專利名稱：：一種檢測三聚氰胺的直接競爭法酶聯(lián)免疫試劑盒的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
：本發(fā)明涉及酶聯(lián)免疫和獸藥殘留檢測領(lǐng)域。具體而言，本發(fā)明涉及一種用于檢測三聚氰胺的直接競爭法酶聯(lián)免疫試劑盒。
背景技術(shù)：
：三聚氰胺(Melamine)，簡稱三胺，學(xué)名三氨三嗪，別名蜜胺、氰尿酰胺、三聚酰胺，是一種重要的氮雜環(huán)有機(jī)化工原料，白色結(jié)晶粉末，無味。這種化學(xué)品常被用于生產(chǎn)塑料、膠水和阻燃劑，在部分亞洲國家，它也被用以制造化肥。它是一種禁止用于寵物食品及動物飼料的化學(xué)物質(zhì)，動物食用后可以使動物發(fā)生腎衰竭并導(dǎo)致死亡。2007年3月中旬以來，美國發(fā)生多起寵物貓、狗中毒死亡事件。經(jīng)調(diào)査，是由于一些寵物飼料供應(yīng)商為了增加飼料中蛋白質(zhì)的含量，在小麥蛋白粉和大米蛋白粉中添加了三聚氰胺，從而導(dǎo)致貓、狗中毒死亡。因此亟需建立方便快捷且靈敏度高的檢測方法，禁止此類事件的發(fā)生。現(xiàn)有的三聚氰胺檢測方法多為色譜法，但是這些方法需要有完善的實(shí)驗(yàn)室，有經(jīng)驗(yàn)的技術(shù)人員，復(fù)雜的儀器設(shè)備，且檢測過程繁瑣，不適應(yīng)現(xiàn)場大量樣本的篩査?；诳乖贵w免疫反應(yīng)的免疫學(xué)檢測技術(shù)為小分子殘留物的分析檢測提供了一個新的途徑?；诖嗽斫⒌闹苯痈偁幏嘎?lián)免疫檢測技術(shù)較間接方法進(jìn)一步縮短了檢測時間。該技術(shù)的關(guān)鍵是完全抗原和酶標(biāo)記抗原的合成及抗體的制備。目前，三聚氰胺的直接競爭酶聯(lián)免疫檢測方法尚未見報道。
發(fā)明內(nèi)容本發(fā)明的目的在于提供一種快速檢測三聚氰胺的酶聯(lián)免疫試劑盒。本發(fā)明提供了一種快速檢測三聚氰胺的酶聯(lián)免疫試劑盒，該試劑盒包括三聚氰胺特異性抗體酶標(biāo)板、酶標(biāo)三聚氰胺。其中三聚氰胺特異性抗體為兔抗三聚氰胺的多克隆抗體，用三聚氰胺與載體蛋白偶聯(lián)物作為免疫原通過免疫動物(例如兔)制得。所述的酶標(biāo)記三聚氰胺采用化學(xué)方法偶聯(lián)得到，標(biāo)記酶為辣根過氧化物酶，所述偶聯(lián)方法為琥珀酸酐法。用于制備所述酶標(biāo)板的固相材料，包括但不限于，例如，聚苯乙烯、聚乙烯、聚丙烯。載體的形式是微量反應(yīng)板凹孔。為方便現(xiàn)場檢測和大量樣本篩查，所述試劑盒還可以進(jìn)一步包括包被有三聚氰胺特異性抗體的酶標(biāo)板、三聚氰胺標(biāo)準(zhǔn)溶液、顯色劑、洗滌液、終止液、酶標(biāo)物稀釋液和濃縮樣品稀釋液。所述的洗滌液為0.05%—0.5%吐溫一20磷酸鹽緩沖液。所述的顯色劑由顯色劑A液和顯色劑B液組成(例如，體積比為1:1)，顯色劑A液為過氧化氫或過氧化脲，顯色劑B液為鄰苯二胺或四甲基聯(lián)苯胺。所述的濃縮樣品稀釋液為含0.1%吐溫一20的磷酸鹽緩沖液，所述的酶標(biāo)物稀釋液為含0.01%吐溫一20的磷酸鹽緩沖液。另一方面，本發(fā)明還提供了一種檢測飼料樣品中三聚氰胺含量的方法，包括步驟(1)樣品前處理；(2)用權(quán)利要求l一9任一所述的試劑盒進(jìn)行檢測，向包被有三聚氰胺抗體的酶標(biāo)板孔中加入標(biāo)準(zhǔn)品或樣品溶液，再加入酶標(biāo)記三聚氰胺，孵育后洗滌拍干，加入顯色劑顯色、終止，用酶標(biāo)儀測定吸光度值；(3)分析檢測結(jié)果。本發(fā)明試劑盒的檢測原理為將三聚氰胺抗體包被于固相載體上，加入樣本或三聚氰胺標(biāo)準(zhǔn)品溶液并加入酶標(biāo)記三聚氰胺工作液，待測樣品中的三聚氰胺與酶標(biāo)記三聚氰胺競爭固相化的三聚氰胺抗體，通過洗滌出去未結(jié)合的酶標(biāo)記物，顯色后終止，測定樣品的吸光度值，該值與樣品中三聚氰胺的量呈負(fù)相關(guān)，與標(biāo)準(zhǔn)曲線比較即可得出三聚氰胺濃度范圍。有益效果本發(fā)明檢測三聚氰胺的試劑盒主要采用直接競爭酶聯(lián)免疫測定法定性或定量檢測樣品中三聚氰胺含量；進(jìn)一步縮短了檢測時間，有間接競爭法的2個小時縮短為1個小時，對樣品的前處理要求低，樣品前處理過程簡單，能同時快速檢測大批樣品。本發(fā)明該試劑盒采用高特異性的三聚氰胺多克隆抗體，主要試劑以工作液形式提供，可以減少試劑盒的操作步驟，為使用者節(jié)省時間并降低因操作步驟冗繁造成的誤差，本發(fā)明具有靈敏度高、特異性強(qiáng)、高精確度、高準(zhǔn)確度、對儀器設(shè)備要求低、試劑保存時間長、自動化程度高、無放射性同位素污染的等優(yōu)點(diǎn)，可在詞料及動物源性產(chǎn)品檢測中發(fā)揮重要作用。圖1為三聚氰胺抑制曲線。提供下述實(shí)施例是為了更好地進(jìn)一步理解本發(fā)明，而決不對本發(fā)明的內(nèi)容和保護(hù)范圍構(gòu)成任何限制。實(shí)施例l三聚氰胺免疫原的合成及免疫血清的制備1.1試劑與儀器三聚氰胺(北京百靈威試劑有限公司)，琥珀酸酐(購自北京耀北生物技術(shù)有限公司)，吡啶(Pyridine,AR.WM=79.10，含量>99.5%，天津市科密歐化學(xué)試劑開發(fā)中心)，N，N-二甲基甲酰胺(Dimethylformamide，DMF，美國新澤西州ACROSORGANICS公司生產(chǎn)，購自百靈威化學(xué)試劑公司)，正三丁胺(Tributylamine，美國新澤西州ACROSORGANICS公司生產(chǎn)，購自百靈威化學(xué)試劑公司)，氯甲酸異丁酯購(自百靈威化學(xué)試劑公司)，牛血清白蛋白(BSA)、辣根過氧化物酶(HRP)等(購自北京耀北生物技術(shù)有限公司)，其它試劑均為分析純。雙光束紫外可見分光光度儀(TU-1909，北京普析通用儀器有限公司)，層析裝置(3057型便攜式記錄儀，重慶川儀四廠；SBS系列數(shù)控計滴器，恒流泵，自動部分收集器，層析柱，上海滬西分析儀器廠)，磁力攪拌器(上海東榮豐科學(xué)儀器有限公司)，臺式離心機(jī)(Minispin最大轉(zhuǎn)速13400rpm最大離心力12100rcf，2mlxl2)。1.2三聚氰胺人工抗原的合成稱取三聚氰胺63.06mg(0.5mmo1)溶于5ml吡啶溶液中，加入琥珀酸酐50mg室溫攪拌反應(yīng)過夜。吹干吡啶，用10ml溶劑(DMF和1,4~二惡垸1:1混合)溶解Rac-戊二酸酐半醛，加入131ul(約0.5mmol)三丁胺，冰中攪拌10min，加入氯甲酸異丁酯72ul(約0.5mmo1)，轉(zhuǎn)入室溫攪拌反應(yīng)1小時?；罨娜矍璋啡芤褐鸬渭尤氲?.1MpH8.5冰冷載體蛋白(BSA或OVA)硼酸鈉溶液中，l小時內(nèi)加完，室溫攪拌反應(yīng)過夜。然后，將偶聯(lián)物過SephadexG—25M凝膠層析純化，用0.01MpH7.4PBS三倍柱床體積平衡，調(diào)節(jié)流速至3ml/min，樣品濃縮至5ml加入到平衡好的層析柱中層析提純偶聯(lián)物，洗脫液用pH7.40.01MPBS。1.3免疫及特異性抗體的制備將上述三聚氰胺-BSA偶聯(lián)物用生理鹽水稀釋成lmg/ml溶液備用。選取6只體重22.5Kg健康雄性新西蘭大白兔。將偶聯(lián)物與等量弗氏完全佐劑通過注射器對抽法混合成油包水的乳濁液，按lmg/Kg體重的量進(jìn)行首次免疫，采取背部皮下多點(diǎn)注射。每隔兩周加強(qiáng)免疫一次，用弗氏不完全佐劑代替弗氏完全佐劑，劑量及方法同首次免疫。從第三次免疫開始，每次免疫后10天，耳緣靜脈取血lml,進(jìn)行抗體效價檢測，當(dāng)抗體效價不再升高時，不加佐劑進(jìn)行最后一次(第7次)免疫，大腿肌肉注射，7天后頸動脈放血，室溫凝固2h后4'C過夜，8000r/min離心10分鐘，除去血塊，血清部分用50%飽和硫酸銨溶液沉淀，離心去上清液，沉淀用磷酸鹽緩沖液重懸，再用33%飽和硫酸銨溶液沉淀兩次，沉淀物用盡可能少的磷酸緩沖液溶解，經(jīng)透析后用S印hadexG-25M層析，即得多克隆抗體。實(shí)施例2免疫檢測方法的建立2.1ELISA方陣法確定最佳反應(yīng)濃度將lOOOug/ml、100tig/ml、10ng/ml、5yg/ml、1yg/ml、0.25yg/ml系列濃度的三聚氰胺抗體按每孔100yl包被酶標(biāo)板，4'C包被過夜，洗滌3次，拍干，按每孔200yl封閉液4'C下封閉過夜，洗滌3次，拍干。加入從1:200開始倍比稀釋的酶標(biāo)三聚氰胺，室溫作用30分鐘，洗滌三次，加50til底物A液和50iU底物B液，室溫避光作用15min，50ul終止液終止反應(yīng)，酶標(biāo)儀檢測A值(450nm)。同時設(shè)置兩個平行，取OD值為1.0左右時的包被濃度為最佳濃度。試驗(yàn)數(shù)據(jù)列于表l。表1方陣法OD值<table>tableseeoriginaldocumentpage6</column></row><table>由表1的數(shù)據(jù)中可以確定，最佳抗體包被濃度為5wg/ml。酶標(biāo)抗原稀釋倍數(shù)1:800達(dá)到最佳反應(yīng)濃度。2.2ELISA檢測抗體抗體IC50值ELISA操作方法同2.1，最佳抗體包被濃度為5yg/ml，酶標(biāo)抗原稀釋倍數(shù)1:800，準(zhǔn)備Opg/L、lng/L、5ug/L、10ug/L、50lig/L、100pg/L系歹U濃度的游離三聚氰月安禾示準(zhǔn)品。每孔加入50iU標(biāo)準(zhǔn)品，隨后加入50lU酶標(biāo)抗原稀釋液，室溫反應(yīng)30分鐘，洗板7次，加顯色劑溫育15分鐘，終止反應(yīng)，酶標(biāo)儀讀數(shù)。檢測結(jié)果的數(shù)據(jù)見下表2表2抗血清ICs。值<table>tableseeoriginaldocumentpage6</column></row><table>由表2中數(shù)據(jù)可知，三聚氰胺抗血清IC5。值在10ng/ml左右，表明本發(fā)明制備的抗血清是具有較好的特異性的抗三聚氰胺多克隆抗體，能滿足三聚氰胺檢測要求。實(shí)施例3檢測三聚氰胺的酶聯(lián)免疫試劑盒的組建組建檢測三聚氰胺的酶聯(lián)免疫試劑盒，使其包含下述組分(1)包被三聚氰胺抗體的酶標(biāo)板；(2)濃度為1mg/L的酶標(biāo)記三聚氰胺；(3)三聚氰胺標(biāo)準(zhǔn)品溶液6瓶，濃度分別為0yg/L、lyg/L、5ug/L、10yg/L、50wg/L、100ug/L;(4)底物顯色液A液為過氧化脲，底物顯色液B液為四甲基聯(lián)苯胺；(6)洗滌液為含0.05%吐溫20的磷酸鹽緩沖液；(7)濃縮樣品稀釋液為0.1%吐溫一20的磷酸鹽緩沖液；(8)酶標(biāo)記三聚氰胺稀釋液為含0.01%吐溫—20的磷酸鹽緩沖液；(9)終止液為2mol/L的鹽酸溶液。實(shí)施例4樣品中三聚氰胺殘留的檢測4.1樣品前處理準(zhǔn)確稱取5g飼料于40ml離心管中。加入20mlDMSO振蕩1小時，離心取上清，用樣品樣品稀釋液稀釋，制備樣品溶液。4.2用試劑盒進(jìn)行檢測向三聚氰胺抗體包被的酶標(biāo)板微孔中加系列標(biāo)準(zhǔn)品或樣品溶液50y1，再加入酶標(biāo)三聚氰胺工作液50ii1，室溫反應(yīng)30分鐘。倒出孔中液體，每孔加入250y1經(jīng)10倍稀釋了的洗滌液，30秒后倒出孔中液體，如此重復(fù)操作共洗板3次，用吸水紙拍干。每孔加入底物顯色液A液(過氧化脲)50ul，再加B液(四甲基聯(lián)苯胺)50ixl，輕輕振蕩混勻，室溫避光顯色15min，每孔加入終止液(2mol/L鹽酸)50yl，輕輕振蕩混勻，用酶^^儀測定每孔吸光度值(OD值)。4.3結(jié)果分析計算百分吸光度值并繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，相對應(yīng)每一個樣品中三聚氰胺的濃度可以從標(biāo)準(zhǔn)曲線上讀出，也可以用回歸方程法計算出在樣本中三聚氰胺的含量。利用專業(yè)電腦軟件更便于大量的樣本的快速分析。根據(jù)酶標(biāo)板上的樣本顏色的深淺與系列濃度標(biāo)準(zhǔn)溶液顏色的比較，可以判斷出樣本中三聚氰胺的濃度范圍。實(shí)驗(yàn)例1試劑盒精密度試驗(yàn)本實(shí)驗(yàn)例為標(biāo)準(zhǔn)可重復(fù)性試驗(yàn)。具體操作為從每批實(shí)施例2或3中的方法制備的酶標(biāo)板中，各抽取10個？L，測定5Pg/L的標(biāo)準(zhǔn)溶液的吸光度值(0D),重復(fù)3次，計算變異系數(shù)CW。。結(jié)果表明變異系數(shù)范圍在4.8—7.6%之間，符合了變異系數(shù)小于10%的規(guī)定，說明本試劑盒標(biāo)準(zhǔn)品精密度達(dá)到了要求。實(shí)驗(yàn)例2試劑盒的回收率試驗(yàn)取兩個濃度的三聚氰胺標(biāo)樣，對樣品進(jìn)行添加回收試驗(yàn)，每個濃度做4個平行，分別計算回收率。結(jié)果表明飼料中的添加回收率為75%—105%。實(shí)驗(yàn)例3試劑盒保存期試驗(yàn)試劑盒保存條件為2—8'C，經(jīng)過6個月的測定，試劑盒的最大吸光度值(零添加)、50%抑制濃度、三聚氰胺添加實(shí)際測定值均在正常范圍之內(nèi)?？紤]在運(yùn)輸和使用過程中，會有非正常保存條件出現(xiàn)，將試劑盒在37'C保存條件下放置兩周，進(jìn)行加速老化實(shí)驗(yàn)，結(jié)果表明該試劑盒各項(xiàng)指標(biāo)完全符合要求。考慮到試劑盒冷凍情況發(fā)生，將試劑盒放入—20°C冰箱冷凍5天，測定結(jié)果也表明試劑盒各項(xiàng)指標(biāo)完全正常。從以上結(jié)果可得出試劑盒可以在2—8'C保存12個月以上。權(quán)利要求1.一種檢測三聚氰胺的直接競爭法酶聯(lián)免疫試劑盒，其中包括三聚氰胺特異性抗體、三聚氰胺標(biāo)準(zhǔn)品和酶標(biāo)記三聚氰胺。2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的酶聯(lián)免^試劑盒，其特征在于所述試劑盒還包括包被了酶標(biāo)記三聚氰胺、包被有三聚氰胺特異性抗體的酶標(biāo)板、三聚氰胺標(biāo)準(zhǔn)溶液、底物顯色劑、洗滌液、終止液、濃縮樣品稀釋液以及酶標(biāo)物稀釋液。3.根據(jù)權(quán)利要求1或2所述的酶聯(lián)免疫試劑盒，其特征在于所述三聚氰胺特異性抗體為多克隆抗體。4.根據(jù)權(quán)利要求1或2所述的酶聯(lián)免疫試劑盒，其特征在于所述的酶標(biāo)記三聚氰胺所用的酶為辣根過氧化物酶。5.根據(jù)權(quán)利要求2所述的酶聯(lián)免疫試劑盒，其特征在于所述的洗滌液為含有0.05%—0.5%吐溫一20磷酸鹽緩沖液。6.根據(jù)權(quán)利要求2所述的酶聯(lián)免疫試劑盒，其特征在于所述的顯色劑由顯色劑A和顯色劑B組成，—顯色劑A為過氧化氫或過氧化脲，顯色劑B為鄰苯二胺或四甲基聯(lián)苯胺。7.根據(jù)權(quán)利要求2所述的酶聯(lián)免疫試劑盒，其特征在于所述的濃縮樣品稀釋液為含0.1%吐溫—20的磷酸鹽緩沖液。8.根據(jù)權(quán)利要求2所述的酶聯(lián)免疫試劑盒，其特征在于所述的酶標(biāo)物稀釋液為含0.01%吐溫一20的磷酸鹽緩沖液。9.一種檢測樣品中三聚氰胺含量的方法，包括步驟-(l辨品前處理；(2)用權(quán)利要求1_9任一所述的試劑盒進(jìn)行檢測，向包被有三聚氰胺抗體的酶標(biāo)板孔中加入標(biāo)準(zhǔn)品或樣品溶液，再加入酶標(biāo)記三聚氰胺，孵育后洗滌拍干，加入顯色劑、終上止，用酶標(biāo)儀測定吸光度值；(3)分析檢測結(jié)果。全文摘要本發(fā)明公開了一種檢測三聚氰胺的直接競爭法酶聯(lián)免疫檢測試劑盒。本發(fā)明所提供的三聚氰胺的酶聯(lián)免疫試劑盒包括三聚氰胺特異性抗體包被的酶標(biāo)板、酶標(biāo)記三聚氰胺。本發(fā)明的檢測三聚氰胺的酶聯(lián)免疫試劑盒靈敏、快速、準(zhǔn)確，主要用于大批樣品的篩查；盒中的主要試劑均以工作液的形式提供，使用方便，具有高特異性、高靈敏性、高精確性、高準(zhǔn)確性等特點(diǎn)，可快速檢測飼料及畜產(chǎn)品中殘留的三聚氰胺。文檔編號G01N33/543GK101206223SQ20071017947公開日2008年6月25日申請日期2007年12月13日優(yōu)先權(quán)日2007年12月13日發(fā)明者于洪俠,楊曙明申請人:中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院農(nóng)業(yè)質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)與檢測技術(shù)研究所