專利名稱：突變羧肽酶原b及突變羧肽酶b的生產(chǎn)方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及分子生物學(xué)領(lǐng)域，主要是通過定點(diǎn)突變使得基因表達(dá)產(chǎn)物的性能改善的方法。具體的說，是通過選擇使得特定的半胱氨酸位點(diǎn)或其它影響二硫鍵形成的基因位點(diǎn)，使得突變羧肽酶B表達(dá)產(chǎn)物的活性提高的方法。
背景技術(shù)：
胰腺羧肽酶B(carboxypeptidase B，CPB，EC 3.4.17.2)發(fā)現(xiàn)于1958年(參見Folk JE，Gladner JA，Carboxypeptidase B J Biol Chem 1958；231379-391)。它是一種消化酶，其水平在正常的血清中幾乎檢測不到。只有發(fā)生胰腺炎期間，血清中才可發(fā)現(xiàn)活性CPB，其血漿半衰期為幾分鐘，這可能是由于沒有糖基化。
羧肽酶B是一種含鋅的胰外肽酶，其中，鋅離子作為酶活性所必需的一種輔因子存在。羧肽酶B可特異性水解肽鏈C端的堿性氨基酸——精氨酸，賴氨酸或鳥氨酸。CPB含307個氨基酸，分子質(zhì)量35ku。天然存在的CPB是由前羧肽酶原B(preprocarboxypeptidase B)產(chǎn)生的，其N-末端包含108個氨基酸(其中13個氨基酸為信號肽序列，95個氨基酸組成活性肽部分)的片段與C端的CPB相連，前羧肽酶原B在轉(zhuǎn)運(yùn)到內(nèi)質(zhì)網(wǎng)的過程中，信號肽被切掉，得到不具酶活性羧肽酶原B(procarboxypeptiedase B，pCPB)從細(xì)胞中分泌出來，然后在小腸中經(jīng)胰蛋白酶酶解為具酶活性的CPB和活性肽部分。
由于羧肽酶B特異性水解肽鏈C端的堿性氨基酸(精氨酸，賴氨酸或鳥氨酸)，所以羧肽酶B可應(yīng)用于蛋白質(zhì)和多肽的序列分析，特別是用來確定羧基端氨基酸。
目前，羧肽酶B最重要的用途是作為工業(yè)用酶，特別是應(yīng)用于胰島素的工業(yè)生產(chǎn)中，歐洲專利申請EP-A 0489780中描述了胰島素的制備，在這個申請中，羧肽酶B被用于將胰蛋白酶打開的胰島素原轉(zhuǎn)變?yōu)橐葝u素的一個必需步驟中。
從豬胰腺中純化的商業(yè)化的羧肽酶B有可能沒有完全去除其他蛋白水解酶的活性。此外，如同大多數(shù)動物來源的產(chǎn)物的情況，豬胰腺來源的羧肽酶B可能含有感染物質(zhì)，如病毒、朊病毒、或其他具有損害人體健康潛能的生物活性組分。如果這種酶應(yīng)用于大規(guī)模工業(yè)生產(chǎn)，例如工業(yè)生產(chǎn)胰島素，另一個不利的因素是獲得和儲存冷藏胰腺的高后勤成本。
除了從胰腺組織中提取羧肽酶B，用生物技術(shù)方法生產(chǎn)羧肽酶B是另一替代方法。這一方法中有一些已知的路線，例如表達(dá)羧肽酶B前體，即羧肽酶原B，它包括羧肽酶B的氨基酸序列和活性肽序列。大腸桿菌(E.coli)、巴斯德畢赤酵母(Pichia pastoris)等均可作為表達(dá)菌株，但表達(dá)所得羧肽酶原需經(jīng)胰蛋白酶激活后獲得活性羧肽酶B，然后再純化去除胰蛋白酶和活性肽部分等。這一方法的另一替代方法是在細(xì)菌或酵母中以融合蛋白形式，如β-半乳糖苷酶-羧肽酶B融合蛋白形式表達(dá)，但需體外去除融合蛋白才可獲得活性羧肽酶B。
WO 0151624公開了在巴斯德畢赤酵母中豬前羧肽酶B的重組表達(dá)。通過胰蛋白酶酶切的方式活化酶原，隨后加入胰蛋白酶抑制劑，疏水柱層析純化得到羧肽酶B，Q-瓊脂糖凝膠層析進(jìn)一步純化活化的酶。WO0151624的純化方法涉及多個步驟并伴隨著羧肽酶B產(chǎn)物的損失。此外，還需從產(chǎn)物中分離胰蛋白酶、胰蛋白酶抑制劑和羧肽酶B前肽。
DE 19915938公開了在甲基營養(yǎng)巴斯德畢赤酵母中組氨酸標(biāo)記的人前羧肽酶B的重組表達(dá)。利用親和層析憑借組氨酸標(biāo)記的優(yōu)點(diǎn)來純化該產(chǎn)物。隨后，利用胰蛋白酶活化前羧肽酶B并通過添加胰蛋白酶抑制劑來終止該活化反應(yīng)。由于活化步驟施用于溶解的酶原，因此需要進(jìn)一步將前肽和羧肽酶B純化分開。
WO 9623064中公開了在E.coli中的鼠前羧肽酶B的重組表達(dá)。產(chǎn)生了非溶解性的前羧肽酶B的包涵體。該酶原被復(fù)性，針對溶解的酶原進(jìn)行胰蛋白酶的活化步驟，并隨后被進(jìn)一步純化，將前肽、胰蛋白酶與羧肽酶B分離。我們也對該方法進(jìn)行了摸索(Su-Xia Li等，Protein and Peptide Letters2003，10(6)1-10)。
目前本領(lǐng)域?qū)τ谕ㄟ^定點(diǎn)突變技術(shù)進(jìn)行突變CPB的研究并無報(bào)道。因此，本領(lǐng)域?qū)τ谕ㄟ^突變技術(shù)來改變CPB表達(dá)，從而進(jìn)行突變CPB的研究以揭示CPB的結(jié)構(gòu)與功能的關(guān)系，從而進(jìn)一步改善其生產(chǎn)方法具有迫切的需要。
發(fā)明內(nèi)容
因此，本發(fā)明的一個目的是提供一種重組生產(chǎn)羧肽酶B的方法。
在本發(fā)明的一個方面，公開了一種突變的羧肽酶B或相應(yīng)的羧肽酶原B，其在對應(yīng)于天然羧肽酶原B氨基酸序列第288位的半胱氨酸被除半胱氨酸之外的天然氨基酸所取代，并且羧肽酶B基本上保留天然羧肽酶B的活性。
在該方面的一個優(yōu)選例中，該羧肽酶原B具有SEQ ID NO1的氨基酸序列，其中Cyt288被選自甘氨酸、丙氨酸、纈氨酸、亮氨酸、異亮氨酸、苯丙氨酸、酪氨酸、色氨酸、甲硫氨酸、絲氨酸、蘇氨酸、賴氨酸、精氨酸、組氨酸、天冬酰胺、谷氨酰胺、天冬氨酸、谷氨酸的氨基酸替換。
在更優(yōu)選的具體實(shí)施方式
中，Cyt288被選自甘氨酸、絲氨酸、賴氨酸、天冬酰胺和苯丙氨酸的氨基酸替換。
在本發(fā)明的另一個方面，提供了一種多核苷酸，它編碼上述羧肽酶B或羧肽酶原B，優(yōu)選編碼SEQ ID NO1的氨基酸序列；更優(yōu)選的，該多核苷酸是SEQ ID NO2的核苷酸序列。
在本發(fā)明的還有一個方面，公開了一種表達(dá)載體，它含有上述多核苷酸。
在本發(fā)明的另一個方面，公開了一種宿主細(xì)胞，它含有上述表達(dá)載體，或者在基因組中整合有上述多核苷酸。優(yōu)選的，該宿主細(xì)胞是大腸桿菌。
在本發(fā)明的另一個方面，提供了一種生產(chǎn)重組羧肽酶B或羧肽酶原B的方法，包括步驟(a)培養(yǎng)宿主細(xì)胞，從而表達(dá)出上述突變的羧肽酶B或羧肽酶原B；(b)從培養(yǎng)物中分離出步驟(a)中所表達(dá)的突變的羧肽酶B或羧肽酶原B。
優(yōu)選宿主細(xì)胞為大腸桿菌，并且羧肽酶B或羧肽酶原B以包涵體形式表達(dá)，并且該方法還包括步驟(c)對分離的羧肽酶B或羧肽酶原B通過變性和復(fù)性而獲得酶活性。
在另一優(yōu)選例中，羧肽酶B以上清形式表達(dá)，純化后得到活性羧肽酶B。
在另一優(yōu)選例中，該方法還包括步驟對分離的羧肽酶原B用胰蛋白酶消化，從而獲得羧肽酶B。
在本發(fā)明的另一個方面，還提供了一種上述突變羧肽酶B或羧肽酶原B的用途，用作從胰島素原制備胰島素的工具酶，或用于蛋白測序、制備診斷胰腺炎的試劑或試劑盒等。
圖1描述了突變羧肽酶原B(mpCPB)的核苷酸序列和相應(yīng)的氨基酸序列。其中羧肽酶原B的氨基酸序列為(SEQ ID NO1)，核苷酸序列為(SEQ ID NO2)。該DNA序列來源于已構(gòu)建的質(zhì)粒pT7-pCPB，pCPB核苷酸序列來源于RT-PCR技術(shù)獲得的大鼠胰腺pCPB RNA序列(Su-Xia Li等，Protein and PeptideLetters 2003，10(6)1-10)。BLAST的結(jié)果表明，與Genbank登錄號P19223上收錄的大鼠的pCPB基因相比有5個核苷酸不同，導(dǎo)致2個氨基酸的差異，其中Lysll變?yōu)锳sn11，Arg139變?yōu)镚lu139。圖1還顯示了突變的核苷酸和相應(yīng)的氨基酸位點(diǎn)，C288→S288，以灰色框表示。
圖2顯示了PCR的電泳鑒定結(jié)果。以含有突變基因的質(zhì)粒pET-mpCPB為模板，本文所述的為特異引物，進(jìn)行PCR擴(kuò)增后獲得pCPB7和CPB7的特異擴(kuò)增條帶，這里的pCPB7和CPB7代表的是突變的基因。
圖3顯示了PCR產(chǎn)物膠回收后進(jìn)行基因電泳鑒定測定的結(jié)果。
圖4顯示了PCR膠回收產(chǎn)物雙酶切及表達(dá)載體雙酶切電泳圖，直接用NcoI/Hind III進(jìn)行基因片段和表達(dá)載體pET-22a的雙酶切，酶切后鑒定。
圖5顯示了重組表達(dá)質(zhì)粒pET-PCPB，pET-CPB的雙酶切鑒定。將圖4所示的雙酶切片段進(jìn)行割膠回收，連接，轉(zhuǎn)化，擴(kuò)增，抽質(zhì)粒，同樣雙酶切鑒定?？傻孟鄳?yīng)條帶。
圖6顯示了SDS-PAGE進(jìn)行重組突變pCPB克隆的IPTG誘導(dǎo)(37℃)后篩選。泳道1，3為誘導(dǎo)前樣品。泳道2、4為用0.5mM IPTG誘導(dǎo)后的樣品。它們都呈陽性。分別與誘導(dǎo)前相對照，含有重組質(zhì)粒的經(jīng)IPTG誘導(dǎo)后有相應(yīng)蛋白條帶(43KD)表達(dá)。結(jié)果顯示菌株2和3為陽性克隆，菌株1為陰性克隆。
圖7顯示了SDS-PAGE電泳分析37℃條件下IPTG誘導(dǎo)后重組突變CPB克隆的篩選。泳道1、3和5是誘導(dǎo)前樣品。泳道2、4和6是0.5mM IPTG誘導(dǎo)后的樣品。分別與誘導(dǎo)前相對照，含有重組質(zhì)粒的經(jīng)IPTG誘導(dǎo)后有相應(yīng)蛋白條帶(35KD)表達(dá)。結(jié)果顯示菌株1(泳道1、2)和3(泳道5、6)為陽性克隆，菌株2(泳道3、4)為陰性克隆。
圖8顯示了SDS-PAGE分析比較突變mPCPB和mCPB與原始菌株(未突變菌株)PCPB在37℃和12℃表達(dá)量的差異。
泳道1～3，12℃誘導(dǎo)表達(dá)，泳道1，pCPB；泳道2，mpCPB；泳道3，mCPB；泳道4～6，37℃誘導(dǎo)表達(dá)，泳道4，pCPB；泳道5，mpCPB；泳道6，mCPB；其中，1和4為原始菌株，2和5為突變后mPCPB，3和6為突變后mCPB。
圖9A顯示了SDS-PAGE分析突變mPCPB在37℃條件下，IPTG誘導(dǎo)表達(dá)情況(培養(yǎng)基中加入0.01mM Zn2+)。泳道1，0.5mM IPTG誘導(dǎo)后菌體沉淀；泳道2，菌體超聲破碎離心后上清；泳道3，菌體超聲破碎離心后上清(SDS-PAGE上樣液中不含β-巰基乙醇)(和附圖中所述正好顛倒)；泳道4，菌體超聲破碎離心后包涵體經(jīng)洗滌后溶解在10M尿素中(SDS-PAGE上樣液中不含β-巰基乙醇)，泳道5，菌體超聲破碎離心后沉淀包涵體經(jīng)洗滌后溶解在10M尿素中。
圖9B顯示了SDS-PAGE分析突變mPCPB在37℃條件下，IPTG誘導(dǎo)表達(dá)情況(培養(yǎng)基中沒有加Zn2+)。泳道1，菌體超聲破碎離心后包涵體經(jīng)洗滌后溶解在10M尿素中，泳道2，菌體超聲破碎離心后沉淀包涵體經(jīng)洗滌后溶解在10M尿素(SDS-PAGE上樣液中不含β-巰基乙醇)。
圖10A顯示了SDS-PAGE電泳分析突變mPCPB在12℃條件下，IPTG誘導(dǎo)表達(dá)情況(培養(yǎng)基中加入0.01mM Zn2+)。其中泳道1為0.5mM IPTG誘導(dǎo)后菌體沉淀；泳道2，菌體超聲破碎離心后上清(SDS-PAGE上樣液中不含β-巰基乙醇)；泳道3，菌體超聲破碎離心后上清；泳道4，菌體超聲破碎離心后包涵體經(jīng)洗滌后溶解在10M尿素中(SDS-PAGE上樣液中不含β-巰基乙醇)，泳道5，菌體超聲破碎離心后沉淀包涵體經(jīng)洗滌后溶解在10M尿素。
圖10B顯示了SDS-PAGE分析突變mPCPB在12℃條件下，IPTG誘導(dǎo)表達(dá)情況(培養(yǎng)基中沒有加Zn2+)。泳道1，0.5mM IPTG誘導(dǎo)后菌體沉淀；泳道2，0.5mM IPTG誘導(dǎo)后，菌體超聲破碎離心后上清；泳道3，菌體超聲破碎離心后上清；泳道4，菌體超聲破碎離心后上清(SDS-PAGE上樣液中不含β-巰基乙醇)；泳道5，菌體超聲破碎離心后包涵體經(jīng)洗滌后溶解在10M尿素中，泳道6，菌體超聲破碎離心后沉淀包涵體經(jīng)洗滌后溶解在10M尿素(SDS-PAGE上樣液中不含β-巰基乙醇)。
具體實(shí)施例方式
術(shù)語解釋本文所用的術(shù)語，除非特別指出，“CPB”指羧肽酶B，“pCPB”(大小寫不論)指羧肽酶原。
本文所用的“CPB”“PCPB”“mPCPB”“mCPB”表示通過重組DNA方法和其他方法制備的一種多肽，它具有與任何天然存在的哺乳動物羧肽酶B的氨基酸序列相同或基本相同的氨基酸序列。“mPCPB”“mCPB”表示通過重組體DNA定點(diǎn)突變方法獲得的一種多肽，除特定氨基酸突變外，它與任何天然存在的哺乳動物羧肽酶B的氨基酸序列相同或基本上相同。
本文所用的一種“具酶活性”的CPB或mCPB指具有天然存在的羧肽酶B的生物活性的CPB。為了此定義的目的，天然存在的羧肽酶B的生物活性即其特異性的去除C末端精氨酸、賴氨酸或鳥氨酸的能力。
本發(fā)明提供了突變的羧肽酶原B，以及由其產(chǎn)生的突變羧肽酶B，以及用該突變的羧肽酶原B產(chǎn)生具有提高的生物活性的羧肽酶B的方法。該方法優(yōu)選僅通過化學(xué)變性復(fù)性來得到活性的、具有正確生物構(gòu)象的羧肽酶B。
本發(fā)明采用了定點(diǎn)突變方法來對CPB的氨基酸序列進(jìn)行突變。定點(diǎn)突變技術(shù)是本領(lǐng)域已知的技術(shù)，主要分為三類1)PCR反應(yīng)介導(dǎo)的；2)非PCR反應(yīng)介導(dǎo)的；3)體內(nèi)定點(diǎn)突變技術(shù)。采用PCR反應(yīng)介導(dǎo)可實(shí)現(xiàn)簡單、快速、高效的基因定點(diǎn)突變，可分為重疊延伸法和快速定點(diǎn)突變法。
采用快速定點(diǎn)突變法是對特定雙鏈DNA中的氨基酸直接以PCR方法引入突變，一步完成，不需要ssDNA，適合與任何載體和宿主菌，模板可大于9kb，有兩種方法①在待突變位點(diǎn)設(shè)計(jì)點(diǎn)突變引物，兩引物5’端相鄰，直接以雙鏈DNA為模板，以突變引物進(jìn)行PCR，DNA聚合酶可采用常規(guī)的DNA聚合物，例如高保真的Pyrobest DNA聚合酶，得到含平末端的PCR產(chǎn)物。產(chǎn)物純化后對末端進(jìn)行磷酸化處理(也可在合成引物時直接對其中一條磷酸化處理)，在DNA連接酶的作用下連接處理后的PCR產(chǎn)物，得到含目的片段的環(huán)狀雙鏈DNA，轉(zhuǎn)化入相應(yīng)的宿主菌，對轉(zhuǎn)化子鑒定，得到目的DNA。②在相應(yīng)位置設(shè)計(jì)突變引物(兩引物完全互補(bǔ))，同樣，為了便于鑒定，可在引物中利用沉默突變引入或去除某一限制性酶切位點(diǎn)。以雙鏈DNA為模板，突變引物、高保真DNA聚合酶PCR，得到帶粘性末端的全長DNA，產(chǎn)物用限制性內(nèi)切酶DpnI(識別序列為5’-Gm6ATC-3’)消化甲基化和半甲基化的模板DNA。因?yàn)榇竽c桿菌里含有甲基化酶，所以大部分從大腸桿菌分離到的DNA都是甲基化的，可以被DpnI消化，依此來選擇突變DNA。消化后的PCR產(chǎn)物轉(zhuǎn)化與XL1-Blue(或TG1)感受態(tài)，對轉(zhuǎn)化子質(zhì)粒進(jìn)行酶切或者測序鑒定。
本發(fā)明人采用PCR快速突變法的第二種方法，實(shí)現(xiàn)了定點(diǎn)突變，并測序證實(shí)了突變體基因的正確性。
本發(fā)明人發(fā)現(xiàn)，對于游離的半胱氨酸288進(jìn)行替換，可以減少其形成不必要的鏈內(nèi)二硫鍵的幾率，從而使得產(chǎn)物的活性大大增加。
可使得半胱氨酸突變?yōu)槿魏尾荒苄纬啥蜴I的氨基酸，包括但不限于甘氨酸、丙氨酸、纈氨酸、亮氨酸、異亮氨酸、苯丙氨酸、酪氨酸、色氨酸、甲硫氨酸、絲氨酸、蘇氨酸、賴氨酸、精氨酸、組氨酸、天冬酰胺、谷氨酰胺、天冬氨酸、谷氨酸。還可包含這些天然氨基酸的衍生形式。本領(lǐng)域技術(shù)人員可以輕易選擇這些氨基酸，只要它們和半胱氨酸的性質(zhì)不相同。這些知識可以從任何生物化學(xué)領(lǐng)域的教科書上找到。
在定點(diǎn)突變mpCPB以后，可用任何方法根據(jù)已知的pCPB的序列設(shè)計(jì)引物，PCR克隆出mCPB序列?？寺⌒蛄械募夹g(shù)可見分子克隆等常用實(shí)驗(yàn)手冊。
表達(dá)載體可用任何本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的原核和真核表達(dá)載體，視具體情況而定。優(yōu)選的表達(dá)載體包括在宿主細(xì)胞內(nèi)表達(dá)克隆的基因所必需的調(diào)節(jié)元件，包括啟動子、終止子等，視需要不同可分為瞬時表達(dá)和組成型表達(dá)。調(diào)節(jié)元件可定位在編碼突變CPB的核酸附近，以便影響其表達(dá)。
可使用任何原核或真核宿主，例如細(xì)菌、真菌、植物、哺乳動物等。優(yōu)選的細(xì)菌寄主細(xì)胞為大腸桿菌細(xì)胞，一種合適的大腸桿菌的例子是菌株BL21(DE3)。
在用含有本發(fā)明的mCPB連接入載體，并感染宿主，在本領(lǐng)域技術(shù)人員常規(guī)所知的適合宿主的培養(yǎng)基或條件下，通過發(fā)酵等方法培養(yǎng)，可收集表達(dá)該mCPB的細(xì)胞進(jìn)行收集。誘導(dǎo)mCPB變?yōu)榛钚詍CPB有兩種途徑，一是通過低溫誘導(dǎo)，從細(xì)胞中回收上清表達(dá)的突變CPB，經(jīng)體外處理和純化可得到活性突變CPB?；蛘邚募?xì)胞中回收包涵體表達(dá)的突變CPB，在突變CPB可折疊的條件下經(jīng)過變性和復(fù)性處理回收的CPB，使其具有酶活性。
在上清表達(dá)的低溫誘導(dǎo)方案中，可在培養(yǎng)基中加入適量ZnCl2，低溫誘導(dǎo)使其上清表達(dá)，從重組細(xì)胞中回收突變CPB包括破壞重組體細(xì)胞的細(xì)胞壁或其片段以產(chǎn)生細(xì)胞裂解產(chǎn)物，離心分離細(xì)胞裂解產(chǎn)物中的上清物質(zhì)，然后調(diào)節(jié)pH，加入適量ZnCl2，純化該上清液，即可得純化的活性突變CPB。
在另一個優(yōu)選方案中，可從重組細(xì)胞中回收突變PCPB包括破壞重組體細(xì)胞的細(xì)胞壁或其片段以產(chǎn)生細(xì)胞裂解產(chǎn)物，離心分離細(xì)胞裂解產(chǎn)物中的上清，然后在合適比例的胰蛋白酶激活可得具酶活性的突變CPB。
可選擇合適的方法來對突變PCPB和突變CPB進(jìn)行變性和復(fù)性選擇合適的變性條件要使包涵體成為有活性的蛋白，第一步就必須使包涵體溶解。有許多方法被用來溶解包涵體，但是，選擇一種合適的溶解試劑，對于后續(xù)的復(fù)性過程極為重要?？梢圆捎枚喾N條件，包括變性劑(8M尿素、6M鹽酸胍)、去污劑、極端酸堿、高溫等條件對重組突變PCPB的包涵體進(jìn)行變性溶解。發(fā)明人采用10M尿素實(shí)現(xiàn)了非常好的復(fù)性和變性效果。
合適的變性條件的前提為①選擇盡量溫和的變性條件(如盡可能低的變性劑濃度)，得到較好的包涵體的溶解性，不破壞氨基酸的結(jié)構(gòu)，盡量保持蛋白表達(dá)初期部分形成的二級結(jié)構(gòu)，因?yàn)楦邼舛鹊淖冃詣?yán)重破壞蛋白質(zhì)的二級結(jié)構(gòu)，這對于隨后的復(fù)性效率的提高可能非常重要。
②采用還原變性的方法，即在變性劑中加入還原試劑如DTT，β-巰基乙醇等用以打開因包涵體形成過程中重組蛋白內(nèi)部、重組蛋白之間以及重組蛋白與菌體蛋白之間形成的二硫鍵，使重組蛋白充分打開呈松散的單體狀態(tài)。
復(fù)性方法可采用不同的復(fù)性方法對變性溶解突變體蛋白進(jìn)行復(fù)性，可采用的復(fù)性方法有稀釋復(fù)性法、柱復(fù)性法等，對于稀釋復(fù)性，可通過優(yōu)化復(fù)性液組成，達(dá)到提高復(fù)性率的目的。
另外，相對于8M尿素還原變性方法，可以選擇下列兩種方案間歇加樣復(fù)性實(shí)現(xiàn)復(fù)性液的高濃度和高復(fù)性率；優(yōu)化稀釋復(fù)性液直接稀釋法可對突變PCPB、突變CPB進(jìn)行。
相對于弱堿性低濃度變性劑的還原變性方法，采用pH分段復(fù)性法偶聯(lián)疏水層析復(fù)性及對復(fù)性蛋白的純化，先在PH11條件下，蛋白質(zhì)的構(gòu)像為松散結(jié)構(gòu)，使二硫鍵正確配對，之后調(diào)整pH8條件下進(jìn)一步復(fù)性，使二級結(jié)構(gòu)、三級結(jié)構(gòu)都復(fù)性接近天然態(tài)。決定氧化重折疊效率或復(fù)性率的關(guān)鍵是折疊后期肽鏈的構(gòu)象。另外，含有二硫鍵的蛋白質(zhì)，是否與強(qiáng)堿性條件有利于保持肽鏈的柔性構(gòu)象有關(guān)。加入固體硫酸銨或者加入高濃度的硫酸銨，上疏水層析柱，梯度洗脫，或者分段洗脫，收集洗脫蛋白峰，測活，透析脫鹽，或者脫鹽柱脫鹽后，電泳，測活。如有必要，DEAE-FF陰離子交換柱對流加上樣的羧肽酶B的吸附、濃縮，洗脫，收集。
實(shí)施例所用培養(yǎng)基及菌株、質(zhì)粒LB培養(yǎng)液1％蛋白胨(Difco)，0.5％酵母提取物(Difco)，1％NaCl，pH7.0；LB平板LB培養(yǎng)液，加瓊脂粉至濃度為1.5-2.0％；菌株BL21(DE3)F-，ompT，HsdSB，(rB-，mB-)，dcm，gal，λ(DE3)DH5αφ80dlacZΔM15，recA1，endAl，gyrA96，thi-1，
hsdR17(rk-，mk+)，supE44，relA1，deoR，Δ(lacZYA-argF)U169質(zhì)粒pET-21a，pET-22a來源于invitrogen實(shí)施例1mCPB/mPCPB表達(dá)質(zhì)粒pET-mCPB/pET-mPCPB的構(gòu)建I.mPCPB基因來源于已構(gòu)建好含有羧肽酶原B基因的質(zhì)粒pET-21a-pCPB，該基因?yàn)橥ㄟ^RT-PCR的方法從Wistar大鼠的胰腺獲得，經(jīng)定點(diǎn)突變后獲得。(如圖1所示)。
PCR擴(kuò)增mCPB/mPCPB基因，克隆中使用的三個引物的DNA核苷酸序列分別為PCPB的5’端引物和3’端引物(引物1(SEQ ID NO3)和引物3(SEQ IDNO5))；CPB的5’端引物和3’端引物(引物2(SEQ ID NO4)和引物3(SEQID NO5))，并用另一個反義引物引入Hind III限制性位點(diǎn)后的終止密碼子(SEQ ID NO6)。分別引入Nco I/Hind III雙酶切位點(diǎn)、和Nco I/Hind III雙酶切位點(diǎn)以及終止密碼子。
引物1pCPB有義引物，5’-GCG GGA TCC CAT GCT TCC GAGGAG CAC TTT GAT GGC---3’(SEQ ID NO3)EcoR I限制位點(diǎn)；引物2CPB有義引物，5’-GCG CAT ATG GCA ACG GGA CAC AGC TAC ACCAAG TAC-3’(SEQ ID NO4)，編碼Nde I限制性位點(diǎn)后的CPB N末端的開始9個氨基酸；反義引物，3’-TTA ATA CAG GCT CTT CTA GAT ATA ATC ACT TTCAAG GGC-5’(SEQ ID NO5)，引物3反義引物，5’-CGC AAG CTT TCA CTA ATA TAG ATG TTCTCG GAC ATA ATT-3’，Hind III限制性位點(diǎn)后的終止密碼子(SEQ IDNO6)。
PCR擴(kuò)增條件如下1.3’端引物1μg2.5’端引物1μg3.模板pT7-473-pCPB(稀釋后) 5μl4.10×緩沖液 5μl5.10mM dNTPs 1μl6.50mM MgSO42μl
7.Taq聚合酶I1.5u8.滅菌雙蒸水ddH2O 加至50μl94℃×2min；92℃×1.5min，53℃×1.5min，72℃×1.5min，40循環(huán)；72℃×15min，反應(yīng)完成后，4℃保存。結(jié)果如圖2所示。
PCR產(chǎn)物用1％低熔點(diǎn)瓊脂糖凝膠電泳鑒定，回收940bp/1200bp處的條帶，雙酶切后，連接入同樣酶切的表達(dá)載體pET-22a，轉(zhuǎn)化感受態(tài)細(xì)胞DH5α，質(zhì)粒小量抽提，雙酶切鑒定，(結(jié)果如圖3，圖4，圖5所示)。測序，測序結(jié)果用BLAST程序與Genbank上的大鼠胰臟來源的pCPB對照證實(shí)(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/)。BLAST的結(jié)果表明，與Genbank登錄號P19223上收錄的大鼠的pCPB基因相比有5個核苷酸不同，導(dǎo)致2個氨基酸的差異，其中Lys11變?yōu)锳sn11，Arg139變?yōu)镚lu139。圖1還顯示了突變的核苷酸和相應(yīng)的氨基酸位點(diǎn)，C288→S288，以灰色框表示。
實(shí)施例2誘導(dǎo)表達(dá)突變體SDS-PAGE進(jìn)行重組突變mPCPB克隆的篩選I.培養(yǎng)基經(jīng)轉(zhuǎn)化后，帶有重組質(zhì)粒pET-mPCPB的大腸桿菌BL21(DE3)可在含氨芐青霉素(100μg/ml)的固體LB培養(yǎng)基上生長。
II.接種物挑取單菌落于5ml LB(含100μg/ml氨芐青霉素)液體培養(yǎng)基中，37℃，搖菌過夜；過夜菌按1％接種于含250ml LB氨芐青霉素抗性培養(yǎng)液中，37℃，搖菌至600nm下OD為0.3～0.5，0.5mM IPTG誘導(dǎo)，調(diào)節(jié)溫度至相應(yīng)溫度，誘導(dǎo)后3～5小時，離心收集菌體。
III.表達(dá)情況分析將誘導(dǎo)前及誘導(dǎo)后的菌體離心，棄上清，沉淀菌體中加入電泳上樣緩沖液，煮沸10min，離心，上清進(jìn)行變性聚丙烯酰氨凝膠電泳(SDS-PAGE)分析。分別與誘導(dǎo)前相對照，含有重組質(zhì)粒的經(jīng)IPTG誘導(dǎo)后又相應(yīng)蛋白條帶(43KD)表達(dá)，結(jié)果顯示菌株2和3為陽性克隆，菌株1為陰性克隆。結(jié)果如附圖6所示。
實(shí)施例3誘導(dǎo)表達(dá)突變體SDS-PAGE進(jìn)行重組突變mCPB克隆的篩選篩選方法與實(shí)施例2相同。結(jié)果如附圖7所示。
分別與誘導(dǎo)前相對照，含有重組質(zhì)粒的經(jīng)0.5mM IPTG誘導(dǎo)后又相應(yīng)蛋白條帶(35KD)表達(dá)，結(jié)果顯示菌株1和3為陽性克隆，菌株2為陰性克隆。
實(shí)施例4SDS-PAGE分析比較重組突變mPCPB和mCPB與原始菌株(未突變菌株)PCPB的在37℃和12℃表達(dá)量的差異。
誘導(dǎo)表達(dá)條件如實(shí)施例2所述，唯一不同是誘導(dǎo)后的培養(yǎng)溫度為37℃和12℃，目的是觀察不同溫度下的表達(dá)量的不同。
由附圖8所示的電泳結(jié)果可知，C288-S288的氨基酸突變不但沒有使表達(dá)量降低，反而使目的蛋白在重組菌中的相對表達(dá)量升高，這可能與游離半胱氨酸的突變降低了菌體細(xì)胞內(nèi)的還原環(huán)境對與外源蛋白表達(dá)的限制作用。同時也說明了突變技術(shù)應(yīng)用的可行性。
實(shí)施例5培養(yǎng)基中的Zn2+加入對于突變mPCPB在37℃條件下表達(dá)的影響培養(yǎng)及誘導(dǎo)表達(dá)條件如實(shí)施例2所述。將誘導(dǎo)誘導(dǎo)后的菌體離心，加入pH8的Tris-HCl緩沖液將菌體重新懸浮，超聲破碎后，離心，對離心后的上清和沉淀中分別加入電泳上樣緩沖液，煮沸10分鐘，離心，上清進(jìn)行變性聚丙烯酰氨凝膠電泳(SDS-PAGE)分析或者非還原的SDS-PAGE分析(加入的電泳上樣緩沖液不含有β-巰基乙醇)。結(jié)果如附圖9A和附圖9B所示。
由電泳圖分析可得如下結(jié)果說明Zn2+加入有利于突變mPCPB正確構(gòu)象的形成。培養(yǎng)基中的Zn2+加入有利于降低突變mPCPB聚集體的形成。
實(shí)施例6培養(yǎng)基中的Zn2+加入對于突變mPCPB在12℃條件下表達(dá)的影響培養(yǎng)及誘導(dǎo)表達(dá)條件如實(shí)施例2所述，唯一不同是誘導(dǎo)后的培養(yǎng)溫度為12℃，而不是37℃，目的是為了獲得降低溫度后的可溶性表達(dá)。
將誘導(dǎo)誘導(dǎo)后的菌體離心，加入pH8的Tris-HCl緩沖液將菌體重新懸浮，超聲破碎后，離心，對離心后的上清和沉淀中分別加入電泳上樣緩沖液，煮沸10min，離心，上清進(jìn)行變性聚丙烯酰氨凝膠電泳(SDS-PAGE)分析或者非還原的SDS-PAGE分析(加入的電泳上樣緩沖液不含有β-巰基乙醇)。結(jié)果如附圖10A和附圖10B所示。
由電泳圖分析可得如下結(jié)果I.降低誘導(dǎo)后培養(yǎng)溫度可獲得突變mPCPB的可溶性表達(dá)。
II.培養(yǎng)基中的Zn2+加入有利于突變mPCPB的可溶性表達(dá)，與不加Zn2+的培養(yǎng)條件相比，可溶性的表達(dá)量上升了1倍多。培養(yǎng)基中加入Zn2+基本都是可溶性的上清表達(dá)形式。而不加Zn2+的培養(yǎng)條件，僅可得到不到1/2的重組蛋白的可溶性表達(dá)。說明Zn2+加入有利于突變mPCPB正確構(gòu)象的形成。
III.培養(yǎng)基中的Zn2+加入有利于降低突變mPCPB聚集體的形成。
實(shí)施例7.上清表達(dá)的突變CPB活性直接測定12℃上清中表達(dá)的突變CPB的活性，并加入不同濃度Zn2+進(jìn)行體外活化，得到如表1所示的結(jié)果。可幫助折疊成活性狀態(tài)。
表1.不同濃度ZnCl2對上清中突變CPB活性的作用
實(shí)施例8上清表達(dá)的突變pCPB的活化及活性測定對于12℃上清中表達(dá)的突變pCPB，加入不同質(zhì)量比例的胰蛋白酶進(jìn)行體外活化，測定激活后的上清中的活性，得到如表2所示的結(jié)果。
表2.不同質(zhì)量比例的胰蛋白酶對PCPB進(jìn)行體外活化作用
等效例本領(lǐng)域中熟練技術(shù)人員使用常規(guī)實(shí)驗(yàn)方法將會認(rèn)識，或能夠確定，本文所述的本發(fā)明具體實(shí)施例的許多等效例。這些等效例應(yīng)包括在權(quán)利要求書所規(guī)定的本發(fā)明的范圍中。
序列表<110>華東理工大學(xué)<120>突變羧肽酶原B及突變羧肽酶B的生產(chǎn)方法<130>071196<160>6<170>PatentIn version 3.3<210>1<211>402<212>PRT<213>人工序列<400>1His Ala Ser Glu Glu His Phe Asp Gly Asn Arg Val Tyr Arg Val Ser1 5 10 15Val His Gly Glu Asp His Val Asn Leu Ile Gln Glu Leu Ala Asn Thr20 25 30Lys Glu Ile Asp Phe Trp Lys Pro Asp Ser Ala Thr Gln Val Lys Pro35 40 45Leu Thr Thr Val Asp Phe His Val Lys Ala Glu Asp Val Ala Asp Val50 55 60Glu Asn Phe Leu Glu Glu Asn Glu Val His Tyr Glu Val Leu Ile Ser65 70 75 80Asn Val Arg Asn Ala Leu Glu Ser Gln Phe Asp Ser His Thr Arg Ala85 90 95Ser Gly His Ser Tyr Thr Lys Tyr Asn Asn Trp Glu Thr Ile Glu Ala100 105 110Trp Ile Gln Gln Val Ala Thr Asp Asn Pro Asp Leu Val Thr Gln Ser115 120 125Val Ile Gly Thr Thr Phe Glu Gly Arg Asn Met Tyr Val Leu Lys Ile130 135 140Gly Lys Thr Arg Pro Asn Lys Pro Ala Ile Phe Ile Asp Cys Gly Phe145 150 155 160
His Ala Arg Glu Trp Ile Ser Pro Ala Phe Cys Gln Trp Phe Val Arg165 170 175Glu Ala Val Arg Thr Tyr Asn Gln Glu Ile His Met Lys Gln Leu Leu180 185 190Asp Glu Leu Asp Phe Tyr Val Leu Pro Val Val Asn Ile Asp Gly Tyr195 200 205Val Tyr Thr Trp Thr Lys Asp Arg Met Trp Arg Lys Thr Arg Ser Thr210 215 220Met Ala Gly Ser Ser Cys Leu Gly Val Asp Pro Asn Arg Asn Phe Asn225 230 235 240Ala Gly Trp Cys Glu Val Gly Ala Ser Arg Ser Pro Cys Ser Glu Thr245 250 255Tyr Cys Gly Pro Ala Pro Glu Ser Glu Lys Glu Thr Lys Ala Leu Ala260 265 270Asp Phe Ile Arg Asn Asn Leu Ser Thr Ile Lys Ala Tyr Leu Thr Ile275 280 285His Ser Tyr Ser Gln Met Met Leu Tyr Pro Tyr Ser Tyr Asp Tyr Lys290 295 300Leu Pro Glu Asn Tyr Glu Glu Leu Asn Ala Leu Val Lys Gly Ala Ala305 310 315 320Lys Glu Leu Ala Thr Leu His Gly Thr Lys Tyr Thr Tyr Gly Pro Gly325 330 335Ala Thr Thr Ile Tyr Pro Ala Ala Gly Gly Ser Asp Asp Trp Ser Tyr340 345 350Asp Gln Gly Ile Lys Tyr Ser Phe Thr Phe Glu Leu Arg Asp Thr Gly355 360 365Phe Phe Gly Phe Leu Leu Pro Glu Ser Gln Ile Arg Gln Thr Ser Glu370 375 380Glu Thr Met Leu Ala Val Lys Tyr Ile Ala Asn Tyr Val Arg Glu His385 390 395 400Leu Tyr<210>2<211>1209<212>DNA<213>人工序列
<400>2catgcttccg aggagcactt tgatggcaac cgggtgtacc gtgtcagtgt acatggtgaa60gatcacgtca acttaattca ggagctagcc aacaccaaag agattgattt ctggaaacca120gattctgcta cacaagtgaa gcctctcact acagttgact ttcatgttaa agcagaagat180gttgctgatg tggagaactt tctggaggag aatgaagttc actatgaggt actgataagc240aacgtgagaa atgctctgga atcccagttt gatagccaca cccgtgcaag tggacacagc300tacaccaagt acaacaactg ggaaacgatt gaggcgtgga ttcaacaagt tgccactgat360aatccagacc ttgtcactca gagcgtcatt ggaaccacat ttgaaggacg taacatgtat420gtcctcaaga ttggcaaaac tagaccgaat aagcctgcca tcttcatcga ttgtggtttc480catgcaagag agtggatttc tcctgcattc tgtcagtggt ttgtgagaga ggctgtccgt540acctataatc aagagatcca catgaaacag cttctagatg aactggattt ctatgttctg600cctgtggtca acattgatgg ctatgtctac acctggacta aggacagaat gtggagaaaa660acccgctcta ctatggctgg aagttcctgc ttgggtgtag accccaacag gaattttaat720gctggctggt gtgaagtggg agcttctcgg agtccctgct ctgaaactta ctgtggacca780gccccagagt ctgaaaaaga gacaaaggcc ctggcagatt tcatccgcaa caacctctcc840accatcaagg cctacctgac catccactca tactcacaga tgatgctcta cccttactcc900tatgactaca aactgcctga gaactatgag gaattgaatg ccctggtgaa aggtgcggca960aaggagcttg ccactctgca tggcaccaag tacacatatg gcccaggagc tacaacaatc1020tatcctgctg ctgggggatc tgacgactgg tcttatgatc agggaatcaa atattccttt1080acctttgaac tccgggatac aggcttcttt ggctttctcc ttcctgagtc tcagatccgc1140cagacctctg aggagacaat gcttgcagtc aagtacattg ccaattatgt ccgagaacat1200ctatattag1209<210>3<211>36<212>DNA<213>引物<400>3gcgggatcccatgcttccga ggagcacttt gatggc36<210>4<211>36<212>DNA<213>引物<400>4
gcgcatatggcaacgggacacagctacaccaagtac36<210>5<211>39<212>DNA<213>引物<400>5ttaatacaggctcttctagatataatcactttcaagggc39<210>6<211>39<212>DNA<213>引物<400>6cgcaagctttcactaatatagatgttctcggacataatt39
權(quán)利要求
1.一種突變的羧肽酶B或相應(yīng)的羧肽酶原B，其特征在于，所述的羧肽酶B或羧肽酶原B在對應(yīng)于天然羧肽酶原B氨基酸序列第288位的半胱氨酸被除半胱氨酸之外的天然氨基酸所取代，并且所述的羧肽酶B基本上保留天然羧肽酶B的活性。
2.如權(quán)利要求1所述的羧肽酶B或相應(yīng)的羧肽酶原B，其特征在于，所述羧肽酶原B具有SEQ ID NO1的氨基酸序列，其中Cyt288被選自甘氨酸、丙氨酸、纈氨酸、亮氨酸、異亮氨酸、苯丙氨酸、酪氨酸、色氨酸、甲硫氨酸、絲氨酸、蘇氨酸、賴氨酸、精氨酸、組氨酸、天冬酰胺、谷氨酰胺、天冬氨酸、谷氨酸的氨基酸替換。
3.一種多核苷酸，其特征在于，它編碼權(quán)利要求1所述的羧肽酶B或羧肽酶原B。
4.如權(quán)利要求3所述的多核苷酸，其特征在于，所述多核苷酸的序列為SEQID NO2的核苷酸序列。
5.一種表達(dá)載體，其特征在于，它含有權(quán)利要求3所述的多核苷酸。
6.一種宿主細(xì)胞，其特征在于，它含有權(quán)利要求5所述的表達(dá)載體，或者在基因組中整合有權(quán)利要求3所述的多核苷酸。
7.如權(quán)利要求6所述的宿主細(xì)胞，其特征在于，所述宿主細(xì)胞是大腸桿菌。
8.一種生產(chǎn)重組羧肽酶B或羧肽酶原B的方法，其特征在于，該方法包括步驟(a)培養(yǎng)權(quán)利要求6所述的宿主細(xì)胞，從而表達(dá)出權(quán)利要求1所述的突變的羧肽酶B或羧肽酶原B；(b)從培養(yǎng)物中分離出步驟(a)中所表達(dá)的突變的羧肽酶B或羧肽酶原B。
9.如權(quán)利要求8所述的方法，其特征在于，所述的宿主細(xì)胞為大腸桿菌，并且羧肽酶B或羧肽酶原B以包涵體形式表達(dá)，并且該方法還包括步驟(c)對分離的羧肽酶B或羧肽酶原B通過變性和復(fù)性而獲得酶活性。
10.一種權(quán)利要求1所述的突變羧肽酶B或羧肽酶原B的用途，其特征在于，用作從胰島素原制備胰島素的工具酶，或用于蛋白測序、制備診斷胰腺炎的試劑或試劑盒。
全文摘要
公開了一種突變的羧肽酶B或相應(yīng)的羧肽酶原B，其在對應(yīng)于天然羧肽酶原B氨基酸序列第288位的半胱氨酸被除半胱氨酸之外的天然氨基酸所取代，并且所述的羧肽酶B基本上保留天然羧肽酶B的活性。還公開了編碼它的多核苷酸、表達(dá)載體、宿主細(xì)胞，以及生產(chǎn)重組羧肽酶B或羧肽酶原B的方法，還公開了該突變羧肽酶B或羧肽酶原B用作從胰島素原制備胰島素的工具酶，或用于蛋白測序、制備診斷胰腺炎的試劑或試劑盒的用途。
文檔編號G01N33/573GK101058805SQ20071006463
公開日2007年10月24日 申請日期2007年3月21日 優(yōu)先權(quán)日2007年3月21日
發(fā)明者李素霞, 王福清, 袁勤生 申請人:北京貫虹科技有限公司, 華東理工大學(xué)