專利名稱：檢測新霉素藥物的酶聯(lián)免疫試劑盒及方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及免疫學(xué)檢測領(lǐng)域，具體地說，涉及一種檢測動(dòng)物源性食品中如雞肉、雞肝、豬肉、豬肝、奶粉、雞蛋和飼料新霉素類藥物的酶聯(lián)免疫試劑盒及其檢測方法。
背景技術(shù)：
新霉素抗菌譜廣，對革蘭氏陽性菌和結(jié)核桿菌均有良好的抑制作用。作為一種常用獸藥在畜牧業(yè)生產(chǎn)中得到廣泛使用。獸醫(yī)臨床上，新霉素主要用于治療畜禽細(xì)菌性腸炎。在畜禽養(yǎng)殖上，可提高飼料利用率，促進(jìn)動(dòng)物生長，但因其毒性較大，在動(dòng)物性食品中的殘留可對消費(fèi)者產(chǎn)生較大的潛在危害，對食品衛(wèi)生和公共健康產(chǎn)生了威脅。
檢測新霉素殘留量的化學(xué)方法主要有薄層色譜法(TLC)、高效液相色譜法(HPLC)、毛細(xì)管電泳(CE)等，由于復(fù)雜的儀器設(shè)備和繁瑣的過程，不適合現(xiàn)場監(jiān)控和大量樣本篩查。

發(fā)明內(nèi)容
(一)要解決的技術(shù)問題本發(fā)明的目的在于提供一種結(jié)構(gòu)簡單、使用方便、價(jià)格便宜、便于攜帶的用于動(dòng)物源性食品中新霉素藥物的酶聯(lián)免疫試劑盒，并提供一種高效、準(zhǔn)確、簡便、適于大批量樣品篩選的定性、定量檢測方法。
本檢測試劑盒的主要內(nèi)容物采用了方便使用的工作液形式，工作液保存性及穩(wěn)定性好，克服了大多數(shù)本領(lǐng)域產(chǎn)品的技術(shù)問題；本試劑盒采用的檢測方法提供了多種樣本的回收方法，可用于多種樣本的檢測。
(二)技術(shù)方案本發(fā)明的檢測原理為當(dāng)在酶標(biāo)板微孔條上預(yù)包被新霉素偶聯(lián)包被抗原時(shí)，加入樣本溶液或標(biāo)準(zhǔn)品溶液后，再加入新霉素特異性抗體溶液，樣本中殘留的新霉素藥物或新霉素標(biāo)準(zhǔn)品與酶標(biāo)板上包被的新霉素偶聯(lián)抗原競爭新霉素特異性抗體，加入酶標(biāo)記抗抗體進(jìn)行放大作用，用顯色液顯色，樣本吸光值與樣本中的新霉素藥物的含量呈負(fù)相關(guān)，與標(biāo)準(zhǔn)曲線比較即可得出樣本中新霉素的殘留含量。同時(shí)也可根據(jù)酶標(biāo)板上的顏色的深淺，與系列濃度的新霉素標(biāo)準(zhǔn)品溶液顏色的比較可粗略判斷樣品中新霉素殘留量的濃度范圍。
當(dāng)在微孔條上預(yù)包被新霉素特異性抗體時(shí)，加入樣本溶液或標(biāo)準(zhǔn)品溶液后，再加入酶標(biāo)記新霉素抗原溶液，樣本中殘留的新霉素藥物或新霉素標(biāo)準(zhǔn)品與酶標(biāo)記抗原競爭包被在酶標(biāo)板上的新霉素特異性抗體，用顯色液顯色，樣本吸光值與樣本中的新霉素藥物的含量呈負(fù)相關(guān)，與標(biāo)準(zhǔn)曲線比較即可得出樣本中新霉素的殘留含量。同時(shí)也可根據(jù)酶標(biāo)板上的顏色的深淺，與系列濃度的新霉素標(biāo)準(zhǔn)品溶液顏色的比較可粗略判斷樣品中新霉素殘留量的濃度范圍。
當(dāng)在微孔條上預(yù)包被新霉素偶聯(lián)抗原時(shí)，加入樣本溶液或標(biāo)準(zhǔn)品溶液后，再加入酶標(biāo)記新霉素特異性抗體溶液，樣本中殘留的新霉素藥物或新霉素標(biāo)準(zhǔn)品與酶標(biāo)板上包被的新霉素抗原競爭新霉素特異性抗體，用顯色液顯色，樣本吸光值與樣本中的新霉素藥物的含量呈負(fù)相關(guān)，與標(biāo)準(zhǔn)曲線比較即可得出樣本中新霉素的殘留含量。同時(shí)也可根據(jù)酶標(biāo)板上的顏色的深淺，與系列濃度的新霉素標(biāo)準(zhǔn)品溶液顏色的比較可粗略判斷樣品中新霉素殘留量的濃度范圍。
當(dāng)在微孔條上預(yù)包被抗抗體時(shí)，加入新霉素抗體孵育后，加入樣本溶液或標(biāo)準(zhǔn)品溶液，再加入酶標(biāo)記新霉素抗原溶液，樣本中殘留的新霉素藥物或新霉素標(biāo)準(zhǔn)品與酶標(biāo)記新霉素抗原競爭新霉素特異性抗體，用顯色液顯色，樣本吸光值與新霉素藥物的含量呈負(fù)相關(guān)，與標(biāo)準(zhǔn)曲線比較即可得出樣本中新霉素的殘留含量。同時(shí)也可根據(jù)酶標(biāo)板上的顏色的深淺，與系列濃度的新霉素標(biāo)準(zhǔn)品溶液顏色的比較可粗略判斷樣品中新霉素殘留量的濃度范圍。
本發(fā)明提供了一種用于檢測新霉素藥物的酶聯(lián)免疫試劑盒，它含有(1)包被有包被原的酶標(biāo)板(酶標(biāo)板上包被抗原，酶標(biāo)記物為酶標(biāo)記抗抗體時(shí)或酶標(biāo)板上包被的抗抗體，酶標(biāo)記物為酶標(biāo)記抗原)；(2)酶標(biāo)記物(為酶標(biāo)記抗原、酶標(biāo)記抗體或酶標(biāo)記抗抗體)；
(3)新霉素特異性抗體(酶標(biāo)板上包被抗原，酶標(biāo)記物為酶標(biāo)記抗抗體時(shí)或酶標(biāo)板上包被的抗抗體，酶標(biāo)記物為酶標(biāo)記抗原)；(4)新霉素標(biāo)準(zhǔn)品溶液；(5)底物顯色液；(6)終止液；(7)濃縮洗滌液；(8)濃縮復(fù)溶液。
本發(fā)明所提供的檢測新霉素的酶聯(lián)免疫試劑盒，包括新霉素特異性抗體及包被有包被原的酶聯(lián)板和酶標(biāo)記物；所述酶標(biāo)記物為酶標(biāo)記的抗抗體，酶標(biāo)記新霉素抗原或酶標(biāo)記新霉素特異性抗體；所述抗抗體為羊抗鼠抗抗體或羊抗兔抗抗體。
所述酶標(biāo)記物的標(biāo)記酶為辣根過氧化物酶或堿性磷酸酯酶，其中優(yōu)選辣根過氧化物酶；酶標(biāo)記的羊抗鼠抗抗體或羊抗兔抗抗體是采用戊二醛法或過碘酸鈉法將標(biāo)記酶與抗抗體進(jìn)行偶聯(lián)得到的，辣根過氧化物酶可采用現(xiàn)有技術(shù)中的多種方法將其與抗抗體進(jìn)行偶聯(lián)，如戊二醛法，過碘酸鈉法等，本發(fā)明經(jīng)過長期的勞動(dòng)創(chuàng)造將過碘酸鈉法進(jìn)行了改良，使其省時(shí)、降低辣根過氧化物酶(HRP)與抗抗體的濃度比率，節(jié)省了原材料。
所述新霉素特異性抗體可為新霉素單克隆抗體或新霉素多克隆抗體；它們均是用新霉素與載體蛋白采用直接活化蛋白法得到的偶聯(lián)物作為免疫原得到的；所述新霉素多克隆抗體可為鼠源、馬源、羊源、兔源或豚鼠源抗體，所述新霉素單克隆抗體優(yōu)選為新霉素鼠單克隆抗體，所述新霉素多克隆抗體優(yōu)選為新霉素兔多克隆抗體。
以上抗體均可以用新霉素與載體蛋白的偶聯(lián)物作為免疫原按直接活化蛋白法制備。所述載體蛋白可為鼠血清蛋白、甲狀腺蛋白(BCG)、牛血清白蛋白、兔血清蛋白、人血清白蛋白、卵清蛋白或血藍(lán)蛋白等常用載體蛋白；所述新霉素與載體蛋白的偶聯(lián)物可通過將新霉素和載體蛋白用直接活化蛋白法進(jìn)行偶聯(lián)得到。
為了更方便現(xiàn)場監(jiān)控和大量樣本篩查，所述試劑盒還包括新霉素標(biāo)準(zhǔn)品溶液、顯色劑、終止液、濃縮洗滌液、濃縮復(fù)溶液。
所述濃縮洗滌液為0.01M，pH7.4，含有0.8～1.2％吐溫20和0.5‰疊氮化鈉防腐劑的磷酸鹽緩沖液。
所述當(dāng)標(biāo)記酶為辣根過氧化物酶時(shí)，顯色劑由顯色液A液和顯色液B液組成，顯色液A液為過氧化氫或過氧化脲，所述顯色液B液為鄰苯二胺或四甲基聯(lián)苯胺，終止液為1～2mol/L硫酸；當(dāng)標(biāo)記酶為堿性磷酸酯酶時(shí)，顯示液為對硝基苯磷酸酯緩沖液，終止液為2mol/L氫氧化鈉溶液。
所述濃縮復(fù)溶液為含0.01～0.05mol/L、含有1％甲醇的磷酸鹽緩沖液。
其中酶標(biāo)板在制備過程中所用的包被緩沖液為pH9.6，0.05mol/L的碳酸鹽緩沖液；所用的封閉液含有5％胎牛血清的溶液。
本發(fā)明中酶標(biāo)板的制備過程為用包被緩沖液將包被原稀釋成0.1～1μg/ml，每孔加入100μl，37℃溫育2h，再4℃過夜，傾去包被液，用洗滌液洗滌2次，每次30秒，拍干，然后在每孔中加入150-200μl封閉液，37℃溫育1-2h，傾去孔內(nèi)液體拍干，干燥后用鋁膜真空密封保存。
本發(fā)明中抗原的合成過程為1.新霉素抗體的制備新霉素是小分子物質(zhì)，只有免疫反應(yīng)性，沒有免疫原性，不能誘發(fā)機(jī)體產(chǎn)生免疫應(yīng)答，必須與大分子載體蛋白偶聯(lián)后才具有免疫原性。
將新霉素與載體蛋白采用直接活化蛋白法進(jìn)行偶聯(lián)得到免疫原。
將新霉素與載體蛋白采用直接活化蛋白法進(jìn)行偶聯(lián)得到包被原。
2.新霉素鼠單克隆抗體的制備動(dòng)物免疫程序采用Balb/c小鼠作為免疫動(dòng)物，以新霉素與載體蛋白偶聯(lián)物為免疫原，得到較好的多克隆抗體，取出肝臟進(jìn)行細(xì)胞融合。
細(xì)胞融合與克隆化取免疫BALB/c小鼠脾細(xì)胞與SP2/0骨髓瘤細(xì)胞融合，篩選細(xì)胞株，直到得到穩(wěn)定分泌單克隆抗體的雜交瘤細(xì)胞株。
3.新霉素兔多克隆抗體的制備采用新西蘭大白兔作為免疫動(dòng)物，以新霉素與載體蛋白偶聯(lián)物為免疫原對新西蘭大白兔進(jìn)行免疫，多次免疫后測定血清抗體效價(jià)得到多克隆抗體。
本發(fā)明抗抗體的制備過程羊抗鼠抗抗體是以羊作為免疫動(dòng)物，以鼠源抗體為免疫原對無病菌體羊進(jìn)行免疫，得到羊抗鼠抗抗體；羊抗兔抗抗體是以羊作為免疫動(dòng)物，以兔源抗體為免疫原對無病菌體羊進(jìn)行免疫，得到羊抗兔抗抗體。
本發(fā)明所述試劑盒中新霉素標(biāo)準(zhǔn)品溶液標(biāo)準(zhǔn)品溶液6瓶，0μg/L，0.5μg/L，1.5μg/L，4.5μg/L，13.5μg/L，40.5μg/L和3ml/瓶。
本發(fā)明還提供了一種應(yīng)用上述酶聯(lián)免疫試劑盒檢測新霉素藥物的方法，它包括步驟(1)樣品前處理；(2)用試劑盒進(jìn)行檢測；(3)分析檢測結(jié)果。
本發(fā)明提供新霉素在動(dòng)物源性食品如雞肉、雞肝、豬肉、豬肝、奶粉、雞蛋和飼料等樣本中的處理方法。
稱取去除脂肪的粉碎動(dòng)物組織樣本于離心管中，加入PB緩沖液上下混合后，置水浴中加熱，室溫離心，取上清液復(fù)溶，取樣分析；將奶粉樣本置于離心管中，加入PB和正己烷，離心后取下層液體復(fù)溶，取樣分析；將雞蛋樣本打碎，用玻璃棒攪勻防止泡沫的產(chǎn)生；將飼料樣本置于離心管中，加入PBS1，離心后復(fù)溶，取樣分析。
本發(fā)明中用試劑盒檢測是當(dāng)包被原為新霉素偶聯(lián)抗原時(shí)，向酶標(biāo)板微孔中加入標(biāo)準(zhǔn)品溶液或樣本溶液再加入抗體，溫育后洗滌拍干，再加入酶標(biāo)抗抗體，溫育后洗滌拍干，顯色、終止，用酶標(biāo)儀測定吸光度值；當(dāng)包被原為新霉素偶聯(lián)抗原時(shí)，向酶標(biāo)板微孔中加入標(biāo)準(zhǔn)品溶液或樣本溶液再加入酶標(biāo)記抗體，溫育后洗滌拍干，顯色、終止，用酶標(biāo)儀測定吸光度值。
當(dāng)包被原為新霉素特異性抗體時(shí)，向酶標(biāo)板微孔中加入標(biāo)準(zhǔn)品溶液或樣本溶液再加入酶標(biāo)記新霉素抗原，溫育后洗滌拍干，顯色、終止，用酶標(biāo)儀測定吸光度值；當(dāng)包被原為抗抗體時(shí)，向酶標(biāo)板微孔中加入新霉素抗體，溫育后洗滌拍干，再加入標(biāo)準(zhǔn)品溶液或樣品溶液后加入酶標(biāo)新霉素抗原，溫育后洗滌拍干，顯色、終止，用酶標(biāo)儀測定吸光度值。
本發(fā)明中檢測結(jié)果分析過程為用所獲得的每個(gè)濃度的標(biāo)準(zhǔn)品溶液的吸光度平均值(B)除以第一個(gè)標(biāo)準(zhǔn)溶液(0標(biāo)準(zhǔn))的吸光度值(B0)再乘以100％，即百分吸光度值。計(jì)算公式為百分吸光度值(％)＝(B/B0)×100％以新霉素標(biāo)準(zhǔn)品溶液的濃度(μg/L)的半對數(shù)值為X軸，百分吸光度值為Y軸，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線圖。用同樣的辦法計(jì)算樣品溶液的百分吸光度值，相對應(yīng)每一個(gè)樣品的濃度則可從標(biāo)準(zhǔn)曲線上讀出樣本中新霉素的殘留量。
本發(fā)明中檢測結(jié)果的分析也可以采用回歸方程法，計(jì)算出樣品溶液濃度。
本發(fā)明中檢測結(jié)果的分析還可以利用計(jì)算機(jī)專業(yè)軟件，此法更便于大量樣品的快速分析，整個(gè)檢測過程只需1小時(shí)可以完成，最低檢測限為0.5μg/L。
(三)有益效果本發(fā)明檢測新霉素的酶聯(lián)免疫試劑盒主要采用間接競爭ELISA方法定性或定量檢測樣品中新霉素的殘留量；對樣品的前處理要求低，樣品前處理過程簡單，能同時(shí)快速檢測大批樣品；采用高特異性的新霉素單克隆抗體，主要試劑以工作液的形式提供，檢驗(yàn)方法方便易行，具有特異性高、靈敏度高、精確度高、準(zhǔn)確度高等特點(diǎn)。本發(fā)明的酶聯(lián)免疫試劑盒，結(jié)構(gòu)簡單、使用方便、價(jià)格便宜、攜帶便利，檢測方法高效、準(zhǔn)確、簡便、適于大批量樣品篩選的定性、定量。本發(fā)明的試劑盒將在新霉素的檢測中發(fā)揮重要作用。本發(fā)明的方法高效、準(zhǔn)確、簡便、適于大批量樣品篩選的定性、定量檢測。


圖1新霉素的檢測標(biāo)準(zhǔn)曲線圖。
具體實(shí)施例方式
下面結(jié)合具體的實(shí)施例來進(jìn)一步闡述本發(fā)明。應(yīng)理解，這些實(shí)施例僅用于說明本發(fā)明，而不用來限制本發(fā)明的范圍。
實(shí)施例1試劑盒組分的制備1.抗原的合成a.新霉素免疫抗原的合成將新霉素與牛血清白蛋白采用直接活化蛋白法進(jìn)行偶聯(lián)得到免疫原。
免疫原的制備過程取牛血清白蛋白18mg用1ml水溶解(I液)；取EDC20mg用0.5ml水溶解后加入溶液(I液)中，攪拌反應(yīng)30min；取硫酸新霉素5mg用1.5ml水溶解后加入溶液(II液)中，攪拌反應(yīng)過夜，得到免疫原。
b.包被原新霉素偶聯(lián)抗原的制備將新霉素與甲狀腺蛋白采用直接活化蛋白法進(jìn)行偶聯(lián)得到包被原。
包被原的制備過程取BCG蛋白18mg用1ml水溶解(I液)；取EDC20mg用0.5ml水溶解后加入溶液(I液)中，攪拌反應(yīng)30min；取硫酸新霉素5mg用1.5ml水溶解后加入溶液(II液)中，攪拌反應(yīng)過夜，得到包被原。
2.單克隆抗體的制備a.動(dòng)物免疫將免疫原注入到Balb/c小鼠體內(nèi)，免疫劑量為100μg/只，使其產(chǎn)生多克隆抗體。
b.細(xì)胞融合和克隆化取免疫Balb/c小鼠脾細(xì)胞，按5∶1比例與SP2/0骨髓瘤細(xì)胞融合，得到單克隆抗體的雜交瘤細(xì)胞株。
c.細(xì)胞凍存和復(fù)蘇將雜交瘤細(xì)胞用凍存液制成1×106個(gè)/ml的細(xì)胞懸液，在液氮中長期保存。復(fù)蘇時(shí)取出凍存管，立即放入37℃水浴中速融，離心去除凍存液后，移入培養(yǎng)瓶內(nèi)培養(yǎng)。
d.單克隆抗體的制備與純化將Balb/c小鼠腹腔注入滅菌石蠟油0.4ml/只，7天后腹腔注射雜交瘤細(xì)胞5×105個(gè)/只，7天后采集腹水。用辛酸-飽和硫酸銨法進(jìn)行腹水純化，-20℃保存。
3.多克隆抗體的制備采用新西蘭大白兔作為免疫動(dòng)物，以新霉素與卵清蛋白偶聯(lián)物為免疫原，免疫劑量為1.5mg/kg，首免時(shí)將免疫原與等量的弗氏完全佐混合制成乳化劑，頸背部皮下多點(diǎn)注射，間隔3～4周取相同劑量免疫原加等量弗氏不完全佐劑混合乳化，加強(qiáng)免疫一次，共免疫5次，最后一次不加佐劑。最后一次免疫10天后采血，測定血清抗體效價(jià)，心臟采血，用硫酸銨分級沉淀得到純化的多克隆抗體。
4.羊抗鼠抗抗體的制備過程以羊作為免疫動(dòng)物，以鼠源抗體為免疫原對無病原體羊進(jìn)行免疫，得到羊抗鼠抗抗體；羊抗兔抗抗體的制備以羊作為免疫動(dòng)物，以兔源抗體為免疫原對無病原體羊進(jìn)行免疫，得到羊抗兔抗抗體。
5.酶標(biāo)板的制備用包被緩沖液將新霉素偶聯(lián)抗原、抗體或抗抗體稀釋成0.1-1μg/ml，每孔加入100μl，37℃溫育2h或4℃過夜，傾去包被液，用稀釋20倍的濃縮洗滌液洗滌2次，每次30秒，拍干，然后在每孔中加入200μl封閉液，37℃溫育2h，傾去孔內(nèi)液體，干燥后用鋁膜真空密封保存。
6.酶標(biāo)記羊抗鼠抗抗體的置備將抗抗體與辣根過氧化物酶(HRP)采用改良后的過碘酸鈉法進(jìn)行偶聯(lián)。傳統(tǒng)的過碘酸鈉法要求反映體系中酶與抗抗體的摩爾濃度比為4∶1；由于辣根過氧化物酶在強(qiáng)氧化的作用下產(chǎn)生許多與抗抗體結(jié)合的位點(diǎn)，這樣活化的辣根過氧化物酶分子充當(dāng)了連接各分子的橋梁，降低了酶標(biāo)記物的酶活性，使制備的偶聯(lián)物中混有許多聚合體，為了解決這個(gè)問題，我們將傳統(tǒng)的方法進(jìn)行了改良，即1)省去了氨基的封閉過程，因?yàn)槟墚a(chǎn)生自身氨基連接的氨基實(shí)際很少。
2)降低了辣根過氧化物酶抗抗體的摩爾濃度比率至2∶1，改良后的方法比傳統(tǒng)的方法簡便，對酶的活性的損失減少。
實(shí)施例2檢測新霉素的酶聯(lián)免疫試劑盒的組建組建檢測新霉素的酶聯(lián)免疫試劑盒，使其包含下述組分(1)包被抗新霉素抗體的酶標(biāo)板；(2)用辣根過氧化物酶標(biāo)記的羊抗鼠抗抗體；(3)新霉素單抗體工作液；(4)新霉素標(biāo)準(zhǔn)品溶液6瓶，濃度分別為0μg/L、0.5μg/L、1.5μg/L、4.5μg/L、13.5μg/L、40.5μg/L；(5)底物顯色液由A液和B液組成，底物顯色液A液為過氧化脲，底物顯色液B液為四甲基聯(lián)苯胺；(6)終止液為2mol/L鹽酸；(7)濃縮洗滌液為0.01M，pH7.4，含有0.8～1.2％吐溫20和0.5‰疊氮化鈉防腐劑的磷酸鹽緩沖液；(8)濃縮復(fù)溶液為0.01～0.05mol/L、含有1％甲醇的磷酸鹽緩沖液。
實(shí)施例3樣品中新霉素殘留的檢測1.樣品前處理動(dòng)物組織(雞肉、雞肝、豬肉、豬肝)稱取2.0g均質(zhì)過的組織樣本于50ml離心管中，加入6ml 0.1MPBS(PH＝10～11)緩沖液，充分上下混合10min，放入60℃水浴環(huán)境中60min，取出冷卻至室溫并搖勻，6000g以上，室溫離心10min，取上清夜，以1∶9的體積比進(jìn)行稀釋，取20μl進(jìn)行分析。
2.用試劑盒檢測向包被有抗新霉素抗體的酶標(biāo)板微孔中加入系列標(biāo)準(zhǔn)品溶液或樣品溶液20μl，再加入酶標(biāo)抗原80μl，25℃反應(yīng)30min。倒出孔中液體，每孔加入稀釋后的洗滌液，30s后倒出孔中液體，如此重復(fù)操作共洗板5次，用吸水紙拍干。每孔加入底物顯色液A液過氧化脲，底物顯色液B液四甲基聯(lián)苯胺(TMB)，各50μl輕輕振蕩混勻，25℃恒溫箱避光顯色15～30min。每孔加入終止液50μl，輕輕振蕩混勻，用酶標(biāo)儀波長設(shè)定在450nm處，測定每孔吸光度值(OD值)。
3.檢測結(jié)果分析用所獲得的每個(gè)濃度的標(biāo)準(zhǔn)品溶液的吸光度平均值(B)除以第一個(gè)標(biāo)準(zhǔn)品溶液(0標(biāo)準(zhǔn))的吸光度值(B0)再乘以100％，得到百分吸光度值。以新霉素標(biāo)準(zhǔn)品濃度(μg/L)的半對數(shù)值為X軸，百分吸光度值為Y軸，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線圖。用同樣的辦法計(jì)算樣品溶液的百分吸光度值，相對應(yīng)每一個(gè)樣品的濃度，則可從標(biāo)準(zhǔn)曲線上讀出新霉素的殘留量。
實(shí)施例4樣品中新霉素殘留的檢測
1.樣品前處理雞蛋樣本稱取1g±0.05g勻質(zhì)好的雞蛋樣本，加入8ml 0.1M PBS1(pH＝10)80℃孵育30分鐘，3000g以上離心，吸取上清液100μl加入900μl稀釋后的復(fù)溶液，混合均勻，取50μl用于分析。
2.用試劑盒檢測向包被有抗新霉素抗體的酶標(biāo)板微孔中加入系列標(biāo)準(zhǔn)品溶液或樣品溶液20μl，再加入酶標(biāo)抗原80μl，25℃反應(yīng)30min。倒出孔中液體，每孔加入稀釋后的洗滌液，30s后倒出孔中液體，如此重復(fù)操作共洗板5次，用吸水紙拍干。每孔加入底物顯色液A液過氧化脲，底物顯色液B液四甲基聯(lián)苯胺(TMB)，各50μl輕輕振蕩混勻，25℃恒溫箱避光顯色15～30min。每孔加入終止液50μl，輕輕振蕩混勻，用酶標(biāo)儀波長設(shè)定在450nm處，測定每孔吸光度值(OD值)。
3.檢測結(jié)果分析用所獲得的每個(gè)濃度的標(biāo)準(zhǔn)品溶液的吸光度平均值(B)除以第一個(gè)標(biāo)準(zhǔn)品溶液(0標(biāo)準(zhǔn))的吸光度值(B0)再乘以100％，得到百分吸光度值。以新霉素標(biāo)準(zhǔn)品濃度(μg/L)的半對數(shù)值為X軸，百分吸光度值為Y軸，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線圖。用同樣的辦法計(jì)算樣品溶液的百分吸光度值，相對應(yīng)每一個(gè)樣品的濃度，則可從標(biāo)準(zhǔn)曲線上讀出新霉素的殘留量。
實(shí)施例5樣品中慶大霉素殘留的檢測1.樣品前處理奶粉樣本稱取1g±0.05g奶粉樣本，加入4ml 0.02M PB，加入5ml正己烷，3000g以上離心，吸取下層液體40μl加入960μl稀釋后的復(fù)溶液，混合均勻，取50μl用于分析。
2.用試劑盒檢測向包被有抗新霉素抗體的酶標(biāo)板微孔中加入系列標(biāo)準(zhǔn)品溶液或樣品溶液20μl，再加入酶標(biāo)抗原80μl，25℃反應(yīng)30min。倒出孔中液體，每孔加入稀釋后的洗滌液，30s后倒出孔中液體，如此重復(fù)操作共洗板5次，用吸水紙拍干。每孔加入底物顯色液A液過氧化脲，底物顯色液B液四甲基聯(lián)苯胺(TMB)，各50μl輕輕振蕩混勻，25℃恒溫箱避光顯色15～30min。每孔加入終止液50μl，輕輕振蕩混勻，用酶標(biāo)儀波長設(shè)定在450nm處，測定每孔吸光度值(OD值)。
3.檢測結(jié)果分析用所獲得的每個(gè)濃度的標(biāo)準(zhǔn)品溶液的吸光度平均值(B)除以第一個(gè)標(biāo)準(zhǔn)品溶液(0標(biāo)準(zhǔn))的吸光度值(B0)再乘以100％，得到百分吸光度值。以新霉素標(biāo)準(zhǔn)品濃度(μg/L)的半對數(shù)值為X軸，百分吸光度值為Y軸，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線圖。用同樣的辦法計(jì)算樣品溶液的百分吸光度值，相對應(yīng)每一個(gè)樣品的濃度，則可從標(biāo)準(zhǔn)曲線上讀出新霉素的殘留量。
實(shí)施例6樣品中慶大霉素殘留的檢測1.樣品前處理飼料樣本稱取1g±0.05g飼料樣本，加入10ml 0.02M PBS1充分振蕩混勻，3000g以上離心5min，吸取100μl加入900μl稀釋后的復(fù)溶液，混合均勻，取50μl用于分析。
2.用試劑盒檢測向包被有抗新霉素抗體的酶標(biāo)板微孔中加入系列標(biāo)準(zhǔn)品溶液或樣品溶液20μl，再加入酶標(biāo)抗原80μl，25℃反應(yīng)30min。倒出孔中液體，每孔加入稀釋后的洗滌液，30s后倒出孔中液體，如此重復(fù)操作共洗板5次，用吸水紙拍干。每孔加入底物顯色液A液過氧化脲，底物顯色液B液四甲基聯(lián)苯胺(TMB)，各50μl輕輕振蕩混勻，25℃恒溫箱避光顯色15～30min。每孔加入終止液50μl，輕輕振蕩混勻，用酶標(biāo)儀波長設(shè)定在450nm處，測定每孔吸光度值(OD值)。
3.檢測結(jié)果分析用所獲得的每個(gè)濃度的標(biāo)準(zhǔn)品溶液的吸光度平均值(B)除以第一個(gè)標(biāo)準(zhǔn)品溶液(0標(biāo)準(zhǔn))的吸光度值(B0)再乘以100％，得到百分吸光度值。以新霉素標(biāo)準(zhǔn)品濃度(μg/L)的半對數(shù)值為X軸，百分吸光度值為Y軸，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線圖。用同樣的辦法計(jì)算樣品溶液的百分吸光度值，相對應(yīng)每一個(gè)樣品的濃度，則可從標(biāo)準(zhǔn)曲線上讀出新霉素的殘留量。
實(shí)驗(yàn)例1
標(biāo)準(zhǔn)品精密度試驗(yàn)分別從三個(gè)不同的時(shí)間段制備的酶標(biāo)板中各抽出一批酶標(biāo)板，每批各抽取10個(gè)試劑盒，每板各抽出20個(gè)微孔，測定4.5μg/L標(biāo)準(zhǔn)溶液的吸光度值，計(jì)算變異系數(shù)。
表1標(biāo)準(zhǔn)可重復(fù)性試驗(yàn)(CV％)

通過上述試驗(yàn)結(jié)果可以得出，每批試劑盒各10次標(biāo)準(zhǔn)品變異系數(shù)在4.6％-16.8％之間，符合精密度小于或等于25％的規(guī)定。
實(shí)驗(yàn)例2樣本精密度和準(zhǔn)確度試驗(yàn)a.樣品精密度試驗(yàn)以50μg/L濃度的新霉素對動(dòng)物組織、奶粉、雞蛋和飼料，添加到樣品中，分別取三個(gè)不同批次的試劑盒各五個(gè)，每個(gè)濃度重復(fù)5次，分別計(jì)算變異系數(shù)，結(jié)果見表2～5。
表2動(dòng)物組織樣品可重復(fù)性試驗(yàn)

表3奶粉樣品可重復(fù)性試驗(yàn)


表4雞蛋樣品可重復(fù)性試驗(yàn)

表5飼料樣品可重復(fù)性試驗(yàn)


結(jié)果表明，動(dòng)物組織、奶粉、雞蛋和飼料樣本中的變異系數(shù)均低于25％。
b.樣本準(zhǔn)確度試驗(yàn)取兩個(gè)濃度的新霉素標(biāo)準(zhǔn)品溶液分別為20μg/kg(L)、50μg/kg(L)，分別對樣品進(jìn)行添加回收試驗(yàn)，每個(gè)濃度做4個(gè)平行，具體方法如實(shí)施例1中樣品前處理步驟，分別計(jì)算準(zhǔn)確度。
表6試劑盒的準(zhǔn)確度



結(jié)果表明肌肉、魚蝦、奶粉、雞蛋和飼料樣品添加準(zhǔn)確度在64.2％-98.5％之間。
實(shí)驗(yàn)例3交叉反應(yīng)率試驗(yàn)選擇與新霉素有類似結(jié)構(gòu)和類似功能的5種藥物測定交叉反應(yīng)率。通各種藥物的標(biāo)準(zhǔn)曲線分別得到其50％抑制濃度。用下式計(jì)算試劑盒對其它藥物的交叉反應(yīng)率。交叉反應(yīng)越大，那么此試劑盒對新霉素的檢測的特異性就越好。
交叉反應(yīng)率(％)＝(引起50％抑制新霉素的濃度/引起50％抑制的類似物濃度)×100％表7試劑盒的特異性

實(shí)驗(yàn)例4試劑盒保存條件為2-8℃，經(jīng)過6個(gè)月的測定，試劑盒的最大吸光度值(零標(biāo)準(zhǔn))、50％抑制濃度、新霉素添加實(shí)際測定值均在正常范圍之內(nèi)?？紤]在運(yùn)輸和使用過程中，會(huì)有非正常保存條件出現(xiàn)，將試劑盒在37℃保存的條件下放置6天，進(jìn)行加速老化實(shí)驗(yàn)，結(jié)果表明該試劑盒各項(xiàng)指標(biāo)完全符合要求?？紤]到試劑盒冷凍情況發(fā)生，將試劑盒放入-20℃冰箱冷凍5天，測定結(jié)果也表明試劑盒各項(xiàng)指標(biāo)完全正常。從以上結(jié)果可得出試劑盒可以在2-8℃至少可以保存6個(gè)月以上。
權(quán)利要求
1.一種檢測新霉素藥物的酶聯(lián)免疫試劑盒，其特征在于它含有(1)包被有包被原的酶標(biāo)板；(2)酶標(biāo)記物；(3)新霉素特異性抗體工作液；(4)新霉素標(biāo)準(zhǔn)品溶液；(5)底物顯色液；(6)終止液；(7)濃縮洗滌液；(8)濃縮復(fù)溶液。
2.如權(quán)利要求1所述的試劑盒，其特征在于酶標(biāo)板中包被的包被原為新霉素與載體蛋白的偶聯(lián)物、新霉素特異性抗體或抗抗體；新霉素與載體蛋白的偶聯(lián)物是將新霉素與載體蛋白通過直接活化蛋白法偶聯(lián)得到；所述載體蛋白為鼠血清蛋白、甲狀腺蛋白、牛血清白蛋白、兔血清蛋白、人血清白蛋白、卵清蛋白或血藍(lán)蛋白；新霉素特異性抗體為單克隆抗體或多克隆抗體，是用新霉素偶聯(lián)免疫抗原進(jìn)行免疫得到的；抗抗體為羊抗鼠抗抗體或羊抗兔抗抗體，羊抗鼠抗抗體是將鼠源抗體對無病原體羊進(jìn)行免疫得到的，羊抗兔抗抗體是將兔源抗體對無病原體山羊進(jìn)行免疫得到的；所用包被緩沖液為pH9.6，0.05mol/L的碳酸鹽緩沖液，所用的封閉液為5％胎牛血清的溶液。
3.如權(quán)利要求1所述的試劑盒，其特征在于酶標(biāo)記物為酶標(biāo)記抗抗體、酶標(biāo)記新霉素抗原或酶標(biāo)記特異性抗體；抗抗體為羊抗鼠抗抗體或羊抗兔抗抗體；標(biāo)記酶為辣根過氧化物酶或細(xì)菌提取堿性磷酸酯酶；酶標(biāo)記抗抗體是采用戊二醛法或過碘酸鈉法將抗抗體與標(biāo)記酶偶聯(lián)得到；酶標(biāo)記新霉素抗原是將新霉素與標(biāo)記酶采用混合酸酐法或碳化二亞氨法偶聯(lián)得到的；酶標(biāo)記特異性抗體是將新霉素特異性抗體與標(biāo)記酶通過戊二醛法或過碘酸鈉法偶聯(lián)得到。
4.如權(quán)利要求1所述的試劑盒，其特征在于新霉素特異性抗體在酶標(biāo)板上包被抗原且酶標(biāo)記物為酶標(biāo)記抗抗體或酶標(biāo)板上包被抗抗體且酶標(biāo)記物為酶標(biāo)記抗原時(shí)含有。
5.如任一權(quán)利要求1-4所述的試劑盒，其特征在于當(dāng)標(biāo)記酶為辣根過氧化物酶時(shí)底物顯色液A液為過氧化氫或過氧化脲、底物顯色液B液為鄰苯二胺或四甲基聯(lián)苯胺、終止液為1～2mol/L的硫酸或鹽酸緩沖液；當(dāng)標(biāo)記酶為細(xì)菌提取堿性磷酸酯酶時(shí)底物顯色液為對硝基磷酸鹽緩沖液、終止液為2mol/L的氫氧化鈉；濃縮洗滌液為0.01M，pH7.4，含有0.8～1.2％吐溫20和0.5‰疊氮化鈉防腐劑的磷酸鹽緩沖液；濃縮復(fù)溶液為0.01～0.05mol/L、含有1％甲醇的磷酸鹽緩沖液。
6.如權(quán)利要求4所述的試劑盒，其特征在于制備新霉素抗體所需要的免疫抗原是采用混合酸酐法或直接活化蛋白法將新霉素與載體蛋白偶聯(lián)得到。
7.如權(quán)利要求1所述的試劑盒，其特征在于新霉素標(biāo)準(zhǔn)品溶液的濃度分別為0μg/L，0.5μg/L，1.5μg/L，4.5μg/L，13.5μg/L和40.5μg/L。
8.一種檢測動(dòng)物源性食品中新霉素藥物殘留的方法，包括步驟(1)樣品前處理；(2)用任一權(quán)利要求1-7所述的試劑盒進(jìn)行檢測；(3)分析檢測結(jié)果。
全文摘要
本發(fā)明提供了一種檢測新霉素藥物的酶聯(lián)免疫試劑盒，它含有包被有包被原的酶標(biāo)板，酶標(biāo)記物，新霉素特異性抗體，新霉素標(biāo)準(zhǔn)品溶液，底物顯色液，終止液，濃縮洗滌液，濃縮復(fù)溶液。本發(fā)明還公開了一種應(yīng)用上述酶聯(lián)免疫試劑盒檢測新霉素的方法，它包括步驟首先進(jìn)行樣品前處理，然后用試劑盒進(jìn)行檢測，最后分析檢測結(jié)果。本發(fā)明提供的是檢測動(dòng)物源性食品中如雞肉、雞肝、豬肉、豬肝、奶粉、雞蛋和飼料等樣品中新霉素的殘留量的酶聯(lián)免疫試劑盒及檢測方法操作簡便、費(fèi)用低廉、靈敏度高、能夠現(xiàn)場監(jiān)控且適合大量樣本篩查。
文檔編號G01N33/577GK101021536SQ20071006434
公開日2007年8月22日 申請日期2007年3月12日 優(yōu)先權(quán)日2007年3月12日
發(fā)明者何方洋, 吳小平, 馮才偉, 萬宇平, 郭勇, 趙正苗, 馮才茂, 朱亮, 汪善良, 劉平, 陳煒琳, 蒲小容, 馮月君, 余厚美, 羅貴昆, 屈曉麗 申請人:北京望爾康泰生物技術(shù)有限公司, 北京望爾生物技術(shù)有限公司