專利名稱：一種固相放射性受配體結(jié)合的分析方法
技術(shù)領(lǐng)域：
一種固相放射性受配體結(jié)合的分析方法，屬于生物醫(yī)藥技術(shù)領(lǐng)域。具體涉
及可溶性白細(xì)胞介素15受體a亞單位，即sIL-15Ra的固相放射性受配體結(jié)合的分析。
背景技術(shù)：
白細(xì)胞介素15 (Interleukin 15,IL-15)是一種與炎癥及自身免疫病密切相關(guān) 的細(xì)胞因子。完整的IL-15受體(IL-15 receptor, IL-15R)是由a、 (3和y三條鏈 組成的異源三聚體(IL-15RaPY)。其中a鏈(IL-15Ra)是形成高特異、高親和 力IL-15R的必要亞單位。
IL-15Ra是一種I型跨膜蛋白，其基因分別定位于人的第10號(hào)染色體和鼠 的第2號(hào)染色體上。全長IL-15Ra由263氨基酸殘基(amino acid， aa)組成，其 中包括32aa的信號(hào)肽，173aa的胞外段，21aa的跨膜段以及37aa的胞內(nèi)段。在 沒有(3和Y鏈參與的情況下，IL-15Ra便可與IL-15高親和力結(jié)合 (KcN10-Hmol/l)，該親和力的大小和IL-15RoiPy與il-15之間的親和力處于同 一數(shù)量級(jí)。參與受體復(fù)合物組成的單一亞單位具有與完整受體復(fù)合物相當(dāng)?shù)摹?與相應(yīng)配體結(jié)合的能力，這一不同尋常的特性使IL-15Ra成為近年來免疫學(xué)研 究的熱門分子。
受配體結(jié)合分析在IL-15Ra特殊結(jié)合特性的發(fā)現(xiàn)中發(fā)揮了重要的作用，而 通常采用的生物膜結(jié)合分析方法存在步驟繁瑣、工作量大、重現(xiàn)性差等缺點(diǎn)， 本發(fā)明使用的固相放射性受配體結(jié)合分析具有簡便、快速、重現(xiàn)性好的特點(diǎn)。
發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是提供一種固相放射性受配體結(jié)合的分析方法，用于可溶性 白細(xì)胞介素15受體a亞單位，即sIL-15Rot的固相放射性受配體結(jié)合的分析。
本發(fā)明的技術(shù)方案 一種固相放射性受配體結(jié)合的分析方法，將配體用 50mmol/L、 pH9.6的碳酸鹽緩沖液溶解后，包被于可拆卸式96孔微孔板條中， 將不同濃度的放射性碘標(biāo)記的受體加于各包被孔中，4"C反應(yīng)2h，洗滌液清洗3 遍，取下各孔于Y計(jì)數(shù)儀上測(cè)總cpm值記為cpmt，以加入對(duì)應(yīng)各孔中放射性碘 標(biāo)記受體濃度200倍的未標(biāo)記受體的計(jì)數(shù)值作為非特異結(jié)合cpm值記為cpmb， 各孔中放射性受配體結(jié)合的cpm值為cpmr cpmb。
要求放射性碘標(biāo)記受體的放射化學(xué)純度》95%。
所述的固相放射性受配體結(jié)合的分析方法的應(yīng)用，用于可溶性白細(xì)胞介素
15受體a亞單位，即sIL-15Ra的固相放射性受配體結(jié)合的分析將配體IL-15 用50mmol/L、pH9.6的碳酸鹽緩沖液溶解后，包被于可拆卸式96孔微孔板條中， 將不同濃度的放射性碘標(biāo)記的受體125I-sIL-15Ra加于各包被孔中，4"C反應(yīng)2h， 洗滌液清洗3遍，取下各孔于Y計(jì)數(shù)儀上測(cè)總cpm值記為cpmt，以加入對(duì)應(yīng)各 孔中放射性碘標(biāo)記受體125I-sIL-15Ra濃度200倍的未標(biāo)記受體sIL-15Ra的計(jì)數(shù) 值作為非特異結(jié)合cpm值記為cpmb，各孔中放射性受配體結(jié)合的cpm值為 cpm = cpmt- cpmb。
要求放射性碘標(biāo)記受體125I-sIL-15Ra的放射化學(xué)純度》95%。
所述的sIL-15Ra的放射性碘標(biāo)記采用氯胺T法sIL-15Ra凍干品用pH7.4、 100mmol/L的磷酸緩沖液溶解成lmg/ml工作液，于該工作液中加lmCi 1251 混勻，加入10嗎氯胺T后室溫反應(yīng)lmin，加50嗎偏重亞硫酸鈉終止反應(yīng)，過 PD-10柱分離純化碘標(biāo)蛋白125I-sIL-15Ra，以pH7.4、 5Ommol/L的磷酸緩沖液洗 脫，收集10滴/管的洗脫液，每管取10^d測(cè)放射性計(jì)數(shù)cpm值。
所述的方法，其中sIL-15Ra的放射化學(xué)純度測(cè)定取氯胺T法碘標(biāo)記后的 各管洗脫液，采用三氯醋酸沉淀法測(cè)定各管的放射化學(xué)純度，計(jì)算公式為放 射化學(xué)純度％= (cpm沉淀+cpm總)xl00%;
其中cpm沉淀為加入三氯醋酸后經(jīng)離心所得沉淀的cpm值，
cpm總為加入三氯醋酸前碘標(biāo)蛋白的cpm值。
本發(fā)明的有益效果受配體結(jié)合分析在IL-15Ra特殊結(jié)合特性的發(fā)現(xiàn)中發(fā) 揮了重要的作用，目前采用的生物膜結(jié)合分析方法存在步驟繁瑣、工作量大、 重現(xiàn)性差等缺點(diǎn)，本發(fā)明使用的固相放射性受配體結(jié)合分析具有簡便、快速、 重現(xiàn)性好的特點(diǎn)。
圖1 sIL-15Ra誘導(dǎo)表達(dá)的SDS-PAGE分析 圖2 125I-sIL-15Ra放射化學(xué)純度的三氯醋酸沉淀法測(cè)定 圖3 sIL-15Ra與IL-15的受配體結(jié)合的Scatchard分析
具體實(shí)施例方式
實(shí)施例1
1. sIL-15Ra基因克隆、重組表達(dá)及純化根據(jù)GenBank中鼠IL-15Ra的cDNA 序列，設(shè)計(jì)sIL-15Ra編碼序列的引物對(duì)；Trizol法提取小鼠脾臟細(xì)胞總RNA， 以01igoT為引物合成cDNA第一鏈，并以此為模板進(jìn)行PCR擴(kuò)增；PCR產(chǎn)物 與pMD18-T simple載體連接，得pMD18-T/s/L-A5i a重組質(zhì)粒，再與表達(dá)載體 pQE-30連接，獲pQE-30/s幾-"i cc重組表達(dá)質(zhì)粒，并轉(zhuǎn)化至M15感受態(tài)細(xì)菌， 通過降低誘導(dǎo)溫度和異丙基-(3-D-硫代半乳糖濃度的方式實(shí)現(xiàn)了重組蛋白的可溶 性表達(dá)，進(jìn)而通過與Ni-NTA金屬螯合柱選擇性結(jié)合實(shí)現(xiàn)了重組蛋白的一步純
化。每升菌中可純化得到約7mg重組蛋白，純度大于95%。以CTLL-2細(xì)胞為 靶的生物學(xué)活性分析結(jié)果顯示，純化所得的重組蛋白sIL-15Rct能夠特異地協(xié)同 IL-15發(fā)揮相應(yīng)的促細(xì)胞增殖效應(yīng)。
2. sIL-15Ra的放射性碘標(biāo)記sIL-15Ra的放射性碘標(biāo)記采用氯胺T法。具 體步驟如下取sIL-15Ra凍干品用pH 7.4、 100mmol/L的磷酸緩沖液溶解成 lmg/mL工作液，于10fiL該工作液中加lmCi 1251混勻，加入IO嗎氯胺T后室 溫反應(yīng)lmin，加50pg偏重亞硫酸鈉終止反應(yīng)，過PD-10柱分離純化碘標(biāo)蛋白 125I-sIL-15Ra，以pH7.4、 50mmol/L的磷酸緩沖液洗脫，收集10滴/管的洗脫液， 每管取10pL測(cè)放射性計(jì)數(shù)cpm值。125I-sIL-15Ra的放射化學(xué)純度測(cè)定采用三氯 醋酸沉淀法，即取碘標(biāo)記后的各管洗脫液，加入三氯醋酸沉淀蛋白，樣品經(jīng)離 心后吸除上清，然后測(cè)定沉淀的放射性。放射化學(xué)純度的計(jì)算公式為放射化 學(xué)純度％= (cpm沉淀+cpm總)xioo%;
其中cpm沉淀為加入三氯醋酸后經(jīng)離心所得沉淀的cpm值， cpm總為加入三氯醋酸前碘標(biāo)蛋白的cpm值。 經(jīng)檢測(cè)，125I-sIL-15Ra的放射化學(xué)純度>95%。
3. sIL-15Rct與IL-15間親和力的固相放射性受配體結(jié)合分析將配體IL-15 用50mmol/L、 pH 9.6的碳酸鹽緩沖液溶解后，包被于可拆卸式96孔微孔板條 中，將不同濃度的放射性碘標(biāo)記的受體^I-sIL-15Ra加于各包被孔中，4'C反應(yīng) 2h，洗滌液清洗3遍，取下各孔于Y計(jì)數(shù)儀上測(cè)總cpm值記為cpmt，以加入未 標(biāo)記受體sIL-15Ra所測(cè)得的計(jì)數(shù)值作為非特異結(jié)合cpm值記為cpmb，該未標(biāo)記 受體sIL-15Ra的濃度為碘標(biāo)記受體125I-sIL-15Ra濃度的200倍。各孔中放射性 受配體結(jié)合的cpm:cpmt-cpmb。所得結(jié)果經(jīng)Scatchard作圖分析顯示，重組表 達(dá)的sIL-15Ra與IL-15之間具有極高的親和力，Kd = 49.26pM。
權(quán)利要求
1、一種固相放射性受配體結(jié)合的分析方法，其特征是將配體用pH9.6、50mmol/L的碳酸鹽緩沖液溶解后，包被于可拆卸式96孔微孔板條中，將不同濃度的放射性碘標(biāo)記的受體加于各包被孔中，4℃反應(yīng)2h，洗滌液清洗3遍，取下各孔于γ計(jì)數(shù)儀上測(cè)總cpm值記為cpmt，以加入對(duì)應(yīng)各孔中放射性碘標(biāo)記受體濃度200倍的未標(biāo)記受體的計(jì)數(shù)值作為非特異結(jié)合cpm值記為cpmb，各孔中放射性受配體結(jié)合的cpm值為cpmt-cpmb；要求放射性碘標(biāo)記受體的放射化學(xué)純度≥95％。
2、 權(quán)利要求l所述的固相放射性受配體結(jié)合的分析方法的應(yīng)用，其特征是 用于可溶性白細(xì)胞介素15受體a亞單位，即sIL-15Ra的固相放射性受配體結(jié)合 的分析將配體IL-15用pH 9.6、 5Ommol/L的碳酸鹽緩沖液溶解后，包被于可 拆卸式96孔微孔板條中，將不同濃度的放射性碘標(biāo)記的受體125I-sIL-15Ra加于 各包被孔中，fC反應(yīng)2h，洗滌液清洗3遍，取下各孔于y計(jì)數(shù)儀上測(cè)總cpm值 記為cpmt，以加入對(duì)應(yīng)各孔中放射性碘標(biāo)記受體125I-sIL-15Ra濃度200倍的未 標(biāo)記受體sIL-15Ra的計(jì)數(shù)值作為非特異結(jié)合cpm值記為cpmb,各孔中放射性 受配體結(jié)合的cpm值為cpmt- cpmb;要求放射性碘標(biāo)記受體125I-sIL-15Ra的放射化學(xué)純度》95%。
3、 根據(jù)權(quán)利要求2所述的方法，其特征是sIL-15Ra的放射性碘標(biāo)記，采用 氯胺T法sIL-15Ra凍干品用pH7.4、 10Ommol/L的磷酸緩沖液溶解成lmg/mL 工作液，于10pL該工作液中加lmCi 1251混勻，加入IO嗎氯胺T后室溫反應(yīng) lmin，加50嗎偏重亞硫酸鈉終止反應(yīng)，過PD-10柱分離純化碘標(biāo)蛋白 125I-sIL-15Ra，以pH7.4、 50mmol/L的磷酸緩沖液洗脫，收集10滴/管的洗脫液， 每管取10nL測(cè)放射性計(jì)數(shù)cpm值。
4、 根據(jù)權(quán)利要求2所述的方法，其特征是125I-sIL-15Ra的放射化學(xué)純度測(cè) 定取氯胺T法碘標(biāo)記后的各管洗脫液，采用三氯醋酸沉淀法測(cè)定各管的放射 化學(xué)純度；計(jì)算公式為放射化學(xué)純度％= (cpm縱+cpm總)xlOO%， 其中cpm縱為加入三氯醋酸后經(jīng)離心所得沉淀的cpm值， cpm總為加入三氯醋酸前碘標(biāo)蛋白的cpm值。
全文摘要
一種固相放射性受配體結(jié)合的分析方法，屬于生物醫(yī)藥技術(shù)領(lǐng)域。本發(fā)明將配體用pH 9.6、50mmol/L的碳酸鹽緩沖液溶解后，包被于可拆卸式96孔微孔板條中，將不同濃度的放射性碘標(biāo)記的受體加于各包被孔中，4℃反應(yīng)2h，洗滌液清洗3遍，取下各孔于γ計(jì)數(shù)儀上測(cè)總cpm值記為cpm<sub>t</sub>，以加入對(duì)應(yīng)各孔中放射性碘標(biāo)記受體濃度200倍的未標(biāo)記受體的計(jì)數(shù)值作為非特異結(jié)合cpm值記為cpm<sub>b</sub>，各孔中放射性受配體結(jié)合的cpm值為cpm<sub>t</sub>-cpm<sub>b</sub>；要求放射性碘標(biāo)記受體的放射化學(xué)純度≥95％。本發(fā)明方法應(yīng)用于可溶性白細(xì)胞介素15受體α亞單位，即sIL-15Rα的固相放射性受配體結(jié)合的分析。
文檔編號(hào)G01N33/53GK101178401SQ20071019061
公開日2008年5月14日 申請(qǐng)日期2007年11月27日 優(yōu)先權(quán)日2007年11月27日
發(fā)明者曹國憲, 李文新, 楊潤琳, 俊 范, 蔣孟軍, 蔡剛明, 鄒美芬 申請(qǐng)人:江蘇省原子醫(yī)學(xué)研究所