專利名稱：雙捕獲法檢測IgM、IgG抗體的膠體金層析條及其制備方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種利用免疫測定法檢測特異性IgM、IgG抗體的層析條及其制備技術(shù)，具體地說，涉及一種借助膠體金標記顯色的免疫層析反應(yīng)對特異性IgM、IgG抗體進行聯(lián)合檢測的層析條及其制備方法。
背景技術(shù)：
免疫球蛋白M(Immunoglobulin M，IgM)和免疫球蛋白G(Immunoglobulin G，IgG)是人或動物體內(nèi)最重要的兩種抗體。一種抗原(細菌或病毒等)進入機體后，最早出現(xiàn)的免疫球蛋白是IgM抗體，之后出現(xiàn)IgG抗體。盡管在某些情況下還可能出現(xiàn)IgA抗體，由于其臨床意義同IgG基本相同，并且IgA含量很低，在臨床檢測中的實際意義不大，因而在臨床檢測中一般不予以區(qū)分。通過檢測機體內(nèi)IgM、IgG抗體的存在，可以診斷人或動物對特定抗原的免疫反應(yīng)狀態(tài)。血清內(nèi)若檢測出特異性IgM抗體，表明有近期感染的發(fā)生，但IgM抗體半衰期較短，IgM的檢測陰性并不能證明機體未受到感染，有時還需要檢測半衰期較長，含量更高的IgG抗體，以明確診斷。
目前檢測特異性IgM、IgG抗體主要采用單獨檢測再綜合分析的方法，先采用常規(guī)的ELISA法、雙抗原夾心法或膠體金免疫層析等方法對IgM和IgG抗體分別進行檢測，然后綜合分析兩次的檢測結(jié)果以診斷疾病，整個操作過程繁瑣，檢測不夠方便快捷。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明所要解決的技術(shù)問題是提供一種膠體金層析條，采用雙捕獲法通過一次操作過程即可聯(lián)合檢測特異性IgM、IgG抗體，從而簡化操作過程，實現(xiàn)快速檢測的目的。
本發(fā)明的技術(shù)方案如下一種雙捕獲法檢測IgM、IgG抗體的膠體金層析條，所述層析條在PVC背板上一端順次相互搭接地貼附有樣品墊、復合物墊、硝基纖維素膜，另一端貼附有吸收墊；所述復合物墊為涂覆有抗原-膠體金復合物的玻璃纖維素膜，其特征在于所述硝基纖維素膜上包含三條包被線，分別包被有抗IgGγ鏈抗體、抗IgMμ鏈抗體、與抗原相應(yīng)的抗體。
本發(fā)明還提供了所述膠體金層析條的制備方法，包括以下步驟(1)制備抗IgMμ鏈抗體、抗IgGγ鏈抗體、與抗原相應(yīng)的抗體采用常規(guī)制法制備抗IgMμ鏈抗體、抗IgGγ鏈抗體以及與已知抗原相應(yīng)的動物抗體，濃度分別為1mg/ml～3mg/ml、3mg/ml～5mg/ml、2mg/ml～6mg/ml；(2)制備抗原-膠體金復合物采用檸檬酸三鈉還原法制備膠體金，在金溶膠中按照20μg/ml～80μg/ml比例加入純化的已知抗原，經(jīng)封閉、離心處理后，取沉淀稀釋至A530值為1～3，備用；(3)取硝基纖維素膜貼在PVC背板中間，將抗IgMμ鏈抗體、抗IgGγ鏈抗體、與抗原相應(yīng)的抗體分開包被在硝基纖維素膜上；將抗原-膠體金復合物涂覆在玻璃纖維素膜上制備復合物墊；(4)在PVC背板上一端順次相互搭接地貼附有樣品墊、復合物墊、硝基纖維素膜，另一端貼附吸收墊；(5)將PVC背板及其貼附的材料切成適宜寬度的層析條。
所制備的抗IgMμ鏈抗體可以為單克隆或多克隆抗體。
所制備的抗IgGγ鏈抗體可以為單克隆或多克隆抗體。
所述抗原-膠體金復合物可以噴涂、敷涂或浸泡的方式涂覆在玻璃纖維素膜上。
所述硝基纖維素膜在包被抗IgMμ鏈抗體、抗IgGγ鏈抗體、與抗原相應(yīng)的抗體后可以進行封閉處理，以減少非特異性反應(yīng)。
所述層析條在制備完成后可以裝入塑料板卡內(nèi)。
本發(fā)明的膠體金層析條，以膠體金作為標記物，采用雙捕獲法測定IgM抗體與IgG抗體，通過一次操作即可聯(lián)合檢測出特異性IgM、IgG抗體，簡化了操作過程，且檢測結(jié)果的總體符合率較高。
具體實施例方式
實施例1檢測抗人巨細胞病毒(HCMV)的IgM、IgG抗體1、檢測人巨細胞病毒(HCMV)IgM、IgG抗體的膠體金層析條的制備方法(1)采用動物免疫法制備濃度為5mg/ml的兔抗HCMV抗體，采用單克隆抗體制備法分別制備濃度為2mg/ml的鼠抗人IgMμ鏈單克隆抗體、濃度為4mg/ml的鼠抗人IgGγ鏈單克隆抗體，備用。
(2)制備抗原-膠體金復合物采用檸檬酸三鈉還原法制備膠體金，在金溶膠中按照60μg/ml比例加入純化的HCMV抗原，經(jīng)封閉、離心處理后，取沉淀稀釋至A530值2.5，備用。
(3)包被鼠抗人IgMμ鏈單克隆抗體、鼠抗人IgGγ鏈單克隆抗體、兔抗HCMV抗體取硝基纖維素膜貼于PVC背板中間，設(shè)定劃膜機涂覆參數(shù)為1μl/cm。取5mg/ml的兔抗HCMV抗體1.5ml、4mg/ml的鼠抗人IgGγ鏈單克隆抗體1.5ml、2mg/ml的鼠抗人IgMμ鏈單克隆抗體1.5ml，分別接到劃膜機的A、B、C管道接口。將貼有硝基纖維素膜的PVC背板置于劃膜機的往復運動平臺上。開啟劃膜機，在硝基纖維素膜上涂覆兔抗HCMV抗體、鼠抗人IgGγ鏈單克隆抗體、鼠抗人IgMμ鏈單克隆抗體，在37℃干燥2小時。將背板置于1％聚乙二醇溶液中浸泡30分鐘，晾干，37℃干燥2小時。
(4)將抗原-膠體金復合物涂覆在玻璃纖維素膜上設(shè)定劃膜機噴涂參數(shù)為30.0μl/cm，將抗原-膠體金復合物連接到劃膜機的D管道接口。取30cm×12cm的玻璃纖維素膜放置往復運動平臺上。開啟劃膜機，在玻璃纖維素膜上噴涂抗原-膠體金復合物制成復合物墊，37℃干燥2小時。
(5)在PVC背板上一端順次相互搭接地貼上復合物墊和樣品墊，另一端貼上吸收墊，將PVC背板及其貼附的材料切成4mm寬層析條。將層析條放入塑料板卡內(nèi)，用壓卡機壓實。
當加入被檢測樣品后，通過層析作用，樣品和抗原-膠體金復合物向吸收墊一端移動。當樣品通過抗IgMμ鏈抗體包被處時，IgM抗體與抗IgMμ鏈抗體結(jié)合，其中含有的針對特異性抗原的IgM抗體與抗原-膠體金復合物結(jié)合，在該處顯示一條紫紅色條帶。如果被檢測樣品中含有針對特異性抗原的IgG抗體，當其移動到抗IgGγ鏈抗體包被處時，特異性IgG抗體既與抗IgGγ鏈抗體結(jié)合，也與抗原-膠體金復合物結(jié)合，在此處顯示一條紫紅色條帶?？乖?膠體金復合物移動到與其相應(yīng)抗體的包被處時，與抗體結(jié)合顯示一條紫紅色條帶。
實際檢測時，若在抗IgMμ鏈抗體包被處顯示紫紅色條帶，表明被檢測樣品中含有針對特異性抗原的IgM抗體，判定為陽性結(jié)果；若在抗IgGγ鏈抗體包被處顯示紫紅色條帶，表明被檢測樣品中含有針對特異性抗原的IgG抗體，判定為陽性結(jié)果；若在抗IgMμ鏈抗體和抗IgGγ鏈抗體包被處均顯示紫紅色條帶，表明被檢測樣品中含有針對特異性抗原的IgM抗體和IgG抗體，判定為陽性結(jié)果；否則表明被檢測樣品中不含有針對特異性抗原的IgM抗體、IgG抗體，判定為陰性結(jié)果。在針對特異性抗原的抗體包被處顯示紫紅色條帶，提示該檢測系統(tǒng)的檢測結(jié)果有效；如果該處沒有顯示紫紅色條帶，表明該檢測系統(tǒng)失效，檢測結(jié)果無效。
2、檢測抗人巨細胞病毒(HCMV)IgM、IgG抗體的檢測結(jié)果應(yīng)用制備的膠體金層析條對臨床診斷明確的抗HCMV IgG陽性血清278份和陰性血清2197份進行了檢測，并與間接法ELISA試劑單獨檢測抗HCMV IgG的結(jié)果進行了對比，結(jié)果分別示于表1和表2。
表1膠體金層析條對抗HCMV IgG臨床血清的檢測結(jié)果 表2膠體金與ELISA檢測抗HCMV IgG的結(jié)果比較 由表1數(shù)據(jù)可計算得到約登指數(shù)為261/(261+17)+2195/(2+2195)-1＝0.94，說明檢測結(jié)果與樣品真實情況的總體符合率很高。由表2數(shù)據(jù)可計算得到本發(fā)明檢測結(jié)果與ELISA檢測結(jié)果的總體符合率為(262+2192)/2475×100％＝99.2％，這表明兩種檢測方法檢測抗人巨細胞病毒(HCMV)IgG具有高度一致性。
應(yīng)用制備的膠體金層析條對臨床診斷明確的抗HCMV IgM陽性血清153份和陰性血清1569份進行了檢測，并與捕獲法ELISA試劑單獨檢測抗HCMV IgM抗體的結(jié)果進行了對比，結(jié)果分別示于表3和表4。
表3膠體金層析條對抗HCMV IgM臨床血清的檢測結(jié)果 表4膠體金與ELISA檢測抗HCMV IgM的結(jié)果比較 由表3數(shù)據(jù)可計算得到約登指數(shù)為141/(141+12)+1568/(1+1568)-1＝0.92，說明檢測結(jié)果與樣品真實情況的總體符合率很高。由表4數(shù)據(jù)可計算得到本發(fā)明檢測結(jié)果與ELISA檢測結(jié)果的總體符合率為(143+1566)/1722×100％＝99.2％，這表明兩種檢測方法檢測抗人巨細胞病毒(HCMV)IgM具有高度一致性。
以上分析結(jié)果表明，本發(fā)明聯(lián)合檢測抗人巨細胞病毒IgM、IgG抗體的膠體金層析條與單獨檢測IgG或IgM抗體的ELISA試劑具有相似的檢測結(jié)果，本發(fā)明的檢測結(jié)果能夠符合實際檢測工作的需要。
實施例2檢測抗風疹病毒(RV)的IgM、IgG抗體采用與實施例1類似的方法制備檢測抗風疹病毒(RV)IgM、IgG抗體的膠體金層析條。應(yīng)用制備的膠體金層析條對臨床診斷明確的抗RV IgG陽性血清568份和陰性血清1563份進行了檢測，并與間接法ELISA試劑單獨檢測抗RV IgG的結(jié)果進行了對比，結(jié)果分別示于表5和表6。
表5膠體金層析條對抗RV IgG臨床血清的檢測結(jié)果 表6膠體金與ELISA檢測抗RV IgG的結(jié)果比較 由表5數(shù)據(jù)可計算得到約登指數(shù)為534/(534+34)+1562/(1+1562)-1＝0.94，說明檢測結(jié)果與樣品真實情況的總體符合率很高。由表6數(shù)據(jù)可計算得到本發(fā)明檢測結(jié)果與ELISA檢測結(jié)果的總體符合率為(539+1560)/2131×100％＝98.5％，這表明兩種檢測方法檢測抗RV IgG具有高度一致性。
應(yīng)用制備的膠體金層析條對臨床診斷明確的抗RV IgM陽性血清136份和陰性血清1968份進行了檢測，并與捕獲法ELISA試劑單獨檢測抗RV IgM抗體的結(jié)果進行了對比，結(jié)果分別示于表7和表8。
表7膠體金層析條對抗RV IgM臨床血清的檢測結(jié)果 表8膠體金與ELISA檢測抗RV IgM的結(jié)果比較 由表7數(shù)據(jù)可計算得到約登指數(shù)為127/(127+9)+1966/(2+1966)-1＝0.93，說明檢測結(jié)果與樣品真實情況的總體符合率很高。由表8數(shù)據(jù)可計算得到本發(fā)明檢測結(jié)果與ELISA檢測結(jié)果的總體符合率為(129+1966)/2104×100％＝99.6％，這表明兩種檢測方法檢測抗RV IgM具有高度一致性。
以上分析結(jié)果表明，本發(fā)明聯(lián)合檢測風疹病毒IgM、IgG抗體的膠體金層析條與單獨檢測IgG或IgM抗體的ELISA試劑具有相似的檢測結(jié)果，本發(fā)明的檢測結(jié)果能夠符合實際檢測工作的需要。
實施例3檢測抗單純皰疹病毒(HV)的IgM、IgG抗體采用與實施例1類似的方法制備檢測抗單純皰疹病毒(HV)IgM、IgG抗體的膠體金層析條。應(yīng)用制備的膠體金層析條對臨床診斷明確的抗HV IgG陽性血清326份和陰性血清1863份進行了檢測，并與間接法ELISA試劑單獨檢測抗HV IgG的結(jié)果進行了對比，結(jié)果分別示于表9和表10。
表9膠體金層析條對抗HV IgG臨床血清的檢測結(jié)果
表10膠體金與ELISA檢測抗HV IgG的結(jié)果比較 由表9數(shù)據(jù)可計算得到約登指數(shù)為304/(304+22)+1862/(1+1862)-1＝0.93，說明檢測結(jié)果與樣品真實情況的總體符合率很高。由表10數(shù)據(jù)可計算得到本發(fā)明檢測結(jié)果與ELISA檢測結(jié)果的總體符合率為(308+1856)/2189×100％＝98.9％，這表明兩種檢測方法檢測抗HV IgG具有高度一致性。
應(yīng)用制備的膠體金層析條對臨床診斷明確的抗HV IgM陽性血清132份和陰性血清1836份進行了檢測，并與捕獲法ELISA試劑單獨檢測抗HV IgM抗體的結(jié)果進行了對比，結(jié)果分別示于表11和表12。
表11膠體金層析條對抗HV IgM臨床血清的檢測結(jié)果 表12膠體金與ELISA檢測抗HV IgM的結(jié)果比較 由表11數(shù)據(jù)可計算得到約登指數(shù)為123/(123+9)+1835/(1+1835)-1＝0.93，說明檢測結(jié)果與樣品真實情況的總體符合率很高。由表12數(shù)據(jù)可計算得到本發(fā)明檢測結(jié)果與ELISA檢測結(jié)果的總體符合率為(125+1830)/1968×100％＝99.3％，這表明兩種檢測方法檢測抗HV IgM具有高度一致性。
以上分析結(jié)果表明，本發(fā)明聯(lián)合檢測單純皰疹病毒IgM、IgG抗體的膠體金層析條與單獨檢測IgG或IgM抗體的ELISA試劑具有相似的檢測結(jié)果，本發(fā)明的檢測結(jié)果能夠符合實際檢測工作的需要。
實施例4檢測抗弓形體(Tox)的IgM、IgG抗體采用與實施例1類似的方法制備檢測弓形體(Tox)IgM、IgG抗體的膠體金層析條。應(yīng)用制備的膠體金層析條對臨床診斷明確的抗Tox IgG陽性血清368份和陰性血清1769份進行了檢測，并與間接法ELISA試劑單獨檢測抗Tox IgG的結(jié)果進行了對比，結(jié)果分別示于表13和表14。
表13膠體金層析條對抗Tox IgG臨床血清的檢測結(jié)果 表14膠體金與ELISA檢測抗Tox IgG的結(jié)果比較 由表13數(shù)據(jù)可計算得到約登指數(shù)為349/(349+19)+1768/(1+1768)-1＝0.95，說明檢測結(jié)果與樣品真實情況的總體符合率很高。由表14數(shù)據(jù)可計算得到本發(fā)明檢測結(jié)果與ELISA檢測結(jié)果的總體符合率為(348+1766)/2137×100％＝98.9％，這表明兩種檢測方法檢測抗Tox IgG具有高度一致性。
應(yīng)用制備的膠體金層析條對臨床診斷明確的抗Tox IgM陽性血清132份和陰性血清1836份進行了檢測，并與捕獲法ELISA試劑單獨檢測抗Tox IgM抗體的結(jié)果進行了對比，結(jié)果分別示于表15和表16。
表15膠體金層析條對抗Tox IgM臨床血清的檢測結(jié)果
表16膠體金與ELISA檢測抗Tox IgM的結(jié)果比較 由表15數(shù)據(jù)可計算得到約登指數(shù)為202/(202+14)+1583/(3+1583)-1＝0.93，說明檢測結(jié)果與樣品真實情況的總體符合率很高。由表16數(shù)據(jù)可計算得到本發(fā)明檢測結(jié)果與ELISA檢測結(jié)果的總體符合率為(205+1581)/1802×100％＝99.1％，這表明兩種檢測方法檢測抗ToxIgM具有高度一致性。
以上分析結(jié)果表明，本發(fā)明聯(lián)合檢測抗弓形體IgM、IgG抗體的膠體金層析條與單獨檢測IgG或IgM抗體的ELISA試劑具有相似的檢測結(jié)果，本發(fā)明的檢測結(jié)果能夠符合實際檢測工作的需要。
權(quán)利要求
1.一種雙捕獲法檢測IgM、IgG抗體的膠體金層析條，所述層析條在PVC背板上一端順次相互搭接地貼附有樣品墊、復合物墊、硝基纖維素膜，另一端貼附有吸收墊；所述復合物墊為涂覆有抗原-膠體金復合物的玻璃纖維素膜，其特征在于所述硝基纖維素膜上包含三條包被線，分別包被有抗IgGγ鏈抗體、抗IgMμ鏈抗體、與抗原相應(yīng)的抗體。
2.一種制備權(quán)利要求1所述膠體金層析條的方法，包括以下步驟(1)制備抗IgMμ鏈抗體、抗IgGγ鏈抗體、與抗原相應(yīng)的抗體采用常規(guī)制法制備抗IgMμ鏈抗體、抗IgGγ鏈抗體以及與已知抗原相應(yīng)的動物抗體，濃度分別為1mg/ml～3mg/ml、3mg/ml～5mg/ml、2mg/ml～6mg/ml；(2)制備抗原-膠體金復合物采用檸檬酸三鈉還原法制備膠體金，在金溶膠中按照20μg/ml～80μg/ml比例加入純化的已知抗原，經(jīng)封閉、離心處理后，取沉淀稀釋至A530值為1～3，備用；(3)取硝基纖維素膜貼在PVC背板中間，將抗IgMμ鏈抗體、抗IgGγ鏈抗體、與抗原相應(yīng)的抗體分開包被在硝基纖維素膜上；將抗原-膠體金復合物涂覆在玻璃纖維素膜上制備復合物墊；(4)在PVC背板上一端順次相互搭接地貼附有樣品墊、復合物墊、硝基纖維素膜，另一端貼附吸收墊；(5)將PVC背板及其貼附的材料切成適宜寬度的層析條。
3.根據(jù)權(quán)利要求2所述的制備方法，其特征在于所制備的抗IgMμ鏈抗體為單克隆或多克隆抗體。
4.根據(jù)權(quán)利要求2所述的制備方法，其特征在于所制備的抗IgGγ鏈抗體為單克隆或多克隆抗體。
5.根據(jù)權(quán)利要求2所述的制備方法，其特征在于所述抗原-膠體金復合物以噴涂、敷涂或浸泡的方式涂覆在玻璃纖維素膜上。
6.根據(jù)權(quán)利要求2所述的制備方法，其特征在于所述硝基纖維素膜在包被抗IgMμ鏈抗體、抗IgGγ鏈抗體、與抗原相應(yīng)的抗體后還可以進行封閉處理。
7.根據(jù)權(quán)利要求2所述的制備方法，其特征在于所述層析條在制備完成后裝入塑料板卡內(nèi)。
全文摘要
本發(fā)明提供一種雙捕獲法檢測IgM、IgG抗體的膠體金層析條及其制備技術(shù)。該層析條以膠體金作為標記物，在PVC背板上一端順次相互搭接地貼附有樣品墊、復合物墊、硝基纖維素膜，另一端貼附有吸收墊；所述復合物墊為涂覆有抗原－膠體金復合物的玻璃纖維素膜，其特征在于所述硝基纖維素膜上包含三條包被線，分別包被有抗IgGγ鏈抗體、抗IgMμ鏈抗體、與抗原相應(yīng)的抗體。本發(fā)明的層析條采用雙捕獲法測定IgM抗體、IgG抗體，通過一次操作即可聯(lián)合檢測出特異性IgM、IgG抗體，簡化了操作過程，且檢測結(jié)果能夠符合實際檢測工作的需要。
文檔編號G01N33/549GK101067626SQ200710106178
公開日2007年11月7日 申請日期2007年6月8日 優(yōu)先權(quán)日2007年6月8日
發(fā)明者陳廷友, 王健, 王志新, 張秀杰 申請人:北京英諾特生物技術(shù)有限公司