專利名稱：卡那霉素殘留酶聯(lián)免疫分析試劑盒及其應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及免疫學(xué)檢測領(lǐng)域，具體地說，涉及一種檢測動物源性食品和飼料中卡那霉素類藥物殘留的酶聯(lián)免疫分析試劑盒及其應(yīng)用。
背景技術(shù)：
卡那霉素(Kanamycin)是氨基糖甙類抗生素，對多數(shù)腸桿菌科細菌有良好抗菌作用。但因其毒性較大，在動物性食品中的殘留可對消費者產(chǎn)生較大的潛在危害，對食品衛(wèi)生和公共健康產(chǎn)生了威脅。
檢測卡那霉素殘留量的化學(xué)方法目前有高效液相色譜法，由于復(fù)雜的儀器設(shè)備和繁瑣的過程，不適合現(xiàn)場監(jiān)控和大量樣本篩查。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是提供一種操作簡便、費用低廉、靈敏度高、能夠現(xiàn)場監(jiān)控且適合大量樣本篩查，用于檢測雞肉、雞肝、豬肉、豬肝、奶粉、雞蛋和飼料中卡那霉素藥物的殘留量的酶聯(lián)免疫分析試劑盒。
本發(fā)明試劑盒的主要內(nèi)容物采用了方便使用的工作液形式，工作液保存性及穩(wěn)定性好，克服了大多數(shù)本領(lǐng)域產(chǎn)品的技術(shù)問題；本試劑盒采用的檢測方法提供了多種樣本的回收方法，可用于多種樣本的檢測。
本發(fā)明試劑盒包括1.包被有包被原的酶標(biāo)板；2.酶標(biāo)記物；3.卡那霉素特異性抗體；4.卡那霉素標(biāo)準品溶液；5.底物顯色液；
6.終止液；7.濃縮洗滌液；8.濃縮復(fù)溶液。
上面所述包被原可為卡那霉素抗原、卡那霉素特異性抗體或抗抗體；所述酶標(biāo)記物為酶標(biāo)記抗抗體、酶標(biāo)記卡那霉素抗原或酶標(biāo)記卡那霉素特異性抗體；所述抗抗體為羊抗鼠抗抗體或羊抗兔抗抗體。并且，當(dāng)包被原為卡那霉素抗原時，酶標(biāo)記物為酶標(biāo)記抗抗體或酶標(biāo)記抗體；當(dāng)包被原為抗抗體時，酶標(biāo)記物為酶標(biāo)記抗原。
所述酶標(biāo)記物的標(biāo)記酶為辣根過氧化物酶或堿性磷酸酯酶，其中優(yōu)選辣根過氧化物酶；酶標(biāo)記的羊抗鼠抗抗體或羊抗兔抗抗體是采用戊二醛法或混合酸酐法將標(biāo)記酶與抗抗體進行偶聯(lián)得到的，辣根過氧化物酶可采用現(xiàn)有技術(shù)中的多種方法將其與抗抗體進行偶聯(lián)，如戊二醛法，過碘酸鈉法等，本發(fā)明經(jīng)過長期的勞動創(chuàng)造將過碘酸鈉法進行了改良，使其省時、降低辣根過氧化物酶(HRP)與抗抗體的濃度比率，節(jié)省了原材料。
所述卡那霉素特異性抗體可為卡那霉素單克隆抗體或卡那霉素多克隆抗體；它們均是用卡那霉素與載體蛋白采用戊二醛法得到的偶聯(lián)物作為免疫原得到的；所述卡那霉素多克隆抗體可為鼠源、馬源、羊源、兔源或豚鼠源抗體，所述卡那霉素單克隆抗體優(yōu)選為卡那霉素鼠單克隆抗體，所述卡那霉素多克隆抗體優(yōu)選為卡那霉素兔多克隆抗體。
以上抗體均可以用卡那霉素與載體蛋白的偶聯(lián)物作為免疫原按戊二醛法制備。所述載體蛋白可為鼠血清蛋白、甲狀腺蛋白(BCG)、牛血清白蛋白、兔血清蛋白、人血清白蛋白、卵清蛋白或血藍蛋白等常用載體蛋白；所述卡那霉素與載體蛋白的偶聯(lián)物可通過將卡那霉素和載體蛋白用戊二醛法進行偶聯(lián)得到。
為了更方便現(xiàn)場監(jiān)控和大量樣本篩查，所述試劑盒還包括卡那霉素標(biāo)準品溶液、底物顯色液、終止液、濃縮洗滌液、濃縮復(fù)溶液。
所述濃縮洗滌液為pH7.4含0.8～1.2％吐溫80的0.01M磷酸鹽緩沖液。
所述濃縮復(fù)溶液為含有0.5％明膠的0.01M磷酸鹽緩沖液。
所述當(dāng)標(biāo)記酶為辣根過氧化物酶時，底物顯色液由顯色液A液和顯色液B液組成，顯色液A液為過氧化氫或過氧化脲，所述顯色液B液為鄰苯二胺或四甲基聯(lián)苯胺，終止液為1～2mol/L硫酸；當(dāng)標(biāo)記酶為堿性磷酸酯酶時，顯色液為對硝基苯磷酸酯緩沖液，終止液為1～2mol/L氫氧化鈉溶液。
其中酶標(biāo)板在制備過程中所用的包被緩沖液為pH 9.6，0.05mol/L的碳酸鹽緩沖液；所用的封閉液含有10％胎牛血清和0.5％明膠的溶液。
本發(fā)明中酶標(biāo)板的制備過程為用包被緩沖液將包被原稀釋成0.05-0.1μg/ml，每孔加入100μl，37℃溫育2h，再4℃過夜，傾去包被液，用洗滌液洗滌2次，每次30秒，拍干，然后在每孔中加入150-200μl封閉液，37℃溫育1-2h，傾去孔內(nèi)液體拍干，干燥后用鋁膜真空密封保存。
本發(fā)明中抗原的合成過程為1.卡那霉素抗體的制備將卡那霉素與載體蛋白采用戊二醛法進行偶聯(lián)得到免疫原。
將卡那霉素與載體蛋白采用戊二醛法進行偶聯(lián)得到包被原。
卡那霉素是小分子物質(zhì)，只有免疫反應(yīng)性，沒有免疫原性，不能誘發(fā)機體產(chǎn)生免疫應(yīng)答，必須與大分子載體蛋白偶聯(lián)后才具有免疫原性。
2.卡那霉素鼠單克隆抗體的制備動物免疫程序采用Balb/c小鼠作為免疫動物，以卡那霉素與載體蛋白偶聯(lián)物為免疫原，得到較好的多克隆抗體，取出肝臟進行細胞融合。
細胞融合與克隆化取免疫BALB/c小鼠脾細胞與SP2/0骨髓瘤細胞融合，篩選細胞株，直到得到穩(wěn)定分泌單克隆抗體的雜交瘤細胞株。
3.卡那霉素兔多克隆抗體的制備采用新西蘭大白兔作為免疫動物，以卡那霉素與載體蛋白偶聯(lián)物為免疫原對新西蘭大白兔進行免疫，多次免疫后測定血清抗體效價得到多克隆抗體。
本發(fā)明抗抗體的制備過程羊抗鼠抗抗體是以羊作為免疫動物，以鼠源抗體為免疫原對無病菌體羊進行免疫，得到羊抗鼠抗抗體；羊抗兔抗抗體是以羊作為免疫動物，以兔源抗體為免疫原對無病菌體羊進行免疫，得到羊抗兔抗抗體。
本發(fā)明所述試劑盒中卡那霉素標(biāo)準品溶液標(biāo)準品溶液6瓶，0μg/L，0.1μg/L，0.3μg/L，0.9μg/L，2.7μg/L，8.1μg/L。
本發(fā)明的檢測原理為當(dāng)在酶標(biāo)板微孔條上預(yù)包被卡那霉素偶聯(lián)包被抗原時，加入樣本溶液或標(biāo)準品溶液后，再加入卡那霉素特異性抗體溶液，樣本中殘留的卡那霉素或卡那霉素標(biāo)準品與酶標(biāo)板上包被的卡那霉素偶聯(lián)抗原競爭卡那霉素特異性抗體，加入酶標(biāo)記抗抗體進行放大作用，用顯色液顯色，樣本吸光值與樣本中卡那霉素的含量成負相關(guān)，與標(biāo)準曲線比較即可得出樣本中卡那霉素的殘留量。同時也可根據(jù)酶標(biāo)板上顏色的深淺，與系列濃度卡那霉素標(biāo)準品溶液顏色的比較可粗略判斷樣品中卡那霉素殘留量的濃度范圍。
當(dāng)在微孔條上預(yù)包被卡那霉素特異性抗體時，加入樣本溶液或標(biāo)準品溶液后，再加入酶標(biāo)記卡那霉素抗原溶液，樣本中殘留的卡那霉素或卡那霉素標(biāo)準品與酶標(biāo)記卡那霉素抗原競爭包被在酶標(biāo)板上的卡那霉素特異性抗體，用顯色液顯色，樣本吸光值與卡那霉素藥物的含量成負相關(guān)，與標(biāo)準曲線比較即可得出樣本中卡那霉素的殘留量。同時也可根據(jù)酶標(biāo)板上的顏色深淺，與系列濃度的卡那霉素標(biāo)準品溶液顏色的比較可粗略判斷樣品中卡那霉素殘留量的濃度范圍。
當(dāng)在微孔條上預(yù)包被卡那霉素偶聯(lián)抗原時，加入樣本溶液或標(biāo)準品溶液后，再加入酶標(biāo)記卡那霉素特異性抗體溶液，樣本中殘留的卡那霉素或卡那霉素標(biāo)準品與酶標(biāo)板上包被的卡那霉素抗原競爭卡那霉素特異性抗體，用顯色液顯色，樣本吸光值與樣本中卡那霉素的含量成負相關(guān)，與標(biāo)準曲線比較即可得出樣本中卡那霉素的殘留量。同時也可根據(jù)酶標(biāo)板上的顏色深淺，與系列濃度卡那霉素標(biāo)準品溶液顏色的比較可粗略判斷樣品中卡那霉素殘留量的濃度范圍。
當(dāng)在微孔條上預(yù)包被抗抗體時，加入卡那霉素抗體孵育后，加入樣本溶液或標(biāo)準品溶液，再加入酶標(biāo)記卡那霉素抗原溶液，樣本中殘留的卡那霉素或卡那霉素標(biāo)準品與酶標(biāo)記卡那霉素抗原競爭卡那霉素特異性抗體，用顯色液顯色，樣本吸光度值與樣本中卡那霉素的含量成負相關(guān)，與標(biāo)準曲線比較即可得出樣本中卡那霉素的殘留量。同時也可根據(jù)酶標(biāo)板上的顏色深淺，與系列濃度卡那霉素標(biāo)準品溶液顏色的比較可粗略判斷樣品中卡那霉素殘留量的濃度范圍。
本發(fā)明還提供了一種應(yīng)用上述酶聯(lián)免疫試劑盒檢測卡那霉素藥物的方法，它包括步驟(1)樣品前處理；(2)用試劑盒進行檢測；(3)分析檢測結(jié)果。
本發(fā)明提供卡那霉素在動物源性食品如雞肉、雞肝、豬肉、豬肝、奶粉、雞蛋和飼料等樣本中的處理方法。
稱取去除脂肪的粉碎動物組織樣本于離心管中，加入PB緩沖液上下混合后，置水浴中加熱，室溫離心，取上清液復(fù)溶，取樣分析；將奶粉樣本置于離心管中，加入PB和正己烷，離心后取下層液體復(fù)溶，取樣分析；將雞蛋樣本打碎，用玻璃棒攪勻防止泡沫的產(chǎn)生；將飼料樣本置于離心管中，加入PBS1，離心后復(fù)溶，取樣分析。
本發(fā)明中用試劑盒檢測是當(dāng)包被原為卡那霉素偶聯(lián)抗原時，向酶標(biāo)板微孔中加入標(biāo)準品溶液或樣本溶液再加入抗體，溫育后洗滌拍干，再加入酶標(biāo)抗抗體，溫育后洗滌拍干，顯色、終止，用酶標(biāo)儀測定吸光度值；當(dāng)包被原為卡那霉素偶聯(lián)抗原時，向酶標(biāo)板微孔中加入標(biāo)準品溶液或樣本溶液再加入酶標(biāo)記抗體，溫育后洗滌拍干，顯色、終止，用酶標(biāo)儀測定吸光度值；當(dāng)包被原為卡那霉素特異性抗體時，向酶標(biāo)板微孔中加入標(biāo)準品溶液或樣本溶液再加入酶標(biāo)記卡那霉素抗原，溫育后洗滌拍干，顯色、終止，用酶標(biāo)儀測定吸光度值；當(dāng)包被原為抗抗體時，向酶標(biāo)板微孔中加入卡那霉素抗體，溫育后洗滌拍干，再加入標(biāo)準品溶液或樣品溶液后加入酶標(biāo)卡那霉素抗原，溫育后洗滌拍干，顯色、終止，用酶標(biāo)儀測定吸光度值。
本發(fā)明中檢測結(jié)果分析過程為用所獲得的每個濃度的標(biāo)準品溶液的吸光度平均值(B)除以第一個標(biāo)準溶液(0標(biāo)準)的吸光度值(B0)再乘以100％，即百分吸光度值。計算公式為百分吸光度值(％)＝(B/B0)×100％以卡那霉素標(biāo)準品溶液的濃度(μg/L)的半對數(shù)值為X軸，百分吸光度值為Y軸，繪制標(biāo)準曲線圖。用同樣的辦法計算樣品溶液的百分吸光度值，相對應(yīng)每一個樣品的濃度則可從標(biāo)準曲線上讀出樣本中卡那霉素的殘留量。
本發(fā)明中檢測結(jié)果的分析也可以采用回歸方程法，計算出樣品溶液濃度。
本發(fā)明中檢測結(jié)果的分析還可以利用計算機專業(yè)軟件，此法更便于大量樣品的快速分析，整個檢測過程只需1.5小時可以完成，樣本最低檢測限為0.1μg/L。
本發(fā)明中檢測食品中卡那霉素的酶聯(lián)免疫試劑盒主要采用間接競爭ELISA方法定性或定量檢測雞肉、雞肝、豬肉、豬肝、奶粉、雞蛋和飼料樣品中卡那霉素的殘留量，樣品前處理過程簡單，能同時檢測大批樣品。
本發(fā)明采用高特異性的卡那霉素單克隆抗體或多克隆抗體，主要試劑以工作液形式提供，檢驗方法簡便易行，具有特異性高、靈敏度高、精確度高等特點，將在食品中卡那霉素的殘留檢測中發(fā)揮重要作用。


圖1卡那霉素的檢測標(biāo)準曲線圖。
具體實施例方式
以下實施例用于說明本發(fā)明，但不用來限制本發(fā)明的范圍實施例1試劑盒組分的制備1.抗原的合成a.卡那霉素免疫抗原的合成將卡那霉素和卵清蛋白(OVA)，采用戊二醛法進行偶聯(lián)得到免疫抗原。
免疫原的制備過程取卡那霉素100mg溶于5ml純水中，加入1％戊二醛溶液1ml 4℃攪拌30分鐘，取OVA 300mg溶于10ml純水中，加入到活化的卡那霉素溶液中4℃攪拌反應(yīng)6～8小時調(diào)節(jié)pH8.5加入硼氫化鈉10mg，反應(yīng)2小時，對純水在4～8℃環(huán)境透析5天，分裝凍存，得到卡那霉素免疫抗原。
b.卡那霉素包被抗原的合成將卡那霉素和牛血清白蛋白，采用戊二醛法進行偶聯(lián)得到包被抗原。
包被抗原的制備過程取卡那霉素100mg溶于5ml純水中，加入1％戊二醛溶液1ml 4℃攪拌30分鐘，取BSA 300mg溶于10ml純水中，加入到活化的卡那霉素溶液中4℃攪拌反應(yīng)6～8小時調(diào)節(jié)pH8.5加入硼氫化鈉10mg，反應(yīng)2小時，對純水在4～8℃環(huán)境透析5天，分裝凍存，得到包被抗原。
2.單克隆抗體的制備a.動物免疫將免疫抗原注入到Balb/c小鼠體內(nèi)，免疫劑量為80μg/只，使其產(chǎn)生多克隆抗體。
b.細胞融合和克隆化取免疫Balb/c小鼠脾細胞，按5∶1比例與SP2/0骨髓瘤細胞融合，得到單克隆抗體的雜交瘤細胞株。
c.細胞凍存和復(fù)蘇將雜交瘤細胞用凍存液制成1×106個/ml的細胞懸液，在液氮中長期保存。復(fù)蘇時取出凍存管，立即放入37℃水浴中速融，離心去除凍存液后，移入培養(yǎng)瓶內(nèi)培養(yǎng)。
d.單克隆抗體的制備與純化將Balb/c小鼠腹腔注入滅菌石蠟油0.4ml/只，7天后腹腔注射雜交瘤細胞5×105個/只，7天后采集腹水。用辛酸-飽和硫酸銨法進行純化，純化后的腹水放入-20℃環(huán)境保存。
3.多克隆抗體的制備采用新西蘭大白兔作為免疫動物，以卡那霉素與卵清蛋白偶聯(lián)物為免疫原，免疫劑量為1.5mg/kg，首免時將免疫原與等量的弗氏完全佐混合制成乳化劑，頸背部皮下多點注射，間隔3～4周取相同劑量免疫原加等量弗氏不完全佐劑混合乳化，加強免疫一次，共免疫5次，最后一次不加佐劑。最后一次免疫10天后采血，測定血清抗體效價，心臟采血，用硫酸銨分級沉淀得到純化的多克隆抗體。
4.羊抗鼠抗抗體的制備過程以山羊作為免疫動物，以鼠源抗體為免疫原對無病原體山羊進行免疫，得到羊抗鼠抗抗體；羊抗兔抗抗體的制備以山羊作為免疫動物，以兔源抗體為免疫原對無病原體山羊進行免疫，得到羊抗兔抗抗體。
5.酶標(biāo)板的制備用包被緩沖液將卡那霉素包被抗原、抗體或抗抗體稀釋成0.05-0.1μg/ml，每孔加入100μl，37℃溫育2h或4℃過夜，傾去包被液，用稀釋20倍的濃縮洗滌液洗滌2次，每次30秒，拍干，然后在每孔中加入150μl封閉液，37℃溫育2h，傾去孔內(nèi)液體，干燥后用鋁膜真空密封保存。
實施例2檢測卡那霉素的酶聯(lián)免疫試劑盒的組建組建檢測卡那霉素的酶聯(lián)免疫試劑盒，使其包含下述組分(1)包被卡那霉素偶聯(lián)抗原的酶標(biāo)板；(2)用辣根過氧化物酶標(biāo)記的羊抗鼠抗抗體；(3)卡那霉素單抗?jié)饪s液；(4)卡那霉素標(biāo)準品溶液6瓶，濃度分別為0μg/L，0.1μg/L，0.3μg/L，0.9μg/L，2.7μg/L，8.1μg/L；(5)底物顯色液由A液和B液組成，底物顯色液A液為過氧化脲，底物顯色液B液為四甲基聯(lián)苯胺；(6)終止液為2mol/L鹽酸；(7)濃縮洗滌液為0.01mol/L，pH7.4含0.9％吐溫80的磷酸鹽緩沖液；(8)濃縮復(fù)溶液為含有0.5％明膠的0.01M磷酸鹽緩沖液。
實施例3樣品中卡那霉素殘留的檢測1.樣品前處理動物組織(雞肉、雞肝、豬肉、豬肝)稱取去除脂肪的粉碎樣本與8ml 0.2M PB緩沖液混合5min，置50℃水浴環(huán)境放置30min，3000g以上，室溫離心10min，取50μl上清液，加入450μl稀釋后的復(fù)溶液混勻，取50μl用于分析。
2.用試劑盒檢測向卡那霉素偶聯(lián)抗原包被的酶標(biāo)板微孔中加入卡那霉素標(biāo)準品溶液或樣本溶液50μl，再加入卡那霉素單克隆抗體工作液50μl，用蓋板膜封板，37℃恒溫箱中反應(yīng)30min，倒出孔中液體，每孔加入250μl洗滌液，30秒后倒出孔中液體，如此重復(fù)操作共洗板5次，用吸水紙拍干。加入辣根過氧化物酶標(biāo)記的羊抗鼠抗抗體工作液100μl，37℃恒溫箱中反應(yīng)30min，倒出孔中液體，重復(fù)洗滌步驟，每孔加入底物顯色液A液過氧化脲，底物顯色液B液四甲基聯(lián)苯胺(TMB)，輕輕振蕩混勻，37℃恒溫箱避光顯色15min，每孔加入2mol/L終止液鹽酸50μl，輕輕振蕩混勻，用酶標(biāo)儀，測定每孔吸光度值。
3.檢測結(jié)果分析用所獲得的每個濃度的標(biāo)準品溶液的吸光度平均值(B)除以第一個標(biāo)準品溶液(0標(biāo)準)的吸光度值(B0)再乘以100％，得到百分吸光度值。以卡那霉素標(biāo)準品濃度(μg/L)的半對數(shù)值為X軸，百分吸光度值為Y軸，繪制標(biāo)準曲線圖。用同樣的辦法計算樣品溶液的百分吸光度值，相對應(yīng)每一個樣品的濃度，則可從標(biāo)準曲線上讀出樣本中卡那霉素的殘留量。
實施例4樣品中卡那霉素殘留的檢測1.樣品前處理雞蛋樣本稱取1g±0.05g勻質(zhì)好的雞蛋樣本，加入8m10.1M PBS1(pH＝10)80℃孵育30分鐘，3000g以上離心，吸取上清液100μl加入900μl稀釋后的復(fù)溶液，混合均勻，取50μl用于分析。
2.用試劑盒檢測向卡那霉素偶聯(lián)抗原包被的酶標(biāo)板微孔中加入卡那霉素標(biāo)準品溶液或樣本溶液50μl，再加入卡那霉素單克隆抗體工作液50l，用蓋板膜封板，37℃恒溫箱中反應(yīng)30min，倒出孔中液體，每孔加入250μl洗滌液，30秒后倒出孔中液體，如此重復(fù)操作共洗板5次，用吸水紙拍干。加入辣根過氧化物酶標(biāo)記的羊抗鼠抗抗體工作液100μl，37℃恒溫箱中反應(yīng)30min，倒出孔中液體，重復(fù)洗滌步驟，每孔加入底物顯色液A液過氧化脲，底物顯色液B液四甲基聯(lián)苯胺(TMB)，輕輕振蕩混勻，37℃恒溫箱避光顯色15min，每孔加入2mol/L終止液鹽酸50μl，輕輕振蕩混勻，用酶標(biāo)儀，測定每孔吸光度值。
3.檢測結(jié)果分析用所獲得的每個濃度的標(biāo)準品溶液的吸光度平均值(B)除以第一個標(biāo)準品溶液(0標(biāo)準)的吸光度值(B0)再乘以100％，得到百分吸光度值。以卡那霉素標(biāo)準品濃度(μg/L)的半對數(shù)值為X軸，百分吸光度值為Y軸，繪制標(biāo)準曲線圖。用同樣的辦法計算樣品溶液的百分吸光度值，相對應(yīng)每一個樣品的濃度，則可從標(biāo)準曲線上讀出樣本中卡那霉素的殘留量。
實施例5樣品中卡那霉素殘留的檢測1.樣品前處理奶粉樣本稱取1g±0.05g奶粉樣本，加入4ml 0.02M PB，加入5ml正己烷，3000g以上離心，吸取下層液體40μl加入960μl稀釋后的復(fù)溶液，混合均勻，取50μl用于分析。
2.用試劑盒檢測向卡那霉素偶聯(lián)抗原包被的酶標(biāo)板微孔中加入卡那霉素標(biāo)準品溶液或樣本溶液50μl，再加入卡那霉素單克隆抗體工作液50μl，用蓋板膜封板，37℃恒溫箱中反應(yīng)30min，倒出孔中液體，每孔加入250μl洗滌液，30秒后倒出孔中液體，如此重復(fù)操作共洗板5次，用吸水紙拍干。加入辣根過氧化物酶標(biāo)記的羊抗鼠抗抗體工作液100μl，37℃恒溫箱中反應(yīng)30min，倒出孔中液體，重復(fù)洗滌步驟，每孔加入底物顯色液A液過氧化脲，底物顯色液B液四甲基聯(lián)苯胺(TMB)，輕輕振蕩混勻，37℃恒溫箱避光顯色15min，每孔加入2mol/L終止液鹽酸50μl，輕輕振蕩混勻，用酶標(biāo)儀，測定每孔吸光度值。
3.檢測結(jié)果分析用所獲得的每個濃度的標(biāo)準品溶液的吸光度平均值(B)除以第一個標(biāo)準品溶液(0標(biāo)準)的吸光度值(B0)再乘以100％，得到百分吸光度值。以卡那霉素標(biāo)準品濃度(μg/L)的半對數(shù)值為X軸，百分吸光度值為Y軸，繪制標(biāo)準曲線圖。用同樣的辦法計算樣品溶液的百分吸光度值，相對應(yīng)每一個樣品的濃度，則可從標(biāo)準曲線上讀出樣本中卡那霉素的殘留量。
實施例6樣品中卡那霉素殘留的檢測1.樣品前處理飼料樣本稱取1g±0.05g飼料樣本，加入10ml 0.02M PBS1充分振蕩混勻，3000g以上離心5min，吸取100μl加入900μl稀釋后的復(fù)溶液，混合均勻，取50μl用于分析。
2.用試劑盒檢測向卡那霉素偶聯(lián)抗原包被的酶標(biāo)板微孔中加入卡那霉素標(biāo)準品溶液或樣本溶液50μl，再加入卡那霉素單克隆抗體工作液50μl，用蓋板膜封板，37℃恒溫箱中反應(yīng)30min，倒出孔中液體，每孔加入250μl洗滌液，30秒后倒出孔中液體，如此重復(fù)操作共洗板5次，用吸水紙拍干。加入辣根過氧化物酶標(biāo)記的羊抗鼠抗抗體工作液100μl，37℃恒溫箱中反應(yīng)30min，倒出孔中液體，重復(fù)洗滌步驟，每孔加入底物顯色液A液過氧化脲，底物顯色液B液四甲基聯(lián)苯胺(TMB)，輕輕振蕩混勻，37℃恒溫箱避光顯色15min，每孔加入2mol/L終止液鹽酸50μl，輕輕振蕩混勻，用酶標(biāo)儀，測定每孔吸光度值。
3.檢測結(jié)果分析用所獲得的每個濃度的標(biāo)準品溶液的吸光度平均值(B)除以第一個標(biāo)準品溶液(0標(biāo)準)的吸光度值(B0)再乘以100％，得到百分吸光度值。以卡那霉素標(biāo)準品濃度(μg/L)的半對數(shù)值為X軸，百分吸光度值為Y軸，繪制標(biāo)準曲線圖。用同樣的辦法計算樣品溶液的百分吸光度值，相對應(yīng)每一個樣品的濃度，則可從標(biāo)準曲線上讀出樣本中卡那霉素的殘留量。
實驗例1
標(biāo)準品精密度試驗分別從三個不同的時間段制備的酶標(biāo)板中各抽出一批酶標(biāo)板，每批各抽取10個試劑盒，每板各抽出20個微孔，測定0.9μg/L標(biāo)準溶液的吸光度值，計算變異系數(shù)。
表1標(biāo)準可重復(fù)性試驗(CV％)

通過上述試驗結(jié)果可以得出，每批試劑盒各測定10次標(biāo)準品變異系數(shù)在5.9％～18.7％之間，符合精密度小于或等于20％的規(guī)定。
實驗例2樣本精密度和準確度試驗a.樣品精密度試驗取卡那霉素標(biāo)樣，添加20μg/L到樣品中，分別取三個不同批次的試劑盒各三個，每個濃度重復(fù)5次，分別計算變異系數(shù)，結(jié)果見表。
表2雞肉樣品可重復(fù)性試驗

表3雞肝樣品可重復(fù)性試驗


表4雞蛋樣品可重復(fù)性試驗

表5飼料樣品可重復(fù)性試驗


結(jié)果表明，動物組織、奶粉、雞蛋和飼料樣本中的變異系數(shù)均低于25％b.樣本準確度試驗取三個濃度的卡那霉素標(biāo)準品溶液分別為20μg/kg(L)、50μg/kg(L)，分別對樣品進行添加回收試驗，每個濃度做4個平行，具體方法如實施例1中樣品前處理步驟，分別計算準確度。
表6試劑盒的準確度

結(jié)果表明肌肉、魚蝦、奶粉、雞蛋和飼料樣品添加準確度在67.5％-99.8％之間。
實驗例3交叉反應(yīng)率試驗選擇與卡那霉素有類似結(jié)構(gòu)和類似功能的3種藥物測定交叉反應(yīng)率。通各種藥物的標(biāo)準曲線分別得到其50％抑制濃度。用下式計算試劑盒對其它藥物的交叉反應(yīng)率。交叉反應(yīng)越大，那么此試劑盒對卡那霉素的檢測的特異性就越好。
交叉反應(yīng)率(％)＝(引起50％抑制卡那霉素的濃度/引起50％抑制的類似物濃度)×100％表7試劑盒的特異性

實驗例4試劑盒保存條件為2-8℃，經(jīng)過6個月的測定，試劑盒的最大吸光度值(零標(biāo)準)、50％抑制濃度、卡那霉素添加實際測定值均在正常范圍之內(nèi)?？紤]在運輸和使用過程中，會有非正常保存條件出現(xiàn)，將試劑盒在37℃保存的條件下放置6天，進行加速老化實驗，結(jié)果表明該試劑盒各項指標(biāo)完全符合要求?？紤]到試劑盒冷凍情況發(fā)生，將試劑盒放入-20℃冰箱冷凍5天，測定結(jié)果也表明試劑盒各項指標(biāo)完全正常。從以上結(jié)果可得出試劑盒可以在2-8℃至少可以保存6個月以上。
權(quán)利要求
1.一種檢測卡那霉素殘留的酶聯(lián)免疫試劑盒，其特征在于它含有(1)包被有包被原的酶標(biāo)板；(2)酶標(biāo)記物；(3)卡那霉素特異性抗體；(4)卡那霉素標(biāo)準品溶液；(5)底物顯色液；(6)終止液；(7)濃縮洗滌液；(8)濃縮復(fù)溶液。
2.如權(quán)利要求1所述的試劑盒，其特征在于酶標(biāo)板中包被的包被原為卡那霉素與載體蛋白的偶聯(lián)物、卡那霉素特異性抗體或抗抗體。
3.如權(quán)利要求2所述的試劑盒，其特征在于所述卡那霉素與載體蛋白的偶聯(lián)物是將卡那霉素與載體蛋白通過戊二醛法偶聯(lián)得到；所述載體蛋白可為鼠血清蛋白、甲狀腺蛋白、牛血清白蛋白、兔血清白蛋白、人血清白蛋白、卵清蛋白或血藍蛋白；卡那霉素特異性抗體為卡那霉素單克隆抗體或多克隆抗體，是用卡那霉素偶聯(lián)免疫抗原進行免疫得到的；抗抗體為羊抗鼠抗抗體或羊抗兔抗抗體，羊抗鼠抗抗體是將鼠源抗體對無病原體羊進行免疫得到的，羊抗兔抗抗體是將兔源抗體對無病原體山羊進行免疫得到的。
4.如權(quán)利要求1所述的試劑盒，其特征在于酶標(biāo)記物為酶標(biāo)記抗抗體、酶標(biāo)記卡那霉素抗原或酶標(biāo)記特異性抗體；抗抗體為羊抗鼠抗抗體或羊抗兔抗抗體；標(biāo)記酶可為辣根過氧化物酶或細菌提取堿性磷酸酯酶；酶標(biāo)記抗抗體是采用戊二醛法或混合酸酐法將抗抗體與標(biāo)記酶偶聯(lián)得到；酶標(biāo)記卡那霉素抗原是將卡那霉素與標(biāo)記酶采用戊二醛法或碳化二亞氨法偶聯(lián)得到的；酶標(biāo)記特異性抗體是將卡那霉素特異性抗體與標(biāo)記酶通過戊二醛法或混合酸酐法偶聯(lián)得到。
5.如權(quán)利要求1所述的試劑盒，其特征在于卡那霉素特異性抗體工作液在酶標(biāo)板上包被抗原且酶標(biāo)記物為酶標(biāo)記抗抗體或酶標(biāo)板上包被抗抗體且酶標(biāo)記物為酶標(biāo)記抗原時含有。
6.如權(quán)利要求1-5任一項所述的試劑盒，其特征在于當(dāng)標(biāo)記酶為辣根過氧化物酶時底物顯色液A液為過氧化氫或過氧化脲、底物顯色液B液為鄰苯二胺或四甲基聯(lián)苯胺、終止液為1～2mol/L的硫酸或鹽酸緩沖液；當(dāng)標(biāo)記酶為細菌提取堿性磷酸酯酶時底物顯色液為對硝基磷酸鹽緩沖液、終止液為2mol/L的氫氧化鈉；濃縮洗滌液為pH7.4含0.8～1.2％吐溫80的0.01M磷酸鹽緩沖液；濃縮復(fù)溶液為含有0.5％明膠的0.01M磷酸鹽緩沖液；封閉液含有10％胎牛血清和0.5％明膠的溶液。
7.如權(quán)利要求5所述的試劑盒，其特征在于制備卡那霉素抗體所需要的免疫抗原是采用戊二醛法或混合酸酐法將卡那霉素與載體蛋白偶聯(lián)得到。
8.如權(quán)利要求1所述的試劑盒，其特征在于卡那霉素標(biāo)準品溶液的濃度分別為0μg/L，0.1μg/L，0.3μg/L，0.9μg/L，2.7μg/L，8.1μg/L。
9.一種檢測樣品卡那霉素藥物殘留的方法，包括步驟(1)樣品前處理；(2)用任一權(quán)利要求1-8所述的試劑盒進行檢測；(3)分析檢測結(jié)果。
10.權(quán)利要求1～8之任一項所述的試劑盒在檢測卡那霉素殘留中的應(yīng)用。
全文摘要
本發(fā)明提供了一種檢測卡那霉素殘留的酶聯(lián)免疫試劑盒，它含有包被有包被原的酶標(biāo)板，酶標(biāo)記物，卡那霉素特異性抗體，卡那霉素標(biāo)準品溶液，底物顯色液，終止液，濃縮洗滌液，濃縮復(fù)溶液。本發(fā)明還公開了一種應(yīng)用上述酶聯(lián)免疫試劑盒檢測卡那霉素的方法，它包括步驟首先進行樣品前處理，然后用試劑盒進行檢測，最后分析檢測結(jié)果。本發(fā)明提供的是檢測動物源性食品如雞肉、雞肝、豬肉、豬肝、奶粉、雞蛋和飼料等樣品中卡那霉素的殘留量的酶聯(lián)免疫試劑盒，其檢測方法操作簡便、費用低廉、靈敏度高，能夠進行現(xiàn)場監(jiān)控且適合大量樣本篩查。
文檔編號G01N33/577GK101017171SQ20071006434
公開日2007年8月15日 申請日期2007年3月12日 優(yōu)先權(quán)日2007年3月12日
發(fā)明者何方洋, 萬宇平, 馮才偉, 吳小平, 馮才茂, 趙正苗, 汪善良, 劉平, 陳煒琳, 郭勇, 余厚美, 馮月君, 蒲小容, 羅貴昆 申請人:北京望爾康泰生物技術(shù)有限公司, 北京望爾生物技術(shù)有限公司