專利名稱：：紅細(xì)胞的懸浮介質(zhì)的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
：本發(fā)明涉及新的紅細(xì)胞的懸浮介質(zhì)，用于在醫(yī)院和血液輸血中心進(jìn)行需要紅血球的主要免疫血液學(xué)凝集測試。血清型的確定、非常規(guī)抗體的探測和辨認(rèn)、正負(fù)對照的制備，和用于反常結(jié)果研究的樣品保存需求均需要紅細(xì)胞，以及在溶液介質(zhì)中再懸浮以維持它們的功能。
背景技術(shù)：
：輸血提供的臨床進(jìn)展帶來了免疫血液學(xué)的發(fā)展。如果沒有免疫血液學(xué)的發(fā)展，目前在意外傷害、手術(shù)中或在白血病治療以及癌癥和其他疾病中不可能進(jìn)行若干數(shù)量的輸血。在西班牙，2004年中共有160萬獻(xiàn)血者(1),在美國，每年捐贈約為1500萬袋血(2),世界衛(wèi)生組織根據(jù)178個國家的數(shù)據(jù)，估計每年捐贈的總血單位約為8100萬個(3)。如果沒有事先進(jìn)行免疫血液學(xué)的確定，這些捐贈則沒有意義。待確定的主要血型為ABO系和RH系，特別是RH系中的抗原D(腿)。在緊急情況下，所有的人都可以接受O型的紅細(xì)胞或紅血球，AB型的人可接受任何ABO型的紅細(xì)胞或紅血球。因此，O型血的人被稱為萬能獻(xiàn)血者，而AB型血的人被稱為萬能受血者。是否能夠接受對來自具有特定血型的人的紅細(xì)胞或紅血球，取決于接受者血漿中的抗體。因此，0型個體中存在對抗原A和B的抗體，A型個體中存在對抗原B的抗體，反之，B型個體中存在對抗原A的抗體，而AB型個體中不存在那些抗體。因此，可以捐獻(xiàn)給所有血型的不是紅細(xì)胞，而是AB型個體的血漿。免疫血液學(xué)分析的基礎(chǔ)是確定ABO型和RH型。ABO系是通過抗原和抗體(常規(guī)抗體)來確定，而RH系和其它的血系只有在懷孕和輸血后才會產(chǎn)生抗體(非常規(guī)抗體)。然而，盡管它們在人群中的發(fā)生頻率較低，但對非常規(guī)抗體的確定是最為重要的。為避免危險的發(fā)生以及確保輸血安全，非常規(guī)抗體的確定都需要在所有的醫(yī)院和輸血中心進(jìn)行。另外，為了診斷新生兒溶血病的可能性，以及預(yù)防出現(xiàn)母親為Rh-(缺少抗原D),而小孩為汕+(存在抗原D)的情況，均需要新生兒非常規(guī)抗體的確定。在免疫血液學(xué)中，用于紅細(xì)胞類型鑒定、相容性測試以及常規(guī)和非常規(guī)抗體的檢測的新技術(shù)的引進(jìn)代表了本領(lǐng)域最為重大的進(jìn)展。這些進(jìn)展涉及促進(jìn)特異性凝集的成分(例如，Coombs溶液、LISS溶液(低離子強(qiáng)度溶液)，具有清蛋白的溶液，具有蛋白水解酶的溶液，或其他抗原-抗體聯(lián)合物的增效劑)，活性抗體的改進(jìn)(例如，單克隆抗體)，以及用于展示凝集的全新的或基本上不同的技術(shù)(例如，微片和凝膠技術(shù))。微管柱技術(shù)、也被稱為凝膠或卡技術(shù)的出現(xiàn)，奠定了現(xiàn)代免疫血液學(xué)的基礎(chǔ)。微管柱技術(shù)(4)自1986年出現(xiàn)以來，不斷得到引入注目的發(fā)展。由于其易于實現(xiàn)自動化，該技術(shù)將取代其他的技術(shù)，而成為唯一的表型確定技術(shù)。與流行的基因型技術(shù)相結(jié)合，它們將形成免疫學(xué)分析的基礎(chǔ)。目前，用于基因型確定的主要方法還處于初級階段，僅限于研究類實驗室。凝膠技術(shù)借助由凝膠小球(EP194212，EP305337)、玻璃小球或其他球型材料的小球(EP485228，EP725276，EP755719)形成的過濾基質(zhì)，通過離心而將那些凝集的細(xì)胞與未凝集的細(xì)胞進(jìn)行分離。將樣品分散于在微管的上部，位于凝膠柱之上的反應(yīng)室。在含有凝膠或過濾基質(zhì)的柱中，根據(jù)分析所使用的緩沖液可含有特異性抗體(例如，抗-A,抗-B,抗-D)或人抗J求蛋白(人抗-IgG或人抗-IgM抗體)，這被稱為Coombs溶液。過濾基質(zhì)由置于緩沖水溶液中的球狀顆粒構(gòu)成。為了展現(xiàn)免疫血液學(xué)凝集，進(jìn)行離心使細(xì)胞(紅細(xì)胞)通過過濾基質(zhì)。顆粒之間的空間足夠大，使那些未凝集的細(xì)胞，即個體細(xì)胞通過。盡管在此過程中發(fā)生凝集，但凝集的細(xì)胞會被保留在小球間。嚴(yán)格地講，盡管這是一個定性技術(shù)，但細(xì)胞通過過濾基質(zhì)使得對不同程度的凝集進(jìn)行區(qū)分成為可能。例如，在陽性樣品中，非常強(qiáng)的凝集的細(xì)胞將被保留在凝膠的上半部分，而弱的凝集的細(xì)胞可以在基質(zhì)中通過一段距離而被保留在中間位置。沒有發(fā)生凝集意味著所有的細(xì)胞將會到達(dá)微管的底部(陰性反應(yīng))。如在常規(guī)的免疫血液學(xué)中所出現(xiàn)的，由于紅細(xì)胞具有明顯的紅色，因此該技術(shù)對抗原(紅細(xì)胞)-抗體聯(lián)合物不需要使用任何標(biāo)記或放大試劑。凝膠技術(shù)使得將陽性產(chǎn)物從陰性產(chǎn)物中進(jìn)行物理分離成為可能，如陽性產(chǎn)物(高強(qiáng)度凝集)位于凝膠的上部分，柱中部分(中度或弱凝集)，以及陰性產(chǎn)物(未凝集的紅細(xì)胞)位于凝膠的下部分。在免疫血液測試中，使用試劑紅細(xì)胞測試血漿或血清中的常規(guī)和非常規(guī)抗體。在溶液中制備所述的紅細(xì)胞從而維持這些細(xì)胞的功能性和完整性一段時間，通常在1到4周。在血庫實驗室或那些負(fù)責(zé)輸血的機(jī)構(gòu)中，通常選擇具有特異性抗原的紅細(xì)胞從而使其能夠在每個免疫血液測試中充當(dāng)試劑紅細(xì)胞。為制備篩選細(xì)胞需進(jìn)行一定的組合，如將2，3或4個具有具體抗原特異性的紅細(xì)胞組合可探測抗體，將ll或更多個紅細(xì)胞組合可鑒別所探測到的抗體的特異性，但這種組合并不容易制得并且在中級機(jī)構(gòu)這種搡作也很難進(jìn)行。本領(lǐng)域內(nèi)的技術(shù)人員都熟知得到所述的篩選細(xì)胞或細(xì)胞群的難度以及需要頻繁地制備這些試劑紅細(xì)胞，同時還需制備用于這些紅細(xì)胞的懸浮溶液或稀釋液。此外，為了加強(qiáng)特異性血型的反應(yīng)性還需要使用酶處理(如木瓜蛋白酶作用)來制備篩選細(xì)胞或細(xì)胞群。通過這種處理加強(qiáng)的血系也為本領(lǐng)域技術(shù)人員所熟知。當(dāng)前使用的溶液是將Alsever溶液進(jìn)行適當(dāng)?shù)母倪M(jìn)所得到。這些溶液通常含有抗凝血劑(如檸檬酸鹽)、磷酸鹽緩沖液、能量源(如葡萄糖)、嘌呤和核苷(如腺噤呤和肌苷)、氯化鈉以及防腐劑(抗生素)。然而，使用這些常規(guī)的溶液制備的試劑紅細(xì)胞在凝膠技術(shù)的使用中可能會存在問題。因為一些沒有凝集的紅細(xì)胞通常會殘留在柱中，所以在使用的凝膠技術(shù)可對物理分離產(chǎn)生影響。因為這些非特異性的存留物與中等或弱凝集物混亂，所以會產(chǎn)生假陽性結(jié)果。用于試劑紅細(xì)胞的懸浮液應(yīng)能夠使得沒有發(fā)生凝集的紅細(xì)胞維持其功能特征和它們通過凝膠柱從而到達(dá)凝膠柱底部的能力。根據(jù)上面所述的在免疫血液學(xué)實驗室中制備紅細(xì)胞所存在的困難，所以應(yīng)維持這些特征盡可能長的時間。其中pH、摩爾滲透壓濃度以及離子強(qiáng)度這些參數(shù)在這段時間內(nèi)應(yīng)維持恒定。同樣，提供葡萄糖和腺噪呤以維持紅細(xì)胞的?；钚砸彩潜匾?。這些物質(zhì)的組成和濃度會增加離子強(qiáng)度，而離子強(qiáng)度會被加入的甘氨酸所降低。因為紅細(xì)胞已經(jīng)失去了遺傳核以及任何生物合成的能力，因此加入這種氨基酸不會對蛋白合成有影響。
發(fā)明內(nèi)容為了減少試劑紅細(xì)胞中所觀察到的特異性的丟失，發(fā)明者們在研究中意外發(fā)現(xiàn)加入稀釋溶液的濃度在高于為降低離子濃度所需的濃度時，可使試劑紅細(xì)胞與氨基酸結(jié)合而與甘氨酸分離，從而可降低試劑紅細(xì)胞中觀察的特異性的丟失，即很大程度上降低了沒有凝集的紅細(xì)胞在凝膠柱中的非特異性保留。由于此原因，在本專利用于試劑紅細(xì)胞的稀釋溶液組合物的申請中，將進(jìn)行描述，其中稀釋溶液組合物能夠使得試劑紅細(xì)胞在延長的時間內(nèi)，如8個星期內(nèi)維持其完整性和功能性。在這段時間內(nèi)，紅細(xì)胞維持其通過凝膠或其它狹窄空間的能力以及不會發(fā)生非特異性的凝集，保持其形變能力、完整性以及抗原性，從而其可被用作免疫血液學(xué)的試劑用在確定血清型、探測常規(guī)抗體測試以及非常規(guī)抗體的研究和識別中。根據(jù)本發(fā)明，在用于紅細(xì)胞的稀釋液或懸浮液中加入氨基酸組合物能夠維持紅細(xì)胞的完整性和功能特征，其中這些特征使得紅細(xì)胞能夠使用在凝膠技術(shù)中。在新鮮的紅細(xì)胞(初始制備懸浮液的時間)和那些保存8周的紅細(xì)胞通過凝膠基質(zhì)時，它們在保留性上并沒有表現(xiàn)出差別。即是說，將氨基酸加入稀釋液中使得紅細(xì)胞維持其新鮮紅細(xì)胞的初始物理特征成為可能。制備紅細(xì)胞的時間越長，出現(xiàn)假陽性結(jié)果的可能性越大。試劑紅細(xì)胞是活細(xì)胞，因此本領(lǐng)域的技術(shù)人員都知道其在相對短時間內(nèi)會發(fā)生退化。凝膠技術(shù)使得不同大小的凝集能夠直接通過視覺量化。凝集結(jié)果使用常用的評分等級來表示，如表l。如上所述，應(yīng)出現(xiàn)在柱底的沒有發(fā)生凝集的紅細(xì)胞可能會出現(xiàn)類似+/-和l+的結(jié)果，從而出現(xiàn)不正確的診斷以及不正確的陽性解釋。表1.<table>tableseeoriginaldocumentpage8</column></row><table>根據(jù)本發(fā)明，如本領(lǐng)域技術(shù)人員所熟知的、含有常用成分的液體中加入氨基酸組合物很夠在很大程度上降低試劑紅細(xì)胞發(fā)生非特異性保留。這些氨基酸組合物是磷酸鹽緩沖液、氯化鈉、葡萄糖、腺嘌呤、防腐劑(如氯霉素和新霉素)、EDTA以及甘氨酸。組成本發(fā)明氨基酸組合物的每種氨基酸濃度可以根據(jù)它們在水溶液中的溶解性而不同，因此用于紅細(xì)胞的稀釋液的整體溶質(zhì)度范圍在100-700毫摩爾滲透壓濃度/kg。將對本發(fā)明中用于紅細(xì)胞懸浮液中的氨基酸組合物的實施例進(jìn)行描述。例如，向不含氨基酸的標(biāo)準(zhǔn)液體(液體l)中加入氨基酸得到液體(液體2)，使用用于非常規(guī)抗體的Coombs技術(shù)的雙細(xì)胞篩選，在超過IO個星期的50次單次測定中，所得到的假陽性結(jié)果總數(shù)從13次降低到0次。需要提及的是從制備試劑紅細(xì)胞到測試的10個星期這段時間已經(jīng)超過了保存試劑紅細(xì)胞的常規(guī)限制。另外一種量化這些液體的差別的方法就是對比所有單個測試的平均得分。對超過10周的10瓶液體1和液體2進(jìn)行50次測定，平均得分分別為2.44和1.52。使用木瓜蛋白酶化的紅細(xì)胞的雙細(xì)胞篩選技術(shù)，在不含氨基酸的液體(液體No.1)和含有氨基酸的液體(液體No.2)之間假陽性結(jié)果的數(shù)目從40次降低到7次。7次假陽性結(jié)果是在10個星期后測得，而液體No.l的假陽性結(jié)果是從制備懸浮液后更短的時間內(nèi)測得。對比使用木瓜蛋白酶化的紅細(xì)胞的雙細(xì)胞篩選技術(shù)所得到的平均得分，清楚地表明液體間的差別，液體No.l和液體No.2進(jìn)行50次測定的平均得分分別為5.92和1.84。液體No.1成分》iKH2P04(無水磷酸二氫鉀)1.36Na2HP04(磷酸一氫鈉)1.42氯霉素0.17新霉素0.10NaCl1.0葡萄糖(無水D-葡萄糖)3.5腺噪呤0.02EDTA(二水合二鈉)2.80甘氨酸14.70液體No.2顛KH2P04(無水磷酸二氫鉀)1.36Na2HP04(磷酸一氫鈉)1.42氯霉素0.17新霉素0.10NaCl1.0葡萄糖(無水D-葡萄糖)3.5腺噤呤0,02EDTA(二水合二鈉)2.80甘氨酸14.70L-纈氨酸3.20L-蛋氨酸2.52L-亮氨酸2.60L-異亮氨酸6.48如果在標(biāo)準(zhǔn)液體(如液體No.1)中加入上面所描述的除氨基酸外的其它成分到紅細(xì)胞溶液中，如肌香、檸檬酸鹽、檸檬酸以及碳酸氫鹽(如液體No.3),氨基酸的效果可更明顯。使用用于非常規(guī)抗體的Coombs技術(shù)的雙細(xì)胞篩選，在超過10個星期的50次單次測定中，沒有得到假陽性結(jié)果并且平均得分為O.96?；蚴窃谀竟系鞍酌富碾p細(xì)胞篩選中也沒有得到假陽性結(jié)果并且平均得分為O.80。液體No.3成分濃度(g/l)KH2P04(無水磷酸二氬鉀)0.30Na2HP04(磷酸一氫鈉)0.28氯霉素0.17新霉素0.10NaCl1.00葡萄糖(無水D-葡萄糖)3.50腺噤呤0.02EDTA(二水合二鈉)2,80肌苦0.02NaHC030.80Na3二水合檸檬酸鹽2.00一水合檸檬酸0.18甘氨酸6.00L-纈氨酸3.20L-蛋氨酸2.52L-亮氨酸2.60L-異亮氨酸6.48如(5)所述，懸浮液中的紅細(xì)胞在低離子強(qiáng)度的溶液中血型中特異性的抗原W戶人,/，F(xiàn)/，S和W的抗原性可能消失或降低。氨基酸的加入并不會改變所述抗原的表達(dá)，這可以從制備的懸浮液放置10個星期后，即在產(chǎn)品的有效壽命內(nèi),觀察到相同的反應(yīng)性和抗原潛能。在加入氨基酸的液體中觀察到紅血球溶解程度要低于沒有加入氨基酸的液體或僅加入甘氨酸的液體中紅血球溶解程度。這表明加入這些物質(zhì)不會對細(xì)胞的滲透脆性產(chǎn)生負(fù)面影響。在用于確定血清型的試劑紅細(xì)胞試驗中，即常規(guī)抗體的測定中，加入氨基酸的紅細(xì)胞的懸浮液功能表現(xiàn)正常。在使用沒有氨基酸的標(biāo)準(zhǔn)液體，即液體l的血清型技術(shù)中，使用超過10個星期的4組血清型細(xì)胞(A!,A2，B和0)進(jìn)行的240次測定中，得到187次-暇陽性結(jié)果，而對于加入氨基酸的液體2和液體3，假陽性結(jié)果的數(shù)目降低到O次。液體1的假陽性結(jié)果是從紅細(xì)胞懸浮液制備后的2周和4周后測得，而對于加入氨基酸的液體，在懸浮液生產(chǎn)10周后，還沒有觀察到假陽性結(jié)果。對液體l、液體2和液體3在超過10個星期、使用4組血清型細(xì)胞、每組血清10瓶的條件下進(jìn)行240次測定，液體l、液體2和液體3的平均得分分別為4.06，1.37和0.94。加入除纈氨酸、亮氨酸、異亮氨酸和蛋氨酸外的氨基酸也會降低非特異性保留，其中上述4種氨基酸前3種為非極性脂肪族氨基酸，最后一種為含硫的氨基酸。例如，使用含有非極性脂肪族氨基酸、芳香族氨基酸、親水氨基酸以及帶正、負(fù)或中性電荷的極性氨基酸的液體4，同樣能夠降低紅細(xì)胞在凝膠柱上的非特異性保留。液體No.4^分KH2P04(無水磷酸二氫鉀)0.30Na2HP04(磷酸一氫鈉)0.28氯霉素0,17新霉素0.10NaCl1.00葡萄糖(無水D-葡萄糖)3.50腺噤呤0.02EDTA(二水合二鈉)2.80肌苷0.02Na跳0.80Na3二水合檸檬酸鹽2.00一水合檸檬酸0.18甘氨酸6.00L-纈氨酸1.60L-蛋氨酸1.26L-亮氨酸1.30L-異亮氨酸3.24L-苯基丙氨酸2.00L-賴氨酸1.22L-組氨酸0.50L-色氨酸0.50L-精氨酸1.60L-蘇氨酸1.10通過本發(fā)明中的方法，有可能明顯地提高存儲紅細(xì)胞懸浮液的有效壽命以供進(jìn)行分析，如進(jìn)行的測試所表現(xiàn)的周期可從常規(guī)的為4個星期到最少的為8個星期。參考文獻(xiàn)(1)Federacidn.Espanoladedonantesdesangre(SpanishBloodDonorFederation).,『.6to/犯fe《6fes犯gre./zet.July2005.(2)Factsaboutblood.AmericanAssociationofBloodBanks(2004).(3)GlobalDatabaseonBloodSafety:Report2001-2002BloodTransfusionSafety,EssentialHealthTechnologies,WorldHealthOrganization.Geneva,Switzerland.<formula>formulaseeoriginaldocumentpage14</formula>盡管用優(yōu)選的實施方式對本發(fā)明進(jìn)行了描述，不應(yīng)認(rèn)為這些實施方式對發(fā)明構(gòu)成任何限制，而應(yīng)由下面的權(quán)利要求的最寬的解釋來限定本發(fā)明的范圍。權(quán)利要求1.用于需要紅細(xì)胞的分析技術(shù)中的試劑紅細(xì)胞的懸浮介質(zhì)，其特征在于，該懸浮介質(zhì)含有任何一組的氨基酸的組合。2.權(quán)利要求l的用于試劑紅細(xì)胞的懸浮介質(zhì)，其含有磷酸鹽緩沖液、氯化鈉、葡萄糖、腺噤呤、防腐劑、EDTA以及甘氨酸。3.權(quán)利要求1和2的用于試劑紅細(xì)胞的懸浮介質(zhì)，其特征在于，該懸浮介質(zhì)還含有肌苷、檸檬酸鹽、檸檬酸以及碳酸氫鹽。4.權(quán)利要求l的用于試劑紅細(xì)胞的懸浮介質(zhì)，其特征在于，氨基酸的濃度高于降低離子強(qiáng)度所需的濃度。5.權(quán)利要求l的用于試劑紅細(xì)胞的懸浮介質(zhì)，其特征在于，該懸浮介質(zhì)含有脂肪族氨基酸。6.權(quán)利要求5的用于試劑紅細(xì)胞的懸浮介質(zhì)，其特征在于，該懸浮介質(zhì)含有脂肪族氨基酸甘氨酸、L-丙胺酸、L-纈氨酸、L-亮氨酸和L-異亮氨酸的組合。7.權(quán)利要求l的用于試劑紅細(xì)胞的懸浮介質(zhì)，其特征在于，該懸浮介質(zhì)含有脂肪族氨基酸、芳香族氨基酸和含硫氨基酸的組合。8.權(quán)利要求7的用于試劑紅細(xì)胞的懸浮介質(zhì)，其特征在于，該懸浮介質(zhì)含有脂肪族氨基酸和以下氨基酸L-苯基丙氨酸，L-酪氨酸，L-色氨酸，L-蛋氨酸和L-半胱氨酸的組合。9.權(quán)利要求l的用于試劑紅細(xì)胞的懸浮介質(zhì)，其特征在于，該懸浮介質(zhì)含有以下氨基酸L-纈氨酸、L-蛋氨酸，L-亮氨酸和L-異亮氨酸的組合。10.權(quán)利要求l的用于試劑紅細(xì)胞的懸浮介質(zhì)，其特征在于，該懸浮介質(zhì)含有疏水和親水氨基酸的組合。11.權(quán)利要求l的用于試劑紅細(xì)胞的懸浮介質(zhì)，其特征在于，該懸浮介質(zhì)含有脂肪族氨基酸、不帶電荷、帶正電荷和帶負(fù)電荷的極性氨基酸的組合。12.權(quán)利要求ll的用于試劑紅細(xì)胞的懸浮介質(zhì)，其特征在于，該懸浮介質(zhì)含有脂肪族氨基酸和以下氨基酸L-絲氨酸，L-蘇氨酸，L-半胱氨酸，L-蛋氨酸，L-天冬酰胺酸，L-谷氨酰胺，L-賴氨酸，L-]精氨酸，L-組氨酸，L-天冬氨酸和L-谷氨酸的組合。13.權(quán)利要求l的用于試劑紅細(xì)胞的懸浮介質(zhì)，其特征在于，該懸浮介質(zhì)含有脂肪族氨基酸、極性、中性或帶電荷(正電和/或負(fù)電)的氨基酸，以及芳香族氨基酸的組合。14.權(quán)利要求l的用于試劑紅細(xì)胞的懸浮介質(zhì)，其特征在于，該懸浮介質(zhì)含有非極性和極性氨基酸的組合。15.權(quán)利要求1-14的用于試劑紅細(xì)胞的懸浮介質(zhì)在凝膠或微管柱中進(jìn)行的免疫血液學(xué)分析技術(shù)中的應(yīng)用。16.權(quán)利要求1-14的用于試劑紅細(xì)胞的懸浮介質(zhì)在需要有試劑紅細(xì)胞的免疫血液學(xué)技術(shù)中的應(yīng)用。17.權(quán)利要求1-14的用于試劑紅細(xì)胞的懸浮介質(zhì)在需要有試劑紅細(xì)胞的分析技術(shù)中的應(yīng)用。全文摘要紅細(xì)胞的懸浮介質(zhì)包含任何一組的氨基酸的組合，以及磷酸鹽緩沖液、氯化鈉、葡萄糖、腺嘌呤、防腐劑、EDTA以及甘氨酸，還包含肌苷、檸檬酸鹽、檸檬酸以及碳酸氫鹽。氨基酸的濃度高于那些需要降低離子強(qiáng)度的濃度。文檔編號G01N33/53GK101101293SQ20071011102公開日2008年1月9日申請日期2007年6月13日優(yōu)先權(quán)日2006年6月22日發(fā)明者丹尼爾·馬托瑞爾·皮納,朱迪·法雷·利昂,約瑟芬娜·卡斯特爾·帕雷拉,邁蒂爾·卡門·特拉弗斯·波羅申請人:基立福有限公司