差，雖然圖像看上去模糊，但是散焦在大粉巨離上都是一樣 的。該波前編碼元件因此增加了沿光軸的分析深度。圖像上的這種扭曲主 要由散焦的波前編碼元件的形狀決定，其中所述形狀是精確已知的。因此， 計(jì)算機(jī)能夠逐點(diǎn)消除模糊。計(jì)算機(jī)可以利用實(shí)質(zhì)上是數(shù)字濾波器的東西對 圖像進(jìn)行解碼，由此形成在大景深上清晰的圖像。通過這種方式，成像系 統(tǒng)的景深可得到增加，從而使樣本的更大深度能夠在焦點(diǎn)上成像。
根據(jù)另一實(shí)施例，成像系統(tǒng)的一部分被設(shè)置成既獲取第一圖像又獲取 第二圖像，且成像系統(tǒng)的放大系統(tǒng)的至少一部分是可切換的以便能夠利用 不同的光學(xué)配置獲取第一和第二數(shù)字圖像。這意味著該測量設(shè)備只需要包 括成像系統(tǒng)的一個單獨(dú)部件。另外，通過例如提供可在光軸上的精確定義 的位置之間移動的主透鏡允許使用數(shù)種不同的光學(xué)配置。
該成像系統(tǒng)可以被設(shè)置成在用于獲取第二數(shù)字圖像的光學(xué)配置中具有 比用于獲取第 一數(shù)字圖像的光學(xué)配置中的放大率大的放大率。這意味著在 第二數(shù)字圖像中能夠更好地觀察細(xì)節(jié)，從而更容易辨別不同類型的白血細(xì) 胞。
具有用于獲取第 一數(shù)字圖像的光學(xué)配置的成像系統(tǒng)可以具有l(wèi)-50x、更 優(yōu)選l-20x、更優(yōu)選3-20x、更優(yōu)選3-10x且更優(yōu)選約為4x的放大率。在放 大率的這些范圍內(nèi)，白血細(xì)胞得到充分放大以便能夠被檢出，同時成像系 統(tǒng)可以被設(shè)置成在充分聚焦的范圍內(nèi)對樣本厚度進(jìn)行成像以便能夠估計(jì)圖
17像中的血細(xì)胞數(shù)量。因此，成像系統(tǒng)可以具有覆蓋樣本厚度的景深。然而，
利用景深的常規(guī)定義，整個樣本厚度不必在成像系統(tǒng)的景深范圍內(nèi)成像。 通過巧妙的圖像分析，仍然可以正確地對略微偏離焦點(diǎn)成像的細(xì)胞進(jìn)行計(jì) 數(shù)。低放大率意味著可以獲得大"景深"。因此允許大的樣本厚度，和可 以分析較大的體積。然而，如果使用H故大率，那么白血細(xì)胞會難以檢測，
因?yàn)槊總€血細(xì)胞被成像在非常少的像素(諸如3-4個像素)上。通過增加 所獲取的圖像中的像素?cái)?shù)量、即通過改善該數(shù)字圖像的分辨率，可以使用 更低的放大率。通過這種方式，可以使用l-4x的光學(xué)放大率，同時仍然能 夠檢測出白血細(xì)胞。
具有用于獲取第二數(shù)字圖像的光學(xué)配置的成像系統(tǒng)可以具有l(wèi)-50x、更 優(yōu)選l-20x、更優(yōu)選3-20x、更優(yōu)選5-20x且更優(yōu)選約為10x的放大率。在 放大率的這些范圍內(nèi)，白血細(xì)胞被充分放大以便能夠辨別不同類型的白血 細(xì)胞。通過使用用于強(qiáng)調(diào)在焦點(diǎn)上成像的細(xì)胞和方便識別這些細(xì)胞的光學(xué) 元件，可以使用更低的放大率。
成像系統(tǒng)可以被設(shè)置成用至少為樣本獲取裝置的測量腔的厚度的景深 來獲取第一圖像。這意味著整個樣本厚度均可獲得充分聚焦，從而使得測 量腔的整個厚度可以同時在樣本的該數(shù)字圖像中得到分析。因此，不必等 待白血細(xì)胞沉淀在測量腔中，從而減少了用于分析的時間。然而，需要等 待使紅血細(xì)胞溶解的反應(yīng)和等待因?qū)颖疽霚y量腔而引起的運(yùn)動停止。
這些等待時間會非常短，在30秒或更少的量級上。通過選擇不是非常嚴(yán)格 地聚焦在樣本的特定部分上，整個樣本厚度得到充分聚焦以允許識別樣本 中的白血細(xì)胞數(shù)量。這意味著白血細(xì)胞會稍顯模糊，卻仍然被視為在景深 的焦點(diǎn)上。樣本的受到分析的體積因此由測量腔的厚度和數(shù)字圖像的尺寸 精確定義，其中所述尺寸說明了被成像的測量腔的橫截面積。
該成像系統(tǒng)可以被設(shè)置成用其范圍在50-200微米內(nèi)的景深來獲取第一 圖像。該景深可以適于與測量腔的深度或厚度相對應(yīng)。至少50微米的深度 允許在小橫截面積上分析較大體積的血液，從而避免將樣本的血細(xì)胞擠入 單層。因此，可以使用相對較小的血樣圖像分析足夠大體積的血樣以給出可靠的白血細(xì)胞計(jì)數(shù)值。另外，難以在獲得充分放大的數(shù)字圖像的同時實(shí)
現(xiàn)超過200微米的景深。甚至難以實(shí)現(xiàn)超過170微米的景深。
該成像系統(tǒng)可以被設(shè)置成用其范圍在2-60微米內(nèi)的景深來獲取第二圖 像。這可以通過對測量腔的厚度的一部分成像來實(shí)現(xiàn)。在這種情況下，只 有測量腔厚度的一部分在焦點(diǎn)上成〗象。然后通過只考慮在得到充分聚焦的 情況下成像的白血細(xì)胞來對第二數(shù)字圖像進(jìn)行分析以確定它們的類型。由 于第二數(shù)字圖#^皮用于確定不同類型的白血細(xì)胞的比值，因此成像體積是 否得到精確定義并不重要。因此，能夠通過對測量腔的同一部分成像而獲 得恰當(dāng)?shù)牡谝缓偷诙D像。然而，可選地，也可以通過對測量腔的不同部 分成像來獲取第二圖像，其中該部分可以具有與用于獲取第二圖像的成像 系統(tǒng)的景深相對應(yīng)的厚度。
圖像分析器可以被設(shè)置成對所獲取的至少一幅圖像進(jìn)行電子放大。在 樣本被放大以獲得樣本的放大數(shù)字圖像的同時，所獲取的數(shù)字圖像本身可 以得到電子放大以簡化對在所獲取的數(shù)字圖像中彼此非常接近地成像的目 標(biāo)的識別。
根據(jù)本發(fā)明的另一方面，提供了一種用于血樣中的白血細(xì)胞的計(jì)數(shù)的 樣本獲取裝置。該樣本獲取裝置包括用于接收血樣的測量腔。該測量腔具 有在測量腔的內(nèi)壁之間定義的第一和第二預(yù)設(shè)的固定厚度，其中第一厚度 適于確定血樣中的白血細(xì)胞的總體積計(jì)數(shù)，第二厚度適于確定血樣中的不 同類型的白血細(xì)胞的比值。樣本獲取裝置還包括試劑，其以干燥的形式設(shè) 置在限定測量腔的表面上。該試劑包括用于溶解血樣中的紅血細(xì)胞的溶血 劑，和用于選擇性地對血樣中的白血細(xì)胞進(jìn)行染色的染色劑。
樣本獲取裝置使得能夠直接將全血樣本采集到測量腔中和將其用于分
析。而無需進(jìn)行樣本的制備。實(shí)際上，血樣可以直接從刺^C的患者手指吸 入測量腔。向樣本獲取裝置提供試劑使得能夠在樣本獲取裝置內(nèi)發(fā)生反應(yīng)， 這使得樣本隨時可用于分析。該反應(yīng)在血樣接觸試劑時開始。因此無需手 工制備樣本，這使得這種分析尤其適于在患者等待的同時直接在檢查室內(nèi)執(zhí)行。
19由于試劑是以干燥的形式提供的，因此該樣本獲取裝置可以被運(yùn)輸和 進(jìn)行長時間保存，而不會影響樣本獲取裝置的有效性。因此，可以在對血 樣進(jìn)行分析之前早早地制造和制備這種具有試劑的樣本獲取裝置。
盡管多種現(xiàn)有方法能夠?qū)Σ煌难?xì)胞和甚至血細(xì)胞的亞族群進(jìn)行計(jì) 數(shù)，但是根據(jù)本發(fā)明的樣本獲取裝置特別適于執(zhí)行對白血細(xì)胞的計(jì)數(shù)。該 試劑包括將溶解血樣中的紅血細(xì)胞的溶血劑。這消除了對樣本中的紅血細(xì) 胞進(jìn)行計(jì)數(shù)的可能性。另一方面，紅血細(xì)胞的溶解簡化了對血樣中的白血 細(xì)胞的區(qū)分和識別。
染色劑提供了對單個白血細(xì)胞的標(biāo)記。這使得能夠單獨(dú)地觀察和檢測 白血細(xì)胞?？梢岳缤ㄟ^掃描測量腔或獲取測量腔的圖像對白血細(xì)胞進(jìn)行 檢測。
該樣本獲取裝置還提供了特別適于方便確定白血細(xì)胞的體積計(jì)數(shù)的測 量腔第一厚度。該測量腔具有足夠大的厚度以允許有相當(dāng)大體積的血樣用 于分析，從而允許白血細(xì)胞的體積計(jì)數(shù)的確定具有良好的統(tǒng)計(jì)性。因此可 以通過將在所定義的體積內(nèi)單獨(dú)檢測到的白血細(xì)胞的數(shù)量加在一起而獲得 白血細(xì)胞計(jì)數(shù)。
樣本獲取裝置還提供了特別適于方便辨別不同類型的白血細(xì)胞的測量 腔第二厚度。關(guān)于這一點(diǎn)，第二厚度可以比第一厚度薄，從而允許整個第 二厚度在更大放大率的景深內(nèi)成像。與僅用于確定血樣中的白血細(xì)胞總數(shù) 而不管類型的成^^目比，在辨別不同類型的白血細(xì)胞時需要這種更大的放 大率。
樣本獲取裝置可以包括具有兩個平的表面的主體構(gòu)件，所述表面形成 用于限定所述測量腔的內(nèi)壁。這些平表面可以被i殳置成彼此相隔預(yù)定多巨離 以確定用于光學(xué)測量的樣本深度。這意味著樣本獲取裝置提供了用于光學(xué) 測量的精確定義的深度，所述光學(xué)測量可用于精確確定單位體積的血樣中 的白血細(xì)胞計(jì)數(shù)。被分析的樣本體積可以由測量腔的深度和樣本的成像面 積來精確定義。因此，該精確定義的體積可被用于將白血細(xì)胞數(shù)與血樣體 積聯(lián)系在一起，以便確定白血細(xì)胞的含量。測量腔優(yōu)選具有均勻的第一深度，其為50-200微米。至少為50微米 的深度意味著測量腔不會迫使血樣被涂成單層，從而使得能夠在較小的橫 截面積上分析較大體積的血樣。因此，可以使用相對較小的血樣圖像分析 足夠大體積的血樣以給出可靠的白血細(xì)胞計(jì)數(shù)值。第一深度更優(yōu)選至少為 100微米，其允許分析甚至更小的橫截面積或者分析更大的樣本體積。另 夕卜，至少為50微米且更優(yōu)選為IOO微米的第一深度還簡化了在兩平面之間 具有精確定義的深度的測量腔的制造。
對于設(shè)在其厚度不超過200 ^t米的腔內(nèi)的大多數(shù)樣本而言，白血細(xì)胞 的計(jì)數(shù)非常低以致于彼此重疊的白血細(xì)胞只會引起微小的偏差。然而，這 種偏差的影響將與白血細(xì)胞計(jì)數(shù)有關(guān)，因此至少在某種程度上可以通過至 少對白血細(xì)胞計(jì)數(shù)的較大值進(jìn)行統(tǒng)計(jì)校正而得到處理。這種統(tǒng)計(jì)校正可以
基于測量設(shè)備的標(biāo)定。這種偏差對于其第一厚度不超過170孩i米的測量腔 而言還會更少些，且對于其第一厚度不超過150微米的測量腔而言更少， 從而可以采用更為簡單的標(biāo)定。這種厚度甚至可以不需要對重疊的血細(xì)胞 進(jìn)行任何標(biāo)定。
另外，測量腔的第一厚度足夠小，以使測量設(shè)備能夠獲取使得該測量 腔的整個深度可同時得到分析的數(shù)字圖像。由于在該測量設(shè)備中將會使用 放大系統(tǒng)，因此不容易獲得大景深。因此，測量腔的第一厚度優(yōu)選不超過 150微米以使整個厚度能夠同時在數(shù)字圖像中得到分析。景深可被設(shè)置成 處理170 #:米或者甚至200微米的測量腔第一厚度。
測量腔優(yōu)選具有均勻的第二厚度，其為20-60微米。該測量腔第二厚 度將允許整個第二厚度在辨別不同類型的白血細(xì)胞所需要的放大率的景深 內(nèi)成像。另外，該第二厚度仍可提供足夠的分析體積，從而使得有足夠數(shù) 量的白血細(xì)胞受到分析。這使得能夠以良好的統(tǒng)計(jì)確定性確定不同類型的 白血細(xì)胞的比值。通常需要分析200個白血細(xì)胞的類型。
樣本獲取裝置可以設(shè)有已施加到表面上的試劑，所述試劑溶解在揮發(fā) 性液體中，而所述揮發(fā)性液體已經(jīng)蒸發(fā)從而使試劑處于干燥的形式。
已經(jīng)認(rèn)識到試劑在被插入測量腔之前要有利地溶解在揮發(fā)性液體中。
21這意味著在樣本獲取裝置的制造和制備過程中，液體可以以有效的方式從 測量腔的狹窄空間中蒸發(fā)掉。該試劑可以優(yōu)選地以干燥的形式被布置在測 量腔的具有第一厚度的部分中。
試劑可優(yōu)選溶解在有機(jī)溶劑中，更優(yōu)選地溶解在甲醇中。這些溶劑是 揮發(fā)性的，且可以恰當(dāng)?shù)赜糜趯⒃噭└稍锏綔y量腔的表面上。
樣本獲取裝置還可以包括樣本入口 ，其使測量腔與樣本獲取裝置的外
部相通，其中該入口被設(shè)置用于獲取血樣。該樣本入口可被設(shè)置成通過毛 細(xì)管作用力抽吸血樣，且測量腔可以進(jìn)一步地將血液從該入口吸入腔中。 該樣本獲取裝置還可以被設(shè)置成首先將樣本吸入測量腔的具有第 一厚度的 部分。樣本的部分然后可以通過毛細(xì)管作用力被進(jìn)一步送入測量腔的具有 第二厚度的部分。因此，通過簡單地使樣本入口接觸血液可以輕易地將血 樣采集到測量腔中。然后，樣本入口和測量腔的毛細(xì)管作用力將精確定義 的數(shù)量的血液吸入測量腔?？蛇x的是，可以通過向樣本獲取裝置施加外部 泵送力將血樣吸入或抽入測量腔。根據(jù)另一種可選方式，血樣可被采集到 吸液管中，然后通過吸液管引入測量腔。
樣本荻取裝置可以是一次性的，即它被設(shè)置成只能使用一次。樣本獲 取裝置提供用于執(zhí)行白血細(xì)胞計(jì)數(shù)的成套裝置，因?yàn)闃颖精@取裝置能夠接 收血樣和保持所有必要的試劑以給出用于細(xì)胞計(jì)數(shù)的樣本。這是特別可行 的，因?yàn)闃颖精@取裝置適于一次性使用，且可以在不考慮清洗樣本獲取裝 置和重新施加試劑的可能性的情況下形成。樣本獲取裝置還可以用塑料材 料模制而成，從而以低價率制造。因此，使用一次性的樣本獲取裝置仍然 具有成本效率。
本發(fā)明還涉及一種包含在計(jì)算機(jī)可讀介質(zhì)中的用于樣本分析的計(jì)算機(jī)
程序產(chǎn)品，其包括用于數(shù)字分析至少一幅樣本圖像以確定樣本中的顆粒 數(shù)的計(jì)算機(jī)代碼；用于數(shù)字分析所述至少一幅樣本圖像以識別樣本聚焦區(qū) 域中的一種或多種顆粒的計(jì)算機(jī)代碼，其中各種顆粒均與一種或多種辨別 物理特征相關(guān)聯(lián)；以及用于輸出與樣本中的顆粒數(shù)量和類型相對應(yīng)的信息 的計(jì)算機(jī)代碼。本發(fā)明還涉及用于分析樣本的計(jì)算機(jī)程序，該計(jì)算機(jī)程序包括計(jì)算機(jī)程序代碼，所述代碼用于分析至少一幅數(shù)字圖像以識別顆粒 和確定樣本中的顆粒數(shù)；以及分析所述至少一幅數(shù)字圖像以識別在焦點(diǎn)上 成像的顆粒和確定這些顆粒的類型和數(shù)量，所述類型通過顆粒的物理特征 來辨別，從而確定樣本中不同類型的顆粒的比值。


現(xiàn)在將通過參考附圖以舉例的方式對本發(fā)明進(jìn)行更詳細(xì)的描述。
圖l是樣本獲取裝置的示意圖2是才艮據(jù)第一實(shí)施例的測量設(shè)備的示意性方框圖3是才艮據(jù)第二實(shí)施例的測量設(shè)備的示意性方框圖4是才艮據(jù)本發(fā)明第一實(shí)施例的方法的流程圖5是根據(jù)本發(fā)明實(shí)施例的活動透鏡構(gòu)造的示意圖6是根據(jù)本發(fā)明實(shí)施例的構(gòu)造的示意圖7示出了在三個不同層上成像的樣本；
圖8a示出了當(dāng)細(xì)胞位于根據(jù)圖10的測量設(shè)備的焦點(diǎn)之外時，照相機(jī) -f見野中的白血細(xì)胞；
圖8b示出了當(dāng)細(xì)胞在根據(jù)圖10的測量設(shè)備的焦點(diǎn)上時，照相枳4SL野 中的白血細(xì)胞；
圖8c示出了當(dāng)細(xì)胞位于根據(jù)圖10的測量設(shè)備的焦點(diǎn)之外時，照相機(jī) 視野中的白血細(xì)胞；
圖9a示出了當(dāng)細(xì)胞位于根據(jù)圖10的測量設(shè)備的焦點(diǎn)之外時，記錄得 到的被分析的細(xì)胞的截面強(qiáng)度；
圖9b示出了當(dāng)細(xì)胞在根據(jù)圖10的測量^殳備的焦點(diǎn)上時，記錄得到的 被分析的細(xì)胞的截面強(qiáng)度；
圖9c示出了當(dāng)細(xì)胞位于根據(jù)圖10的測量設(shè)備的焦點(diǎn)之外時，記錄得 到的被分析的細(xì)胞的截面強(qiáng)度；
圖IO是才艮據(jù)第三實(shí)施例的測量設(shè)備的示意圖ll是根據(jù)本發(fā)明的第二實(shí)施例的方法的流程圖；以及
23圖12是根據(jù)第四實(shí)施例的測量設(shè)備的示意圖。
具體實(shí)施例方式
現(xiàn)在參見圖1，將描述根據(jù)第一實(shí)施例的樣本獲取裝置10。樣本獲取 裝置IO優(yōu)選是一次性的，且將在用于分析之后被丟棄。這意味著樣本獲取 裝置10無需復(fù)雜的處理。樣本獲取裝置10優(yōu)選由塑料材料形成，且可以 通過注塑成型的方式進(jìn)行制造。這使得樣本獲取裝置10的制造簡單且廉 價，從而可以使樣本獲取裝置10的成本處于較低水平。
樣本獲取裝置10包括主體構(gòu)件12,其具有底部14，所述底部可以由 操作人員接觸而不會對分析結(jié)果造成任何千擾。底部14還可以具有突出部 16，其可以將保持器安裝在分析設(shè)備中。突出部16可被設(shè)置成使樣本獲取 裝置10將被正確放置在分析設(shè)備中。
樣本獲取裝置IO還包括樣本入口 18。樣本入口 18被限定在樣本獲取 裝置10的相對的壁之間，所述壁被設(shè)置成彼此接近以致于會在樣本入口 18中形成毛細(xì)管作用力。樣本入口 18與樣本獲取裝置10的外部相通，以 允許將血液吸入樣本獲取裝置10。樣本獲取裝置10還包括用于對白血細(xì) 胞進(jìn)行計(jì)數(shù)的腔室，其為設(shè)在樣本獲取裝置10內(nèi)部的相對的壁之間的測量 腔20的形式。測量腔20被i殳置成與樣本入口 18相通。與樣本入口 18的 壁相比，用于限定測量腔20的壁被設(shè)置成彼此更為接近，以便毛細(xì)管作用 力可以將血液從樣本入口 18吸入測量腔20。
測量腔20具有第一部分20a和第二部分20b，第一部分20a具有第一 厚度，第二部分20b具有更小的第二厚度。第一部分20a與樣本入口 18 相通，而第二部分20b與第一部分20a相通。因此，毛細(xì)管作用力可以將 血液從測量腔20的第一部分20a吸入第二部分20b。
測量腔20的第一部分20a的壁,皮設(shè)置成彼此相隔50 - 200孩吏米的距 離。第一部分20a更優(yōu)選為至少IOO微米厚。另外，第一部分20a的厚度 更優(yōu)選不超過150微米。所i^J巨離在整個第一部分20a上基本一致。第一 部分20a的厚度限定了被檢血液的體積。由于分析結(jié)果要與被檢血樣的體積進(jìn)行比較，所以第一部分20a的基本一致的厚度必須非常精確，即在 不同樣本獲取裝置10的第一部分20a之間，厚度只允許有非常小的變化。 厚度被選擇成允許在腔的較小區(qū)域內(nèi)獲得相對較大的分析樣本體積，以使 可供計(jì)數(shù)的顆粒或細(xì)胞足夠多。測量腔20的第一部分20a特別適于確定血 樣中的白血細(xì)胞總體積計(jì)數(shù)。第一部分20a的整個厚度可被選擇成允許它 在成像系統(tǒng)的景深內(nèi)成像。然后對圖像進(jìn)行分析，并且計(jì)算該圖像中的白 血細(xì)胞數(shù)量以求出白血細(xì)胞體積計(jì)數(shù)。
樣本獲取裝置10通常適于測量比0.5 x 109細(xì)胞/升血液高的白血細(xì)胞 計(jì)數(shù)。在白血細(xì)胞計(jì)數(shù)比之低很多的情況下；將會因樣本體積過小而不能 提供具有統(tǒng)計(jì)意義的數(shù)量的白血細(xì)胞用于計(jì)數(shù)。另外，當(dāng)白血細(xì)胞計(jì)數(shù)超 過12x 109細(xì)胞/升血液時，在測量出的白血細(xì)胞計(jì)數(shù)中，因血細(xì)胞相互重 疊而帶來的影響將變得嚴(yán)重。在該白血細(xì)胞計(jì)數(shù)下，如果第一部分20a的 厚度為140微米，白血細(xì)胞將覆蓋分析樣本的截面的約8%。因此，為了 獲得正確的白血細(xì)胞計(jì)數(shù)，這種影響必須加以考慮。因此，可以對高于12 x 109細(xì)胞/升血液的白血細(xì)胞計(jì)數(shù)的值進(jìn)行統(tǒng)計(jì)校正。該統(tǒng)計(jì)校正將隨著 白血細(xì)胞計(jì)數(shù)的增大而增大，因?yàn)橐蜓?xì)胞重疊而帶來的影響會隨著白血 細(xì)胞計(jì)數(shù)的增加而變大。該統(tǒng)計(jì)校正可通過測量設(shè)備的標(biāo)定而求出。作為 替換，可以基于一般水平求出該統(tǒng)計(jì)校正以設(shè)置與樣本獲取裝置10結(jié)合使 用的測量設(shè)備。該統(tǒng)計(jì)校正的量級與目前在利用Coulter原理的分析設(shè)備 中執(zhí)行的統(tǒng)計(jì)校正類似。預(yù)期樣本獲取裝置10可用于分析與50 x io9細(xì)胞 /升血液一般大的白血細(xì)胞計(jì)數(shù)。
測量腔20的第二部分20b特別適于確定血樣中不同類型的白血細(xì)胞的 比值。第二部分20b的整個厚度將在成像系統(tǒng)的景深內(nèi)成像。然后對圖像 進(jìn)行分析，并且計(jì)算該圖像中的各類白血細(xì)胞的數(shù)量以求出不同類型的白 血細(xì)胞的比值。
測量腔20的第二部分20b的壁被設(shè)置成彼此相隔20 - 60微米的距離。 該距離在整個第二部分20b上基本一致。由于該分析主要用于將不同類型 的白血細(xì)胞的數(shù)量相互作比較，所以是否知道確切的分析體積并不重要。因此，第二部分20b的厚度不必像第一部分20a的厚度那樣精確。第二部 分20b的厚度必須允許用于分析的白血細(xì)胞數(shù)量足夠多以便能夠獲得具有 統(tǒng)計(jì)意義的結(jié)果。另外，如上所述，第二部分20b的厚度應(yīng)適于全部都能 夠在成像系統(tǒng)的景深內(nèi)成像。因此，樣本中的所有白血細(xì)胞均在焦點(diǎn)上成 像，且對樣本的分析不受由在焦點(diǎn)外成像的樣本部分引起的圖像噪聲的妨 礙。第二部分20b比第一部分20a薄以便能夠使用更大的放大率，同時允
許整個第二部分在成像系統(tǒng)的景深內(nèi)成像。需要更大的放大率以便不僅能 夠計(jì)算白血細(xì)胞的總數(shù)，而且還能夠確定白血細(xì)胞的類型。
測量腔20的壁的表面至少部分涂有試劑22。試劑22可被凍結(jié)干燥、 加熱干燥或真空干燥，且被施加到測量腔20的表面上。當(dāng)血樣被采集到測 量腔20內(nèi)時，血液將接觸干燥的試劑22并且引發(fā)試劑22與血液之間的反 應(yīng)。
通過利用吸液管或分配器將試劑22插入測量腔20來施加試劑22。在 4皮插入測量腔20時，試劑22溶解在揮發(fā)性液體(例如曱醇這樣的有機(jī)溶 劑)中。具有試劑22的溶劑可充滿測量腔20。然后進(jìn)行干燥以使溶劑蒸 發(fā)并且試劑22將附著在測量腔20的表面上。
由于試劑將被干燥到狹窄空間的表面上，因此液體與環(huán)境大氣的接觸 表面將會非常小，從而使得液體的蒸發(fā)更為困難。因此使用揮發(fā)性液體(諸 如甲醇)是有利的，所述揮發(fā)性液體使得液體能夠以有效的方式從測量腔 的狹窄空間中蒸發(fā)。
根據(jù)可選的制造方法，通過使兩個片相互連接來形成樣本獲取裝置 10，其中一個片形成測量腔20的底壁，另一片形成測量腔20的頂壁。這 允許在使兩個片相互連接之前將試劑22干燥到開放表面上。因此，可以將 試劑22溶解在水中，因?yàn)槿軇┎槐厥菗]發(fā)性的。
試劑22包括紅血細(xì)胞溶血劑和白血細(xì)胞染色劑。溶血劑可以是季銨 鹽、皂草苷、膽汁酸(諸如脫氧膽酸)、毛地黃毒苷、蛇毒、吡喃葡萄糖 苷或者Triton型非離子洗滌劑。染色劑可以是蘇木精、亞甲藍(lán)、亞甲綠、 亞曱天藍(lán)、乙酸甲苯酯紫、曱苯胺藍(lán)、龍膽紫、蘇丹類似物、掊花青、或品紅類似物、或者它們的任意組合。當(dāng)血樣接觸試劑22時，溶血劑將起到 溶解紅血細(xì)胞的作用以使溶解的紅血細(xì)胞與血漿混合。另外，染色劑將積 聚在白血細(xì)胞的胞核中。試劑22應(yīng)該包含足量的染色劑以清楚地對所有白 細(xì)胞的胞核進(jìn)行染色。因此常常會有過剩的染色劑，其將混合在血漿中。 過剩的染色劑將在血漿中形成染色劑的均勻的低背景水平。在染色劑的背 景水平上，積聚在白血細(xì)胞中的染色劑可被識別。
試劑22還可以包括其它組分，其可以是活性的(即參加與血樣的化學(xué) 反應(yīng))，或者是非活性的(即不參加與血樣的化學(xué)反應(yīng))。活性組分可以 例如被設(shè)置成對溶血或染色作用起催化作用。非活性的組分可以例如被設(shè) 置成改善試劑22在測量腔20的壁的表面上的附著。
在幾分鐘或者甚至不到一分鐘內(nèi)，血樣將會與試劑22發(fā)生反應(yīng)，以使 紅血細(xì)胞溶解和染色劑積聚在白血細(xì)胞的胞核內(nèi)。
現(xiàn)在參見圖2，將描述用于對血樣中的白血細(xì)胞進(jìn)行分析的測量設(shè)備 30的第一實(shí)施例。設(shè)備30包括樣本保持器32，其用于接收帶有血樣的樣 本獲取裝置10。樣本保持器32被設(shè)置成接收樣本獲取裝置10以使樣本獲 取裝置10的測量腔20正確定位于設(shè)備30內(nèi)。設(shè)備30包括光源34，其用 于照射樣本獲取裝置10內(nèi)的血樣。光源34可以是白熾燈，其在整個可見 光鐠上發(fā)光。積聚在白血細(xì)胞胞核中的染色劑將吸收特定波長的光，從而 使得白血細(xì)胞的胞核顯示在樣本的數(shù)字圖像中。如果得到彩色圖像，白血 細(xì)胞將顯現(xiàn)為特殊顏色的點(diǎn)。如果得到黑白圖像，白血細(xì)胞則將顯現(xiàn)為較
亮的背景下的黑點(diǎn)。
作為替換，光源34可以是激光器或發(fā)光二極管。這可被用于提高圖像 中的對比度，以便能夠更容易地檢測出白血細(xì)胞。在這種情況下，光源34 被設(shè)置成發(fā)出其波長對應(yīng)染色劑的吸收峰的電磁輻射。該波長還應(yīng)被選擇 成使血液中的非白血細(xì)胞成分的吸收相對較低。另外，樣本獲取裝置10 的壁對該波長應(yīng)該基本透明。例如，當(dāng)亞甲藍(lán)被用作染色劑時，光源34 可,皮i殳置成用波長為667nm的光輻照。
設(shè)備30還包括成像系統(tǒng)36，其設(shè)在樣本保持器32的與光源34相對
27的那側(cè)。成像系統(tǒng)36因此被設(shè)置成接收已穿透血樣的輻射。此實(shí)施例中的 成像系統(tǒng)36包括放大裝置38，其分為兩個獨(dú)立部分。放大裝置38的第一 部分38a被設(shè)置成接收已穿透測量腔20的第一部分20a中的血樣的輻射。 成像系統(tǒng)還包括第一圖像獲取裝置40，其被設(shè)置成對凈皮放大裝置38的第 一部分38a放大的測量腔20的第一部分20a進(jìn)行成像。放大裝置38的第 一部分38a被設(shè)置成提供l-50x、更優(yōu)選l-20x且最優(yōu)選l-4x的》文大率。 在放大率的這些范圍內(nèi)能夠辨別出白血細(xì)胞?？梢砸愿纳频姆直媛诗@取該 圖像，以便允許使用更低的放大率。另外，放大裝置38的第一部分38a 的景深可設(shè)置成包括測量腔20的厚度。
放大裝置38的第一部分38a包括設(shè)在樣本保持器32附近的物鏡或透 鏡系統(tǒng)42,和設(shè)置成與物鏡42相隔一定距離的目鏡或透鏡系統(tǒng)44。物鏡 或透鏡系統(tǒng)42和目鏡或透鏡系統(tǒng)44中的每一個可包括一個或多個單獨(dú)的 透鏡或其它光學(xué)元件。物鏡42提供對樣本的首次放大，樣本由目鏡44進(jìn) 一步放大。放大裝置38可以包括另外的透鏡，用于實(shí)現(xiàn)樣本的適當(dāng)放大和 成像。放大裝置38的第一部分38a被設(shè)置成使測量腔20的第一部分20a 中的樣本在^U文入樣本保持器32內(nèi)時將被聚焦在第一圖像獲取裝置40的 像平面上。
第 一 圖像獲取裝置40被設(shè)置成獲取樣本的第 一數(shù)字圖像。第 一 圖像獲 取裝置40可以是任何一種數(shù)字相機(jī)，諸如CCD -或者CMOS -相機(jī)。對 在此描述的數(shù)字相機(jī)的參考應(yīng)該僅被看作為圖像分析部分的一個實(shí)施例。 數(shù)字相機(jī)的像素尺寸對成像系統(tǒng)36形成限制，以便像平面上的模糊圏不會 超出景深內(nèi)的像素尺寸。然而，即使白血細(xì)胞稍顯模糊卻仍然可以被檢測 出，因此模糊圏可以超出像素尺寸而同時^J"作落在景深內(nèi)，如在上下文 中定義的那樣。因此在用于本文中時，"景深"將指光軸方向上的長度， 其在得到充分聚焦的情況下成像以允許圖像分析識別出位于該長度內(nèi)的細(xì) 胞。該"景深"不同于由光學(xué)配置定義的常規(guī)景深，且取決于要執(zhí)行的特 定圖像分析。
數(shù)字相機(jī)40將獲取測量腔20的第一部分20a中的樣本的第一數(shù)字圖像，其中在用于對白血細(xì)胞進(jìn)行計(jì)數(shù)的第一數(shù)字圖像中整個樣本厚度都 得到充分聚焦。成像系統(tǒng)36限定測量腔20的第一部分20a的將成像在第 一數(shù)字圖像中的面積。該成像面積和測量腔20的第一部分20a的厚度一起 限定被成像的樣本的體積。
放大裝置38的第二部分38b被設(shè)置成接收已穿透測量腔20的第二部 分20b中的血樣的輻射。成像系統(tǒng)還包括第二圖像獲取裝置41，其被設(shè)置 成對被放大裝置38的第二部分38b放大的測量腔20的第二部分？0b進(jìn)行 成像。放大裝置38的第二部分38b被設(shè)成提供5-200x、更優(yōu)選5-100x且 最優(yōu)選5-20x的放大率。在放大率的這些范圍內(nèi)能夠辨別白血細(xì)胞?？梢?以改善的分辨率獲取圖像以允許使用較低的放大率。另外，放大裝置38 的第二部分38b的景深仍可設(shè)成包括測量腔20的厚度。
與第一部分38a類似，放大裝置38的第二部分38b也包括設(shè)在樣本保 持器32附近的物鏡或透鏡系統(tǒng)43，和設(shè)置成與物鏡43相隔一定距離的目 鏡或透鏡系統(tǒng)45。同樣，物鏡或透鏡系統(tǒng)43和目鏡或透鏡系統(tǒng)45中的每 一個可以包括一個或多個透鏡或其它光學(xué)元件。物鏡43提供對樣本的首次 放大，樣本由目鏡45進(jìn)一步放大。放大裝置38可以包括另外的透鏡或其 它光學(xué)元件，用于實(shí)現(xiàn)樣本的適當(dāng)放大和成像。放大裝置38的第二部分 38b被設(shè)置成使測量腔20的第二部分20b中的樣本在被放入樣本保持器 32內(nèi)時將被聚焦在第二圖像獲取裝置41的像平面上。
第二圖像獲取裝置41被設(shè)置成獲取樣本的第二數(shù)字圖像。笫二圖像獲 取裝置41可以是任何一種數(shù)字相機(jī)，諸如CCD -或者CMOS -相機(jī)。由 于第二圖傳4皮用于確定白血細(xì)胞的不同類型，因此像平面上的模糊圏不可 超出景深內(nèi)的像素尺寸。數(shù)字相機(jī)41將獲取測量腔20的第二部分20a中 的樣本的第二數(shù)字圖像，其中在用于識別所存在的白血細(xì)胞的類型的第
二數(shù)字圖像中，整個樣本厚度得到充分聚焦。
成像系統(tǒng)36可被設(shè)置用于在不必對成^^系統(tǒng)36進(jìn)行調(diào)節(jié)的情況下對 樣本獲取裝置10中的血樣進(jìn)行成像。優(yōu)選，成像系統(tǒng)36被設(shè)在殼體內(nèi)， 所述殼體將成像系統(tǒng)保持成相對于樣本保持器固定。設(shè)備30還包括圖像分析器46。圖像分析器46連接第一和第二數(shù)字相 機(jī)40、 41以接收由數(shù)字相機(jī)40、 41獲取的第一和第二數(shù)字圖像。圖像分 析器46被設(shè)置成識別第一數(shù)字圖像中的對應(yīng)白血細(xì)胞的圖案以計(jì)數(shù)存在 于該數(shù)字圖像中的白血細(xì)胞數(shù)量。因此，圖像分析器46可被設(shè)置成識別較 亮背景下的黑點(diǎn)。圖像分析器46可以被設(shè)置成在分析數(shù)字圖像之前首先將 該數(shù)字圖像電子放大。這意味著圖像分析器46能夠更輕易地辨別彼此靠近 地成像的白血細(xì)胞，即使對數(shù)字圖像的這種電子放大使得該數(shù)字圖像稍顯 模糊。
圖像分析器46可包括處理器，其適于從第一和第二數(shù)字相機(jī)40、 41 處接收圖像信息。該處理器可以配置有圖像分析軟件或算法，例如其精確 特性適于執(zhí)行本文所描述的分析。
圖像分析器46可以通過將在第一數(shù)字圖像中辨別出的白血細(xì)胞數(shù)除 以血樣的體積而計(jì)算出單位體積血液中的白血細(xì)胞數(shù)，如上所述，所# 樣體積已被明確定義。白血細(xì)胞體積計(jì)數(shù)可以在設(shè)備30的顯示器上給出。
圖像分析器46還被設(shè)置成識別第二數(shù)字圖像中的對應(yīng)白血細(xì)胞的圖 案，以計(jì)算存在于該數(shù)字圖像中的白血細(xì)胞數(shù)。圖像分析器46還將分析所 檢測出的每個白血細(xì)胞的形狀和尺寸，以確定該白血細(xì)胞的類型。因此， 圖像分析器46可設(shè)置成將較亮背景中的黑點(diǎn)識別為白血細(xì)胞。圖像分析器 46可設(shè)置成在分析數(shù)字圖像之前首先對該數(shù)字圖像進(jìn)行電子放大。這意味 著圖像分析器46能夠更輕易地辨別彼此靠近地成像的白血細(xì)胞，即使對數(shù) 字圖像的這種電子放大使得該數(shù)字圖像稍顯模糊。圖像分析器46然后依據(jù) 各種物理標(biāo)準(zhǔn)確定白血細(xì)胞的類型，其中 一項(xiàng)重要標(biāo)準(zhǔn)是被成像的白血細(xì) 胞的尺寸。依照文獻(xiàn)，淋巴細(xì)胞的直徑約為5-ll微米，粒細(xì)胞的直徑約為 8-15微米，且單核白細(xì)胞的直徑約為16-25微米。由于所期望的尺寸在 某些情況下發(fā)生重疊，因此優(yōu)選利用另外的信息來鑒別不同的白血細(xì)胞類 型。這種信息例如為胞核的形狀和/或尺寸。例如，可以通過在對應(yīng)分葉核 (segmented nucleus )的細(xì)胞內(nèi)出現(xiàn)兩個或更多個點(diǎn)而識別出粒細(xì)胞。這 可#:用來改進(jìn)通過尺寸分類而進(jìn)行的評估。
30可以通過利用另外的物理特性來獲得分化成五個部分的白血細(xì)胞計(jì) 數(shù)，其中粒細(xì)胞進(jìn)一步分化為嗜酸性粒細(xì)胞、嗜中性粒細(xì)胞和嗜堿性粒細(xì) 胞。分為三部分的白血細(xì)胞計(jì)數(shù)也可以利用這些附加物理特性而得到改善。 該分析由此可以進(jìn)一步檢查所檢測出的血細(xì)胞的形狀。該分析還可以進(jìn)一 步檢查穿透所檢測出的血細(xì)胞的輻射強(qiáng)度。
圖像分析器46可以計(jì)算各類白血細(xì)胞的數(shù)量。圖像分析器46通?？?以對特定數(shù)量(例如1000)的白血細(xì)胞進(jìn)行計(jì)數(shù)和分類。各類白血細(xì)胞的 百分比或比值然后可以在將分類成屬于該類型的白血細(xì)胞的數(shù)量除以被分 析的白血細(xì)胞的總數(shù)時求出。通過對約200個白血細(xì)胞進(jìn)行類型分析可以 求出具有統(tǒng)計(jì)意義的測量結(jié)果。然而，希望更多數(shù)量的白血細(xì)胞被用于類 型分析以改善統(tǒng)計(jì)性。另外，圖像分析器46可以被設(shè)置成分析在得到充分 聚焦的情況下成像以便被正確分類的白血細(xì)胞。而且在兩個或多個白血細(xì) 胞彼此非常接近的情況下，它們難以正確分開，因此這些白血細(xì)胞會被圖 像分析器46完全忽略。另一方面，由于成像系統(tǒng)36被設(shè)置成使測量腔20 的第二部分20b的整個厚度在焦點(diǎn)上成像，因此圖像分析器46可以僅根據(jù) 笫二數(shù)字圖像確定各類白血細(xì)胞的體積計(jì)數(shù)。
圖像分析器46可以以處理單元的形式實(shí)現(xiàn)，其包括用于執(zhí)行這種圖像 分析的代碼。
現(xiàn)在參見圖3,將描述用于分析血樣中的白血細(xì)胞的測量設(shè)備130的 第二實(shí)施例。設(shè)備130包括樣本保持器132，其用于接收帶有血樣的樣本 獲取裝置110。設(shè)備130被設(shè)置成接收樣本獲取裝置110，其中測量腔120 在整個成^^區(qū)域上具有一致的厚度。因此，測量腔120具有與根據(jù)上面參 考圖1所描述的實(shí)施例的樣本獲取裝置10的測量腔20的第一部分20a相 一致的厚度。樣本保持器132被設(shè)置成接收樣本獲取裝置110以使樣本獲 取裝置110的測量腔120被正確定位在設(shè)備130內(nèi)。設(shè)備130包括光源134， 其用于以與第一實(shí)施例的光源34相一致的方式照明樣本獲取裝置110內(nèi)的 血樣。
設(shè)備130還包括成像系統(tǒng)136，其被設(shè)在樣本保持器132的與光源134相對的那側(cè)。成像系統(tǒng)136因此被設(shè)置成接收已穿透血樣的輻射。此實(shí)施 例中的成像系統(tǒng)136被設(shè)置成沿同一光路獲取第一和第二數(shù)字圖像以使這 些圖像的中心在測量腔120中的同一點(diǎn)上。仍用不同的光學(xué)配置獲取樣本 的第一和第二數(shù)字圖像。這可以以多種不同的方式來實(shí)現(xiàn)，其將在下面得 到描述。
如圖3所示，成像系統(tǒng)包括放大裝置138，其包括共用部分和兩獨(dú)立 部分。放大裝置138因此可包括物鏡或透鏡系統(tǒng)142,其被設(shè)在樣本保持 器132附近且由兩光學(xué)配置共用以獲取第一和第二數(shù)字圖像。物鏡142提 供對樣本的首次》文大。成像系統(tǒng)136還可以包括分束器139，其用于沿兩 個不同方向?qū)⒐庖虻谝缓偷诙D像獲取裝置140、 141，所述圖像獲取裝 置可以是任何一種數(shù)字相機(jī)，諸如CCD-相機(jī)。放大裝置138包括第一目 鏡或透鏡系統(tǒng)144，其被設(shè)置在分束器139與第一數(shù)字相機(jī)140之間。物 鏡142提供對樣本的首次放大，樣本由目鏡144進(jìn)一步放大。放大裝置138 可以包括另外的透鏡或光學(xué)元件，用于實(shí)現(xiàn)樣本在第一數(shù)字圖像中的恰當(dāng) 放大和成像。
放大裝置138還包括第二目鏡或透鏡系統(tǒng)145，其被設(shè)在分束器139 和第二數(shù)字相機(jī)141之間。物鏡142提供對樣本的首次放大，樣本由目鏡 145進(jìn)一步放大。放大裝置138可以包括另外的透鏡或光學(xué)元件，用于實(shí) 現(xiàn)樣本在第二數(shù)字圖像中的恰當(dāng)放大和成像。物鏡142和目鏡145可以以 透鏡組的形式實(shí)現(xiàn)，目鏡組145然后在物鏡組142的范圍內(nèi)移動虛主平面 以改變像平面與物鏡組142之間的關(guān)系從而獲得另外的放大率，與之同時， 樣本獲取裝置110相對于物鏡組142不動。通過這種方式可以在第一和第 二數(shù)字圖像中獲得不同的放大率。
特別是，該實(shí)施例所示的放大裝置138包括光學(xué)元件147，其加強(qiáng)了 位于焦點(diǎn)上的白血細(xì)胞的成像。這使得識別何種血細(xì)胞在焦點(diǎn)上成像且因 此何種血細(xì)胞在辨別不同白血細(xì)胞類型時應(yīng)加以考慮的能力得到提升。
光學(xué)元件147允許獲取比捕獲第二數(shù)字圖像的成像系統(tǒng)136的部分的 景深大很多的樣本厚度的圖像。光學(xué)元件147確保不考慮位于焦點(diǎn)之外的
32細(xì)胞從而提高測量結(jié)果的確定性。由于光學(xué)元件147影響位于焦點(diǎn)之外的 細(xì)胞的成像，因此位于焦點(diǎn)上的細(xì)胞將易于識別。光學(xué)元件147可以實(shí)現(xiàn) 為空間濾波器，其對細(xì)胞的成像產(chǎn)生作用以使細(xì)胞邊緣包括比背景強(qiáng)度大 的過調(diào)強(qiáng)度，其中細(xì)胞通過吸收光線而成像。這可在圖像分析中輕易地檢 出，因此可以迅速放棄考慮這些細(xì)胞。
根據(jù)可選實(shí)施例，放大裝置可以在分束器139與第二數(shù)字相機(jī)141之 間包括波前編碼元件。該波前編碼元件因此可以替代光學(xué)元件147。波前 編碼元件通過讓光線經(jīng)過鞍形波片而故意使光線扭曲，其中所述鞍形玻片 在中間相對平坦，但是具有裙?fàn)钸吘墶＿@引起特殊的光學(xué)像差，雖然圖像 看上去模糊，但是散焦在大對巨離上都是一樣的。該波前編碼元件因此增 加了沿光軸的分析深度。圖像上的這種扭曲主要由散焦的波前編碼元件的 形狀決定，其中所述形狀是精確已知的。因此，計(jì)算機(jī)能夠逐點(diǎn)消除模糊。 計(jì)算機(jī)可以利用實(shí)質(zhì)上是數(shù)字濾波器的東西對圖像進(jìn)行解碼，由此形成在 大景深上清晰的圖像。通過這種方式，放大裝置可以增加成像系統(tǒng)的景深， 從而使樣本的更大深度能夠在焦點(diǎn)上成像。
在該實(shí)施例中，分束器可被取代，成像系統(tǒng)136可包括反射鏡或其它 元件(未示出)，用于基本上將所有來自樣本的光引向在兩個數(shù)字相機(jī)140 、 141中選定的那一個。反射鏡然后可以被轉(zhuǎn)動或移動以變換正在觀察樣本 的相機(jī)140、 141。這使得能有更多的光傳到數(shù)字相機(jī)140、 141上，因此 為獲取圖像提供更好的光照條件。然而，這兩個圖像不可同時記錄，且成 像系統(tǒng)136將需要活動部件。根據(jù)一種可選方式，相機(jī)之一可以被設(shè)置成 在反射鏡被完全移離光路時觀察樣本。
根據(jù)另一可選方式，物鏡142可以提供獲取第一圖像所需的所有放大。 因此，光可以直接從分束器或反射鏡傳至第一數(shù)字相機(jī)140。
根據(jù)又一可選方式，沒有物鏡被第一和第二光學(xué)配置所共用。因此， 分束器或反射鏡可被設(shè)在樣本保持器132附近，放大裝置138可以在分束 器與第一數(shù)字相機(jī)140之間和分束器與第二數(shù)字相機(jī)141之間的光路上都 既包括物鏡又包括目鏡。根據(jù)進(jìn)一步的可選方式，第 一和第二數(shù)字圖像由一個數(shù)字相機(jī)來獲取。
在這種情況下，放大裝置138必須被切換或改變來改變光學(xué)配置以獲取這 兩幅數(shù)字圖像。因此，物鏡242可以在明確限定的兩個不同位置之間移動， 如圖5所示那樣。物鏡242因此祐j殳置成沿光軸移動并且將接觸擋塊，例 如光軸的邊緣接觸突出部250、 252。物鏡與樣本獲取裝置之間的距離因此 可得到精確控制以控制所獲取的圖像的放大率。
在上述可選方式中的任何一個中，第一數(shù)字相機(jī)140被設(shè)置成利用由 放大裝置138提供的第一光學(xué)配置對測量腔120進(jìn)行成像。放大裝置138 因此被設(shè)置成提供l-50x、更優(yōu)選l-20x、且最優(yōu)選l-4x的放大率。在放大 率的這些范圍內(nèi)能夠辨別白血細(xì)胞?？梢砸愿纳频姆直媛诗@取該圖像以允 許使用較低的放大率。另外，放大裝置138的景深仍可設(shè)置成包括測量腔 120的厚度。
如參考圖2所示的第一實(shí)施例所描述的那樣，第二實(shí)施例中的第一數(shù) 字相機(jī)140被設(shè)置成獲取樣本的第 一數(shù)字圖像。第 一數(shù)字相機(jī)140觀察樣 本以使測量腔120的整個厚度均落在關(guān)于第一實(shí)施例所定義的景深內(nèi)。成 像系統(tǒng)136限定測量腔120的將成像在第一數(shù)字圖像中的面積。該成像面 積和測量腔120的厚度一同限定正^L成像的樣本的體積。
另外，在上述實(shí)施例中的任何一個中，第二數(shù)字相機(jī)141被設(shè)置成利 用由放大裝置138提供的第二光學(xué)配置對測量腔120進(jìn)行成像。放大裝置 138祐:設(shè)置成提供5-200x、更優(yōu)選5-100x、且最優(yōu)選5-20x的放大率。在 放大率的這些范圍內(nèi)能夠辨別白血細(xì)胞?？梢砸愿纳频姆直媛诗@取該圖像 以允許使用較低的放大率。然而，由于第二數(shù)字圖像所觀察的測量腔120 的部分與第一數(shù)字圖像相同，因此在第二光學(xué)配置中使用更大的放大率會
阻礙測量腔120的整個厚度在景深內(nèi)成像。因此，第二數(shù)字圖像不僅將對 處于焦點(diǎn)上的白血細(xì)胞成像而且還將對血樣的處于焦點(diǎn)之外的白血細(xì)胞和 其它部分成像，從而在圖像中產(chǎn)生模糊干擾。在這些情況下，上迷光學(xué)元 件147將改善識別在焦點(diǎn)上成像的細(xì)胞的幾率，從而使得更易于進(jìn)行分類。 放大裝置138可以有利地被設(shè)置成使測量腔120的厚度的頂部處于第
34二數(shù)字相機(jī)141的像平面中的焦點(diǎn)上。這意味著血樣的處于焦點(diǎn)之外的那 些部分的干擾位于底部附近，且保持相對較低。然而，可以想象使測量腔 120的任意部分成像在第二數(shù)字圖4象中的焦點(diǎn)上。另外，放大裝置138可 被設(shè)置成通常使測量腔120的20-60微米的厚度成像在焦點(diǎn)上。
根據(jù)又一可選實(shí)施例，如圖6所示，只獲取一幅數(shù)字圖像。然而，該 數(shù)字圖像需要提供被檢光的方向信息。這意味著該數(shù)字圖像不僅包含被檢 輻射的信息，而且還包含被檢輻射在空間中的發(fā)射點(diǎn)的信息。該數(shù)字圖像 然后可以以數(shù)字圖像的焦點(diǎn)可根據(jù)需要移動的方式給出。該數(shù)字圖像因此 可以首先被用于對測量腔的整個深度內(nèi)的白血細(xì)胞總數(shù)進(jìn)行計(jì)數(shù)，其次通 過將焦點(diǎn)移至厚度的一部分而確定樣本中不同類型的白血細(xì)胞的比值。該 可選方式可以如圖6所示那樣來實(shí)現(xiàn)，其包括光源334、物鏡342和一個 數(shù)字相機(jī)340。這些部分的實(shí)現(xiàn)方式可以與上述方式類似。該設(shè)備還包括 小透鏡陣列360，其被設(shè)置在樣本獲取裝置110與數(shù)字相機(jī)340之間的光 路上。所述小透鏡陣列360使得能夠在所獲取的圖像中追蹤光線以便可以 將圖像的不同部分放在焦點(diǎn)之上。
現(xiàn)在參見圖3，設(shè)備130還包括圖像分析器146。圖像分析器146連接 第一和第二數(shù)字相機(jī)140、 141以接收由數(shù)字相機(jī)140、 141獲取的第一和 第二數(shù)字圖像?；蛘?，圖像分析器146只接收一幅包含光的方向信息的數(shù) 字圖像，正如在上一段落中描述的那樣。圖像分析器146被設(shè)置成以與關(guān) 于上述第一實(shí)施例的圖像分析器46描述的方式類似的方式分析第一和第 二數(shù)字圖像。然而，由于第二數(shù)字圖像可以通過只對樣本厚度的落在景深 中的那部分成像來獲得，因此圖像分析器146必須更仔細(xì)地處理第二數(shù)字 圖像。首先，圖像分析器146將只分析被識別出在焦點(diǎn)上成像的白血細(xì)胞。 這是可行的，因?yàn)閳D像分析器146可以只確定不同類型的白血細(xì)胞的比值， 且因此將不必精確知道分析樣本的體積。在焦點(diǎn)之外成像的細(xì)胞會是模糊 的，以致于圖像分析器146不能正確確定這些細(xì)胞的尺寸，從而將這些細(xì) 胞錯誤分類。因此，通過確保只分析在焦點(diǎn)上成像的細(xì)胞，該分析的確定 性得到改善。圖7示出了在樣本710的三個不同層720a-c上成像的樣本。層720b 表示焦平面，其將在下面詳細(xì)討論。光學(xué)系統(tǒng)具有景深，在該景深內(nèi)物體 可以械j見為處于焦點(diǎn)上，即使他們并不是正好落在焦平面上。在圖7中， 用虛線720b，來表示焦平面720b的景深。
圖8a-c示出了相才感圖中的三種不同白血細(xì)胞，圖9a-c示出了它 們對應(yīng)的光分布。
圖8b示出了在焦點(diǎn)上成像的白血細(xì)胞。胞核顯示為黑色陰影，而周圍 的細(xì)胞質(zhì)則幾乎不可見。在圖9b中示出了光強(qiáng)分布。胞核顯示為其光強(qiáng)相 當(dāng)?shù)偷牟糠?，而?xì)胞質(zhì)則不對光強(qiáng)產(chǎn)生影響。
圖8a示出了離圖像獲取裝置441過近以致于不能在焦點(diǎn)上成像的白血 細(xì)胞。胞核顯示為黑色陰影，而周圍的細(xì)胞質(zhì)則用作透鏡且使光發(fā)生折射 和散射，這形成環(huán)繞胞核的黑圏。在圖9a中示出了光強(qiáng)的分布。胞核顯示 為其光強(qiáng)相當(dāng)?shù)偷牟糠?，?xì)胞質(zhì)顯示出具有低光強(qiáng)。
圖8c示出了離圖像獲取裝置441過遠(yuǎn)以致于不能在焦點(diǎn)上成像的白血 細(xì)胞。胞核顯示為黑色陰影，而周圍的細(xì)胞質(zhì)用作透鏡且使光發(fā)生折射， 這形成環(huán)繞胞核的亮圏。在圖9c中示出了光強(qiáng)的分布。胞核顯示為其光強(qiáng) 相當(dāng)?shù)偷牟糠?，而?xì)胞質(zhì)顯示出具有高的光強(qiáng)。
圖像分析器146進(jìn)一步設(shè)置成確定在焦點(diǎn)上成像的白血細(xì)胞的尺寸。 所確定的尺寸然后可被用于對白血細(xì)胞進(jìn)行分類，其中所述分類方式與上 面參考第 一 實(shí)施例所描述的方式相當(dāng)。由于第二數(shù)字圖像會有些模糊和難
以分析，圖像分析器146可被設(shè)置成只對相對較小數(shù)量(比如說200)的 白血細(xì)胞進(jìn)行計(jì)數(shù)和分類。這仍然足以形成樣本中的不同類型白血細(xì)胞的 比值的具有統(tǒng)計(jì)意義的結(jié)果。作為可選方式，圖像分析器146被設(shè)置成在 同一圖像處理步驟中測量尺寸和a^細(xì)胞是否在焦點(diǎn)上成像。因此，每個 被成像的細(xì)胞的尺寸均被求出，但是在確定樣本中的不同類型白血細(xì)胞的 比值時只考慮在焦點(diǎn)上成^f象的細(xì)胞。
圖像分析器146可以以處理單元的形式實(shí)現(xiàn)，其包括用于執(zhí)行這種圖 像分析的代碼。當(dāng)采用圖7-9a-c的原理和圖10的配置時，i殳備30可,皮i殳置成利用不 同的光學(xué)配置獲取樣本的數(shù)幅數(shù)字圖像。例如，所述數(shù)幅數(shù)字圖像可以對 圖10所示的樣本710的十個不同的層720a-j進(jìn)行成像。圖像分析器被設(shè) 置成針對特殊的顆?；蚣?xì)胞確定所述顆粒或細(xì)胞成像于其中的所述圖像的 數(shù)量。圖像的計(jì)數(shù)從其中顆粒或細(xì)胞被確定是沿第 一方向離開焦點(diǎn)的圖像 開始，經(jīng)由其中顆粒或細(xì)胞被確定是位于焦點(diǎn)上的圖像繼續(xù)，且以其中顆 粒或細(xì)胞被確定是沿第二方向離開焦點(diǎn)的圖像結(jié)束。第一和第二方向是關(guān) 于焦平面的基^目反的法線。在圖8a和圖9a中，細(xì)胞被確定是沿第一方 向離開焦點(diǎn)。沿該方向離開焦點(diǎn)的極P艮被確定是其中特定細(xì)胞的不同區(qū)域 (中心區(qū)域和環(huán)狀區(qū)域)之間的對比度被測出最大的圖像。對于更接近成 像系統(tǒng)的細(xì)胞，將檢測到具有環(huán)繞黑暗胞核的黑環(huán)的相同的基本形狀，但 是它們會更為模糊，且對比度將低于確定為沿第一方向離開焦點(diǎn)的極限的 圖像中的對比度。類似地，通過識別在哪幅圖像中檢測到在黑暗胞核和環(huán) 繞胞核的光之間存在最大對比度確定其它極限。在其焦平面離成像系統(tǒng)更 遠(yuǎn)的圖像中，細(xì)胞將仍被檢測為黑暗的胞核和光圏，但是它們將會更加模 糊，且對比度將低于被看作是沿第二方向離開焦點(diǎn)的極限的圖像中的對比 度。
這將給出關(guān)于相應(yīng)白血細(xì)胞的曲率半徑的信息。相比較小的白血細(xì)胞 將給出相比較短的焦距，且將在對處于極限圖像之間的圖像進(jìn)行計(jì)數(shù)時， 得到相比較低的圖像數(shù)。這也可以被表達(dá)成它們快速移入和移離焦點(diǎn)。相 比較大的白血細(xì)胞將給出相比較長的焦距，且在其中它們沿一個方向離開 焦點(diǎn)的圖像與其中它們沿另 一方向離開焦點(diǎn)的圖像之間的距離將相比較 大。這也可以被表達(dá)成當(dāng)將所獲取的不同圖像與來自相鄰層的圖像作比 較時，它們將緩慢地移入和移離焦點(diǎn)。注意焦距和極限圖像涉;o巨離， 但是利用關(guān)于相應(yīng)圖像的在焦平面上的特定距離，距離可以替換表示成圖 像的數(shù)量。
圖10的實(shí)施例包括光源434、樣本獲取裝置410、光學(xué)系統(tǒng)438 (其 具有10x的放大系數(shù))、將光引至圖像獲取裝置440的光圏450。參見圖4,
37將描述用于白血細(xì)胞的體積計(jì)數(shù)的方法。該方法包括將血樣采集到樣本獲
取裝置的步驟102。未經(jīng)稀釋的全血樣本被采集到樣本獲取裝置中?？梢詮拿?xì)管血或靜脈血中采集樣本。毛細(xì)管血的樣本可以直接從刺破的患者手指抽入測量腔。血樣接觸樣本獲取裝置中的試劑，引發(fā)反應(yīng)。紅血細(xì)胞將被溶解，且染色劑將積聚在白血細(xì)胞的胞核中。在采集血樣之后的幾分鐘內(nèi)，樣本就可以用于分析?？蛇x的是，采集樣本且在將其引入樣本獲取裝置之前使其與溶血劑和染色劑混合。在步驟104，樣本獲取裝置然后被放入分析設(shè)備。通過按壓分析設(shè)備的按鈕來啟動分析。或者，該分析通過設(shè)備檢測到樣本獲取裝置的存在而自動啟動。
在步驟106,樣本^L輻照，且在步驟108，利用不同的光學(xué)配置獲取樣本的第一和第二數(shù)字圖像。用其波長與染色劑的吸收峰相對應(yīng)的電磁輻射輻照樣本。這意味著數(shù)字圖像將在白血細(xì)胞胞核的位置上包含有黑色或者較暗的點(diǎn)。
在步驟110,所獲取的數(shù)字圖像被傳給圖像分析器，所述圖像分析器執(zhí)行第一和第二數(shù)字圖像的圖像分析。圖像分析器對第一數(shù)字圖像中的黑點(diǎn)數(shù)進(jìn)行計(jì)數(shù)，以確定血樣中的所有白血細(xì)胞的體積計(jì)數(shù)。該圖像分析器還分析第二數(shù)字圖像中的一定數(shù)量的黑點(diǎn)的尺寸和形狀，以對白血細(xì)胞進(jìn)
行分類和獲取血樣中的不同類型的白血細(xì)胞的比值。
根據(jù)圖11所示的另一實(shí)施例，圖像獲取步驟108b包括在不同層上獲取多幅數(shù)字圖像。
在圖像分析器中，對(來自各層的)相應(yīng)的數(shù)字圖像進(jìn)行分析以確定哪些白血細(xì)胞位于焦點(diǎn)上，且針對這些白血細(xì)胞對圖像進(jìn)行分析以對白血細(xì)胞進(jìn)行分類，和獲取血樣中不同種類的白血細(xì)胞的比值。
應(yīng)強(qiáng)調(diào)在此描述的優(yōu)選實(shí)施例并非限制性的，且在由所提交的權(quán)利要求定義的保護(hù)范圍內(nèi)存在多種替換實(shí)施例。
圖10的設(shè)備可以是獨(dú)立的單元，因?yàn)榭梢栽诖_定相應(yīng)白血細(xì)胞的分類的同時確定白血細(xì)胞的總數(shù)?；蛘撸瑘D10的設(shè)備可以被用作圖2的實(shí)施例中的圖像獲取裝置41,或者用作圖3的實(shí)施例中的圖像獲取裝置141。這種設(shè)計(jì)在圖12中大體示出。該實(shí)施例包括光源534、光圏550、樣本獲取裝置510、分束器539、將光引至第一圖^象獲取裝置540的第一光學(xué)系統(tǒng)538a(其具有約3x的第一放大系數(shù))，和經(jīng)由反射鏡534將光引至第二圖像獲取裝置541的第二光學(xué)系統(tǒng)538b (其具有約10x的第二放大系數(shù))。第二光學(xué)系統(tǒng)還包括用于改變焦點(diǎn)的裝置542,或者是活動的。因此，第二獲取裝置541能夠獲取多幅數(shù)字圖像。在一個實(shí)施例中，第一圖像獲取裝置540被省略，且顆?；虬籽?xì)胞的總數(shù)從由第二圖像獲取裝置541獲取的圖像中求出。
權(quán)利要求
1. 一種用于對樣本中的顆粒進(jìn)行計(jì)數(shù)的測量設(shè)備，所述設(shè)備包括保持器，其被設(shè)置成接收樣本獲取裝置，所述樣本獲取裝置包括保持樣本的測量腔；成像系統(tǒng)，其適于獲取至少一幅樣本的放大數(shù)字圖像；以及圖像分析器，其被設(shè)置成對所獲取的至少一幅數(shù)字圖像進(jìn)行分析以識別顆粒和確定樣本中的顆粒數(shù)，其中所述圖像分析器被設(shè)置成分析所獲取的至少一幅數(shù)字圖像以識別在焦點(diǎn)上成像的顆粒和確定這些顆粒的類型和數(shù)量，所述類型通過顆粒的物理特征來辨別，從而確定樣本中不同類型的顆粒的比值。
2. 如權(quán)利要求1所述的測量設(shè)備，其中所述設(shè)備適于計(jì)數(shù)血樣中 的白血細(xì)胞，所述測量腔適于保持經(jīng)染色和溶血的血樣，其中所述圖像分 析器被設(shè)置成分析所獲取的至少 一幅數(shù)字圖像以識別經(jīng)染色的白血細(xì)胞和 確定樣本中的白血細(xì)胞數(shù)量，其中所述圖像分析器被設(shè)置成分析所獲取的 至少一幅數(shù)字圖像以識別在焦點(diǎn)上成像的白血細(xì)胞和確定這些白血細(xì)胞的 類型和數(shù)量，其中通過白血細(xì)胞的物理特征來辨別所述類型，從而確定樣 本中不同類型的白血細(xì)胞的比值。
3. 如權(quán)利要求1或2所述的測量設(shè)備，還包括電磁輻射源，所述電 磁輻射源被設(shè)置成對保持在所述樣本獲取裝置的測量腔中的樣本進(jìn)行輻 照。
4. 如權(quán)利要求1-3中任一項(xiàng)所述的測量設(shè)備，其中所述成像系統(tǒng) 被設(shè)置成利用不同的光學(xué)配置獲取多幅樣本的數(shù)字圖像，其中所述圖像分 析器被設(shè)置成分析所獲取的各幅數(shù)字圖像以識別顆?；蛘弑蝗旧陌籽?xì) 胞，和確定樣本中的顆?；虬籽?xì)胞的數(shù)量，其中所述圖像分析器被設(shè)置 成分析所獲取的各幅數(shù)字圖像以識別在焦點(diǎn)上成像的顆?；虬籽?xì)胞，和 確定這些顆?；虬籽?xì)胞的類型和數(shù)量，其中所述類型通過顆?；虮蝗旧?的白血細(xì)胞的物理特征來辨別，從而確定樣本中不同類型的顆?；虬籽?xì)胞的比值。
5. 如權(quán)利要求1所述的測量設(shè)備，其中所述成像系統(tǒng)被設(shè)置成在 所獲取的圖像中提供光的方向信息，從而能夠在所獲取的圖像中轉(zhuǎn)移焦點(diǎn)。
6. 如權(quán)利要求1所述的測量設(shè)備，其中所述成像系統(tǒng)被設(shè)置成利 用不同光學(xué)配置獲取樣本的第一和第二數(shù)字圖像，其中所述圖像分析器被 設(shè)置成分析所獲取的第一數(shù)字圖像以確定樣本中的顆?；虬籽?xì)胞的數(shù) 量，且所述圖像分析器被設(shè)置成分析所獲取的第二數(shù)字圖像以確定樣本中 不同類型的顆粒的比值。
7. 如權(quán)利要求6所述的測量設(shè)備，其中所述成像系統(tǒng)包括兩個至 少部分獨(dú)立的部分，其將光從受輻照的樣本引至所述成像系統(tǒng)的第一和第 二部分。
8. 如權(quán)利要求1-7中任一項(xiàng)所述的測量設(shè)備，其中所述圖像分析 器被設(shè)置成分析被成像的顆?；蚣?xì)胞的邊緣，以基于在所述邊緣上的強(qiáng)度 斜率估計(jì)所述顆?；蚣?xì)胞是否在焦點(diǎn)上成像。
9. 如權(quán)利要求1-8中任一項(xiàng)所述的測量設(shè)備，其中所述圖像分析 器被設(shè)置成針對特定顆?；蚣?xì)胞確定所述顆粒或細(xì)胞成像于其中的圖像的 數(shù)量，其中所述數(shù)量從其中顆?；蚣?xì)胞被確定是沿第一方向離開焦點(diǎn)的圖 像到其中顆?；蚣?xì)胞被確定是沿第二方向離開焦點(diǎn)的圖像計(jì)數(shù)。
10. 如權(quán)利要求9所述的測量設(shè)備，其中所述圖像分析器被設(shè)置成 基于所述計(jì)數(shù)出的圖像數(shù)，確定與所述顆?；蚣?xì)胞的尺寸有關(guān)的物理特征。
11. 如權(quán)利要求1-10中任一項(xiàng)所述的測量設(shè)備，其中具有用于獲取 所述至少一幅數(shù)字圖像的光學(xué)配置的成像系統(tǒng)具有l(wèi)-50x、更優(yōu)選l-20x、 更優(yōu)選3-20x、更優(yōu)選5-20x且更優(yōu)選約為10x的方文大率。
12. 如權(quán)利要求l-ll中任一項(xiàng)所述的測量設(shè)備，其中所述成像系統(tǒng) 被設(shè)置成用范圍為2-60微米、更優(yōu)選2-30微米、更優(yōu)選約為8-10微米的 景深獲取所述至少一幅數(shù)字圖像。
13. 如權(quán)利要求3-12中任一項(xiàng)所述的測量設(shè)備，其中所述電磁輻射 源被設(shè)置成用與染色劑的吸收峰相對應(yīng)的光波長進(jìn)行輻照。
14. 如權(quán)利要求3-13中任一項(xiàng)所述的測量設(shè)備，其中所述電磁輻射 源包括激光源。
15. 如權(quán)利要求3-13中任一項(xiàng)所述的測量設(shè)備，其中所述電磁輻射 源包括發(fā)光二極管。
16. 如權(quán)利要求4-15中任一項(xiàng)所述的測量設(shè)備，其中所述圖像分析 器4皮設(shè)置成識別具有高的光吸收率的區(qū)域，以確定樣本中的顆粒或白血細(xì) 胞的數(shù)量。
17. 如權(quán)利要求16所述的測量設(shè)備，其中所述圖像分析器被設(shè)置 成識別暗點(diǎn)以確定樣本中的顆?；虬籽?xì)胞的數(shù)量。
18. 如權(quán)利要求4-17中任一項(xiàng)所述的測量設(shè)備，其中所述圖像分析 器被設(shè)置成通過分析在所述至少一幅數(shù)字圖像中識別出的光吸收率高的區(qū) 域的形狀和尺寸而辨別不同類型的顆?；虬籽?xì)胞。
19. 一種用于對樣本中的顆粒進(jìn)行計(jì)數(shù)的方法，所述方法包括 將樣本采集到樣本獲取裝置的測量腔中； 獲取至少一幅測量腔中的受輻照樣本的放大數(shù)字圖像；數(shù)字分析所述至少 一幅數(shù)字圖像以識別顆粒和確定樣本中的顆粒數(shù) 量；以及數(shù)字分析所述至少一幅數(shù)字圖像以識別在焦點(diǎn)上成像的顆粒和確定這 些顆粒的類型和數(shù)量，其中通過顆粒的物理特征來辨別所述類型，從而確 定樣本中不同類型的顆粒的比值。
20. 如權(quán)利要求19所述的方法，其中所述方法適于對血樣中的白血 細(xì)胞進(jìn)行計(jì)數(shù)，所述方法包括將血樣采集到樣本獲取裝置的測量腔中，將血樣與試劑混合，其中所胞進(jìn)行染色的染色劑；獲取至少一幅測量腔中的受輻照樣本的放大數(shù)字圖像； 數(shù)字分析所述至少 一幅數(shù)字圖像以識別通過選擇性染色而染色的白血細(xì)胞和確定樣本中的白血細(xì)胞的數(shù)量；以及數(shù)字分析所述至少一幅數(shù)字圖像以識別在焦點(diǎn)上成像的白血細(xì)胞和確 定這些白血細(xì)胞的類型和數(shù)量，其中所述類型通過,皮染色的細(xì)胞的物理特 征來辨別，從而確定血樣中不同類型的白血細(xì)胞的比值。
21. 如權(quán)利要求19所述的方法，其中所述樣本在測量腔中與所述 試劑混合。
22. 如權(quán)利要求19所述的方法，還包括輻照保持在樣本獲取裝置 的測量腔中的樣本。
23. 如權(quán)利要求19-22中任一項(xiàng)所述的方法，其中利用不同的光學(xué) 配置獲取樣本的多幅數(shù)字圖像，其中對所獲取的各數(shù)字圖像進(jìn)行分析以識 別顆?；虮蝗旧陌籽?xì)胞和確定樣本中的顆?；虬籽?xì)胞的數(shù)量，其中 對所獲取的各數(shù)字圖像進(jìn)行分析以識別在焦點(diǎn)上成像的顆?；虬籽?xì)胞和 確定這些顆?；虬籽?xì)胞的類型和數(shù)量，其中所述類型通過所述顆粒或被 染色的白血細(xì)胞的物理特征來辨別，從而確定樣本中不同類型的顆?；虬?血細(xì)胞的比值。
24. 如權(quán)利要求19-23中任一項(xiàng)所述的方法，其中獲取所述至少一 幅數(shù)字圖像以使得在所獲取的圖像中記錄光的方向信息，從而能夠在所獲 取的圖像中轉(zhuǎn)移焦點(diǎn)，且其中通過順序轉(zhuǎn)移焦點(diǎn)來執(zhí)行分析。
25. 如權(quán)利要求19-24中任一項(xiàng)所述的方法，其中所述獲取至少一幅 數(shù)字圖像包括獲取測量腔中的樣本的具有第 一放大率的第 一數(shù)字圖像， 和獲取測量腔中的樣本的具有第二放大率的第二數(shù)字圖像，其中所述第二 放大率大于所述第 一放大率，其中對所獲取的第一數(shù)字圖像進(jìn)行分析以確 定樣本中的顆?；虬籽?xì)胞的數(shù)量，和對所獲取的第二數(shù)字圖像進(jìn)行分析 以確定樣本中的不同類型的顆?；虬籽?xì)胞的比值。
26. 如權(quán)利要求19-25中任一項(xiàng)所述的方法，還包括針對特定細(xì)胞 確定所述細(xì)胞成像于其中的所述圖像的數(shù)量，其中所述數(shù)量從其中顆?；?細(xì)胞被確定是沿第 一方向離開焦點(diǎn)的圖像到其中顆粒或細(xì)胞被確定是沿第 二方向離開焦點(diǎn)的圖像計(jì)數(shù)。
27. 如權(quán)利要求26所述的方法，其中基于所述計(jì)數(shù)的圖像數(shù)，確定與所述細(xì)胞的尺寸有關(guān)的物理特征。
28. 如權(quán)利要求19-27中任一項(xiàng)所述的方法，其中使用l-50x、更 優(yōu)選l-20x、更優(yōu)選3-20x、更優(yōu)選5-20x且更優(yōu)選約為10x的放大率獲取 所述至少一幅數(shù)字圖像。
29. 如權(quán)利要求19-28中任一項(xiàng)所述的方法，其中所述成像系統(tǒng)被 設(shè)置成用范圍為2-60微米、更優(yōu)選2-30微米、更優(yōu)選約為8-10微米的景 深獲取所述至少 一幅數(shù)字圖像。
30. 如權(quán)利要求22-29中任一項(xiàng)所述的方法，其中用波長對應(yīng)染色 劑的吸收峰的光輻照樣本。
31. 如權(quán)利要求22-30中任一項(xiàng)所述的方法，其中用激光源執(zhí)行所 述輻照。
32. 如權(quán)利要求22-31中任一項(xiàng)所述的方法，其中用發(fā)光二極管執(zhí) 行所述輻照。
33. 如權(quán)利要求19-32中任一項(xiàng)所述的方法，其中所述分析包括識 別具有高的光吸收率的區(qū)域，以確定樣本中的顆?；虬籽?xì)胞的數(shù)量。
34. 如權(quán)利要求33所述的方法，其中所述分析包括識別暗點(diǎn)以確 定樣本中的顆?；虬籽?xì)胞的數(shù)量。
35. 如權(quán)利要求19-34中任一項(xiàng)所述的方法，其中所述分析包括通 過分析在所述至少 一幅數(shù)字圖像中識別出的光吸收率高的區(qū)域的形狀和尺 寸而辨別不同類型的顆粒或白血細(xì)胞。
36. —種包含在計(jì)算機(jī)可讀介質(zhì)中的用于樣本分析的計(jì)算機(jī)程序產(chǎn) 品，其包括用于數(shù)字分析至少一幅樣本圖像以確定樣本中的顆粒數(shù)的計(jì)算機(jī)代碼；用于數(shù)字分析所述至少 一幅樣本圖像以識別樣本的聚焦區(qū)域中的 一種 或多種顆粒的計(jì)算機(jī)代碼，其中各種顆粒均與一種或多種辨別物理特征相 關(guān)聯(lián)；以及用于輸出與樣本中的顆粒數(shù)量和類型相對應(yīng)的信息的計(jì)算機(jī)代碼。
37. —種用于分析樣本的計(jì)算機(jī)程序，該計(jì)算機(jī)程序包括計(jì)算機(jī)程序代碼，所述代碼用于分析至少一幅數(shù)字圖像以識別顆粒和確定樣本中的顆粒數(shù)；以及 分析所述至少一幅數(shù)字圖像以識別在焦點(diǎn)上成像的顆粒和確定這些顆粒的類型和數(shù)量，所述類型通過顆粒的物理特征來辨別，從而確定樣本中不同類型的顆粒的比值。
全文摘要
一種用于對樣本中的顆?；虬籽?xì)胞進(jìn)行計(jì)數(shù)的測量設(shè)備，其包括保持器，其被設(shè)置成接收保持樣本的樣本獲取裝置；成像系統(tǒng)，其包括放大裝置和至少一個數(shù)字圖像獲取裝置，所述成像系統(tǒng)被設(shè)置成獲取至少一幅樣本的數(shù)字圖像；以及圖像分析器，其被設(shè)置成對數(shù)字圖像進(jìn)行分析以識別顆?；虬籽?xì)胞和確定顆粒或白血細(xì)胞的數(shù)量，且被設(shè)置成分析數(shù)字圖像以識別在焦點(diǎn)上成像的顆?；虬籽?xì)胞、確定這些顆?；虬籽?xì)胞的類型(其中通過物理特征來辨別類型)和確定不同類型的顆粒或白血細(xì)胞的比值。
文檔編號G01N15/14GK101490529SQ200780026960
公開日2009年7月22日 申請日期2007年7月4日 優(yōu)先權(quán)日2006年7月19日
發(fā)明者S·林德貝格, T·奧勒森 申請人:海莫庫公司