專利名稱：：一種檢測蓖麻毒素的免疫層析試紙及其制備方法
技術(shù)領(lǐng)域：
：本發(fā)明涉及一種蓖麻毒素的檢測試紙及其制備方法。
背景技術(shù)：
：蓖麻毒素(Ricintoxin,RT)是一種從蓖麻種子的胚乳中提取的植物蛋白毒素，分子量約為64kDa，兩條多肽鏈分別稱為RTA鏈(RicintoxinA，RTA)和RTB鏈(RicintoxinB，RTB)。RTA是活性鏈，分子量約為32kDa。RTB是結(jié)合鏈，分子量約為34kDa，兩者間由二硫鍵連接。由于蓖麻毒素來源廣泛，毒性較高，已被外軍作為武器化的一種毒素加以研究，禁止化學(xué)和生物武器公約把蓖麻毒素列為最為嚴(yán)格的控制對象之一。尤其是自美國"9.11"恐怖襲擊后，隨著多個(gè)恐怖組織和極端分子研制、擁有并攜帶蓖麻毒素驚現(xiàn)英國首都倫敦，使這種致命的毒素成為最有可能被用作恐怖襲擊的生物毒素。由于氣溶膠化的蓖麻毒素微粒無色無味，不易被發(fā)現(xiàn)，因此偵檢非常困難。歷史上最初是用動(dòng)物實(shí)驗(yàn)測定蓖麻毒素的毒性和定量檢測。現(xiàn)階段則根據(jù)蓖麻毒素所具有的理化特性、生化特性和免疫原性發(fā)展出多種檢測法，其中以免疫檢測法為主[11。免疫檢測法多是依賴于抗原抗體反應(yīng)的免疫學(xué)方法，包括多克隆和(或)單克隆抗體為基礎(chǔ)的放射免疫法或酶聯(lián)免疫吸附法(ELISA)，免疫層析試驗(yàn)和電化學(xué)發(fā)光生物傳感器，其中ELISA法是國際規(guī)定的檢測蓖麻毒素的金標(biāo)準(zhǔn)。但是,不同的檢測方法檢測蓖麻毒素的敏感性有差別。其中，免疫熒光技術(shù)(FIA)的靈敏度為420pg/mL，放射免疫技術(shù)(RIA)為0.006pmol，ELISA法則可檢測至100pg/mL2'3'。另外，與傳感器技術(shù)相結(jié)合，現(xiàn)已開發(fā)用于偵檢和鑒定蓖麻毒素和其他生物毒素的生物傳感器，如電化學(xué)發(fā)光傳感器(ECL)和光纖生物傳感器，靈敏度均在ng-fg水平。其中，美國所研制的生物傳感器始終處于世界領(lǐng)先的地位[4_8]。目前尚未發(fā)現(xiàn)利用免疫膠體金技術(shù)制備的免疫層析試紙檢測蓖麻毒素的報(bào)道。
發(fā)明內(nèi)容本發(fā)明的目的是提供一種檢測蓖麻毒素的免疫層析試紙。本發(fā)明所提供的檢測蓖麻毒素的免疫層析試紙，包括吸水紙墊、緊密連接于所述吸水紙墊的包被有抗蓖麻毒素A鏈蛋白抗體的纖維膜、緊密連接于所述纖維膜上的含有抗蓖麻毒素B鏈蛋白抗體的免疫金膠體探針的金標(biāo)墊和緊密連接于所述金標(biāo)墊的樣品墊。為了使用更加方便，所述吸水紙墊的下面還緊密連接有背板，背板的材料優(yōu)選的是塑料。本發(fā)明的另一個(gè)目的是提供制備上述檢測蓖麻毒素的免疫層析試紙的方法。本發(fā)明所提供的制備檢測蓖麻毒素的免疫層析試紙的方法，包括以下步驟1.制備抗蓖麻毒素A鏈蛋白抗體，選取一株抗蓖麻毒素A鏈蛋白單克隆抗體的雜交瘤細(xì)胞株免疫雌性Balb/C小鼠，一周后取腹水；將該抗體溶液噴到纖維膜上，室溫晾干，然后將其粘貼在吸水紙墊上。2.制備抗蓖麻毒素B鏈蛋白抗體肌肉注射重組蓖麻毒素B鏈蛋白0.2mg+等體積福氏完全佐劑，一周后lmg蛋白+等體積福氏不完全佐劑加強(qiáng)免疫，4周后加強(qiáng)免疫蛋白lmg，3天后抽血。3.制備抗蓖麻毒素B鏈蛋白抗體的免疫金膠體探針(1)將O.OP/。HAuCU水溶液，加熱煮沸，每100mlHAuCU溶液進(jìn)行如下操作攪動(dòng)下加入1.5ml的1。/。檸檬酸三鈉水溶液，直到液體顏色穩(wěn)定成葡f酒紅色，得到膠體金溶液；(2)確定最低偶聯(lián)抗體濃度調(diào)節(jié)膠體金溶液pH9.0，將抗蓖麻毒素B鏈蛋白抗體稀釋2mg/mL，并依次加入到lml膠體金溶液中IOOW、90W、80W、70W、60W、50W、40Ml、3(M、20W、l(M、(M，混勻后于室溫下放置5min，加入10%NaCl水溶液0.1ml，混勻，靜置，10—20min后觀察液體顏色，膠體金溶液顏色不變時(shí)所含最少抗體量，為穩(wěn)定lml膠體金溶液所需最低偶聯(lián)抗體量；(3)將終濃度為0.08mg/mL上述最低偶聯(lián)抗體量的抗蓖麻毒素B鏈蛋白抗體加入到50ml膠體金溶液中，混勻后得到抗蓖麻毒素B鏈蛋白抗體的免疫膠體金探針溶液。4.將玻璃纖維膜或樹脂浸泡到上述免疫膠體金探針溶液，得到金標(biāo)墊，干燥后粘貼在步驟1得到的粘貼在吸水紙墊上的噴有抗蓖麻毒素A鏈蛋白抗體的纖維膜上；5.在步驟4中的金標(biāo)墊上面再粘貼樣品墊，得到檢測蓖麻毒素的免疫層析試紙。為了使用更加方便，所述吸水紙墊的下面還粘貼有背板。在實(shí)際應(yīng)用中，所述纖維膜為硝酸纖維膜，寬度控制在2.5—3mm為宜；所述金標(biāo)墊的材料為玻璃纖維膜、聚酯等，寬度為5-7mm;所述樣品墊為玻璃纖維膜，寬度為20—30mm。蓖麻毒素對人具有極強(qiáng)的毒性，毒性至少是有機(jī)磷神經(jīng)毒劑VX的380倍，小鼠腹腔LD50為3.0pg/kg。利用本發(fā)明所研制的膠體金ICA檢測試紙檢測蓖麻毒素，非專業(yè)人員按照說明書即可操作，標(biāo)本處理簡單，5—10min觀察結(jié)果，最少可檢出蓖麻毒素20ng/ml，檢測靈敏度不受標(biāo)本來源的影響。該蓖麻毒素免疫檢測試紙具有簡便性、敏感性、特異性和快速性的優(yōu)點(diǎn)，適于臨床和現(xiàn)場使用。圖1為特異性試驗(yàn)結(jié)果圖2為靈敏性試驗(yàn)結(jié)果圖3為穩(wěn)定性試驗(yàn)結(jié)果圖4為模擬檢測"環(huán)境污染物"試驗(yàn)結(jié)果具體實(shí)施例方式實(shí)施例1檢測蓖麻毒素的免疫層析試紙的準(zhǔn)備一、材料氯金酸(HAuCl44H20)，分析純，上海試劑一廠；檸檬酸三鈉(Na3C6H507*2H20)，分析純，北京化工廠；蓖麻毒素，本實(shí)驗(yàn)室按常規(guī)純化方法制備；牛血清白蛋白(BSA)，分析純，進(jìn)口分裝；聚乙二醇(PEG)，分析純，進(jìn)口分裝；硝酸纖維膜，購于美國Millipore公司，HFB504;玻璃纖維膜，購于美國Millipore.公司；重組蓖麻毒素B鏈蛋白91:采用密碼子優(yōu)化軟件對RTB編碼基因序列重新優(yōu)化設(shè)計(jì)，以18條長片段寡核苷酸引物經(jīng)兩步重疊PCR合成RTB基因片段，并在RTB的C端引入6xHis標(biāo)簽序列，插入表達(dá)載體pBV220，轉(zhuǎn)化&o//DH5a獲得表達(dá)工程菌株，誘導(dǎo)表達(dá)后純化，得到重組蓖麻毒素B鏈蛋白；重組蓖麻毒素A鏈蛋白1，用PCR方法從克隆質(zhì)粒pUC19-RTA中擴(kuò)增出蓖麻毒素A(RTA)鏈基因，序列分析正確后，亞克隆到原核表達(dá)質(zhì)粒pET-His中，構(gòu)建重組表達(dá)質(zhì)粒pET-HisRTA，再轉(zhuǎn)化到五.co//BL21(DE3)plys中獲得表達(dá)工程菌株BL21/pET-HisRTA,誘導(dǎo)表達(dá)并純化后得到重組蓖麻毒素A鏈蛋白；天然蓖麻毒素[11將蓖麻籽去殼后先用0.01111018(:(117.2灘提，再用硫酸鉸鹽析。取40%-80%飽和度的鹽析組分，用適量PBS溶解，透析去鹽，離心去沉淀，上清液即為粗提液。然后利用蓖麻毒素和凝集素對D-半乳糖基結(jié)合的特性，用Sepharose4B親和層析法從粗提液中提取這兩種蛋白質(zhì)，再根據(jù)兩者分子量的差異，用凝膠過濾法純化得到蓖麻毒素；重組相思豆毒素A鏈蛋白(ABRaA)1121:根據(jù)對密碼子的偏好性，設(shè)計(jì)并合成相互重疊的24條長片段寡核苷酸引物，以兩步PCR法合成了優(yōu)化的ABRaA基因，克隆到pGEM-T載體后又亞克隆至pET-His載體。轉(zhuǎn)入五.co//中，誘導(dǎo)表達(dá)可溶性蛋白，親和純化后得到重組蛋白；福氏佐劑思語偉業(yè)生物技術(shù)有限公司吸水紙墊購于美國Millipore公司塑料背板購于美國Millipore公司二、方法結(jié)果1、制備抗蓖麻毒素B鏈蛋白抗體肌肉注射重組蓖麻毒素B鏈蛋白0.2mg+等體積福氏完全佐劑，一周后lmg蛋白+等體積福氏不完全佐劑加強(qiáng)免疫，4周后加強(qiáng)免疫蛋白lmg，3天后抽血。2、抗蓖麻毒素A鏈蛋白抗體以重組蓖麻毒素A鏈蛋白(RTA)作為抗原，利用雜交瘤技術(shù)成功制備四株鼠抗RTA單克隆抗體，從中選取一株抗蓖麻毒素A鏈蛋白單克隆抗體的雜交瘤細(xì)胞株免疫雌性Balb/C小鼠，一周后取腹水，并用ProteinG柱純化。3、制備抗蓖麻毒素B鏈蛋白抗體的免疫金膠體探針1)將O.Oiy。HAuCU水溶液，加熱煮沸，每100mlHAuCU溶液進(jìn)行如下操作攪動(dòng)下加入1.5ml的1%檸檬酸三鈉水溶液，直到液體顏色穩(wěn)定成葡萄酒紅色，得到膠體金溶液；2)確定最低偶聯(lián)抗體濃度調(diào)節(jié)膠體金溶液pH9.0，將抗蓖麻毒素B鏈蛋白抗體稀釋2mg/mL，并依次加入到lml膠體金溶液中l(wèi)OO)il、90|il、80^1、70|il、60^1、50W、40^1、30^1、20^x1、lOpl、Opl，混勻后于室溫下放置5min，加入100/。NaCl水溶液0.1ml，混勻，靜置，10—20min后觀察液體顏色，膠體金溶液顏色不變時(shí)所含最少抗體量，為穩(wěn)定lml膠體金溶液所需最低偶聯(lián)抗體量；3)將終濃度為0.08mg/mL上述最低偶聯(lián)抗體量的抗蓖麻毒素B鏈蛋白抗體加入到50ml膠體金溶液中，混勻后得到抗蓖麻毒素B鏈蛋白抗體的免疫膠體金探針溶液。4、膠體金顆粒與免疫金探針的電鏡觀察于透射電鏡下，可見膠體金顆粒呈圓形或橢圓形，大小均勻一致，計(jì)數(shù)100個(gè)金顆粒，顆粒直徑約為25nm;膠體金偶聯(lián)抗體后，可見金顆粒外圍有明顯的低電子密度暈圈，表面吸附有蛋白。結(jié)果表明，按照以上技術(shù)路線制備的膠體金顆粒和免疫金探針合格。5、檢測蓖麻毒素的免疫層析試紙的制備檢測蓖麻毒素的免疫層析試紙由吸水紙墊、硝酸纖維膜、金標(biāo)墊和玻璃纖維膜樣品墊四部分組成。用濃度為0.01M,pH7.0-7.5的PBS稀釋抗蓖麻毒素A鏈蛋白抗體到lmg/ml，用CAMAG公司的CamagLinomat5TLC點(diǎn)樣儀噴到2.5mm寬的NC膜上，室溫晾干，然后將其用雙面膠粘貼在吸水紙墊上；將5—7mm寬的玻璃纖維膜浸泡到制備好的免疫膠體金探針溶液中制備成金標(biāo)墊，4。C放置30min，一50'C冷凍抽干后，將該金標(biāo)墊用雙面膠粘貼在上述包被有抗蓖麻毒素A鏈蛋白抗體的硝酸纖維膜上，再在該金標(biāo)墊上面用雙面膠粘貼25mm寬的玻璃纖維膜樣品墊，最后將它們用雙面膠粘貼在塑料背板上，按所需大小切割，即為檢測蓖麻毒素的免疫層析試紙，加干燥劑后密封保存。實(shí)施例2蓖麻毒素?fù)鞙y試驗(yàn)1、ICA試紙條條檢出蓖麻毒素的敏感性以軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院微生物流行病所病原微生物生物安全國家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室純化制備的蓖麻毒素[111為標(biāo)準(zhǔn)，經(jīng)生理鹽水有限稀釋后，作為樣品檢測液，取蓖麻毒素ICA檢測試紙，分別浸入不同蓖麻毒素濃度樣品檢測液中，5min后開始觀察結(jié)果，15min觀察終止。結(jié)果報(bào)告出現(xiàn)l條紅色(對照)沉淀線為陰性，即無蓖麻毒素檢出；出現(xiàn)2條紅色(樣品和對照)沉淀線為陽性，即有蓖麻毒素檢出。本發(fā)明所提供的蓖麻毒素ICA試紙條條可檢出20ng/ml。文獻(xiàn)報(bào)道，ELISA方法檢測蓖麻毒素純品的敏感性為100pg/mL。2、ICA檢測試紙對近緣毒素-相思豆毒素的檢出以及BSA和PBS的交叉反應(yīng)將重組相思豆毒素A鏈蛋白[121、BSA分別稀釋成濃度為0.2mg/ml、lmg/ml，并結(jié)合PBS溶液，用ICA試紙條條檢測，結(jié)果表明，該試紙不與重組相思豆毒素A鏈蛋白、BSA和PBS有交叉反應(yīng)。3、模擬標(biāo)本中的蓖麻毒素檢測選用幾種常見蓖麻毒素污染樣本，如水源、血清樣本、土壤樣本、普通肉湯培養(yǎng)基等用于制備模擬標(biāo)本。先稱取土壤lg，搗碎置容器中，加入5ml無菌生理鹽水，充分?jǐn)嚢杌靹?，靜置沉淀，血清lml取上清，牛奶1:4稀釋，普通肉湯用原液。每種樣品一式4份，l份取上清作陰性對照，其他3份分別加入濃度100ng/ml、50ng/ml、20ng/ml的蓖麻毒素，作為模擬陽性標(biāo)本。ICA試紙條條檢測模擬標(biāo)本中蓖麻毒素的結(jié)果表明ICA試紙條條檢測的特異性不受標(biāo)本來源的影響，檢測靈敏度均為20ng/ml。主要參考文獻(xiàn)1.PeruskiAH，PeruskiLFJRImmunologicalmethodsfordetectionandidentificationofinfectiousdiseaseandbiologicalwarfareagents.ClinDiagnLabImmunol.2003，10(4):506-513.2.NarangU，AndersonGP，LiglerFS，"a/.Fiberoptic-basedbiosensorforricin.BiosensBioelectron.1997，12(9-10):937-945.3.ShyuRH，ShyuHF，LiuHW，e/a/.Colloidal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