專利名稱：：游離前列腺特異性抗原化學發(fā)光免疫分析測定試劑盒及其制備方法
技術領域：
：本發(fā)明涉及免疫分析醫(yī)學領域，具體地，本發(fā)明提供了一種游離前列腺特異性抗原化學發(fā)光免疫分析定量測定試劑盒及其制備方法。
背景技術：
：前列腺特異性抗原(PSA)是人體前列腺上皮組織細胞分泌的一種分子量為3033kDa的單鏈糖蛋白分子。PSA由前列腺分泌之后，首先進入精液，成為精液漿的一個重要蛋白組分，濃度大約為0.55mg/mL。PSA通常以低濃度釋放到健康男性的血液中，在人體中主要存在于男性前列腺組織、精液和血清中，有研究表明女性血清中也可以檢出低濃度的PSA。PSA在精液中以游離PSA(free-PSA，f-PSA)形式存在，在其進入血液后，會和血液里的其它蛋白分子結合，形成結合態(tài)的PSA(complexed-PSA，c-PSA)。正常男性血液中的PSA水平一般低于4ng/mL，f-PSA水平一般低于2ng/mL。PSA在前列腺癌(prostatecancer,PCa)病人血清中的濃度水平高于正常人，近年來作為一種器官特異性的腫瘤標志物，取代前列腺酸性磷酸酶(prostateacidphosphatase,PAP)成為篩查PCa的主要指標。相關研究表明良性的前列腺增生(benignprostatehyperplasia,BPH)病人血清中，PSA水平也會相應的升高，隨著年齡的增加，人血清PSA水平也會有不同程度的升高，因此在410ng/mL的PSA濃度范圍，就形成了"診斷灰區(qū)"。相繼有學者提出不同的診斷指標來改善單一檢測PSA的缺陷，諸如前列腺生長速率(PSAvelocity,PSAV)、前列腺密度(PSAdensity,PSAD)和年齡特異參考值范圍(age-specificreferenceranges,ASR-RS)等，這些指標在前列腺癌評價中都有應用的局限性，一直存在爭議。隨著對前列腺疾病和PSA研究的不斷深入，研究發(fā)現(xiàn)PCa病人血清中f-PSA濃度水平與BPH病人以及正常人相比，明顯偏低，因此引入一個新的臨床指標——游離前列腺特異抗原百分率(free/totalPSAratio)。該參數(shù)對PCa的特異性更高，同時也降低了臨床檢驗的假陽性率。對f-PSA的定量分析，目前常用的是放射免疫分析(RIA)和酶聯(lián)免疫吸附分析(ELISA)，其中RIA必須用1251等放射性元素標記，檢測設備復雜，必須用專門的儀器測定，其放射性核素的半衰期短，不能長期保存，測定結果不穩(wěn)定，同時也給實驗操作人員帶來了放射性傷害。ELISA檢測靈敏度不夠高，檢測范圍窄，影響因素較多，易造成假陰性和假陽性等缺點也不能滿足臨床的要求?；瘜W發(fā)光免疫分析方法(CLIA)應運而生?；瘜W發(fā)光免疫分析(ChemiluminescenceImmunoassay,CLIA)于1977年問世，1985年第一代化學發(fā)光免疫分析試劑盒研制成功并投放市場。進入九十年代，化學發(fā)光免疫分析試劑盒的研制和自動化測量儀的生產取得了突破性進展，從而進入高速發(fā)展階段?；瘜W發(fā)光免疫分析是繼熒光、放射性同位素和酶免疫分析之后發(fā)展起來的一項新的免疫分析技術，根據(jù)大量的實驗結果及臨床應用資料，從實用性、穩(wěn)定性、準確性及發(fā)展前景來看，在非放射性標記分析技術中化學發(fā)光免疫分析處于領先地位，代表了當今世界發(fā)展的方向和潮流，它不僅具有免疫反應的特異性，而且具有化學發(fā)光反應的高靈敏度(檢測限度可達10_1510—18mol/L)?；瘜W發(fā)光免疫分析技術具有靈敏度高、快速、準確、重復性好、效期長并安全無毒無污染等優(yōu)點，成為取代放射免疫分析和酶免疫分析技術的首選?，F(xiàn)有技術中的化學發(fā)光免疫分析試劑盒為封閉式全自動化學發(fā)光測量系統(tǒng)，需要昂貴的全自動化學發(fā)光測量儀，從而限制了推廣使用，無法廣泛地應用于臨床診斷和科研工作。本發(fā)明是在酶聯(lián)免疫分析的基礎上應用酶催化發(fā)光底物，通過檢測發(fā)光底物產生的光信號代替酶聯(lián)免疫分析中的顯色底物，因而其靈敏度大大提高，并且操作簡便適用性廣,既可應用于開放式的半自動化學發(fā)光測量儀，也可用于全自動的測量系統(tǒng)，可實現(xiàn)大批量快檢測，使用成本低，更易推廣應用。
發(fā)明內容本發(fā)明的發(fā)明人為了解決上述問題提出并完成了本發(fā)明，即將化學發(fā)光技術與f-PSA的免疫分析學有效地結合，同時使用了發(fā)光信號強、持續(xù)時間長、更高信噪比的自制化學發(fā)光底物液，提供了一種能夠簡便、快速、靈敏、穩(wěn)定地檢測f-PSA的試劑盒。本發(fā)明的試劑盒采用的方法比酶免疫分析法靈敏度高，可以縮短檢測窗口期，使本試劑盒適于在產業(yè)上有效地推廣應用。本發(fā)明的目的是提供一種游離前列腺特異性抗原化學發(fā)光免疫分析定量測定試劑盒。本發(fā)明的再一目的是提供一種制備上述試劑盒的方法。根據(jù)本發(fā)明的游離前列腺特異性抗原化學發(fā)光免疫分析定量測定試劑盒包括1)游離前列腺特異性抗原校準品；2)游離前列腺特異性抗原單克隆抗體包被的固相載體；3)酶標記的抗游離前列腺特異性抗原抗體；以及4)上述酶所作用的化學發(fā)光底物液。根據(jù)本發(fā)明的試劑盒，其中，所述固相載體為微孔板、塑料珠、塑料管或磁性顆粒。根據(jù)本發(fā)明的試劑盒，其中，所述標記酶為辣根過氧化物酶或堿性磷酸酶。根據(jù)本發(fā)明的試劑盒，其中，所述化學發(fā)光底物液為魯米諾、異魯米諾或1,2-二氧乙烷類衍生物。優(yōu)選地，上述試劑盒中，所述1,2-二氧乙烷類衍生物為(金剛烷)-1,2-二氧乙烷、3-(2'-螺旋金剛烷)-4-甲氧基-4-(3"-磷酰氧基)苯基-l，2-二氧乙烷、CSPD或CDP-Star。優(yōu)選地，上述試劑盒中，所述化學發(fā)光底物液包含A液和B液，其中，A液是在雙蒸水中加入Tris和濃HC1配成0.1MpH值為8.5的Tris-HCl緩沖液，包含4.0mg/mL的Luminol和0.3mg/mL的對碘苯酚；B液是在雙蒸水中加入檸檬酸三鈉和檸檬酸，配制成O.lMpH值為4.6的檸檬酸緩沖液，包含200mg/mL的過氧化氫溶液；或者，所述化學發(fā)光底物液包含24gTris、160gNaCl、4gKCl、15mLHCl、200mL3-(2'-螺旋金剛烷)-4-甲氧基-4-(3"-磷酰氧基)苯基-l，2-二氧乙烷、lmLProclin300、lOOOmL雙蒸水。本發(fā)明提供了一種制備上述試劑盒的方法，包括以下步驟1)配制游離前列腺特異性抗原校準品；2)以游離前列腺特異性抗原單克隆抗體包被固相載體，3)以酶標記抗游離前列腺特異性抗原抗體；4)分裝上述游離前列腺特異性抗原校準品、酶標記的抗游離前列腺特異性抗原抗體和該酶所作用的化學發(fā)光底物液；以及5)組裝為成品。根據(jù)本發(fā)明的方法，優(yōu)選，所述包被固相載體的步驟2)包括以下步驟I)包被采用0.05MpH值為9.6的碳酸鹽緩沖液或0.046MpH值為4.6的檸檬酸緩沖液與適當濃度的游離前列腺特異性抗原單克隆抗體混合制成包被液，并將其負載于固相載體上；II)用生理鹽水洗滌上述固相載體；以及III)封閉配制封閉液，基于lOOOmL所述封閉液包含0.2gNaH2PCV2H20、2.9gNaH2P04'12H20、10gBSA禾口lmL生物防腐劑，所述封閉液的pH值為7.07.6，然后將所得封閉液負載于上述洗滌后的固相載體上。具體地，所述包被方法可以包括-I)包被采用lOOOmL的0.05MpH值為9.6的碳酸鹽緩沖液包含1.59g的無水碳酸鈉和2.94g的碳酸氫鈉去離子水溶液，或1000mL的0.046MpH值為4.6的檸檬酸緩沖液包含4.44g的檸檬酸和7.3g的檸檬酸三鈉去離子水溶液制成緩沖液，與適當濃度的游離前列腺特異性抗原單克隆抗體混合制成包被液，并將其負載于固相載體上；II)用生理鹽水洗滌上述固相載體；以及III)封閉配制封閉液，基于1000mL所述封閉液包含0.2gNaH2PCV2H20、2.9gNaH2PCV12H20、10gBSA和lmL生物防腐劑，所述封閉液的pH值為7.07.6，然后將所得封閉液負載于上述洗滌后的固相載體上。在上述方法中，優(yōu)選，所述固相載體為微孔板、塑料珠、塑料管或磁性顆粒。在上述方法中，優(yōu)選，所述酶為辣根過氧化物酶或堿性磷酸酶。在上述方法中，優(yōu)選，所述化學發(fā)光底物液為魯米諾、異魯米諾或1，2-二氧乙烷類衍生物。在上述方法中，優(yōu)選，所述1,2-二氧乙烷類衍生物為(金剛烷)-1,2-二氧乙烷、3-(2'-螺旋金剛烷)-4-甲氧基-4-(3"-磷酰氧基)苯基-l，2-二氧乙烷、CSPD或CDP-Star。在上述方法中，優(yōu)選，所述化學發(fā)光底物液包含A液和B液，其中，A液是在雙蒸水中加入Tris和濃HC1配成0.1MpH值為8.5的Tris-HCl緩沖液，包含4.0mg/mL的Luminol和0.3mg/mL的對碘苯酚；B液是在雙蒸水中加入檸檬酸三鈉和檸檬酸，配制成O.lMpH值為4.6的擰檬酸緩沖液，包含200mg/mL的過氧化氫溶液；或者，所述化學發(fā)光底物液包含24gTris、160gNaCl、4gKCl、15mLHCl、200mL3-(2'-螺旋金剛烷)-4-甲氧基-4-(3"-磷酰氧基)苯基-l，2-二氧乙烷、lmLProclin300、1000mL雙蒸水。本發(fā)明針對臨床檢驗實驗室提供了一種即可手工操作，也可適用于一些標準半自動檢測儀器的檢測手段，建立了定量分析人血清中游離前列腺特異性抗原(f-PSA)的方法。采用96/48孔聚苯乙烯微孔板或者包被試管，或者磁性微粒子為固相載體，以辣根過氧化物酶(HRP)或者堿性磷酸酶(ALP)為標記酶，以Luminol或者AMPPD為主要成分的發(fā)光底物的酶促化學發(fā)光檢測體系，對人血清中游離前列腺特異性抗原(f-PSA)進行定量分析。該游離前列腺特異性抗原化學發(fā)光免疫分析定量測定試劑盒的各項指標均達到同類進口試劑盒的分析法水平。利用本發(fā)明方法進行檢測，靈敏度高，特異性強，檢測范圍寬，操作簡單，無放射性污染，試劑盒成本低，臨床適用性強，更適用于我國臨床檢測篩査實驗室。根據(jù)本發(fā)明的試劑盒，酶標記的抗體與載體上包被的抗體和被測樣品的游離前列腺特異性抗原形成"包被抗體-抗原-抗體-酶"的夾心復合物結構，因此本發(fā)明采用的"雙抗體夾心一步法"反應模式，既有效地利用了化學發(fā)光技術原理，又在酶聯(lián)免疫分析的基礎上應用酶催化發(fā)光底物，通過檢測發(fā)光底物產生的光信號代替酶聯(lián)免疫分析中的顯色底物，因而其靈敏度大大提高。另外，這種模式還便于操作和生產。圖1為實施例1所制備的試劑盒中的校準品線性圖圖2為本發(fā)明的試劑盒同國外試劑盒臨床血樣測值比對結果具體實施例方式實施例1制備本發(fā)明的游離前列腺特異性抗原化學發(fā)光免疫分析定量測定試劑盒一、酶標記的游離前列腺特異性抗原單克隆抗體的制備(1)辣根過氧化物酶標記游離前列腺特異性抗原單克隆抗體的制備溶解4.4mgHRP于lmL蒸餾水中，加入0.4mL過碘酸鈉(5Ommol/L)室溫攪拌20min，經lmmol/L醋酸鈉緩沖液，pH4.4透析后加入8mg的游離前列腺特異性抗原單克隆抗體，攪拌2h，最后用200mmol/L的NaBH4進行還原，經0.02MPB緩沖液透析后，加等體積甘油，一2(TC以下保存。(2)堿性磷酸酶標記游離前列腺特異性抗原單克隆抗體的制備游離前列腺特異性抗原單克隆抗體用戊二醛法與堿性磷酸酶偶聯(lián)，對PBS充分透析，加等體積甘油，一2(TC以下保存。二、酶標抗體濃度選定試驗證明，采用方陣法選擇酶標抗體的工作濃度范圍為1:500-50000。三、游離前列腺特異性抗原校準品的制備以小牛血清為基質，將提純的人精液漿濃原料以國家標準品為準系列稀釋而成。分裝濃度范圍為0、0.5、1、2.5、5.0、10ng/mL的校準品共6瓶。四、以游離前列腺特異性抗原單克隆抗體包被固相載體(1)包被采用0.05MpH值為9.6的碳酸鹽緩沖液或0.046MpH值為4.6的檸檬酸緩沖液與適當濃度的游離前列腺特異性抗原單克隆抗體混合制成包被液，并將其負載于固相載體上；具體地，所述包被方法可以包括無水碳酸鈉1.59g碳酸氫鈉2.94g去離子水1000mL溶解混勻后，調整pH值至9.6，加入5.0mg游離前列腺特異性抗原單克隆抗體混勻，然后加入微孔板各孔中，每孔110pL，4。C過夜?；蛘撸瑱幟仕?.44g檸檬酸三鈉7.3g去離子水1000mL溶解混勻后，調整pH值至4.6，加入5.0mg游離前列腺特異性抗原單克隆抗體混勻，然后加入微孔板各孔中，每孔110pL，4。C過夜。(2)洗滌用生理鹽水洗三次。(3)封閉NaH2P04.2H200.2gNa2HP04.12H202.9gBSA10gProclin300lmL雙蒸水定容至lOOOmL將上述試劑稱量好放入潔凈容器中，加雙蒸水定容，溶解混勻，測定pH值為7.0。每孔分別加入封閉液300nL，室溫放置3小時。甩掉封閉液，在吸水紙上拍干。室溫除濕干燥24小時。立即進行真空封袋。封袋后放置15分鐘檢査無漏氣，如果有漏氣需重新封袋。貼簽后置28i:保存。五、酶標單抗稀釋液Tris12.120gBSA5gProclinlmL雙蒸水lOOOmL六、化學發(fā)光底物本發(fā)明所使用的辣根過氧化物酶(HRP)的化學發(fā)光底物液的配制方法A液在雙蒸水中加入Tris和濃HCl配成O.IMpH值為8.5的Tris-HCl緩沖液。在此緩沖液中加入4.0mg/mL的Luminol和0.3mg/mL的對碘苯酚。B液在雙蒸水中加入擰檬酸三鈉和檸檬酸，配制成O.IMpH值為4.6的擰檬酸緩沖液，在此溶液中加入200mg/mL的過氧化氫溶液。使用方法使用前將A液與B液按1:l比例混合后使用。本發(fā)明所使用的堿性磷酸酶(ALP)的化學發(fā)光底物液的配制方法Tris24gNaCl160gKC14gHCl15mL雙蒸水lOOOmLProclin300lmLAMPPD200mL七、洗滌緩沖液Tris24gNaCl160gKC14gHC115mL去離子水lOOOmL調整pH值至7.4。八、半成品及成品組成上述步驟所得產品分裝即為半成品。抽出三份經過特異性、精密性、靈敏度及穩(wěn)定性檢定合格才能組裝成f-PSA定量測定試劑盒。組裝成試劑盒后還需抽檢合格后才能出廠。本發(fā)明試劑盒中的固相抗體為提前包被好的，不需要現(xiàn)場包被；校準品為液體；標記抗體也是已經稀釋到工作濃度的工作溶液，均可以直接使用。校準品/待測樣品，酶標記抗體溶液以及發(fā)光底物加樣體積均為50pL，實驗過程中，不需要調節(jié)加樣體積，最大程度的方便使用。以本發(fā)明上述測試方法按上述程序進行測定，所用時間短，方便，快速。實施例23制備本發(fā)明的游離前列腺特異性抗原化學發(fā)光免疫分析定量測定試劑盒除以分別以塑料珠、磁性顆粒作為載體外，其余均以與實施例1相同的方法制備f-PSA化學發(fā)光免疫分析定量測定試劑盒。實施例4本發(fā)明的試劑盒的使用方法使用本試劑盒進行實驗前，需先取出固相抗體、校準品/檢測樣品、標記抗體溶液在室溫放置1530分鐘，使它們平衡到室溫；之后，將恒溫溫箱或者水浴鍋調至37'C;再后，準備好合適的微量加樣器及對應吸頭并且檢查化學發(fā)光儀以及輔助儀器，如洗板機等，是否正常工作。使用本試劑盒按照實施例1的方法進行實驗的具體操作步驟如下1)將實驗需要的板條(已包被好抗體，96/48孔可拆為12/6*8*1L)放置在板架上；2)反應孔中分別加待測樣品和各濃度校準品，校準品每孔加0、0.5、1、2.5、5.0、10ng/mL各50|aL，每次試驗設空白1孔，然后除空白孔外各孔加酶標記抗體溶液50pL;3)微量振蕩器上振蕩30秒混勻；4)37t恒溫溫育60分鐘；5)棄去孔中溶液，用Tris-HCl洗液，自動洗板機或者手工洗板5次，在吸水紙上拍干；6)每孔加發(fā)光底物50nL，振蕩混勻，室溫(2228°C)反應3090分鐘；7)用化學發(fā)光儀測相對發(fā)光值(RLU)，測量時間1秒/孔；8)分別對校準品濃度和對應RLU取對數(shù)，在建立的雙對數(shù)曲線上建立標準曲線，以各待測血清RLU值在標準曲線上查出該血清的f-PSA的濃度，計算檢測結果(參見附圖1);9)打印檢測結果報告。實施例5本發(fā)明的試劑盒的方法學鑒定按照本領域中常規(guī)的制造及檢定規(guī)程對實施例1中制備的試劑盒進行鑒定，經過大量的實驗證明，本發(fā)明的試劑盒在用于f-PSA濃度水平測定時，該方法學指標如下檢測范圍0~10ng/mL;靈敏度最小檢出限為0.01ng/mL;精密度分析內精密度(高、中、低三個質量控制范圍)均小于7%(11=10)，分析間精密度(高、中、低三個質量控制范圍)均小于7%(n=10);準確性加標回收率在90110%之間；特異性與CA199、CEA、AFP等常見的腫瘤標志物的交叉反應率小于0.1%;穩(wěn)定性各試劑組分置37X:，考察6天后，各組分仍穩(wěn)定。本發(fā)明的試劑盒所用樣品量少，一次檢測只要50pL，體外檢測對測試對象沒有任何毒副作用。同時本發(fā)明采用的化學發(fā)光酶免疫分析方法，不產生放射性污染，各指標也優(yōu)于目前廣泛應用的酶聯(lián)免疫吸附分析方法(ELISA)。利用本發(fā)明方法進行檢測，靈敏度高，特異性強，檢測范圍寬，操作簡單，無放射性污染，試劑盒成本低，臨床適用性強，更適用于我國臨床檢測篩查實驗室。因此本發(fā)明為臨床檢測游離前列腺特異性抗原(f-PSA)，輔助診斷前列腺癌以及手術后觀察提供了一種更準確，特異，方便，快捷的方法。實施例6本發(fā)明的試劑盒同國外試劑盒臨床血樣測值比對本發(fā)明的試劑和Monobind游離前列腺特異性抗原化學發(fā)光試劑對102份臨床血清樣品同時進行檢測，檢測結果見附圖2，本發(fā)明方法測定的血樣f-PSA結果為橫坐標，以Monobind測定的結果為縱坐標作回歸分析，相關方程為Y=1.1182X—0.0309，相關系數(shù)1=0.9918。本發(fā)明方法同國外試劑盒臨床血樣測值相關性良好。本實施例采用臨床血樣102份中，臨床診斷前列腺癌(PCA)樣本21例，前列腺良性疾病30例，正常人樣本51例，同時測定樣本的PSA和f-PSA水平，在PSA水平410ng/ml范圍內時，計算游離前列腺特異性抗原百分率，以20%作為臨床診斷參考值，測定結果如表1所示表h對102例臨床診斷血樣的測定結果臨床實驗項目本方法測定結果<table>tableseeoriginaldocumentpage19</column></row><table>如果僅用PSA水平大于4.0ng/ml作為臨界值來判斷，就會帶來由于前列腺增生等良性病人的假陽性，表2則為僅用PSA水平大于4.0ng/ml作為陽性判斷標準的結果表2:對102例臨床診斷血樣的測定結果<table>tableseeoriginaldocumentpage19</column></row><table>兩種評判標準相比，本發(fā)明試劑盒提供的方法和評判標準，可以明顯的區(qū)分開PSA在4~10ng/ml范圍內的前列腺癌和良性前列腺疾病病人樣本，大大提高前列腺癌的臨床診斷率，避免出現(xiàn)假陽性，此結果和國外同類進口試劑檢測結果符合率及相關性均良好。從所列試劑檢測結果數(shù)據(jù)分析，本發(fā)明試劑盒的靈敏度、特異性、準確性與同類進口試劑盒無明顯差異；便于推廣應用，安全可靠。權利要求1、一種游離前列腺特異性抗原化學發(fā)光免疫分析測定試劑盒，其特征在于，所述試劑盒包括1)游離前列腺特異性抗原校準品；2)游離前列腺特異性抗原單克隆抗體包被的固相載體；3)酶標記的抗游離前列腺特異性抗原抗體；以及4)上述酶所作用的化學發(fā)光底物液。2、如權利要求1所述的試劑盒，其特征在于，所述固相載體為微孔板、塑料珠、塑料管或磁性顆粒。3、如權利要求1所述的試劑盒，其特征在于，所述酶為辣根過氧化物酶或堿性磷酸酶。4、如權利要求1所述的試劑盒，其特征在于，所述化學發(fā)光底物液為魯米諾、異魯米諾或1,2-二氧乙烷類衍生物。5、如權利要求4所述的試劑盒，其特征在于，所述1,2-二氧乙垸類衍生物為(金剛烷)-l,2-二氧乙烷、3-(2'-螺旋金剛垸)-4-甲氧基-4-(3"-磷酰氧基)苯基-1，2-二氧乙烷、CSPD或CDP-Star。6、如權利要求K4或5所述的試劑盒，其特征在于，所述化學發(fā)光底物液包含A液和B液，其中，A液是在雙蒸水中加入Tris和濃HC1配成0.1MpH值為8.5的Tris-HCl緩沖液，包含4.0mg/mL的Luminol和0.3mg/mL的對碘苯酚；B液是在雙蒸水中加入檸檬酸三鈉和檸檬酸，配制成0.1MpH值為4.6的檸檬酸緩沖液，包含200mg/mL的過氧化氫溶液；或者，所述化學發(fā)光底物液包含24gTris、160gNaCl、4gKC1、15mLHC1、200mL3-(2'-螺旋金剛烷)-4-甲氧基-4-(3"-磷酰氧基)苯基-l，2-二氧乙垸、lmLProclin300、1000mL雙蒸水。7、一種制備權利要求1所述試劑盒的方法，其特征在于包括以下步驟1)配制游離前列腺特異性抗原校準品；2)以游離前列腺特異性抗原單克隆抗體包被固相載體；3)以酶標記抗游離前列腺特異性抗原抗體；4)分裝上述游離前列腺特異性抗原校準品、酶標記的抗游離前列腺特異性抗原抗體和該酶所作用的化學發(fā)光底物液；以及5)組裝為成品。8、如權利要求7所述的方法，其特征在于，所述包被固相載體的步驟2)采用以下方法I)包被采用0.05MpH值為9.6的碳酸鹽緩沖液或0.046MpH值為4.6的檸檬酸緩沖液與適當濃度的游離前列腺特異性抗原單克隆抗體混合制成包被液，并將其負載于固相載體上；II)用生理鹽水洗滌上述固相載體；以及m)封閉配制封閉液，基于lOOOmL所述封閉液包含0.2gNaH2P04'2H20、2.9gNaH2P04'12H20、10gBSA和lmL生物防腐劑，所述封閉液的pH值為7.07.6，然后將所得封閉液負載于上述洗滌后的固相載體上。9、如權利要求7或8所述的方法，其特征在于，所述固相載體為微孔板、塑料珠、塑料管或磁性顆粒。10、如權利要求7所述的方法，其特征在于，所述酶為辣根過氧化物酶或堿性磷酸酶。11、如權利要求7所述的方法，其特征在于，所述化學發(fā)光底物液為魯米諾、異魯米諾或1,2-二氧乙烷類衍生物。12、如權利要求11所述的方法，其特征在于，所述1,2-二氧乙垸類衍生物為(金剛烷)-l,2-二氧乙垸、3-(2'-螺旋金剛烷)-4-甲氧基-4-(3"-磷酰氧基)苯基-1，2-二氧乙烷、CSPD或CDP-Star。13、如權利要求7、11或12所述的方法，其特征在于，所述化學發(fā)光底物液包含A液和B液，其中，A液是在雙蒸水中加入Tris和濃HC1配成0.1MpH值為8.5的Tris-HCl緩沖液，包含4.0mg/mL的Luminol和0.3mg/mL的對碘苯酚；B液是在雙蒸水中加入檸檬酸三鈉和檸檬酸，配制成0.1MpH值為4.6的檸檬酸緩沖液，包含200mg/mL的過氧化氫溶液；或者，所述化學發(fā)光底物液包含24gTris、160gNaCl、4gKC1、15mLHC1、200mL3-(2'-螺旋金剛垸)-4-甲氧基-4-(3"-磷酰氧基)苯基-l，2-二氧乙烷、lmLProclin300、1000mL雙蒸水。全文摘要本發(fā)明涉及免疫分析醫(yī)學領域，具體地，本發(fā)明提供了一種游離前列腺特異性抗原化學發(fā)光免疫分析測定試劑盒及其制備方法。根據(jù)本發(fā)明的試劑盒包括1)游離前列腺特異性抗原校準品；2)游離前列腺特異性抗原單克隆抗體包被的固相載體；3)酶標記的抗游離前列腺特異性抗原抗體；以及4)化學發(fā)光底物液。進一步，根據(jù)本發(fā)明制備上述試劑盒的方法包括以下步驟1)配制校準品；2)以游離前列腺特異性抗原單克隆抗體包被固相載體；3)以酶標記抗游離前列腺特異性抗原抗體；4)分裝上述校準品、酶標記物和化學發(fā)光底物液；以及5)組裝為成品。本發(fā)明的試劑盒具有簡便、快速、靈敏、穩(wěn)定等優(yōu)點。文檔編號G01N21/76GK101377500SQ200710121139公開日2009年3月4日申請日期2007年8月31日優(yōu)先權日2007年8月31日發(fā)明者應希堂,林金明,栩王,根石,胡國茂申請人:北京科美東雅生物技術有限公司