專利名稱：量子點(diǎn)熒光淬滅基礎(chǔ)上的實(shí)時(shí)熒光定量pcr的檢測方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及的是一種生物工程技術(shù)領(lǐng)域的方法，具體是一種量子點(diǎn)熒光淬滅基礎(chǔ)上的實(shí)時(shí)熒光定量PCR的檢測方法。
背景技術(shù)：
PCR即聚合酶鏈反應(yīng)技術(shù)，熒光定量PCR技術(shù)是通過熒光染料或熒光標(biāo)記的特異性的探針，對(duì)PCR產(chǎn)物進(jìn)行標(biāo)記跟蹤，實(shí)時(shí)在線監(jiān)控反應(yīng)過程，結(jié)合相應(yīng)的軟件可以對(duì)結(jié)果進(jìn)行分析，計(jì)算待測樣品的初始模板量。熒光定量實(shí)時(shí)PCR與普通PCR的比較，具有諸多優(yōu)勢，因而獲得了廣泛的應(yīng)用。到目前為止，熒光定量PCR標(biāo)記方法主要有兩類內(nèi)摻式染料如SYBR Green I與SYBR Gold，序列特異性探針如Taqman探針，分子信標(biāo)探針(Molecular Beacons)與熒光共振能量轉(zhuǎn)移探針[Dual Probes(FRET)]。但是它們使用的定量PCR方法都是采用有機(jī)熒光染料。存在不穩(wěn)定，高溫降解，見光易分解，發(fā)射光的光譜寬，光穩(wěn)定性差，檢測本底高等缺點(diǎn)。量子點(diǎn)是半徑小于或接近于激子玻爾半徑的一類半導(dǎo)體納米粒子，由于存在顯著的量子尺寸效應(yīng)和表面效應(yīng)，從而使它具有常規(guī)塊體材料不具備的光吸收特性，是一類理想的熒光探針。與傳統(tǒng)的熒光染料探針相比，量子點(diǎn)熒光信號(hào)穩(wěn)定，受溫度與光照的影響非常小，可同時(shí)對(duì)多種組分進(jìn)行同步檢測，量子點(diǎn)合成制備成本低，因此具有顯著的優(yōu)勢。
經(jīng)對(duì)現(xiàn)有技術(shù)的文獻(xiàn)檢索發(fā)現(xiàn)，Wickert L等人在《Biochemical andBiophysical Research Communications》[生物化學(xué)與生物物理研究交流]雜志2002年第296卷第4期第1035-1039頁發(fā)表了“Quantitative monitoring of themRNA expression pattern of the TGF-beta-isoforms(beta 1，beta 2，beta 3)during transdifferentiation of hepatic stellate cells using a newly developedreal-time SYBR Green PCR”[利用新建立的實(shí)時(shí)SYBR Green PCR方法定量檢測TGF-β異構(gòu)體(β1，β2，β3)mRNA的表達(dá)水平]文章。檢索中還發(fā)現(xiàn)，Aldea C等在《Journal of Clinical Microbiology》[臨床微生物雜志]雜志2002年第40卷第3期第1060-1062頁發(fā)表了“Rapid detection of herpes simplex virusDNA in genital ulcers by real-time PCR using SYBR green I dye as the detectionsignal”[利用SYBR green I作為探測信號(hào)的實(shí)時(shí)PCR方法快速檢測皰疹病毒DNA]文章。利用SYBR Green染料結(jié)合雙鏈DNA并產(chǎn)生熒光特性，隨著PCR產(chǎn)物增多，反應(yīng)液中熒光信號(hào)增強(qiáng)，因此，可進(jìn)行實(shí)時(shí)定量PCR檢測。由于SYBRGreen有機(jī)熒光染料，存在不穩(wěn)定，高溫降解，見光易分解，發(fā)射光的光譜寬，光穩(wěn)定性差，檢測本底高等缺點(diǎn)，而量子點(diǎn)正好彌補(bǔ)其不足，具有顯著優(yōu)勢。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明針對(duì)現(xiàn)有技術(shù)的不足和缺陷，提供一種量子點(diǎn)熒光淬滅基礎(chǔ)上的實(shí)時(shí)熒光定量PCR的檢測方法，利用量子點(diǎn)結(jié)合雙鏈PCR產(chǎn)物，而且PCR雙鏈產(chǎn)物量與量子點(diǎn)熒光淬滅信號(hào)的程度成正相關(guān)特性，可實(shí)現(xiàn)實(shí)時(shí)定量PCR檢測。
本發(fā)明是通過以下技術(shù)方案實(shí)現(xiàn)的本發(fā)明利用PCR雙鏈產(chǎn)物結(jié)合量子點(diǎn)并淬滅量子點(diǎn)熒光信號(hào)，量子點(diǎn)的熒光信號(hào)淬滅程度與PCR雙鏈產(chǎn)物的量成正比，建立實(shí)時(shí)熒光定量PCR方法。具體實(shí)現(xiàn)過程為在常規(guī)PCR擴(kuò)增的反應(yīng)體系中加入表面帶有負(fù)電荷的量子點(diǎn)，PCR反應(yīng)液中量子點(diǎn)的最終濃度在0.007mg/mL-1.33mg/mL之間，PCR反應(yīng)液充分混合后，將PCR管放入熒光定量PCR檢測儀中，在擴(kuò)增過程中進(jìn)行實(shí)時(shí)熒光檢測，根據(jù)熒光信號(hào)的強(qiáng)弱，結(jié)合定量分析軟件，可實(shí)現(xiàn)實(shí)時(shí)定量檢測PCR擴(kuò)增產(chǎn)物中PCR產(chǎn)物的量。
所述的量子點(diǎn)是采用帶負(fù)電荷的表面活性劑或用帶正負(fù)電荷的雙性離子型表面活性劑修飾的量子點(diǎn)，而且量子點(diǎn)表面帶有負(fù)電荷。
本發(fā)明利用帶負(fù)電荷的量子點(diǎn)加入到PCR反應(yīng)液中(PCR反應(yīng)液中量子點(diǎn)濃度在0.007mg/mL與1.33mg/mL之間)，都可以獲得很好的熒光淬滅強(qiáng)度與起始模板濃度之間的線性關(guān)系，利用量子點(diǎn)的這一特性，可進(jìn)行PCR產(chǎn)物實(shí)時(shí)定量檢測，與傳統(tǒng)方法相比，具有更好的靈敏性與特異性，穩(wěn)定性與重復(fù)性。


圖1為PCR擴(kuò)增時(shí)不同的循環(huán)次數(shù)與熒光強(qiáng)度關(guān)系的曲線(熒光分光光度計(jì)檢測)圖2為PCR擴(kuò)增時(shí)隨時(shí)間的增加熒光強(qiáng)度的變化曲線(實(shí)時(shí)熒光定量PCR儀中檢測)
圖3為CT值與起始模板濃度之間的關(guān)系曲線(實(shí)時(shí)熒光定量PCR儀中檢測)具體實(shí)施方式
本發(fā)明用DNA標(biāo)準(zhǔn)品配制一系列的濃度梯度，加入帶負(fù)電荷的量子點(diǎn)(濃度在1.33mg/mL-0.007mg/mL之間)到PCR反應(yīng)液中，PCR反應(yīng)采用30μl總體積。PCR反應(yīng)條件是3μl 10×PCR buffer，3μl 2.5mM dNTPs，3μl 1.5mM MgCl2，各1μl上游與下游PCR引物，2μl DNA模板，1μl Taq enzyme，16μl去離子水，DNA模板采用系列稀釋的已知濃度的樣品，量子點(diǎn)的量分別為0.5μl，1μl，2μl，3μl，4μl，5μl，6μl，7μl，8μl，9μl，10μl，用去離子水補(bǔ)充到總體積為30μl。PCR反應(yīng)條件94℃預(yù)變性4分鐘，94℃變性35秒，30℃退火42秒，72℃延伸50秒，30個(gè)循環(huán)，最后在72℃延伸5分鐘。
PCR反應(yīng)結(jié)束后，測定每一管PCR產(chǎn)物的熒光強(qiáng)度，把熒光強(qiáng)度作為縱座標(biāo)，起始模板濃度對(duì)數(shù)作為橫坐標(biāo)，可描繪出標(biāo)準(zhǔn)曲線，是一個(gè)線性關(guān)系曲線。同時(shí)同時(shí)也進(jìn)行了PCR循環(huán)次數(shù)與熒光強(qiáng)度的測量。以循環(huán)次數(shù)作為縱坐標(biāo)，起始模板濃度對(duì)數(shù)為橫坐標(biāo)，描繪出標(biāo)準(zhǔn)曲線，也是一個(gè)線性關(guān)系。
采用不同已知濃度的模板，重復(fù)了此實(shí)驗(yàn)，結(jié)果完全一致。采用SYBR GreenI定量試劑盒作對(duì)照，結(jié)果相一致。為了進(jìn)一步驗(yàn)證本發(fā)明建立的方法，包含量子點(diǎn)的PCR反應(yīng)液樣品被準(zhǔn)備，分別在ABI公司7700型號(hào)定量PCR儀與Roch公司LightCycler定量PCR儀上進(jìn)行了實(shí)時(shí)定量PCR檢測，結(jié)果與預(yù)期的一樣，隨著循環(huán)次數(shù)的增加，熒光信號(hào)在降低，在指數(shù)增長期，熒光信號(hào)降低更顯著。
在熒光定量PCR技術(shù)中，有一個(gè)很重要的概念即Ct值。C代表Cycle，t代表threshold，Ct值的含義是每個(gè)反應(yīng)管內(nèi)的熒光信號(hào)到達(dá)設(shè)定的域值時(shí)所經(jīng)歷的循環(huán)數(shù)。PCR循環(huán)在到達(dá)Ct值所在的循環(huán)數(shù)時(shí)，剛剛進(jìn)入真正的指數(shù)擴(kuò)增期(對(duì)數(shù)期)，此時(shí)微小誤差尚未放大，因此Ct值的重現(xiàn)性極好，即同一模板不同時(shí)間擴(kuò)增或同一時(shí)間不同管內(nèi)擴(kuò)增，得到的Ct值是恒定的。Ct值與起始模板量的關(guān)系如下logN＝log N0+nlogE n＝Ct，N擴(kuò)增物數(shù)量；N0起始模板數(shù)量；E擴(kuò)增效率。Ct值與起始模板的關(guān)系表明，每個(gè)模板的Ct值與該模板的起始拷貝數(shù)的對(duì)數(shù)存在線性關(guān)系，起始拷貝數(shù)越多，Ct值越小。利用已知起始拷貝數(shù)的標(biāo)準(zhǔn)品可作出標(biāo)準(zhǔn)曲線，其中橫坐標(biāo)代表起始拷貝數(shù)的對(duì)數(shù)，縱坐標(biāo)代表Ct值。因此，只要獲得未知樣品的Ct值，即可從標(biāo)準(zhǔn)曲線上計(jì)算出該樣品的起始拷貝數(shù)。本發(fā)明中，采用已知濃度的樣品，測量了相應(yīng)數(shù)據(jù)，計(jì)算出Ct值，描繪了Ct值與起始拷貝數(shù)的對(duì)數(shù)關(guān)系曲線。
以下結(jié)合附圖以及本發(fā)明的技術(shù)方案提供實(shí)施例。
實(shí)施例一氯化鎘溶解在含有巰基乙酸的堿性(pH 10)水溶液中，加入離子型碲源NaHTe(由碲粉和硼氫化鈉制備成)，100℃反應(yīng)30～240分鐘，反應(yīng)時(shí)間不同得到量子點(diǎn)的粒徑不同，溶液顏色由綠色到橙色最終為紅色，合成表面帶有羧基的CdTe量子點(diǎn)，用此方法可得到1.2nm～2.8nm范圍內(nèi)不同粒徑的CdTe量子點(diǎn)。這里選用粒徑為2.8左右納米的量子點(diǎn)，得到的量子點(diǎn)溶液濃度為3.5mg/mL，在小于500納米的任何波長激發(fā)，可得到發(fā)射波長為554nm的熒光。
取乳腺癌相關(guān)抗原基因(brcaa1基因)為模板DNA 3μL，dNTP 3μL，緩沖液5μL，引物A1μL，引物B1μL，鎂離子2μL，Taq DNA聚合酶1μL，上述實(shí)驗(yàn)合成得到的量子點(diǎn)2μL，用去離子水補(bǔ)充體積，使反應(yīng)總體積為30μL。最初變性94℃，2min；35個(gè)循環(huán)變性94℃1min，復(fù)性55℃ 40sec，延伸72℃50sec；最后的延伸72℃ 8min。隨著PCR擴(kuò)增DNA量不斷增加，檢測不同循環(huán)次數(shù)后熒光信號(hào)，采用熒光分光光度計(jì)檢測熒光強(qiáng)度(激發(fā)波長450nm，測發(fā)射波長為565nm的熒光強(qiáng)度)，采用熒光強(qiáng)度為縱坐標(biāo)，循環(huán)次數(shù)為橫坐標(biāo)，得到循環(huán)次數(shù)與熒光強(qiáng)度的曲線(見附圖1)，隨著循環(huán)次數(shù)的增加，DNA的量逐漸增加，熒光信號(hào)也隨著降低。PCR擴(kuò)增產(chǎn)物用1％瓊脂糖電泳，并用凝膠成像系統(tǒng)儀分析有目標(biāo)DNA。
實(shí)施例二氯化鎘溶解在含有巰基乙酸的堿性(pH 10)水溶液中，加入離子型碲源NaHTe(由碲粉和硼氫化鈉制備成)，100℃反應(yīng)30～240分鐘，反應(yīng)時(shí)間不同得到量子點(diǎn)的粒徑不同，溶液顏色由綠色到橙色最終為紅色，合成表面帶有羧基的CdTe量子點(diǎn)，用此方法可得到1.6nm～3nm范圍內(nèi)不同粒徑的CdTe量子點(diǎn)。這里選用粒徑為3納米的量子點(diǎn)，在小于500納米的任何波長激發(fā)，可得到發(fā)射波長為560nm的熒光。
取乳腺癌相關(guān)抗原基因(brcaa1基因)為模板DNA 3μL，dNTP 3μL，緩沖液5μL，引物A1μL，引物B1μL，鎂離子2μL，Taq DNA聚合酶1μL，上合成得到的量子點(diǎn)1μL，用去離子水補(bǔ)充體積，使反應(yīng)總體積為30μL。最初變性94℃，2min；35個(gè)循環(huán)變性94℃1min，復(fù)性55℃ 40sec，延伸72℃ 50sec；最后的延伸72℃ 8min。隨著PCR擴(kuò)增DNA量不斷增加，在實(shí)時(shí)熒光定量PCR儀中檢測，熒光信號(hào)逐漸降低(見附圖2)。根據(jù)計(jì)算，獲得量子點(diǎn)熒光定量PCR反應(yīng)中CT值與起始模板濃度對(duì)數(shù)值之間的關(guān)系曲線(見附圖3)。這表明，量子點(diǎn)是一個(gè)很好的熒光染料，PCR雙鏈產(chǎn)物引起它的熒光淬滅特性，完全符合目前定量PCR技術(shù)的參數(shù)要求，能夠用于實(shí)時(shí)定量PCR檢測。
權(quán)利要求
1.一種量子點(diǎn)熒光淬滅基礎(chǔ)上的實(shí)時(shí)熒光定量PCR的檢測方法，把適量帶負(fù)電荷的量子點(diǎn)加到PCR反應(yīng)液中，制成PCR反應(yīng)混合液，隨著PCR反應(yīng)的進(jìn)行，PCR擴(kuò)增的雙鏈產(chǎn)物結(jié)合量子點(diǎn)并淬滅已結(jié)合的量子點(diǎn)熒光信號(hào)，量子點(diǎn)的熒光信號(hào)淬滅程度與PCR雙鏈產(chǎn)物的量成正比，結(jié)合定量分析軟件，實(shí)現(xiàn)實(shí)時(shí)熒光定量PCR的檢測。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的量子點(diǎn)熒光淬滅基礎(chǔ)上的實(shí)時(shí)定量PCR檢測方法，具體實(shí)現(xiàn)過程為在PCR擴(kuò)增的反應(yīng)體系中加入表面帶有負(fù)電荷的量子點(diǎn)，PCR反應(yīng)液中量子點(diǎn)的最終濃度在0.007mg/mL-1.33mg/mL之間，PCR反應(yīng)液充分混合后，將PCR管放入熒光定量PCR檢測儀中，在擴(kuò)增過程中進(jìn)行實(shí)時(shí)熒光檢測，根據(jù)熒光信號(hào)的強(qiáng)弱，結(jié)合定量分析軟件，實(shí)現(xiàn)實(shí)時(shí)定量檢測PCR擴(kuò)增產(chǎn)物中PCR產(chǎn)物的量。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的量子點(diǎn)熒光淬滅基礎(chǔ)上的實(shí)時(shí)熒光定量PCR的檢測方法，其特征是，所述的量子點(diǎn)是采用帶負(fù)電荷的表面活性劑或用帶正負(fù)電荷的雙性離子型表面活性劑修飾的量子點(diǎn)，而且量子點(diǎn)表面帶有負(fù)電荷。
全文摘要
一種量子點(diǎn)熒光淬滅基礎(chǔ)上的實(shí)時(shí)熒光定量PCR的檢測方法，屬于生物工程技術(shù)領(lǐng)域。本發(fā)明利用量子點(diǎn)優(yōu)越的熒光特性，且PCR雙鏈產(chǎn)物能與量子點(diǎn)結(jié)合并淬滅已結(jié)合的量子點(diǎn)的熒光信號(hào)，熒光信號(hào)淬滅的程度與PCR產(chǎn)物的量成正相關(guān)，在常規(guī)PCR擴(kuò)增的反應(yīng)體系中加入表面帶有負(fù)電荷的量子點(diǎn)，PCR反應(yīng)液中量子點(diǎn)的最終濃度控制在0.007mg/mL與1.33mg/mL之間的范圍，將PCR反應(yīng)液管放入熒光定量PCR檢測儀中，進(jìn)行實(shí)時(shí)熒光定量PCR的擴(kuò)增，根據(jù)熒光信號(hào)的強(qiáng)弱檢測PCR擴(kuò)增過程中不同時(shí)間點(diǎn)的PCR產(chǎn)物量，建立快速、靈敏、簡便、特異性好的定量PCR檢測方法。
文檔編號(hào)G01N21/64GK1837792SQ20061002609
公開日2006年9月27日 申請(qǐng)日期2006年4月27日 優(yōu)先權(quán)日2006年4月27日
發(fā)明者崔大祥, 高峰, 賀蓉, 潘碧峰 申請(qǐng)人:上海交通大學(xué)