專利名稱：正向和反向abo血型的同步測(cè)定的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及血型測(cè)定的領(lǐng)域，尤其涉及正向和反向血型測(cè)定的同步測(cè)定。
背景技術(shù)：
血型血清學(xué)要求在涉及病人輸血或器官移植之前，需要測(cè)定血液捐獻(xiàn)者和病人受體間的血細(xì)胞相容性。血細(xì)胞相容性是由病人血清中的抗體與捐獻(xiàn)者血細(xì)胞上的抗原不發(fā)生免疫反應(yīng)來確定的。
許多不同的血型抗原被發(fā)現(xiàn)存在于每個(gè)個(gè)體的紅血細(xì)胞的表面上。這些抗原，遺傳基因的產(chǎn)物，以結(jié)合體存在，除了同一對(duì)雙胞胎外，所有個(gè)體間的這些結(jié)合體似乎是獨(dú)特的。血型檢測(cè)一般是通過檢測(cè)紅細(xì)胞來確定哪種抗原存在，哪種抗原不存在的過程，通常采用被檢測(cè)抗原的抗體進(jìn)行檢測(cè)。另外，當(dāng)一個(gè)人在他的或她的紅血細(xì)胞上沒有特定的紅細(xì)胞抗原時(shí)，他的或她的血清可能含有該抗原的抗體?？贵w是否存在于血清中決定于人體的免疫系統(tǒng)以前是否被該特定抗原或與該抗原非常類似的物質(zhì)激發(fā)并產(chǎn)生過應(yīng)答反應(yīng)。例如，紅血細(xì)胞是A型的人，即紅細(xì)胞上具有“A”抗原，他的或她的血清中有抗B抗體。因此，如果此人被輸入B型血液，就會(huì)發(fā)生免疫反應(yīng)而引起嚴(yán)重的臨床后果。
作為另外一方面的考慮，應(yīng)該注意到人體經(jīng)常與花粉、食物、細(xì)菌和病毒中的抗原接觸。這些“天然”抗原中的一些抗原明顯地與于人的血型抗原相類似，以致于它們能刺激幾乎每一個(gè)接觸的人來產(chǎn)生抗體。因此，一定的抗體應(yīng)該存在于紅細(xì)胞中缺少互補(bǔ)抗原的任何人的血清中。對(duì)于ABO系統(tǒng)，這確實(shí)如此，因此，經(jīng)常對(duì)病人/捐獻(xiàn)者的血清進(jìn)行第二種確定試驗(yàn)。該檢測(cè)血清中ABO血型系統(tǒng)中的預(yù)期抗體試驗(yàn)被稱作“反向”血型檢測(cè)。
ABO血型系統(tǒng)的抗體通常是免疫球蛋白M(IgM)。這些抗體的每個(gè)分子具有十個(gè)抗原結(jié)合位點(diǎn)。該IgM抗體足夠大以致跨越了紅血細(xì)胞之間的距離，因此當(dāng)對(duì)其進(jìn)行離心時(shí)，細(xì)胞將以“細(xì)胞-抗體-細(xì)胞-抗體”的網(wǎng)格形式結(jié)合在一起并將保持凝集狀態(tài)。例如，如果抗-A加到血型A或血型AB細(xì)胞中并離心混合物，當(dāng)重新懸浮時(shí)，細(xì)胞將保持凝集的形式。用同樣的抗體，血型O和血型B細(xì)胞將以分離的細(xì)胞形式懸浮。由一種抗體，諸如IgM抗體引起的凝集，被稱作直接凝集。
輸血醫(yī)學(xué)中，由于上述原因，最常進(jìn)行的試驗(yàn)是測(cè)定ABO血型?，F(xiàn)有技術(shù)是分別測(cè)定紅細(xì)胞上的抗原A、B，有時(shí)是A+B一起測(cè)定(正向型)；和確定(交叉檢測(cè))檢測(cè)血清或血漿中的抗-A和抗-B抗體(反向型)。因此，最少采用4次試驗(yàn)，但通常采用7次分試驗(yàn)(樣品紅細(xì)胞上的抗原A、B、A+B；采用A1、A2、B、O試劑紅細(xì)胞，血清/血漿樣品中的抗-A和抗-B)。從這些測(cè)型操作的每一個(gè)試驗(yàn)中得到(正向和反向類型)的結(jié)果是一致的。因此，僅在美國(guó)，血液中心每年大約要進(jìn)行104000000次測(cè)定血型的試驗(yàn)。
自20世紀(jì)初期以來，稱作“蘭斯泰訥”方法(Landsteiner，science 73405(1931))的普通方法與Ashby(J.Exp.Med.29267(1919))和Coombs(Brit.J.Exp.Pathol.26255(1945))的方法的結(jié)合是將病人的紅血細(xì)胞加到含有血型抗體(如抗-A或抗-B)的標(biāo)準(zhǔn)實(shí)驗(yàn)試管中，混合后使得發(fā)生抗體/抗原結(jié)合反應(yīng)，然后離心。如果所測(cè)定的抗原存在，將發(fā)生抗體/抗原的結(jié)合并導(dǎo)致病人紅血細(xì)胞的凝集。用手搖動(dòng)試管來移開“結(jié)塊”的細(xì)胞離心后在試管底部產(chǎn)生的塊結(jié)。然后進(jìn)行主觀判斷，看移開的細(xì)胞是否是“結(jié)塊的”，并且看“結(jié)塊”的程度。
20世紀(jì)中葉，進(jìn)行了許多努力來簡(jiǎn)化所述技術(shù)以減小試驗(yàn)的主觀性和降低錯(cuò)誤率。人們認(rèn)識(shí)到某種程度上，相容性試驗(yàn)結(jié)果的持久性記錄可通過利用可濕性的，即非吸收性的或有些情況下可吸收性的、至少一部分表面積上載有必需的免疫學(xué)試劑的試驗(yàn)載玻片或試驗(yàn)板來獲得。在這方面，專利號(hào)為2770572、2850430、3074853、3272319、3424558、3502437和366642的美國(guó)專利以及歐洲專利申請(qǐng)#0104881-A2描述了這種試驗(yàn)板和相關(guān)儀器的選擇實(shí)例。在微板上進(jìn)行血型鑒定的優(yōu)點(diǎn)包括可簡(jiǎn)單操作大量的樣品，通過儀器和計(jì)算機(jī)的內(nèi)部處理進(jìn)行結(jié)果的搜集和處理，來對(duì)凝集反應(yīng)進(jìn)行客觀的測(cè)定。一些帶有計(jì)算機(jī)控制的自動(dòng)儀器和高通過量的分光光度計(jì)讀取器的昂貴的和專用的系統(tǒng)被引進(jìn)到血庫的自動(dòng)操作系統(tǒng)中(Chung，等.，Transfusion33384(1992))。
商品化的血型測(cè)定試劑盒中引進(jìn)了在填充了凝膠形試劑的特殊微試管中進(jìn)行紅細(xì)胞抗原與抗體反應(yīng)的改進(jìn)檢測(cè)方法。(Lapierre，等.，Transfusion30109(1990))。為了克服以血細(xì)胞凝集反應(yīng)作為血型測(cè)定終點(diǎn)的方法中存在的問題而使用固相技術(shù)已由Scott論述過了(Transfusion Med.Rev.560(1991))。最近，Growe等(Transfusion Med.Rev.1044(1996))報(bào)導(dǎo)了RBC抗原自動(dòng)測(cè)型的完成和應(yīng)用和不但適用于血液中心而且也適用于醫(yī)院輸血實(shí)驗(yàn)室的血清抗體的篩選方法。至少七種不同的具有特定測(cè)型試劑的孔被用于這些方法來測(cè)定樣品的血型。用于大規(guī)模血型的測(cè)定和單個(gè)試管/孔中只有一種抗原或抗體型的測(cè)定的所有方法主要是應(yīng)用了基于凝集反應(yīng)的方法。專利號(hào)為4550017和4748129的美國(guó)專利中報(bào)導(dǎo)了使用熒光標(biāo)記試劑進(jìn)行的分離辨別反應(yīng)已被用于血型的鑒別。
目前的方法是利用紅細(xì)胞的凝集反應(yīng)作為終點(diǎn)。如上所述，這一反應(yīng)是在試管中、載玻片表面上、微板中和柱凝集反應(yīng)試驗(yàn)中完成的。后面的兩種方法可手工或通過自動(dòng)儀器完成。所有的方法都需要從細(xì)胞中分離血清(或血漿)來進(jìn)行正向和反向型測(cè)定。
因此，建立一種在單一試驗(yàn)中進(jìn)行正向和反向型測(cè)定的方法是有意義的，而更好地是，在試驗(yàn)以前不需要分離血液樣品。這種方法將使得一名血庫技術(shù)人員同時(shí)測(cè)定紅細(xì)胞上的血型抗原和血清中具有臨床意義的抗體成為可能。這種方法將大大減少所進(jìn)行的個(gè)體試驗(yàn)數(shù)目，即每年減少了在血液中心進(jìn)行的大約5千萬至1億次試驗(yàn)，明顯地節(jié)省了時(shí)間和費(fèi)用。我們建立了能夠區(qū)別樣品紅細(xì)胞(RBC)和試劑RBC的技術(shù)，因此它們的凝集反應(yīng)是截然不同的。另外，本文公開的新方法使用了標(biāo)記的測(cè)型抗體試劑來識(shí)別它們的反應(yīng)和樣品中預(yù)先形成的抗體。本發(fā)明的試驗(yàn)不需要分離血液樣品就能完成，因此可采用全血(WB)來完成。本文公開的試驗(yàn)可在自動(dòng)儀器上使用，所得的進(jìn)一步的優(yōu)點(diǎn)是不需要從血清中分離細(xì)胞。而且，正向和反向試驗(yàn)的同時(shí)檢測(cè)減少了分型和定型(正向和反向試驗(yàn))所需的試驗(yàn)次數(shù)。

發(fā)明內(nèi)容
在本發(fā)明的熒光標(biāo)記的技術(shù)方案中的正向試驗(yàn)中，單克隆抗體被標(biāo)記。而反向試驗(yàn)中，試劑紅細(xì)胞被標(biāo)記。更加優(yōu)越的是能夠識(shí)別(目測(cè)或通過自動(dòng)讀取器)混合的紅細(xì)胞群。例如，反向試驗(yàn)可以在1次試驗(yàn)中進(jìn)行而不需要2次試驗(yàn)，導(dǎo)致試驗(yàn)次數(shù)的減少。進(jìn)一步應(yīng)用抗體篩選，其中采用2個(gè)細(xì)胞在一個(gè)孔中一起試驗(yàn)來代替2次單獨(dú)試驗(yàn)，減少了試驗(yàn)的次數(shù)。
對(duì)視覺系統(tǒng)的細(xì)胞染色被應(yīng)用到現(xiàn)有的血型試驗(yàn)平板中，其中采用了試管、微板、載玻片和柱凝集技術(shù)(CAT)，以及試驗(yàn)平板如VitrosTM250、750或950(Ortho-Clinical Diagnostics，Inc.，Rochester，NY)玻片方法，Vyas等在專利號(hào)為5776711的美國(guó)專利中公開了一種“同步”ABO和RH(D)血液測(cè)型或抗體篩選方法。然而，為了減少測(cè)定ABO血型的試驗(yàn)次數(shù)而進(jìn)行了類似的嘗試后，本發(fā)明同時(shí)進(jìn)行了樣品紅細(xì)胞ABO的測(cè)型和對(duì)應(yīng)于A和/或B抗原的抗體存在的測(cè)定。另外，本發(fā)明使用的是全血而不是分離的血清和紅細(xì)胞組分。本發(fā)明中標(biāo)記的試劑紅細(xì)胞的使用也不同于Vyas等的合成珠子的使用。
ABO血型的同步分析可采用合適的熒光色素來標(biāo)記試劑紅血細(xì)胞并選擇出標(biāo)記了熒光色素的合適單克隆抗體。細(xì)胞和凝集物可在顯微鏡載玻片或類似的物體上通過激光掃描血細(xì)胞計(jì)數(shù)器進(jìn)行測(cè)定。載玻片上的細(xì)胞被掃描激光光源照射。通常，所使用的激光光源包括藍(lán)色氬離子激光和/或紅色氦-氖激光。熒光和光散射可通過使用激光掃描血細(xì)胞計(jì)數(shù)器(Compucyte，Cambridge，MA)來進(jìn)行測(cè)定。
正向和反向試驗(yàn)的同步測(cè)定中激光掃描血細(xì)胞計(jì)數(shù)器的使用如下所述。當(dāng)一個(gè)細(xì)胞或細(xì)胞簇(凝集物)被激光束掃描時(shí)照射光被細(xì)胞或細(xì)胞簇散射并且散射的強(qiáng)度與細(xì)胞(或凝集物)的大小和形狀有關(guān)。例如，單個(gè)紅細(xì)胞比小凝集物散射的光少，而小凝集物比大凝集物散射的光少。
而且，當(dāng)一個(gè)細(xì)胞或細(xì)胞簇(凝集物)被激光束掃描時(shí)，照射光可使和細(xì)胞結(jié)合的熒光色素發(fā)出熒光。如果每個(gè)細(xì)胞的熒光色素較均勻地與試劑紅細(xì)胞結(jié)合，熒光強(qiáng)度則與凝集物的大小有關(guān)。例如，單個(gè)紅細(xì)胞發(fā)出的熒光比小凝集物少，而小凝集物發(fā)出的熒光比大凝集物少。
在鑒別不同類型的凝聚物方面，散射光和熒光的結(jié)合使用比單使用其中的任何一種光更可靠。
除了這兩種參量外，結(jié)合了熒光素的單克隆抗體也可被用于標(biāo)記需要測(cè)定的細(xì)胞(和凝集物)。通過照射激光束照射細(xì)胞而發(fā)射出的熒光給出關(guān)于這些單克隆抗體與細(xì)胞或凝集物結(jié)合的其它信息來區(qū)分細(xì)胞或凝集物的亞群。
ABO同步測(cè)定的五個(gè)參量的(正向散射，側(cè)向散射，和三個(gè)熒光通道)點(diǎn)圖分析如圖1A-D所示。
本技術(shù)領(lǐng)域的技術(shù)人員可以看出流式細(xì)胞儀或熒光顯微鏡也能用來進(jìn)行ABO血型的同步分析。
在流式細(xì)胞儀中，要測(cè)定的細(xì)胞和凝集物被引入快速移動(dòng)的液流中心并成單行勻速流出小孔。通過周圍的液層作用，顆粒以流體動(dòng)力學(xué)的形式被集中到液流的中心。液流中的細(xì)胞通過測(cè)量站，在此細(xì)胞被光源照射并且測(cè)量是以每分鐘2.5×102到106個(gè)細(xì)胞的速度進(jìn)行。激光源被用于細(xì)胞的測(cè)量；一般使用的激光源包括氬離子激光(UV，藍(lán)和綠光)、氪激光(黃和紅光)、氦-鎘激光(UV和藍(lán)光)、和氦-氖激光(紅光)。熒光和光散射能通過使用流式細(xì)胞儀，例如，CytoronAbsoluteTM流式細(xì)胞儀(Ortho-ClinicalDiagnostic，Inc.，Raritan，NJ)來測(cè)定。
在熒光顯微鏡中，細(xì)胞和凝集物是在顯微鏡載玻片或類似物體上計(jì)數(shù)測(cè)量的。細(xì)胞通常以白光源或基本上單色光源進(jìn)行照射。在此，激光源也可被用作單色光源。凝集物的存在可以采用白光進(jìn)行分析，有關(guān)的熒光分析采用單色光和合適的濾光片。目測(cè)或自動(dòng)讀取可用于這些讀取中的一種或兩種。
目測(cè)技術(shù)可被用于本文的正向和反向血型測(cè)定中。使用柱凝集試驗(yàn)(CAT)的這種方法可采用一個(gè)BioVueTM盒(Ortho-ClinicalDiagnostics，Inc.，Rochester，NY)。這種盒包括加入了微?；|(zhì)的柱子。這種基質(zhì)上覆蓋了分散在緩沖液中的合適血液測(cè)型抗體，形成了初始反應(yīng)帶。
CAT可采用自動(dòng)讀取器系統(tǒng)來翻譯凝集結(jié)果。實(shí)施CAT的ortho AutoVueTM(Ortho-Clinical Diagnostic，Inc.，Rochester，NY)全自動(dòng)化系統(tǒng)中有一個(gè)這種讀取器。自動(dòng)讀取器是一個(gè)由CCD(充電的耦合裝置)單色視頻照相機(jī)、和圖像處理板、和一個(gè)IBM-兼容PC組成的計(jì)算機(jī)控制圖像系統(tǒng)。讀取器首先需要一個(gè)數(shù)字化的反應(yīng)圖像并通過圖像處理軟件進(jìn)行處理來獲得反應(yīng)的特性，然后這些特性被用于反應(yīng)分類程序。這些特性被用來將反應(yīng)分成負(fù)和正兩類，并轉(zhuǎn)化成七種常規(guī)反應(yīng)類型或級(jí)別中的一種。鑒定分析，一種線性統(tǒng)計(jì)模式鑒別工具，是用來區(qū)別負(fù)和弱反應(yīng)的。
然而CAT中使用的另一種讀取器是BioVueTM讀取器2(Ortho-ClinicalDiagnostics，Inc.，Rochester，NY)。這種讀取器有一個(gè)用于十二個(gè)BioVueTM盒的自動(dòng)裝載器和一個(gè)鹵素?zé)粼矗⑶覉D像分析特性允許在RBC波長(zhǎng)基礎(chǔ)上鑒定細(xì)胞，由此轉(zhuǎn)化成凝集反應(yīng)結(jié)果。通過CCD照相機(jī)和數(shù)字板獲得圖像。
本發(fā)明提供了一種分析血液的方法，包括(a)使血液樣品與抗-A和抗-B的抗體反應(yīng)，其中抗體結(jié)合了檢測(cè)標(biāo)記；(b)使血液樣品與帶有標(biāo)記了的A抗原和標(biāo)記了的B抗原的試劑紅血細(xì)胞反應(yīng)；(c)將樣品進(jìn)行血細(xì)胞計(jì)數(shù)分析；和(c)分析血細(xì)胞計(jì)數(shù)的分析結(jié)果來確定ABO血型。血液樣品可以是全血并且上述步驟(a)和(b)中使用的血液樣品可以是相同的未分離樣品，或可以是來源于同一病人的樣品的不同部分。與抗體結(jié)合的檢測(cè)標(biāo)記物可以是熒光標(biāo)記物如FITC、BODIPY、藻膽蛋白(包括藻紅蛋白)、藻膽蛋白的能量轉(zhuǎn)化偶聯(lián)物、多甲藻素葉綠酸蛋白、Cascade Blue、AMCA、活性吲哚羰花青、TRITC、別藻藍(lán)蛋白(APC)、藻青素(PC)、和吲哚二羰花青(Cy5TM)。相反，標(biāo)記了的A抗原和標(biāo)記了的B抗原可以是選自FITC、BODIPY、藻膽蛋白(包括藻紅蛋白)、藻膽蛋白的能量轉(zhuǎn)化偶聯(lián)物、多甲藻素葉綠酸蛋白、Cascade Blue、AMCA、活性吲哚羰花青、TRITC、別藻藍(lán)蛋白(APC)、藻青素(PC)、和吲哚羰花青(Cy5TM)組成的一組熒光染料。
本發(fā)明還提供了血液分析試劑盒，該盒包括(a)第一個(gè)含有標(biāo)記了的抗-A、和抗-B的抗體的容器；和(b)第二個(gè)含有標(biāo)記了的試劑紅血細(xì)胞的容器，其中該標(biāo)記了的試劑紅血細(xì)胞帶有標(biāo)記了的血型A抗原和標(biāo)記了的血型B抗原?？?A抗體可含有IgM-FITC，并且抗-B抗體可含有IgM-FITC。試劑紅血細(xì)胞是血型A1、A2、B和/或O，并且可以用選自于下列熒光染料組的染料進(jìn)行熒光標(biāo)記，該染料組由活性染料(例如熒光素異硫氰酸酯(FITC))、親脂性染料(例如步花青540或DiIC18(3)-DS)、活性親脂性染料、與膜結(jié)構(gòu)反應(yīng)的染料、和結(jié)合了熒光染料的單克隆抗體組成，這些單克隆抗體與紅細(xì)胞上的共同結(jié)構(gòu)反應(yīng)(例如抗-血型糖蛋白-PE偶聯(lián)物)。優(yōu)選地，熒光染料是DiIC18(3)-DS。試劑盒可另外含有一個(gè)柱凝集技術(shù)(CAT)盒如BioVueTM盒。
本發(fā)明用于同步進(jìn)行正向和反向ABO測(cè)型的方法，包括(a)血液樣品與抗-A和抗-B抗體反應(yīng)，其中抗體結(jié)合了檢測(cè)標(biāo)記；(b)血液樣品與帶有標(biāo)記的A抗原和標(biāo)記的B抗原的試劑紅血細(xì)胞反應(yīng)；(c)樣品進(jìn)行血細(xì)胞計(jì)數(shù)或熒光顯微分析；和(d)分析血細(xì)胞計(jì)數(shù)或熒光顯微分析的結(jié)果來確定ABO類型。進(jìn)一步用來分析血液的方法包括(a)血液樣品與抗-A和抗-B抗體反應(yīng)；(b)血液樣品與帶有A抗原的試劑紅血細(xì)胞和帶有B抗原的試劑紅血細(xì)胞反應(yīng)；(c)樣品進(jìn)行目測(cè)分析；和(d)分析目測(cè)分析的結(jié)果來確定ABO類型。(b)步驟中的試劑紅血細(xì)胞可以被染色。所述方法可通過柱凝集技術(shù)來進(jìn)行并且結(jié)果可通過自動(dòng)讀取器如Ortho AutoVueTM系統(tǒng)自動(dòng)讀取器或Ortho BioVueTM讀取器2而自動(dòng)讀取。


圖1是同步正向和反向ABO血型測(cè)型的四色激光掃描血細(xì)胞計(jì)數(shù)分析的圖示說明。
圖1A表示抗-B FITC和A標(biāo)記的RBC與A型全血的正向(X-軸)和側(cè)向(Y-軸)散射(分別是綠色的最大象素和桔黃色的最大象素)。在凝集物區(qū)域中的側(cè)向散射圖中沒有測(cè)到結(jié)果。而且，在綠色相對(duì)于桔黃色的圖中，從側(cè)向散射中也沒有得到進(jìn)行進(jìn)一步分析的結(jié)果。
圖1B表示抗-B FITC和A標(biāo)記的RBC與B型全血的正向(X-軸)和側(cè)向(Y-軸)散射(分別是綠色的最大象素和桔黃色的最大象素)。在凝集物區(qū)域中的側(cè)向散射圖中測(cè)到了結(jié)果。當(dāng)在綠色相對(duì)于桔黃色的圖中進(jìn)一步分析了這些結(jié)果后，我們確定存在試劑細(xì)胞(桔黃色陽性)的凝集物，也存在試驗(yàn)rbcs(綠色陽性)的凝集物。還測(cè)到了一些具有混合熒光(混合的綠色和桔黃色)的凝集物。
圖1C表示抗-B FITC和A標(biāo)記的RCB與AB型全血的正向(X-軸)和側(cè)向(Y-軸)散射(分別是綠色的最大象素和桔黃色的最大象素)。在凝集物區(qū)域中的側(cè)向散射圖中測(cè)到了結(jié)果。當(dāng)在綠色相對(duì)于桔黃色的圖中進(jìn)一步分析了這些結(jié)果后，我們沒有發(fā)現(xiàn)試劑細(xì)胞(桔黃色陽性)的凝集物，但確定存在試驗(yàn)rbcs(綠色陽性)的凝集物。還測(cè)到了一些具有混合熒光(混合的綠色和桔黃色)的凝集物。
圖1D表示抗-B FITC和A標(biāo)記的RCB與O型全血的正向(X-軸)和側(cè)向(Y-軸)散射(分別是綠色的最大象素和桔黃色的最大象素)。在凝集物區(qū)域中的側(cè)向散射圖中測(cè)到了結(jié)果。當(dāng)在綠色相對(duì)于桔黃色的圖中進(jìn)一步分析了這些結(jié)果后，我們發(fā)現(xiàn)了試劑細(xì)胞(桔黃色陽性)的凝集物，但沒有發(fā)現(xiàn)試驗(yàn)rbcs(綠色陽性)的凝集物。
圖2是同步正向和反向測(cè)型試驗(yàn)的預(yù)測(cè)結(jié)果示意圖。圖2A表示標(biāo)記了的A型試劑RBCs和標(biāo)記抗-B與A型全血的混合沒有產(chǎn)生凝集反應(yīng)。
圖2B是標(biāo)記了的A型試劑RBCs和標(biāo)記抗-B與B型全血的混合產(chǎn)生了BRBCs與抗-B(綠色)和抗-A-A型試劑細(xì)胞(桔黃色)的凝集物的示意圖。
圖2C是標(biāo)記了的A型試劑RBCs和標(biāo)記抗-B與AB型全血的混合產(chǎn)生了ABRBC-抗-B(綠色)的凝集物的示意圖。
圖2D是標(biāo)記了的A型試劑RBCs和標(biāo)記抗-B與O型全血的混合產(chǎn)生了抗-A-A試劑細(xì)胞(桔黃色)的凝集物的示意圖。
圖3是綠色凝集物、桔黃色凝集物和混合的桔黃色/綠色凝集物的示意圖，其中每一種凝集物將在綠色相對(duì)于桔黃色的最大象素圖譜上呈現(xiàn)不同的散射。
圖4是桔黃色凝集物、綠色凝集物、和混合的桔黃色/綠色凝集物在綠色相對(duì)于桔黃色最大象素圖譜上的相對(duì)位置的示意圖。
圖5是桔黃色凝集物、綠色凝集物、和混合的桔黃色/綠色凝集物在綠色相對(duì)于桔黃色最大象素散射圖譜上的相對(duì)位置(密度)的示意圖。
圖6是CAT系統(tǒng)中B血清反向試驗(yàn)?zāi)繙y(cè)的示意圖。標(biāo)記了的試劑A和B細(xì)胞與B血清混合，產(chǎn)生了褐色凝集物，離心后，發(fā)現(xiàn)該凝集物在CAT系統(tǒng)中的凝膠柱的頂部；未反應(yīng)的標(biāo)記試劑B細(xì)胞則被發(fā)現(xiàn)在柱的底部。
具體實(shí)施例方式
根據(jù)本發(fā)明，同步正向和反向ABO血型檢測(cè)以不同的技術(shù)方案進(jìn)行了描述。本發(fā)明可與柱凝聚試驗(yàn)(CAT)反應(yīng)和以O(shè)rtho-ClinicalDiagnostics，Inc.，Rochester，New York盒的形式生產(chǎn)和銷售的、商標(biāo)為BIOVUETM的分離管一起使用。結(jié)果可以采用計(jì)算機(jī)化的圖像系統(tǒng)AutoVueTM自動(dòng)讀取器，或BioVueTM讀取器2來測(cè)定，兩種系統(tǒng)如上所述。
本文公開的進(jìn)行試驗(yàn)的其它方法是采用了試管、微板、載玻片和試驗(yàn)平板如VitrosTM載玻片方法。結(jié)果也可采用流式細(xì)胞儀如，CytoronAbsoluteTM或激光掃描血細(xì)胞計(jì)數(shù)器或上述列舉的方法來測(cè)定。
一般用于反向測(cè)型試驗(yàn)的試劑RBCs在其表面上具有A1、A2、B或沒有ABO抗原(A1型、A2型、B型、O型)。這些細(xì)胞用于檢測(cè)引起試劑RBCs的凝集反應(yīng)的反應(yīng)抗體。在正向型試驗(yàn)中，單克隆抗-A和抗-B被用來檢測(cè)在樣品紅細(xì)胞表面上的它們各自對(duì)應(yīng)的抗原存在。
本發(fā)明也教導(dǎo)了同步測(cè)定其它血型抗原的存在，包括，例如，D、C、E、c、e、M、N、S、s、P1、Lea、Leb、K、k、Jsa、Fya、Fyb、Jka、Jkb、Lua、和Lub、和其它多種血型抗原。本發(fā)明的方法能進(jìn)行正向或反向型血型試驗(yàn)的熒光或視覺檢測(cè)，在一個(gè)優(yōu)選的技術(shù)方案中，能同步進(jìn)行正向和反向血型試驗(yàn)。
熒光檢測(cè)系統(tǒng)在熒光檢測(cè)的技術(shù)方案中，試劑RBCs、單克隆抗-A(從小鼠單克隆IgM純化的)或抗-B抗體(也是從小鼠單克隆IgM純化的)、或所有三種，被熒光染料標(biāo)記，(1)試劑RBCs與循環(huán)抗體的凝集物；和(2)單克隆抗-A或抗-B抗體與RBC表面抗原的凝集物可通過使用488nm的激光，例如使用計(jì)算機(jī)細(xì)胞激光掃描血細(xì)胞計(jì)數(shù)器進(jìn)行檢測(cè)?；蛘?，抗血清不需進(jìn)行熒光標(biāo)記，但可利用光散射進(jìn)行檢測(cè)。結(jié)果可進(jìn)一步通過激光流式細(xì)胞儀，例如使用OrthoCytoronAbsoluteTM流式細(xì)胞儀進(jìn)行檢測(cè)。也可以使用熒光顯微鏡。
對(duì)于同步正向和反向型試驗(yàn)，在有A型全血的情況下，試驗(yàn)過程中使用了標(biāo)記了的B型試劑RBCs和FITC標(biāo)記了的抗-A。見圖1A和2A。見例1。FITC-標(biāo)記的抗-A能夠凝集全血樣品中的A型紅細(xì)胞而產(chǎn)生綠色的凝集物。全血的血漿中的抗-B能夠凝集桔黃色的標(biāo)記的試劑B型RBCs，而產(chǎn)生桔黃色的凝集物。采用B、AB和O型全血也可進(jìn)行類似的試驗(yàn)。見圖1B-D和2B-D。
基于綠色和/或桔黃色凝集物的出現(xiàn)，可觀察到與四種主要ABO血型的每一種相關(guān)的四種不同的反應(yīng)模式。見表1。因此，在一種試驗(yàn)中，ABO血型通過同步的正向和反向測(cè)型試驗(yàn)進(jìn)行測(cè)定。相反，在有A、B、AB或O型全血存在的情況下，標(biāo)記了的A1型試劑RBCs和FITC標(biāo)記了的抗-B混合在一起。再次觀察到了基于出現(xiàn)的綠色和/或桔黃色凝集物的四種不同的凝集反應(yīng)模式，每一種模式對(duì)應(yīng)于一種特定的ABO血型。因此為了測(cè)定和確定ABO血型需要進(jìn)行兩種試驗(yàn)。見表1。一些具有混合熒光的凝集物(混合的綠色和桔黃色)被測(cè)定出來。見圖3-5。這些凝集物產(chǎn)自于未標(biāo)記細(xì)胞的凝集物上或附近的標(biāo)記的細(xì)胞的俘獲/鄰近或產(chǎn)生于標(biāo)記的細(xì)胞的凝集物上或附近的標(biāo)記抗體的俘獲或鄰近?；旌系木G色/桔黃色凝集物的存在并不干擾結(jié)果的闡明。采用試驗(yàn)2產(chǎn)生的對(duì)應(yīng)于每一種ABO血型的數(shù)據(jù)表如表1所示。
表1測(cè)定和確定ABO血型的反應(yīng)模式

表1中的結(jié)果是由計(jì)算機(jī)細(xì)胞激光掃描血細(xì)胞計(jì)數(shù)器測(cè)出的。然而，也設(shè)計(jì)了其它檢測(cè)凝集物的方法，這些方法可以有標(biāo)記的抗血清也可以沒有標(biāo)記的抗血清，包括但并不限于上述討論的方法。盡管本文所述的各種試驗(yàn)可單獨(dú)進(jìn)行，或任意組合進(jìn)行，但本發(fā)明優(yōu)選的方法是同步進(jìn)行正向和反向試驗(yàn)。
熒光染料用來標(biāo)記試劑細(xì)胞(用于反向測(cè)定)和單克隆抗-A和抗-B的抗體(用于正向檢測(cè))。用于標(biāo)記試劑細(xì)胞的優(yōu)選的熒光標(biāo)記包括1，1’-二十八烷基-3，3，3’，3’-四甲基吲哚羰花青-5，5’-二磺酸(DiIC18(3)DS)。當(dāng)用488nm的蘭氬激光激發(fā)時(shí)這種染料使得細(xì)胞發(fā)出桔黃色熒光。用于這一技術(shù)方案的其它熒光標(biāo)記物包括活性染料(例如熒光素異硫氰酸酯(FITC))、親脂性染料(例如步花青540)、活性親脂性染料(DiI的氯甲基苯甲酰氨基和甲基苯甲酰氨基的衍生物、DiI的磺化衍生物和DiO的磺化衍生物)，與膜結(jié)構(gòu)發(fā)生作用的染料，和結(jié)合了熒光染料的單克隆抗體，這些單克隆抗體與紅細(xì)胞上的共同結(jié)構(gòu)具有反應(yīng)活性(例如抗-血型糖蛋白-PE偶聯(lián)物)。
標(biāo)記單克隆抗體優(yōu)選的熒光標(biāo)記物包括熒光素異硫氰酸酯(FITC)。當(dāng)用488nm的蘭氬激光激發(fā)時(shí)，F(xiàn)ITC標(biāo)記物使得結(jié)合了這種抗體的任何細(xì)胞發(fā)出綠色熒光。FITC屬于蛋白-活性的、可用488nm的蘭氬激光激發(fā)的低分子量熒光染料中的一員，其中任何一種這種染料可用于本發(fā)明單克隆抗體的標(biāo)記。這類染料的另一個(gè)例子是BODIPY，(分子探針，Eugene，OR)，當(dāng)用這種激光激發(fā)時(shí)，其也能發(fā)出綠色熒光。其它潛在的有用熒光色素包括藻膽蛋白(例如.，藻紅素(PE)、藻膽蛋白的能量轉(zhuǎn)化偶聯(lián)物(例如.，DuoChromeTM(BectonDickinson，San Jose，CA)、CY5TM(Ortho-Clinical Diagnostic，Inc.，Raritan，NJ)和其它)、和多甲藻素葉綠素蛋白(PerCPTM(Becton Dickinson，San Jose，CA))。前面的染料都采用488nm的蘭氬激光激發(fā)，但其它激發(fā)波長(zhǎng)光源和發(fā)光染料的結(jié)合也是可行的。一些例子包括采用紫外光激發(fā)的Cascade藍(lán)和7-氨基-4-甲基香豆素-3-乙酸(AMCA)；采用綠光激發(fā)的藻紅素、活性吲哚羰花青(Cy3TM)、和四甲基若丹明異硫氰酸酯(TRITC)；采用紅光激發(fā)的別藻藍(lán)蛋白(APC)、藻青素(PC)、和吲哚二羰花青(Cy5TM)。
作為所述熒光檢測(cè)系統(tǒng)的替換，不需要用熒光標(biāo)記物(FITC)標(biāo)記抗血清。凝集物的檢測(cè)可以通過將光散射設(shè)置在適合于這種大小和類型粒子的位置上進(jìn)行測(cè)定，如本技術(shù)領(lǐng)域的技術(shù)人員所知的。
反向試驗(yàn)條件為了優(yōu)化凝集反應(yīng)的結(jié)果，首先要確定標(biāo)記試劑RBC和標(biāo)記單克隆抗體與全血的有效比例。因此凝集反應(yīng)的結(jié)果被最大化并且不采用過量標(biāo)記。確定合適的試驗(yàn)比例而降低了假陰性的概率，所以特異性得到了改進(jìn)。
RBCs的標(biāo)記對(duì)于使用DiIC18(3)-DS標(biāo)記試劑RBC的反向試驗(yàn)，試劑RBCs相對(duì)于全血的理想比例是根據(jù)試劑RBCs的這種比例特異凝集全血中的相應(yīng)抗體的能力來確定的。尤其是，標(biāo)記A1試劑RBCs被以不同的比例與B型全血混合。以5％、10％和40％的試劑RBC懸浮液進(jìn)行試驗(yàn)來確定有效的試劑RBC濃度。采用了2μM的DiI-DS的溶液。通過CytoronAbsoluteTM流式細(xì)胞儀分析標(biāo)記的RBCs，并且測(cè)了平均熒光值。大約5％到大約10％的RBC濃度是有效的，最優(yōu)選地是大約5％的RBC懸浮液，這是由于使用較低濃度的RBCs，平均熒光值較亮。然而，可以使用能夠提供充分可測(cè)熒光或高于背景的可測(cè)熒光物質(zhì)數(shù)量的試劑RBCs的濃度，并且從實(shí)用的角度出發(fā)，濃度可高到不被禁止的濃度，例如試劑的體積。表2表示在所用DiI-DS的濃度下，通過對(duì)不同比例的試劑RBCs進(jìn)行試驗(yàn)所獲得的平均熒光值。
表2

DiI-DS的濃度范圍在本發(fā)明的反向型試驗(yàn)中，為了確定有效的DiI-DS濃度范圍，在5％的RBC懸浮液中測(cè)試了五種不同的DiI-DS的終濃度。使用CytoronAbsoluteTM對(duì)這些細(xì)胞進(jìn)行了分析。測(cè)量了平均熒光值和％CV(變化系數(shù))。從5微摩爾到40微摩爾的DiI-DS濃度試驗(yàn)結(jié)果為陽性，或在這一技術(shù)方案中，采用低于20％的百分CV能產(chǎn)生足夠亮度信號(hào)的任何濃度都是可行的。由于采用最小的CV產(chǎn)生最亮的信號(hào)，所以四十微摩爾的溶液是優(yōu)選的。見表3表3

反向測(cè)型-DiI標(biāo)記的RBCs和全血(WB)下一步是確定反應(yīng)條件，其中桔黃色的標(biāo)記A型試劑rbcs在B型或O型全血中凝集，但在A型或AB型全血中不凝集。相反地，也確定出了標(biāo)記B型試劑RBCs與A型或O型全血形成桔黃色的凝集物，但與B型或AB型全血不形成凝集物。有色凝集物是通過在計(jì)算機(jī)細(xì)胞激光掃描血細(xì)胞計(jì)數(shù)器上在488nm的藍(lán)氬激光下的最大象素圖譜上的桔黃色和綠色信號(hào)的相對(duì)位置進(jìn)行測(cè)量的。
全血相對(duì)于標(biāo)記的RBCs的比例是通過制備不同的混合物并采用標(biāo)準(zhǔn)的血庫血清學(xué)技術(shù)進(jìn)行測(cè)定的。結(jié)果既可采用肉眼測(cè)視也可采用顯微測(cè)視。5％的懸浮液可用于全血試驗(yàn)。可觀察到凝集反應(yīng)；然而，我們發(fā)現(xiàn)RBCs混合物中的RBCs的濃度不足以給出穩(wěn)定的凝集反應(yīng)結(jié)果。見表4。
表4

★陰性對(duì)照5％標(biāo)記的RBC懸浮液被濃縮到40％并將其中的5μL加到5μL的全血中。結(jié)果很好，觀察到了凝集反應(yīng)，因此沒有再進(jìn)行其它比例的試驗(yàn)。
正向測(cè)型試驗(yàn)-FITC標(biāo)記的抗體和全血同樣地，對(duì)于使用標(biāo)記的單克隆抗體的正向測(cè)型試驗(yàn)，基于標(biāo)記的抗體的比例特異地凝集全血中對(duì)應(yīng)的細(xì)胞抗原的能力，首先需要測(cè)定標(biāo)記的抗體相對(duì)于全血的合適比例。尤其是，用A型全血滴定FITC標(biāo)記的抗-A來確定反應(yīng)條件，該反應(yīng)條件是在A型或AB型的全血中形成綠色凝集物而在B型或O型全血中不形成凝集物。另外，再確定標(biāo)記的抗-B與B型或AB型全血形成綠色凝集物而不與A型或O型全血形成凝集物的反應(yīng)條件。有色凝集物通過在計(jì)算機(jī)細(xì)胞激光掃描血細(xì)胞計(jì)數(shù)器上在488nm的藍(lán)氬激光下的最大象素圖譜上的桔黃色和綠色信號(hào)的相對(duì)位置進(jìn)行測(cè)量。
下一步確定的是熒光標(biāo)記物相對(duì)于抗體的比例。標(biāo)記的抗體部分是以3種不同的稀釋度、以50μL的體積與全血進(jìn)行試驗(yàn)。見表5。
表5


★陰性對(duì)照★★如AABB技術(shù)手冊(cè)所定義的級(jí)別系統(tǒng)，第12版；607頁。
采用LSC，A型1∶100的稀釋度給出了最好的結(jié)果，因此被選出作進(jìn)一步的試驗(yàn)。基于這些結(jié)果，50μL的FITC∶抗體以1∶100的稀釋度和5μL的DiI-DS標(biāo)記的RBCs作進(jìn)一步的試驗(yàn)。然而，所使用的標(biāo)記物抗體的范圍可以是能在背景(在低端)和前區(qū)(在頂端)上產(chǎn)生可測(cè)熒光的任何濃度。
目測(cè)系統(tǒng)改變紅細(xì)胞顏色的能力使得能夠通過目測(cè)或分光光度測(cè)定法(通過吸收或反射)同時(shí)檢測(cè)2個(gè)細(xì)胞群，即，不需要檢測(cè)熒光。例如，受氰化物或疊氮化物的作用，紅細(xì)胞由亮紅色轉(zhuǎn)化為褐色。然后從褐色凝集物可以目測(cè)出紅色凝集物。雖然本技術(shù)方案中改變紅細(xì)胞血紅蛋白固有的顏色也是可行的，但簡(jiǎn)單地將有色基附著到或結(jié)合到紅細(xì)胞上能夠檢測(cè)到其光譜特性的變化。
在目測(cè)技術(shù)方案中，通過柱凝集方法(CAT)來進(jìn)行正向和反向試驗(yàn)，例如，通過采用BioVueTM盒。利用柱凝集試驗(yàn)裝置，如本文描述的通過使用填加了本發(fā)明的基質(zhì)的圓柱形裝置來進(jìn)行正向血型測(cè)型分析。含有抗血清的單克隆抗體或多克隆抗體被分散在生理學(xué)上相容的緩沖液中，然后加到微粒基質(zhì)中來浸濕這些微?；|(zhì)，并從基質(zhì)向進(jìn)口擴(kuò)展以形成初始反應(yīng)帶。這種抗體的合適用量可由本技術(shù)領(lǐng)域的技術(shù)人員根據(jù)抗體的抗原親和性和特異性、按常規(guī)方法進(jìn)行優(yōu)化?？贵w被分散到緩沖液中，該緩沖液中也可含有本領(lǐng)域已知的合適添加劑，諸如高分子量的聚合物等，來增強(qiáng)它們的活性和避免非特異性結(jié)合。
這些實(shí)例包括聚乙烯、葡聚糖、明膠、和聚乙二醇。也可加入低分子量聚合物來增加溶液的濃度。
在這一實(shí)例中，如果加入相對(duì)B型血細(xì)胞的抗體，病人樣品中的B型血細(xì)胞將與抗體結(jié)合，在基質(zhì)頂部附近形成捕獲的凝集細(xì)胞層。在這個(gè)實(shí)例中，A型細(xì)胞不凝集并被離心到裝置的底部。通常，病人細(xì)胞中可能含有弱反應(yīng)的突變體。遍布在柱基質(zhì)中的較小的散射凝集物表示中等程度的反應(yīng)，而陰性反應(yīng)是在基質(zhì)柱的底部形成扣狀體。圖6表示采用柱凝集反應(yīng)方法的反向試驗(yàn)，其中試劑A和B細(xì)胞分別被標(biāo)記。按照產(chǎn)品說明將樣品血清輸送到柱的頂部，然后按照所述方法溫育柱管并離心。試劑A型細(xì)胞與存在的抗A抗體發(fā)生凝集，而試劑B細(xì)胞則流到柱底，表明樣品血清是B型。
試劑RBC(Affirmgen@A1和B型細(xì)胞，Ortho-ClinicalDiagnostics，Raritan，NJ)用0.2％終濃度的疊氮鈉(NaN3)進(jìn)行處理。NaNa減少血紅蛋白中的鐵離子，導(dǎo)致顏色由普通的紅色變?yōu)樯詈稚蚶跎?。源于同一份Affirmgen的未經(jīng)處理的細(xì)胞被用作對(duì)照。未處理的對(duì)照和處理的試驗(yàn)細(xì)胞分別與BioVueTM反向盒中的B型血清按照產(chǎn)品說明(10μL3-5％的紅細(xì)胞和40μL血清；然后按照廠家說明在BioVue離心機(jī)中離心5分鐘)進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。B血清將凝集A1細(xì)胞但不凝集B細(xì)胞。除了未處理細(xì)胞是紅色、處理過的細(xì)胞是褐色，沒發(fā)現(xiàn)未處理的與處理的細(xì)胞的凝集物之間有其它的不同。參見本文中的實(shí)施例2和表6。
通過所述目測(cè)系統(tǒng)對(duì)凝集反應(yīng)結(jié)果進(jìn)行的自動(dòng)測(cè)定可利用本文描述的兩種系統(tǒng)AutoVueTM自動(dòng)讀取器計(jì)算機(jī)化圖像系統(tǒng)或BioVueTM讀取器2來完成。
如本文所公開的，如果需要肉眼觀察凝集物，優(yōu)選的是先采用適合于實(shí)現(xiàn)目測(cè)凝集反應(yīng)的染料對(duì)附著在細(xì)胞上的任何無色細(xì)胞或無色顆粒進(jìn)行染色。紅血細(xì)胞的血紅蛋白能自然提供這種合適的顏色，所以不需要染色。直接凝集反應(yīng)實(shí)驗(yàn)可利用上述ABO紅血細(xì)胞來完成，還可利用含有D、C、E、c、e、M、N、S、s、P1、Lea、Leb、K、k、Jsa、Fya、Fyb、Jka、Jkb、Lua、和Lub抗原等的血細(xì)胞。類似地，當(dāng)血清用來檢測(cè)對(duì)應(yīng)于特殊抗原或含有抗原的細(xì)胞的抗體的存在時(shí)，它們可與已知抗原進(jìn)行混合。如果未知血清含有對(duì)應(yīng)于所提供的已知抗原的抗體時(shí)，當(dāng)它們從基質(zhì)中流動(dòng)或流下時(shí)，將產(chǎn)生凝集反應(yīng)物并被截留下來。而陰性血清將不發(fā)生反應(yīng)，也沒有凝集物被截留下來。
在血液血清學(xué)一文中詳盡地闡明了本發(fā)明的方法的應(yīng)用。然而，應(yīng)當(dāng)理解的是在本發(fā)明可行性范圍內(nèi)進(jìn)行的同步正向和反向測(cè)型結(jié)合分析包括任何與粒子結(jié)合的結(jié)合配體，這種粒子在正向和反向試驗(yàn)中，由于配體與其結(jié)合底物結(jié)合的結(jié)果而進(jìn)行反應(yīng)。例如，通常采用從樣品RBC’s中分離出的血漿或血清進(jìn)行的“抗體篩選試驗(yàn)”能夠采用全血與本文公開的標(biāo)記試劑紅細(xì)胞來進(jìn)行。另外，血清或血漿也可被使用，但通過混合1未標(biāo)記試劑紅細(xì)胞和1標(biāo)記試劑紅細(xì)胞使得抗體篩選或抗體鑒定所需進(jìn)行的試驗(yàn)次數(shù)減少了50％。盡管紅細(xì)胞正向和反向測(cè)型系統(tǒng)已被進(jìn)行了說明，但本技術(shù)領(lǐng)域的技術(shù)人員將會(huì)理解其它系統(tǒng)也能以這種方式進(jìn)行優(yōu)化。
下列實(shí)施例只是用來說明但不是對(duì)本發(fā)明保護(hù)范圍的限制。
實(shí)施例1熒光檢測(cè)技術(shù)方案組A-試劑制備通過往DiI-DS的1mg小瓶中加入1mL的乙醇(Sigma，St Louis MO)，并充分混合來制備親脂性的、熒光膜標(biāo)記物、1，1’-二十八烷基-3，3，3’，3’-四甲基吲哚羰花青-5，5’-二磺酸(DiI-DS)(Molecular Probes Inc.，Eugene，OR)的儲(chǔ)存溶液，濃度為1mg/mL。該儲(chǔ)存溶液可在室溫下避光保存多達(dá)6個(gè)月。
DiI-DS的實(shí)驗(yàn)溶液通過用Hanks平衡鹽溶液(HBSS)(Sigma)稀釋儲(chǔ)存溶液到80μM而制得。棄掉未使用的實(shí)驗(yàn)溶液。
組B-紅血細(xì)胞(RBC)的熒光標(biāo)記采用Vacutainer腺嘌呤檸檬酸鹽葡萄糖(ACD)保存試管(Becton-Dickinson，F(xiàn)ranklin Lakes，NJ)從血型是A1、B和O的捐獻(xiàn)者身上收集全血。RBCs在大約3000Xg下離心分離5分鐘并在3到5mL的磷酸鹽緩沖鹽水(PBS)(Gibco)中洗滌兩次，并且每次洗滌后，在大約3000Xg下離心分離3到5分鐘。以HBSS作為稀釋液來制備A型5％的RBC懸浮液。
等體積(0.1到5mL)的5％的RBC懸浮液和DiI-DS實(shí)驗(yàn)溶液在一支試管中進(jìn)行混合并在37℃下溫育30分鐘，避光保存。每十分鐘手搖一次試管。標(biāo)記的RBCs用3到5mL的PBS洗滌三次，在大約3000Xg下離心分離5分鐘并重新懸浮在HBSS中成為5％的溶液。
通過裝有免疫計(jì)數(shù)IITM軟件的CytoronAbsoluteTM流式細(xì)胞儀(Ortho-Clinical Diagnostics，Inc.，Raritan，NJ)確定桔黃色熒光。
基于光散射參數(shù)，對(duì)RBCs進(jìn)行了門控，并且測(cè)量到了與門控的RBC結(jié)合的熒光。并且在背景上的熒光的測(cè)量結(jié)果表明標(biāo)記充分。用等體積的PBS(0.1到5mL)代替熒光標(biāo)記物溫育相同的RBCs作為陰性對(duì)照同時(shí)進(jìn)行試驗(yàn)。
組C-熒光素異硫氰酸酯(FITC)標(biāo)記抗體小鼠單克隆抗-A、克隆MHO4、和小鼠單克隆抗-B、克隆NB10.5A5是以組織培養(yǎng)形式從Ortho-Clinical Diagnostics，Inc.生產(chǎn)裝置中獲得的。單克隆抗體被部分純化并用標(biāo)準(zhǔn)方法進(jìn)行了濃縮。
用PH值為9.5的碳酸鹽緩沖液透析純化了的抗-A和抗-B，并按照標(biāo)準(zhǔn)方法用FITC進(jìn)行標(biāo)記。采用尺寸排阻層析將FITC標(biāo)記的抗體從沒有被FITC標(biāo)記的抗體中分離出來。在280nm和492nm下測(cè)定各部分的吸收值。每一部分的F/P(熒光素/蛋白)摩爾比例采用下列公式計(jì)算F＝A495/0.15P＝[A280-(A495×0.32)]/1.2F/P比例＝(F/P)×2.39具有最高的F/P比例的三個(gè)部分被用在本發(fā)明的熒光同步正向和反向試驗(yàn)的技術(shù)方案中。

組D-全血(WB)中的同步正向/反向測(cè)型試驗(yàn)和試驗(yàn)闡明-激光掃描血細(xì)胞計(jì)數(shù)器(LSC)我們制備了以抗-B FITC標(biāo)記的抗體稀釋的DiI-DS A型標(biāo)記RBCs。用0.5mL含有2％的小牛血清白蛋白和1％疊氮鈉的PBS將抗體稀釋到1∶100。九個(gè)體積的稀釋抗體與一個(gè)體積的標(biāo)記細(xì)胞相混合。在下列亞組1至4中，55μL的標(biāo)記細(xì)胞/抗體混合物被加到5μL的全血中。用Clay-Adams(Parsippany，NJ)血清離心機(jī)以大約3500rpm的轉(zhuǎn)速將試管離心15秒鐘。RBCs被輕輕重新懸浮起來。通過將3μL的反應(yīng)混合物加到7μL的PBS中，來制備載玻片，然后蓋上蓋玻片。
采用LSC(Compucyte，Cambridge，MA)對(duì)載玻片進(jìn)行分析。
亞組-1采用本文組-D的材料和方法，對(duì)A型全血進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。由于A型全血不含對(duì)應(yīng)于A紅細(xì)胞的抗體，所以與標(biāo)記的試劑紅細(xì)胞不形成凝集物。另外，由于A型全血細(xì)胞不帶有B抗原，所以與抗-B FITC不形成凝集物。圖1A表示抗-B FITC和A型標(biāo)記的RBCs與A型全血的正向(X-軸)和側(cè)向(Y-軸)散射(分別是綠色最大象素和桔黃色最大象素)。如所示，在凝集物區(qū)域的側(cè)向散射圖中沒有檢測(cè)到什么結(jié)果。而且，從側(cè)向散射圖中沒有得到用來在綠色相對(duì)于桔黃色的圖上作進(jìn)一步分析的結(jié)果。
亞組-2采用本文組-D的材料和方法，對(duì)B型全血接著進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。由于B型全血含對(duì)應(yīng)于A型紅細(xì)胞的抗體，所以能與標(biāo)記的試劑紅細(xì)胞形成凝集物。另外，由于B型全血細(xì)胞表達(dá)B抗原，所以與抗-B FITC形成凝集物。圖1B表示抗-BFITC和A型標(biāo)記的RBCs與B型全血的正向(X-軸)和側(cè)向(Y-軸)散射(分別是綠色最大象素和桔黃色最大象素)。凝集物區(qū)域的側(cè)向散射圖中檢測(cè)到了結(jié)果。如所示，當(dāng)在綠色相對(duì)于桔黃色的圖上進(jìn)一步分析這些結(jié)果時(shí)，我們確認(rèn)既產(chǎn)生了試劑細(xì)胞的凝集物(桔黃色陽性)，也產(chǎn)生了試驗(yàn)RBCs的凝集物(綠色陽性)。
亞組-3采用本文組-D的材料和方法，對(duì)AB型全血接著進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。由于AB型全血不含對(duì)應(yīng)于A紅細(xì)胞的抗體，所以與標(biāo)記的試劑紅細(xì)胞不形成凝集物。然而，由于AB型全血細(xì)胞表達(dá)B抗原，所以與抗-B FITC形成凝集物。圖1C表示抗-B FITC和A型標(biāo)記的RBCs與AB型全血的正向(X-軸)和側(cè)向(Y-軸)散射(分別是綠色最大象素和桔黃色最大象素)。凝集物區(qū)域的側(cè)向散射圖中檢測(cè)到了結(jié)果。如所示，當(dāng)在綠色相對(duì)于桔黃色的圖上進(jìn)一步分析這些結(jié)果時(shí)，我們沒有觀察到試劑細(xì)胞的凝集物(桔黃色陽性)，但確認(rèn)存在試驗(yàn)RBCs的凝集物(綠色陽性)。
亞組-4最后，采用本文組-D的材料和方法，對(duì)O型全血進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。由于O型全血含對(duì)應(yīng)于A型紅細(xì)胞的抗體，所以與標(biāo)記的試劑紅細(xì)胞形成凝集物。然而，由于O型全血細(xì)胞不表達(dá)B抗原，所以與抗-B FITC不形成凝集物。圖1D表示抗-B FITC和A型標(biāo)記的RBCs與O型全血的正向(X-軸)和側(cè)向(Y-軸)散射(分別是綠色最大象素和桔黃色最大象素)。凝集物區(qū)域的側(cè)向散射圖中檢測(cè)到了結(jié)果。如所示，當(dāng)在綠色相對(duì)于桔黃色的圖上進(jìn)一步分析這些結(jié)果時(shí)，我們觀察到了試劑細(xì)胞的凝集物(桔黃色陽性)，但沒有觀察到試驗(yàn)RBCs rbcs的凝集物(綠色陽性)。
實(shí)施例2目測(cè)技術(shù)方案組A-有色紅細(xì)胞的制備A1和B紅細(xì)胞型的商品制劑(Affirmagen)是從Ortho-ClinicalDiagnostics，Inc.(Raritan，NJ)購買的。從小瓶中取出A1型RBCs的兩個(gè)1mL等份試樣，并放入分開的試管中。其中一個(gè)等份的試樣與20μL的10％的疊氮鈉混合(Mallinckrodt，Paris，KY)。另一個(gè)等份試樣不進(jìn)行處理并用作對(duì)照。將每支試管蓋好并在室溫下溫育16小時(shí)。經(jīng)過夜處理后，疊氮鈉處理的RBC呈褐色，而未經(jīng)處理的對(duì)照細(xì)胞仍保持紅色。
組B-反向BioVue柱試驗(yàn)-雙柱試驗(yàn)在標(biāo)準(zhǔn)BioVueTM反向盒中采用一只柱中加入10μL的A1型細(xì)胞和40μL的B型血清和另一只柱中加入10μL的B型細(xì)胞和40μL的B型血清(表6中的柱3和柱4)對(duì)疊氮鈉處理的細(xì)胞進(jìn)行試驗(yàn)。對(duì)照細(xì)胞，未經(jīng)處理的A1型和B型細(xì)胞，分別在柱1和柱2中進(jìn)行試驗(yàn)。按照生產(chǎn)廠家的說明書進(jìn)行離心后，在珠柱的頂部觀察到了凝集的A1細(xì)胞、未經(jīng)處理的對(duì)照細(xì)胞(柱1)和處理的試驗(yàn)細(xì)胞(柱3)，這表明B型血清中存在著抗-A。在柱的底部觀察到了未凝集的B細(xì)胞、未經(jīng)處理的對(duì)照細(xì)胞(柱2)和處理的試驗(yàn)細(xì)胞(柱4)，這表明沒有抗-B。未經(jīng)處理的對(duì)照細(xì)胞呈紅色而經(jīng)處理的試驗(yàn)細(xì)胞呈褐色。這些結(jié)果表明對(duì)A1型和B型細(xì)胞進(jìn)行處理并不降低它們?cè)谥橹械哪芰Α?br> 組C-反向BioVue柱試驗(yàn)-單柱試驗(yàn)在實(shí)施例2的組B中，A1型和B型細(xì)胞分別在單獨(dú)的柱中進(jìn)行試驗(yàn)來確定樣品的反向型。接下來，在一只柱中將10μL的未經(jīng)處理的A1型細(xì)胞(紅)和10μL的經(jīng)處理的B型細(xì)胞(褐色)與40μL的B型血清進(jìn)行混合。離心后，觀察到兩種不同的細(xì)胞群。在珠柱的頂部觀察到了凝集的(A1)細(xì)胞和在柱(表6中的柱5)的底部觀察到了未凝集的褐色(B)細(xì)胞。結(jié)果表明1個(gè)柱(1個(gè)試驗(yàn))可代替正常的2個(gè)柱來測(cè)定正確的反向血型。另外，按照此組B對(duì)經(jīng)處理的10μLA1型細(xì)胞和未經(jīng)處理的10μLB型細(xì)胞進(jìn)行試驗(yàn)并且所得結(jié)果能檢測(cè)出凝集的褐色(A1)細(xì)胞和未凝集的紅(B)細(xì)胞(表6中的柱6)。
由組B和C得到的結(jié)果如表6所示。見圖6。
表62個(gè)不同的細(xì)胞群的目測(cè)和鑒別BioVue反向柱標(biāo)號(hào)

注釋所有的柱含有40μL的B血清和所示的紅細(xì)胞。
Untr，未經(jīng)處理對(duì)照細(xì)胞Tr，NaN3處理的細(xì)胞
權(quán)利要求
1.一種在單柱中對(duì)血液樣品進(jìn)行抗體測(cè)試的方法，包括(a)混合血液樣品與帶有第一抗原的試劑紅血細(xì)胞和帶有第二抗原的試劑紅血細(xì)胞，其中所述紅血細(xì)胞群之一被染色；(b)使混合物凝集；(c)對(duì)混合物在單柱中進(jìn)行目測(cè)或自動(dòng)計(jì)算機(jī)化圖象分析；和(d)檢測(cè)和鑒別抗體。
2.如權(quán)利要求1所述的方法，其中血液樣品是血清或血漿。
3.如權(quán)利要求1所述的方法，其中進(jìn)行目測(cè)或自動(dòng)計(jì)算機(jī)化圖象分析的單柱選自管和柱凝集技術(shù)。
4.如權(quán)利要求3所述的方法，其中柱凝集反應(yīng)技術(shù)是柱凝集反應(yīng)試驗(yàn)和試劑盒形式的分離管。
5.如權(quán)利要求4所述的方法，其中采用自動(dòng)計(jì)算機(jī)化圖象系統(tǒng)來闡明凝集反應(yīng)結(jié)果。
6.一種在單柱中進(jìn)行抗體測(cè)試的血液分析凝集測(cè)試試劑盒，包括(a)含帶有第一抗原的第一試劑紅血細(xì)胞群和帶有第二抗原的第二試劑紅血細(xì)胞群的容器，其中所述第一或第二試劑紅血細(xì)胞群之一被可區(qū)分性地染色(b)進(jìn)行抗體測(cè)試的反應(yīng)裝置，其中所述反應(yīng)裝置由管或柱凝集反應(yīng)管構(gòu)成；以及(c)在單柱中進(jìn)行抗體測(cè)試的指導(dǎo)書，以便檢測(cè)和鑒別作為抗體測(cè)試對(duì)象的抗體，其中對(duì)單柱采用CCD照相機(jī)和數(shù)字板進(jìn)行目測(cè)或自動(dòng)計(jì)算機(jī)化圖象分析，以檢測(cè)和鑒別抗體。
7.權(quán)利要求6的試劑盒，其中試劑紅血細(xì)胞選自以下組A1、A2、B、O、D、C、E、c、e、M、N、S、s、P1、Lea、Leb、K、k、Jsa、Fya、Fyb、Jka、Jkb、Lua和Lub。
8.權(quán)利要求7的試劑盒，其中進(jìn)行抗體測(cè)試的反應(yīng)裝置是柱凝集測(cè)試反應(yīng)管。
9.一種在單柱中進(jìn)行反向ABO測(cè)型的血液分析凝集測(cè)試試劑盒，包括(a)含帶有A抗原的第一試劑紅血細(xì)胞群和帶有B抗原的第二試劑紅血細(xì)胞群的容器，其中所述第一或第二試劑紅血細(xì)胞群之一被可區(qū)分生地染色；(b)進(jìn)行反向ABO測(cè)型的反應(yīng)裝置，其中所述反應(yīng)裝置由管或柱凝集反應(yīng)管構(gòu)成；以及(c)在單柱中進(jìn)行反向ABO測(cè)型的指導(dǎo)書，其中對(duì)單柱采用CCD照相機(jī)和數(shù)字板進(jìn)行目測(cè)或自動(dòng)計(jì)算機(jī)化圖象分析，以檢測(cè)和鑒別抗體。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種在單柱中對(duì)血液樣品進(jìn)行抗體測(cè)試的方法，包括(a)混合血液樣品與帶有第一抗原的試劑紅血細(xì)胞和帶有第二抗原的試劑紅血細(xì)胞，其中所述紅血細(xì)胞群之一被染色；(b)使混合物凝集；(c)對(duì)混合物在單柱中進(jìn)行目測(cè)或自動(dòng)計(jì)算機(jī)化圖象分析；和(d)檢測(cè)和鑒別抗體。
文檔編號(hào)G01N33/555GK1982894SQ200610169088
公開日2007年6月20日 申請(qǐng)日期2000年6月8日 優(yōu)先權(quán)日1999年6月8日
發(fā)明者T·J·默科利諾, K·J·雷斯 申請(qǐng)人:奧索臨床診斷有限公司