專利名稱：基于磁顆粒和微電極的體外檢測方法、試劑盒及儀器的制作方法
專利說明基于磁顆粒和微電極的體外檢測方法、試劑盒及儀器 本發(fā)明涉及生物醫(yī)學領域的一種體外檢測方法、試劑盒及儀器，更確切的說，是一種基于磁納米顆粒和金納米顆粒針對生物大分子物質進行體外檢測的技術、相關試劑盒及由此技術開發(fā)的一種自動化檢測儀器。目前生物檢測通常采用光學方法，借助熒光標記、化學發(fā)光、酶聯(lián)等手段，但是光學方法存在靈敏度較低，穩(wěn)定性差，所需設備昂貴，不便于攜帶等缺點。
近年來，隨著納米技術、微電子技術和生物技術的融合，多學科交叉滲透，隨之產生了電學檢測方法。美國Northwest University的Mirkin教授率先實現(xiàn)了無需PCR擴增的炭疽DNA電學檢測(Science 295，1503-1506，2002)，其簡要過程如下(見

圖1)1)常規(guī)的光刻法制備微電極，將DNA探針分子(P1)共價固定在微電極間隙；2)待測DNA分子、納米金顆粒標記的DNA探針分子(P2)與P1探針分子雜交，納米金顆粒將在微電極間隙聚集；3)銀染液處理，在金顆粒表面選擇性的沉積一層銀，改變電極間的電阻(銀染也是信號放大的一個步驟)；4)同時監(jiān)測電流，探測DNA分子識別過程。這種基于的微電極的生物分子探測方法無需復雜的光學系統(tǒng)，便于檢測儀器的集成，可做成攜式的檢測儀器；對于使用者而言，操作簡單。
但是，這種檢測方法也有其局限性，1)由于探針分子與基片的相互作用，探針分子間的相互作用，液體中離子在探針分子上的吸附，基片表面復雜的形貌，所以探針分子很難均一的分布、定向的排列在基片上；2)只有接近基片的待測分子才能與固定在基片上的探針分子雜交，大部分的檢測分子游離于溶液，使得檢測靈敏度大大減低(見圖2)；3)銀染過程中部分Ag+會形成Ag顆粒，非特異性吸附在電極基片上，背景噪聲增加(Nano Letters 5，1475-1482 2005)；4)微電流檢測在液相中進行，難以避免溶液中離子對電流的干擾，因此信噪比較低。針對現(xiàn)有技術的上述缺點，本發(fā)明所要達到的技術目的是提供一種高靈敏、特異性好的檢測方法，并開發(fā)一種檢測儀，從而解決目前存在設備昂貴笨重，靈敏度不高的不足。
技術方案，本發(fā)明提出液相雜交、銀染，固相微電極檢測的路線(見圖4)，步驟如下1)富集，利用特異性標記物1(L1)修飾的磁納米顆粒在液相中富集待檢測物質，待測物質可以為核酸、蛋白，包括DNA、RNA、抗原、抗體等；2)形成磁-金顆粒復合體，可加入特異性標記物2(L2)、金納米顆粒，或直接加入金納米顆粒標記的L2；3)銀染，加入銀染液在磁-金顆粒復合體表面選擇性沉積一層銀，4)分離，外加磁場分離銀染后的復合體；5)電學檢測，將銀染后復合體轉移至微電極上，干燥處理后測其阻抗。
液相雜交，有以下優(yōu)點1)采用葡聚糖或瓊脂糖或殼聚糖修飾的磁顆粒，能夠減少雜交、銀染過程中的非特異性吸附；2)磁顆粒直徑小于1μm，特異性標記物L1可以較均勻、有序地修飾到磁納米顆粒表面；3)磁納米顆粒大大增加了特異性標記物分子與待測樣品的反應界面，能夠有效地富集待測物質(見圖3)；4)磁納米顆粒均一分散在反應液中，反應更加接近生理環(huán)境。均勻有序的修飾，高反應界面，液相中均一分散使得反應時間更快、靈敏度更高、特異性更好。
固相檢測，有以下優(yōu)點1)銀染后，磁場分離磁-金顆粒復合體，去除未經Au催化產生的Ag顆粒，將復合體重新分散到溶液中，轉移到微電極上，減少了Ag+在溶液中自發(fā)還原產生的Ag顆粒引起的背景噪聲(Nano Letters 5，1475-1482 2005)；2)電學信號可靠，重復性提高；3)雖然檢測物質不同，但銀染及電學測量過程一樣，可實現(xiàn)一個微電極芯片上同時測量多種物質或一種物質的多個樣本。因此，我們的方案，更加靈敏、快速、穩(wěn)定，特異性地檢測生物大分子。
特異性標記物，根據(jù)核酸雜交及抗原抗體特異性結合原理，特異性標記物為DNA、RNA、抗原或抗體，其共同特點是L1、L2能同時和待測物質結合。
金顆粒、銀顆?？梢源呋疉g+在其表面還原成Ag，所以兩者均可用于結合特異性標記物L2(Science 295，1503-1506，2002)。最近有文獻報道一些酶也可催化Ag+在其表面還原成Ag，生成Ag顆粒，所以這些酶也可用來結合L2(Nano Letters5，1475-1482 2005)。
銀染后復合體的分離方法，通過外加磁場分離銀染后復合體具有快速、簡便的優(yōu)勢，另外也可通過傳統(tǒng)的離心法分離復合體。
電學檢測儀，由信號發(fā)生器、放大器及顯示器三部分組成。信號發(fā)生器產生-1～1V的電壓信號，施加于微電極上。通過放大器放大，經顯示器繪制電流-電壓曲線?？梢越Y合自動化裝置，構建一種生物大分子的雜交、銀染、均借助一集成的自動化檢測裝置完成的自動化檢測儀，無需手工逐步操作。圖1為Mirkin教授首創(chuàng)的電學檢測方法路線圖，其雜交、銀染及微電流檢測均在基片上進行，1為電極，2為探針1，3為待測物質，4為金顆粒標記的探針2，5為Ag+。
圖2為基片上的雜交，只有接近基片的待測分子才能與固定在基片上的探針分子雜交，大部分的檢測分子游離于溶液，使得檢測靈敏度大大減低。
1為能于探針分子結合的金顆粒，2為特異性探針分子，3為基片。
圖3為基于磁顆粒的液相雜交，既增大了反應界面，又接近生理環(huán)境，最大限度的結合了待檢分子，提高了靈敏度。
1為分散到溶液中的磁顆粒，2為能夠結合磁顆粒的特異性標記物，3為待測物質。
圖4為本發(fā)明所創(chuàng)新的液相雜交、固相檢測生物分子電學檢測路線圖1為磁顆粒，2為能夠結合磁顆粒的特異性標記物L1，3為待測物質，4為特異性標記物L2，5為能和L2結合的金顆粒，6為銀染后形成的銀染磁-金顆粒復合體，7為外加磁場，8為微電極檢測儀。
圖5為本發(fā)明的檢測方法檢測炭疽核酸片斷。
圖6為本發(fā)明的檢測方法檢測鼠AA98單克隆抗體。生物樣本檢測實例1利用本發(fā)明的實驗方法進行炭疽DNA的檢測，所用50nm磁顆粒由Dynal公司購買，探針1在磁顆粒上標記參照說明書，銀染試劑盒Sigma公司購買，銀染過程參照說明書，金顆粒標記的探針2見文獻(Science 295，1503-1506，2002)，炭疽核酸片斷購買于北京賽百盛公司，間隙為50μm的微電極通過光刻方法制備，具體實施步驟如下1)富集50μL的炭疽DNA探針(P1)修飾的磁納米顆粒，50μL的炭疽DNA樣品混合，室溫下雜交20分鐘，外加磁場吸附磁顆粒，PBS清洗三次后重新分散到100μL雜交液中。
2)形成磁顆粒-金納米顆粒復合體加入金顆粒標記探針2(P2)10μL、室溫下雜交20分鐘，形成復合體，外加磁場吸附復合體，PBS清洗三次。
3)銀染加入20μL銀染液A和20μL銀染液B，反應5分鐘，外加磁場分離得到黑色沉淀，PBST清洗一次，蒸餾水清洗兩次后重新分散到20μL溶液。
4)電學檢測沉淀物轉移至微電極上，55℃加熱10分鐘使水分蒸發(fā)，干燥后測其阻抗。為檢測這種基于納米顆粒和微電極電學檢測方法的靈敏度，將炭疽DNA片斷進行稀釋，50μL溶液中分別含有104，105，106和107個炭疽DNA片斷。純凈水作空白對照。結果顯示炭疽DNA片斷個數(shù)的對數(shù)和測得相應電阻的對數(shù)呈近似線性關系(如圖5)，可以用于定量分析?？瞻讓φ战M的測得電阻為106，含有104個炭疽DNA片斷組測得電阻為103，信號噪聲比約103。同探針分子固定在電極間基片上的檢測，信號噪聲比提高了兩個數(shù)量級以上(Science295，1503-1506，2002)。
生物樣本檢測實例2利用本發(fā)明的實驗方法進行鼠AA98單克隆抗體的檢測，所用50nm磁顆粒由Dynal公司購買，A蛋白在磁顆粒上標記參照說明書，銀染試劑盒、金顆粒標記的二抗Sigma公司購買，銀染過程參照說明書，間隙為50μm的微電極通過光刻方法制備，具體實施步驟如下1)富集100μL的A蛋白修飾的磁納米顆粒，100μL的鼠AA98單克隆抗體混合，室溫下120分鐘，外加磁場吸附磁顆粒，PBS清洗三次后重新分散到100μL雜交液中。
2)形成磁顆粒-金納米顆粒復合體加入金顆粒標記的二抗20μL、室溫下雜交20分鐘，形成復合體，外加磁場吸附復合體，PBS清洗三次。
3)銀染加入20μL銀染液A和20μL銀染液B，反應5分鐘后外加磁場分離得到黑色沉淀，外加磁場吸附，PBST清洗一次，蒸餾水清洗兩次后重新分散到20μL溶液。
4)電學檢測沉淀物轉移至微電極上，55℃加熱10分鐘使水分蒸發(fā)，干燥后測其阻抗。為檢測這種基于納米顆粒和微電極電學檢測方法的靈敏度，將抗體進行稀釋，100μL溶液中分別含有10pg，100pg，1ng，10ng抗體。純凈水作空白對照。結果顯示抗體濃度的對數(shù)和測得相應電阻的對數(shù)呈近似線性關系，可以用于定量分析(如圖6)。
權利要求
1.一種基于磁顆粒和微電極的體外檢測方法，其特征在于包括下列步驟，1)設計特異性標記物1(L1)、特異性標記物2(L2)，使L1和L2能同時結合待測物質，L1固定到磁顆粒上，L2能結合金顆粒；2)在溶液中固定有L1的磁顆粒、L2、金顆粒及待測物質結合形成磁-金顆粒復合體；3)加入銀染液在復合體表面選擇性沉積銀；4)分離銀染復合體并轉移至微電極上，干燥處理后通過檢測儀測其阻抗。
2.根據(jù)權利要求1所述的基于磁顆粒和微電極的體外檢測方法，其特征在于所述待測物質是核酸和蛋白質。
3.根據(jù)權利要求2所述的基于磁顆粒和微電極的體外檢測方法，其特征在于所述核酸是DNA和RNA。
4.根據(jù)權利要求2所述的基于磁顆粒和微電極的體外檢測方法，其特征在于所述核酸包括禽流感的RNA、cDNA以及炭疽DNA。
5.根據(jù)權利要求2所述的基于磁顆粒和微電極的體外檢測方法，其特征在于所述蛋白質是抗原或抗體。
6.根據(jù)權利要求2所述的基于磁顆粒和微電極的體外檢測方法，其特征在于所述蛋白質包括腫瘤標記物。
7.根據(jù)權利要求6所述的基于磁顆粒和微電極的體外檢測方法，其特征在于所述的腫瘤標記物包括甲胎蛋白、癌胚抗原、前列腺特異性抗原、CA-199、CA-125、CA-153。
8.根據(jù)權利要求1所述的基于磁顆粒和微電極的體外檢測方法，其特征在于，用銀顆?；蚰艽呋疉g+在其表面選擇性還原成銀的酶替換權利要求1中的金顆粒。
9.根據(jù)權利要求1所述的基于磁顆粒和微電極的體外檢測方法，其特征在于，所述銀染復合體分離方法是外加磁場或離心沉淀。
10.根據(jù)權利要求1所述的基于磁顆粒和微電極的體外檢測方法，其特征在于所述磁顆粒表面修飾有葡聚糖或瓊脂糖或殼聚糖。
11.根據(jù)權利要求1所述的基于磁顆粒和微電極的體外檢測方法，其特征在于所述電極芯片上有一個或多個電極，微電極間隙為1-200μm。
12.根據(jù)權利要求1所述的基于磁顆粒和微電極的體外檢測方法，其特征在于通過手動操作完成雜交、銀染及檢測步驟。
13.根據(jù)權利要求1所述的基于磁顆粒和微電極的體外檢測方法，其特征在于通過全自動檢測儀自動完成雜交、銀染及檢測步驟。
14.根據(jù)權利要求1-13所述的基于磁顆粒和微電極的體外檢測方法的用途，其特征在于用于待測物質的定性檢測或定量檢測。
15.用于權利要求1所述的基于磁顆粒和微電極的體外檢測方法的試劑盒，其特征在于包含雜交試劑盒、銀染試劑盒。
16.根據(jù)權利要求15所述的試劑盒，其特征在于試劑盒中的磁顆粒大小為8-800nm，表面修飾有葡聚糖或瓊脂糖或殼聚糖。
17.用于權利要求1所述的基于磁顆粒和微電極的體外檢測方法的檢測系統(tǒng)，其特征在于包含權利要求15所述的試劑盒，權利要求11所述微電極及檢測儀，以及權利要求13所述的全自動檢測儀。
18.根據(jù)權利要求17所述的基于磁顆粒和微電極的檢測系統(tǒng)，其微電極特征為叉指電極。
全文摘要
本發(fā)明涉及一種基于磁顆粒和微電極的體外檢測方法、試劑盒及由此方法開發(fā)的一種檢測儀器。將磁顆粒固定特異性標記物1，液相中和待測物質、特異性標記物2及金顆粒雜交形成磁－金顆粒復合體、銀染復合體后將其分離，然后轉移到微電極上，干燥處理后通過電學檢測儀測其阻抗，進行定性或定量分析待測物質，并基于此方法結合自動化技術開發(fā)一種集成的自動化雜交、銀染及檢測的儀器及相關試劑盒。
文檔編號G01N27/02GK101093220SQ20061008661
公開日2007年12月26日 申請日期2006年6月23日 優(yōu)先權日2006年6月23日
發(fā)明者聶棱 申請人:湖北新納康生物科技有限公司