專利名稱：一種通過同時(shí)識(shí)別多個(gè)表位來檢測(cè)蛋白或蛋白復(fù)合物的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及蛋白質(zhì)組學(xué)的研究技術(shù)，具體涉及識(shí)別蛋白質(zhì)表位的寡聚核苷酸適配子(Nucleic Acid Aptamer)用于同時(shí)識(shí)別多個(gè)表位來檢測(cè)蛋白質(zhì)或者蛋白復(fù)合物的方法。
背景技術(shù)：
蛋白質(zhì)的表達(dá)可以以單體存在，也可以以二聚體存在，還有更復(fù)雜的多蛋白形成的復(fù)合物，對(duì)這些蛋白乃至復(fù)合物的檢測(cè)是非常重要的，特別是在蛋白組學(xué)研究中，我們不僅要知道有什么樣的蛋白表達(dá)，同時(shí)我們還要知道蛋白的狀態(tài)，包括修飾和復(fù)合物。因此對(duì)蛋白的檢測(cè)特別是蛋白翻譯后的各種狀態(tài)的檢測(cè)是至關(guān)重要的。對(duì)蛋白組學(xué)的研究需要高通量技術(shù)和靈敏的檢測(cè)手段，最近二維電泳技術(shù)和以抗體為配體的蛋白芯片為相關(guān)研究提供了重要的工具，但是由于各自的局限性需要更靈敏便捷的方式來檢測(cè)蛋白。以滾環(huán)DNA復(fù)制和proximity dependent DNA ligation等原理設(shè)計(jì)出來的各種方法可以檢測(cè)SNP和蛋白等，但都有一些缺點(diǎn)。
在蛋白檢測(cè)中，proximity dependent DNA ligation的方法可以檢測(cè)微量蛋白，但是由于其所采用的最后定量的方法是熒光定量PCR的方法，經(jīng)常會(huì)由于PCR擴(kuò)增的非特異性或者是寡核苷酸適配子的GC含量過高導(dǎo)致無法進(jìn)行PCR反應(yīng)，為此就不得不延長輔助片斷。此外這種方法只能針對(duì)同種蛋白的二元復(fù)合物的相同表位進(jìn)行檢測(cè)。當(dāng)然這種方法的主要缺點(diǎn)是有背景連接反應(yīng)的存在，需要對(duì)其反應(yīng)條件進(jìn)行繁瑣的優(yōu)化以盡量減少干擾。這種方法最多也只能同時(shí)檢測(cè)兩個(gè)表位，因此對(duì)于蛋白組學(xué)的研究需要更靈活的方法。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的旨在提出一種通過同時(shí)識(shí)別多個(gè)蛋白表位來檢測(cè)特定的蛋白或者蛋白復(fù)合物的方法，從而克服上述已問世蛋白檢測(cè)方法的缺陷。
這種應(yīng)用多個(gè)寡聚核苷酸適配子同時(shí)識(shí)別含有相應(yīng)序列的蛋白質(zhì)的方法為用靶向于不同表位的寡聚核苷酸適配子利用proximitydependent DNA Ligation的原理將其連接成單鏈環(huán)狀DNA，然后檢測(cè)單鏈環(huán)狀DNA。
其具體做法是I、將合成的寡聚核苷酸適配子進(jìn)行適當(dāng)延長、并分別使兩臂的序列與寡核苷酸適配子互補(bǔ)，再將其5’端進(jìn)行磷酸化修飾；II、在反應(yīng)體系中加入上述各種寡核苷酸適配子和蛋白質(zhì)室溫放置1小時(shí)，然后加入連接子，連接酶緩沖液和連接酶；III、采用滾環(huán)DNA復(fù)制進(jìn)行檢測(cè)。
靶向于三肽KAI，GEL，DGI和LAS的寡聚核苷酸適配子的核苷酸序列為GEL-寡聚核苷酸適配子gcgaagcggg ctgaagtgca cacagctgga ggagtattgt tgggtgctcKAI-寡聚核苷酸適配子gcgcagcggg tggagtgtta agatgaattg cggtgtgggc cggcctctat tggcLAS-寡聚核苷酸適配子acgaagtggg tgtatagcga ataatcatta agaaagggcg ctgtgttgtgDGI-寡聚核苷酸適配子agcctaaaat attgcttagta agggtggtct ggctccgaga ggggt寡聚核苷酸適配子可以識(shí)別蛋白中的相應(yīng)三肽序列，并且可以從重組大腸桿菌粗裂解液中捕獲和純化含有相應(yīng)三肽序列的CathepsinD(CatD)蛋白。即重組表達(dá)的CatD蛋白含有四個(gè)可以被識(shí)別的表位。為了檢驗(yàn)實(shí)驗(yàn)的特異性還用到了翻譯后修飾過的CatD蛋白(含有三個(gè)可以識(shí)別的表位)等。
根據(jù)本發(fā)明提出的這種檢測(cè)方法的使用結(jié)果表明該技術(shù)可以非常靈敏的檢測(cè)靶蛋白，其檢測(cè)濃度最低可以達(dá)到fM級(jí)。這種方法具有靈活性可以根據(jù)需要對(duì)配體的數(shù)目進(jìn)行調(diào)整。這種技術(shù)也可以檢測(cè)蛋白復(fù)合物，對(duì)以寡聚核苷酸適配子為配體的芯片技術(shù)提供了靈敏的檢測(cè)方法。


圖1為CatD蛋白檢測(cè)結(jié)果
A定量PCR中樣品放置位置圖，其中標(biāo)出在實(shí)驗(yàn)中有信號(hào)的兩個(gè)位置8，9；B為18小時(shí)后電泳結(jié)果(從右向左的樣品依次為1為Marker；2，3為BSA；4，5為1.0aM CatD；6，7為100.0aM CatD；8，9為10.0fM CatD)；C為定量檢測(cè)結(jié)果數(shù)據(jù)，其中標(biāo)出在實(shí)驗(yàn)中有信號(hào)的兩個(gè)樣品的位置8，9；D為定量檢測(cè)結(jié)果數(shù)據(jù)經(jīng)軟件分析后的結(jié)果，其中標(biāo)出在實(shí)驗(yàn)中有信號(hào)的兩個(gè)樣品的位置8，9。
圖2為CatD蛋白檢測(cè)特異性結(jié)果從右向左的樣品依次為1為BSA；2為1.0aM CatD；3為100.0aM CatD；4，5為10.0fM CatD；6為10.0nM mCatD；7為1.0nM mCatD；CatD含有四個(gè)可檢測(cè)表位；mCatD為成熟蛋白只含有三個(gè)可檢測(cè)的表位。
下面結(jié)合附圖進(jìn)一步詳述本發(fā)明。
利用Structure-switch寡聚核苷酸適配子技術(shù)使適配子與蛋白質(zhì)相應(yīng)三肽的結(jié)合并促進(jìn)連接反應(yīng)Structure-switch signaling寡聚核苷酸適配子技術(shù)的主要方法是將寡聚核苷酸適配子進(jìn)行末端延長后，使其能夠同時(shí)跟寡聚核苷酸適配子內(nèi)部退火結(jié)合，此時(shí)兩臂不能與連接子結(jié)合發(fā)生連接反應(yīng)，沒有信號(hào)產(chǎn)生。當(dāng)寡聚核苷酸適配子的靶蛋白出現(xiàn)時(shí)，靶蛋白與寡聚核苷酸適配子結(jié)合，從而導(dǎo)致兩臂能夠與連接子結(jié)合從而促進(jìn)連接反應(yīng)。這樣有利于背景連接反應(yīng)的降低。
(1)根據(jù)寡聚核苷酸適配子序列合成structure-switch寡聚核苷酸適配子和相應(yīng)的連接子。
GELacttcagccc ttttttttaa tcacttatgc gaagcgggct gaagtgcaca cagctggaggagtattgttg ggtgctcttt ctcctccagcKAIttaacactcc ttttttttat cttgcgcagc gggtggagtg ttaagatgaa ttgcggtgtgggccggcctc tattggcttt cccacaccgcLAScgctatacac ttttttatca cttatacgaa gtgggtgtat agcgaataat cattaagaaagggcgctgtg ttgtgttttt cctttcttaaDGItaagcaatat tttatcactt atccatagcc taaaatattg cttagtaagg gtggtctggctccgagaggg gttgaattct gagccagaccconnector 1aaagggctga agtggtctgg ctctttconnector2aaaggagtgt taagctggag gagtttconnector3aaagtgtata gcggcggtgt gggtttconnector4aaaatattgc ttattaagaa aggttt(2)在PCR管中加入1.0uL 100pM的四種寡核苷酸適配子混合液后，分別加入不同濃度的BSA和CatD等蛋白室溫放置1小時(shí)；再分別加入含有0.1uL 25uM的四種連接子和1.0U的T4DNA Ligase的緩沖液，室溫放置5小時(shí)進(jìn)行連接反應(yīng)；然后采用phi29 DNA聚合酶對(duì)環(huán)狀單鏈DNA于30℃進(jìn)行擴(kuò)增；最后用定量PCR和瓊脂糖電泳進(jìn)行檢測(cè)。
本技術(shù)可以采用多個(gè)寡聚核苷酸適配子來檢測(cè)蛋白，由于寡聚核苷酸適配子具有類似于抗體的性質(zhì)，而且具有抗體難以達(dá)到的優(yōu)點(diǎn)如化學(xué)穩(wěn)定性等。因此本技術(shù)可以作為以寡聚核苷酸適配子作為蛋白配體的芯片的信號(hào)檢測(cè)方法。本技術(shù)可以使用多個(gè)寡聚核苷酸適配子來確定唯一的一個(gè)靶點(diǎn)，這樣可以增加結(jié)果的精確性和可靠性。同時(shí)本技術(shù)可以有很大的調(diào)整余地，也可以針對(duì)每一個(gè)靶點(diǎn)設(shè)計(jì)特異的寡聚核苷酸適配子組合，而且可以根據(jù)需要調(diào)整配體的數(shù)目。因此對(duì)于高通量的芯片技術(shù)是非常適用的。
具體實(shí)施例方式
實(shí)施例1四個(gè)寡聚核苷酸適配子檢測(cè)CatD蛋白1、在PCR管中加入1.0uL 100pM的四種寡核苷酸適配子混合液2、以1％BSA為稀釋液將CatD蛋白進(jìn)行倍比稀釋，然后在不同管內(nèi)分別加入濃度為1.0aM，100.0aM和10.0fM的CatD蛋白和作為對(duì)照的1％BSA，室溫放置1小時(shí)3、加入含有0.1uL 25uM的四種連接子混合液到含有1.0U的T4 DNA Ligase的緩沖液中，將此混合液加入到反應(yīng)管后室溫放置5小時(shí)進(jìn)行連接反應(yīng)4、每管中再加入1.0uL 10X phi29緩沖液，0.5uL 10mM dNTP，0.2uL 100X BSA，0.3uL phi DNA聚合酶，7.5uL ddH2O，0.5uL Eva Green，0.1uL primer1和0.1uL primer2。于30℃進(jìn)行擴(kuò)增8-12小時(shí)5、在第8小時(shí)開始采用OPTICON2 continuous fluorescencedetector(MJ Research)記錄數(shù)據(jù)四個(gè)小時(shí)，每隔2.5分鐘讀值一次，大約持續(xù)四個(gè)小時(shí)，期間維持30℃。擴(kuò)增18小時(shí)后采用2％瓊脂糖電泳進(jìn)行檢測(cè)。
6、結(jié)果如圖1顯示10.0fM蛋白可以在8-12小時(shí)檢測(cè)到熒光信號(hào)；反應(yīng)18小時(shí)后電泳可以得到擴(kuò)增條帶(圖1B中從右向左的樣品依次為1為Marker；2，3為BSA；4，5為1.0aM CatD；6，7為100.0aM CatD；8，9為10.0fM CatD；圖1C和D表示相應(yīng)的熒光變化曲線)實(shí)施例2四個(gè)寡聚核苷酸適配子檢測(cè)CatD蛋白1、在PCR管中加入1.0uL 100pM的四種寡核苷酸適配子混合液2、以1％BSA為稀釋液將CatD蛋白進(jìn)行倍比稀釋，然后在不同管內(nèi)分別加入濃度為1.0aM，100.0aM和10.0fM的CatD蛋白和作為對(duì)照的1％BSA；同時(shí)也使用只含有三個(gè)表位的CatD蛋白作為對(duì)照即在管中加入10.0nM和1.0nM的蛋白，室溫放置1小時(shí)
3、加入含有0.1uL 25uM的四種連接子混合液到含有1.0U的T4 DNA Ligase的緩沖液中，將此混合液加入到反應(yīng)管后室溫放置7小時(shí)進(jìn)行連接反應(yīng)4、每管中再加入1.0uL 10X phi29緩沖液，0.5uL 10mM dNTP，0.2uL 100X BSA，0.3uL phi DNA聚合酶，8.0uL ddH2O，0.1uL primer1和0.1uL primer2于30℃進(jìn)行擴(kuò)增36小時(shí)5、采用2％瓊脂糖電泳進(jìn)行檢測(cè)6、結(jié)果如圖2顯示100.0aM的CatD和10.0fM蛋白可以使?jié)L環(huán)DNA復(fù)制產(chǎn)生信號(hào)，后者由于蛋白濃度較低信號(hào)比較弱。而高濃度的mCatD只含有三個(gè)可檢測(cè)表位，無法得到擴(kuò)增信號(hào)表明本檢測(cè)方法的特異性很高(從右向左的樣品依次為1為BSA；2為1.0aM CatD；3為100.0aM CatD；4，5為10.0fM CatD；6為10.0nM mCatD；7為1.0nM mCatD；CatD含有四個(gè)可檢測(cè)表位；mCatD為成熟蛋白只含有三個(gè)可檢測(cè)的表位)。
上述檢測(cè)過程表明通過結(jié)合滾環(huán)DNA復(fù)制，structure-switch和proximitydependent DNA ligation等原理采用多個(gè)寡核苷酸適配子來識(shí)別蛋白。這種方法可以檢測(cè)蛋白的存在，特異性強(qiáng)，靈敏度高，檢測(cè)最低濃度至少可達(dá)fM水平。這種方法的優(yōu)點(diǎn)是應(yīng)用寡聚核苷酸適配子來進(jìn)行識(shí)別，這樣可以避免抗體的諸多不便。滾環(huán)DNA復(fù)制的方法已經(jīng)被應(yīng)用到芯片領(lǐng)域，因此這種檢測(cè)方法不僅可以應(yīng)用到微量蛋白檢測(cè)還可以很方便的應(yīng)用到寡聚核苷酸適配子作為配體的蛋白芯片技術(shù)中。如果結(jié)合識(shí)別三肽的寡聚核苷酸適配子則可以實(shí)現(xiàn)對(duì)單個(gè)蛋白或者蛋白復(fù)合物的檢測(cè)。
另外，本項(xiàng)技術(shù)采用多個(gè)5’磷酸化的寡核苷酸適配子來分別作用到蛋白復(fù)合物的不同成份上或者同種蛋白的不同表位上，然后采用proximity dependent DNA ligation的方法將其連接成單鏈環(huán)狀DNA。只有靶蛋白或蛋白復(fù)合物出現(xiàn)時(shí)多個(gè)5’磷酸化的寡核苷酸適配子同時(shí)與相應(yīng)靶點(diǎn)作用并促進(jìn)連接反應(yīng)，這樣由于多個(gè)DNA的連接使得背景反應(yīng)的干擾降至最低，同時(shí)結(jié)合structure-switch的方法，使背景反應(yīng)進(jìn)一步降至最低。
序列表<110>華東師范大學(xué)<120>一種通過同時(shí)識(shí)別多個(gè)表位來檢測(cè)蛋白或蛋白復(fù)合物的方法<160>4<210>1<211>49<212>DNA<213>人工序列<220>
<400>1GEL-aptamergcgaagcggg ctgaagtgca cacagctgga ggagtattgt tgggtgctc 49
<210>2<211>54<212>DNA<213>人工序列<220>
<400>2KAI-aptamergcgcagcggg tggagtgtta agatgaattg cggtgtgggc cggcctctat tggc 54<210>3<211>50<212>DNA<213>人工序列<220>
<400>3LAS-aptameracgaagtggg tgtatagcga ataatcatta agaaagggcg ctgtgttgtg 50<210>4<211>45<212>DNA
<213>人工序列<220>
<400>4DGI-aptameragcctaaaat attgcttagta agggtggtct ggctccgaga ggggt4權(quán)利要求
1.一種通過同時(shí)識(shí)別多個(gè)表位來檢測(cè)蛋白或蛋白復(fù)合物的方法，其特征在于用靶向于不同表位的寡聚核苷酸適配子利用proximity dependent DNA Ligation的原理將其連接成單鏈環(huán)狀DNA，然后檢測(cè)單鏈環(huán)狀DNA。
2.如權(quán)利要求1所述的一種通過同時(shí)識(shí)別多個(gè)表位來檢測(cè)蛋白或蛋白復(fù)合物的方法，其特征在于檢測(cè)蛋白的步驟為A、將合成的寡聚核苷酸適配子進(jìn)行延長、并分別使兩臂的序列與寡聚核苷酸適配子互補(bǔ)，再將其5′端進(jìn)行磷酸化修飾；B、在反應(yīng)體系中加入上述各種寡核苷酸適配子和蛋白質(zhì)室溫放置1小時(shí)，然后加入連接子，連接酶緩沖液和連接酶；C、采用滾環(huán)DNA復(fù)制進(jìn)行檢測(cè)。
3.如權(quán)利要求1或2所述的一種通過同時(shí)識(shí)別多個(gè)表位來檢測(cè)蛋白或蛋白復(fù)合物的方法，其特征在于根據(jù)Structure-switch的原理將兩臂進(jìn)行特殊設(shè)計(jì)使其與寡聚核苷酸適配子內(nèi)部互補(bǔ)以降低連接背景。
4.根據(jù)權(quán)利要求1或2所述的一種通過同時(shí)識(shí)別多個(gè)表位來檢測(cè)蛋白或蛋白復(fù)合物的方法，其特征在于靶向于三肽KAI，GEL，DGI和LAS的寡聚核苷酸適配子的核苷酸序列為GEL-寡聚核苷酸適配子gcgaagcggg ctgaagtgca cacagctgga ggagtattgt tgggtgctcKAI-寡聚核苷酸適配子gcgcagcggg tggagtgtta agatgaattg cggtgtgggc cggcctctat tggcLAS-寡聚核苷酸適配子acgaagtggg tgtatagcga ataatcatta agaaagggcg ctgtgttgtgDGI-寡聚核苷酸適配子agcctaaaat attgcttagta agggtggtct ggctccgaga ggggt。
全文摘要
本發(fā)明采用能識(shí)別特定三肽序列KAI，GEL，DGI和LAS的寡聚核苷酸適配子來證實(shí)，方法為利用Structure－switch將寡聚核苷酸適配子進(jìn)行延長并將其5’端進(jìn)行磷酸化修飾，同時(shí)合成四條連接子；利用proximity dependent DNA Ligation技術(shù)將結(jié)合到靶蛋白上的寡聚核苷酸適配子連接成單鏈環(huán)狀DNA；隨后采用滾環(huán)DNA復(fù)制的方法進(jìn)行擴(kuò)增檢測(cè)信號(hào)；結(jié)果表明該技術(shù)可以非常靈敏的檢測(cè)靶蛋白，其檢測(cè)濃度最低可以達(dá)到nM級(jí)；這種方法具有靈活性可以根據(jù)需要對(duì)配體的數(shù)目進(jìn)行調(diào)整；這種技術(shù)也可以檢測(cè)蛋白復(fù)合物，對(duì)以寡聚核苷酸適配子為配體的芯片技術(shù)提供了靈敏的檢測(cè)方法。
文檔編號(hào)G01N33/68GK101037706SQ20061002591
公開日2007年9月19日 申請(qǐng)日期2006年4月21日 優(yōu)先權(quán)日2006年4月21日
發(fā)明者牛文澤, 江楠, 胡應(yīng)和 申請(qǐng)人:華東師范大學(xué)