專利名稱：：口腔流體快速免疫層析檢測(cè)的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
：本發(fā)明涉及口腔流體快速免疫層析檢測(cè)。更具體地，本發(fā)明涉及用于檢測(cè)口腔流體中分析物的側(cè)向流免疫層析檢測(cè)試條，收集口腔流體標(biāo)本的方法，生產(chǎn)所述試條的方法、通過(guò)使用該試條檢測(cè)口腔流體中分析物的側(cè)向流免疫層析方法、以及含有此試條的試劑盒。
背景技術(shù)：
：人們已經(jīng)開(kāi)發(fā)了許多定性或定量檢測(cè)生物體組織和流體中各種分析物的分析方法。當(dāng)前多數(shù)診斷檢測(cè)是采用血液、尿、糞便、活組織檢查或口腔流體。與其它物質(zhì)相比，收集口腔流體唾液和/或口腔粘膜滲出物用于檢測(cè)帶來(lái)相對(duì)較少的隱私侵犯，其相對(duì)安全，并可相對(duì)容易地快速完成。迄今，為開(kāi)發(fā)用于口腔流體的收集、傳送和樣品處理的測(cè)試條以及為開(kāi)發(fā)基于口腔流體的分析，尤其是對(duì)各種抗體和代謝物的分析，人們已付出了很多努力。例如，WO88/07680公開(kāi)了通過(guò)復(fù)雜的放射免疫分析法(RIA)、酶聯(lián)免疫分析法(ELISA)等定性或定量檢測(cè)人或動(dòng)物體液(選自唾液、目艮淚、精液、尿和腦脊液)中特定IgM、IgG和IgA的存在或其量的方法，所述方法相對(duì)難以進(jìn)行，費(fèi)時(shí)且花費(fèi)多。美國(guó)專利No.5,103,836>開(kāi)了一種從口腔收集物質(zhì)用于檢測(cè)的方法，其包括以下步驟將以高滲鹽溶液浸透的吸收墊插入口腔，其中高滲溶液的鹽在墊中的濃度可以有效地從口腔中回收高濃度的所述物質(zhì)；從口腔中移除所述墊；保存該墊以隨后從墊中取出所收集物質(zhì)用于ELISA。在本公開(kāi)文件中公開(kāi)的吸收墊需要用高滲溶液預(yù)處理以提供高濃度的分析物，且再次使用復(fù)雜的ELISA來(lái)檢測(cè)分析物。美國(guó)專利No.6,303,081公開(kāi)了用于從口腔收集和轉(zhuǎn)運(yùn)水性流體到用于檢測(cè)的側(cè)向?qū)游鲈嚄l的檢測(cè)試條。側(cè)向?qū)游鲈嚄l置于外罩(housing)內(nèi)并沿外罩中限定的腔伸展。向所述側(cè)向?qū)游鲈嚄l提供至少一個(gè)檢視(inspection)部位以實(shí)現(xiàn)在側(cè)向?qū)游鲈嚄l上所選部位檢視測(cè)試結(jié)果。多孔芯條(wick)材料在一端從所述外罩伸出到外罩外部的收集部位，在另一端與所述側(cè)向?qū)游鲈嚄l相通。所述多孔芯條材料具有微粒構(gòu)造，所述微粒吸附水性口腔流體以將該流體從口傳送到所述側(cè)向?qū)游鲈嚄l而基本上沒(méi)有吸收。該多孔芯條材料容易將口腔流體釋放到側(cè)向?qū)游鲈嚄l。由于該多孔芯條材料的迂回流路，自然防止從側(cè)向?qū)游鲈嚄l到口腔的反向流動(dòng)。咬合板(biteplate)與所述外罩相連并可插入患者牙齒間以將多孔芯條定位于口腔中來(lái)收集口腔流體。所述咬合板通常通過(guò)牙齒咬合力(occlusalforce)被保持在適當(dāng)位置以將多孔芯條定位于口腔空間中。當(dāng)檢測(cè)試條在口中時(shí)，通過(guò)觀察側(cè)向?qū)游鲈嚄l迅速得到檢測(cè)結(jié)果。在美國(guó)專利申請(qǐng)No.2002/0192839、美國(guó)專利申請(qǐng)No.2002/0155029中均公開(kāi)了用于一步收集口腔流體以檢測(cè)和/或定量口腔流體中分析物的改進(jìn)的檢測(cè)試條和方法，這些專利或申請(qǐng)的內(nèi)容均以其整體通過(guò)參考并入本文。盡管通過(guò)上述檢測(cè)試條的分析法具有直接、快速且不需要復(fù)雜步驟的優(yōu)點(diǎn)，但對(duì)于檢測(cè)對(duì)象而言，在整個(gè)檢測(cè)過(guò)程中都要咬合檢測(cè)試條是不方便的。此外，對(duì)于具有"無(wú)效"指示的分析，在無(wú)效結(jié)果需要重新檢測(cè)時(shí)，或者對(duì)于比如HIV這樣的常規(guī)需要對(duì)收集標(biāo)本進(jìn)行確認(rèn)檢測(cè)的診斷檢測(cè)而言，對(duì)象將不得不一而再再而三地為檢測(cè)而咬合檢測(cè)試條。然而，應(yīng)當(dāng)指出，在初次收集后長(zhǎng)達(dá)一小時(shí)，口腔粘膜滲出物的收集通常減少口腔組織表面可得的富含IgG的滲出物，這將使隨后收集以使用"一站式樣品收集器/檢測(cè)組合"重新檢測(cè)不夠方便，因?yàn)闄z測(cè)對(duì)象必須等到滲出物水平更高，否則用樣品來(lái)檢測(cè)風(fēng)險(xiǎn)可能會(huì)有更低的靈敏度(R.Mink，未出版數(shù)據(jù))。
發(fā)明內(nèi)容本發(fā)明是謹(jǐn)記現(xiàn)有技術(shù)中存在的上述缺點(diǎn)而做出的，本發(fā)明的一個(gè)目的是提供一種簡(jiǎn)單、方便且有成本效益的用側(cè)向免疫層析試條的口腔流體收集方法，其適于靈敏和快速地檢測(cè)口腔流體中分析物。本發(fā)明的另一個(gè)目的是提供一種生產(chǎn)所述側(cè)向流免疫層析檢測(cè)試條的方法。本發(fā)明的另外一個(gè)目的是提供一種適于靈敏和快速地檢測(cè)口腔流體中分析物的靈敏方法。本發(fā)明的另外一個(gè)目的是提供用于靈敏和快速地檢測(cè)口腔流體中分析物的試劑盒。因此，在第一個(gè)方面，本發(fā)明提供一種用于檢測(cè)口腔流體中分析物的側(cè)向流免疫層析檢測(cè)試條，其基本上由樣品墊、偶聯(lián)物墊、檢測(cè)區(qū)和對(duì)照區(qū)墊組成，所述墊由至少一種基質(zhì)材料制成，其中所述偶聯(lián)物墊位于樣品墊的下游且其上用偶聯(lián)物劃條紋，所述檢測(cè)區(qū)和對(duì)照區(qū)墊位于該偶聯(lián)物墊的下游且包含檢測(cè)區(qū)和對(duì)照區(qū)，其中檢測(cè)區(qū)固定有特異性結(jié)合試劑，所述特異性結(jié)合試劑特異性地與靶分析物結(jié)合；且對(duì)照區(qū)固定有第二捕獲試劑。在此方面的一個(gè)實(shí)施方案中，待檢測(cè)分析物選自抗以下抗原的抗體傳染性疾病、激素、生長(zhǎng)因子、治療藥物、濫用藥物及濫用藥物的代謝產(chǎn)物。在另一個(gè)實(shí)施方案中，所述基質(zhì)材料選自無(wú)機(jī)粉末，比如二氧化硅和氧化鋁；玻璃纖維濾紙；天然聚合材料尤其是基于纖維素的材料、層析紙；合成或改性的天然聚合物比如硝酸纖維素、醋酸纖維素、聚氯乙烯、聚丙烯酰胺、交聯(lián)葡聚糖、瓊脂糖；以及其組合。在另一個(gè)實(shí)施方案中，樣品墊的基質(zhì)材料為玻璃纖維濾紙；偶聯(lián)物墊的基質(zhì)材料為聚酯材料；檢測(cè)墊和對(duì)照墊的基質(zhì)材料為硝酸纖維素膜。在另一個(gè)實(shí)施方案中，偶聯(lián)物包含與第一捕獲試劑偶聯(lián)的標(biāo)記物，所述第一捕獲試劑捕獲口腔流體中內(nèi)源性抗體。所述標(biāo)記物選自膠體金顆粒；元素或金屬溶膠顆粒，包括硒、銀、鐵或碳；其它珠狀顆粒，包括有色乳膠、脂質(zhì)體和染料顆粒。優(yōu)選地，所述標(biāo)記物為膠體金顆粒。在另一個(gè)實(shí)施方案中，所述第一捕獲試劑選自抗IgG、IgM或IgA的抗體，蛋白A,蛋白G和伴刀豆球蛋白A。優(yōu)選地，所述第一捕獲試劑為蛋白A。在另一個(gè)實(shí)施方案中，所述特異性結(jié)合試劑選自以下的抗原傳染性疾病、激素、生長(zhǎng)因子、治療藥物、濫用藥物及濫用藥物的代謝產(chǎn)物。在另一個(gè)實(shí)施方案中，傳染性疾病的抗原為代表HIV蛋白免疫決定區(qū)的重組或合成肽，所述HIV蛋白尤其是選自HIV-1的gpl20和gp41以及HIV-2的gp36的HIV包膜蛋白。在另一個(gè)實(shí)施方案中，第二捕獲試劑選自抗IgG、IgM或IgA的抗體、蛋白A、蛋白G和伴刀豆球蛋白A,其中所述抗IgG的抗體為山羊抗人IgG抗體。在第二個(gè)方面，本發(fā)明提供生產(chǎn)權(quán)利要求1-17中任一項(xiàng)所定義的側(cè)向流免疫層析檢測(cè)試條的方法，其包括a)將偶聯(lián)物在偶聯(lián)物墊上劃條紋；b)將所述特異性結(jié)合試劑固定到檢測(cè)區(qū)和對(duì)照區(qū)墊的檢測(cè)區(qū)上；c)將第二捕獲試劑固定于檢測(cè)區(qū)和對(duì)照區(qū)墊的對(duì)照區(qū)上；d)用封閉劑封閉所述每個(gè)墊；以及e)對(duì)齊所得墊使得相互之間流體連通。在一個(gè)實(shí)施方案中，在劃條紋之前，偶聯(lián)物在簡(jiǎn)單或復(fù)合糖溶液中被穩(wěn)定化，其中所述糖溶液包含蔗糖、海藻糖、錫酸鉀以及過(guò)氧化氫脲。在另一個(gè)實(shí)施方案中，使用生物素/鏈親合素連接子將所述特異性結(jié)合試劑固定于檢測(cè)區(qū)和對(duì)照區(qū)上。在另一個(gè)實(shí)施方案中，使用生物素/鏈親合素連接子將所述特異性結(jié)合試劑固定于對(duì)照區(qū)上。在另一個(gè)實(shí)施方案中，所述封閉劑包含非離子型、陽(yáng)離子型、陰離子和兩性離子型的去污劑；糖，包括蔗糖、果糖；或蛋白質(zhì)，包括牛血清白蛋白、動(dòng)物全血清、酪蛋白和脫脂奶粉。在另一個(gè)實(shí)施方案中，動(dòng)物全血清為胎牛血清。在另一個(gè)實(shí)施方案中，動(dòng)物全血清為選自鵝血清、火雞血清和雞血清的鳥(niǎo)類血清。在第三個(gè)方面，本發(fā)明提供用于檢測(cè)口腔流體中分析物的側(cè)向流免疫層析方法，其包括(a)使用與由權(quán)利要求1-17中任一項(xiàng)所定義的側(cè)向流免疫層析測(cè)試試條分開(kāi)的收集器收集口腔流體；(b)將收集器投入一定體積的樣品緩沖液中以將口腔流體釋放到緩沖液中而得到混合物；(c)將前述權(quán)利要求中任一項(xiàng)所定義的側(cè)向流免疫層析測(cè)試試條放入所述混合物中；和(d)通過(guò)觀察對(duì)照區(qū)信號(hào)的存在以確定檢測(cè)的有效性，并且通過(guò)在檢測(cè)開(kāi)始后15-60分鐘內(nèi)觀察檢測(cè)區(qū)中信號(hào)的存在來(lái)確定分析物的存在。在另一個(gè)實(shí)施方案中，在步驟(a)中的收集器是未處理過(guò)的聚酯拭子(swab)，例如TexwipeLargeAlphaSwabTX714A。在另一個(gè)實(shí)施方案中，樣品緩沖液為pH7.2+/-0.2的磷酸鉀緩沖溶液，其還包含0.15M氯化鈉、0.1%TritonX-IOO、15。/。熱滅活雞血清、30ng/ml親合素、0.2%Tween80、0.2%TetronicT-904以及0.0.285%(活性成分)ProClin950。在另一個(gè)實(shí)施方案中，樣品緩沖液的體積為1000^1。在另一個(gè)實(shí)施方案中，所述方法還包括在步驟(b)和步驟(c)之間取出混合物試樣的步驟，其中所述試樣的體積為200jU。在另一個(gè)實(shí)施方案中，所述信號(hào)為有色線，如微紅色(reddish)線。在另一個(gè)實(shí)施方案中，在20-45分鐘內(nèi)觀察所述信號(hào)。在第四個(gè)方面，本發(fā)明提供用于檢測(cè)口腔流體中分析物的試劑盒，其包括至少一種上述側(cè)向流免疫層析檢測(cè)試條。所述檢測(cè)試條封閉于干燥容器內(nèi)。每一試劑盒可任選地包括樣品緩沖液、口腔流體收集器、提供所附試條使用指導(dǎo)的包裝插頁(yè)、含有用于對(duì)檢測(cè)試條進(jìn)行質(zhì)量檢測(cè)的陽(yáng)性和陰性對(duì)照的小管(vial)、可用于確定本發(fā)明測(cè)定何時(shí)完成的計(jì)時(shí)器、和/或生物危險(xiǎn)物處理容器。在本方面的一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方案中，樣品緩沖液為pH7.2+/-0.2的磷酸鉀緩沖溶液，其還包含0.15M氯化鈉、0.1%TritonX-IOO、15%熱滅活雞血清、30ng/ml親合素、0.2%Tween80、0.2%TetronicT-904以及0.0285%(活性成分)ProClin950。在另一個(gè)實(shí)施方案中，收集器是未處理過(guò)的聚酯拭子，例如TexwipeLargeAlphaSwabTX714A。因此，本發(fā)明的一個(gè)優(yōu)點(diǎn)是設(shè)計(jì)的筒單性和材料的低成本，這是由于缺少外罩，比如這可見(jiàn)于其它口腔流體快速檢測(cè)(例如參見(jiàn)美國(guó)專利6303081、美國(guó)專利申請(qǐng)20020155029和20020192386)以及其它快速側(cè)向流檢測(cè)(美國(guó)專利6,303,081、5,935,864、6,485,982、6,534,320、6,352,862、6,187,598和6，027，943)中。這不僅4吏得產(chǎn)品制造的成本更低，而且還提供了更低復(fù)雜性的制造工藝復(fù)雜性，這進(jìn)一步降低了成本。本發(fā)明的另一個(gè)優(yōu)點(diǎn)在于該分析自身獨(dú)立于樣品收集器(例如在美國(guó)專利6303081、美國(guó)專利申請(qǐng)20020155029和20020192839以及美國(guó)專利5935864中)，這使得使用者在不需另外收集的情況下對(duì)標(biāo)本進(jìn)行多次檢測(cè)。這在具有"無(wú)效"指示的側(cè)向流免疫層析測(cè)定中尤其有利，其中無(wú)效的結(jié)果需要重新檢測(cè)，或者對(duì)于例如HIV這樣常規(guī)需要對(duì)所收集標(biāo)本進(jìn)行確認(rèn)檢測(cè)的診斷檢測(cè)也是尤其有利，因?yàn)樵诔醮问占箝L(zhǎng)達(dá)一小時(shí)，口腔粘膜滲出物收集通常減少口腔組織表面可用的富含IgG的流出物，使得隨后收集以用"一站式樣品收集器/檢測(cè)組合"進(jìn)行重新檢測(cè)不夠方便。本發(fā)明進(jìn)一步的優(yōu)點(diǎn)在于與其它口腔流體檢測(cè)(例如美國(guó)專利6,303,081)相比，所述口腔流體快速免疫層析試條非常緊湊(例如5mmx1mmx75mm)，這4吏得運(yùn)輸和儲(chǔ)存成本降低。本發(fā)明的另一個(gè)優(yōu)點(diǎn)在于所述口腔流體收集方法提供了足夠用于其它檢測(cè)判斷比如確證性檢測(cè)的體積。本發(fā)明進(jìn)一步的優(yōu)點(diǎn)在于相比于其它口腔流體檢測(cè)(例如美國(guó)專利6,303,081)而言生產(chǎn)的復(fù)雜性降低，因?yàn)樵趥?cè)向流層析試條周圍不必配置外罩，這導(dǎo)致材料成本和加工時(shí)間均得以降低。圖1舉例說(shuō)明根據(jù)本發(fā)明一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方案的口腔流體快速免疫層析檢測(cè)的程序，其中圖1-1至1-15舉例說(shuō)明檢測(cè)的步驟。圖2舉例說(shuō)明根據(jù)本發(fā)明一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方案，口腔流體快速免疫層析檢測(cè)的三種可能結(jié)果，其中圖2A、2B和2C分別代表陰性、陽(yáng)性和無(wú)效的結(jié)果。優(yōu)選實(shí)施方案的描述通過(guò)對(duì)以下優(yōu)選實(shí)施方案的詳細(xì)描述并結(jié)合附圖，可更好地理解本發(fā)明。在第一個(gè)方面，本發(fā)明提供一種用于檢測(cè)口腔流體中分析物的側(cè)向流免疫層析檢測(cè)試條，其基本上由樣品墊、偶聯(lián)物墊、檢測(cè)區(qū)和對(duì)照區(qū)墊組成，所述墊由至少一種基質(zhì)材料制成，其中偶聯(lián)物墊位于樣品區(qū)墊的下游，且用偶聯(lián)物在其上劃條紋，所述檢測(cè)區(qū)和對(duì)照區(qū)墊位于該偶聯(lián)物墊的下游，并且在檢測(cè)區(qū)固定有與靶分析物特異性結(jié)合的特異性結(jié)合試劑，在對(duì)照區(qū)固定有第二捕獲試劑。所述樣品墊接收口腔流體樣品。樣品墊通常由表現(xiàn)出低的靶抗體保留的材料構(gòu)成。在一些實(shí)施方案中，樣品墊也可起到機(jī)械過(guò)濾器的作用，其可捕獲任何不需要的顆粒物比如灰塵、碎片、沉淀、粘液或血液。所述偶聯(lián)物墊位于樣品墊的下游并含有偶聯(lián)物，所述偶聯(lián)物包含直接或間接與第一捕獲試劑偶聯(lián)的標(biāo)記物。所述檢測(cè)區(qū)位于偶聯(lián)物墊的下游并含有特異性結(jié)合試劑，所述特異性結(jié)合試劑特異性地與耙抗體結(jié)合，借此，標(biāo)記的偶聯(lián)物能被固定于基質(zhì)。所述對(duì)照區(qū)位于流路中檢測(cè)區(qū)的下游。對(duì)照區(qū)含有第二捕獲試劑，所述第二捕獲試劑捕獲被第一捕獲試劑捕獲的抗體，且優(yōu)選地被固定在對(duì)照區(qū)內(nèi)以形成對(duì)照線，所述對(duì)照線濃縮任何被第二捕獲試劑結(jié)合的標(biāo)記抗體偶聯(lián)物。如本文中所用，術(shù)語(yǔ)"口腔流體"指單獨(dú)或組合發(fā)現(xiàn)于口腔內(nèi)的一種或多種流體。其包括但不限于唾液和口腔粘膜滲出物。應(yīng)該知道，口腔流體可包括來(lái)自多種來(lái)源(例如附屬腺體腮腺、頜下腺、舌下腺，齒齦粘膜和口腔粘膜)的流體的組合，且術(shù)語(yǔ)口腔流體包括來(lái)自每一種單獨(dú)或組合的這些來(lái)源的流體。術(shù)語(yǔ)唾液指口腔流體的組合，例如通常見(jiàn)于口腔，尤其是在咀嚼后。如本文中所用，術(shù)語(yǔ)"口腔粘膜滲出物，，指通過(guò)血清組分從口腔粘膜空隙向口腔中被動(dòng)擴(kuò)散而產(chǎn)生的流體?？谇徽衬B出物常常形成唾液的一種組分。如本文中所用，術(shù)語(yǔ)"分析物，，用于指在特定分析中待檢測(cè)的部分。通常在本發(fā)明分析中檢測(cè)的分析物包括但不限于抗以下抗原的抗體傳染性疾病、激素、生長(zhǎng)因子、治療藥物、濫用藥物及濫用藥物的代謝產(chǎn)物。特別優(yōu)選的分析物包括抗傳染性疾病的抗原的抗體，所述傳染性疾病比如HIV、肝炎等。抗原可以是但不限于比如乙型肝炎抗原，抗體可以是但不限于HIV的抗體、HTLV的抗體、幽門(mén)螺桿菌的抗體、肝炎的抗體、麻滲的抗體、腮腺炎的抗體和風(fēng)滲的抗體。治療藥物和濫用藥物或?yàn)E用藥物的代謝產(chǎn)物可以是但不限于四氫大麻酚、煙堿、乙醇、茶堿、苯妥英、對(duì)乙酰氨基酚、鋰、安定、去曱替林(nortryptyline)、司可巴比妥、苯巴比妥。激素可以是但不限于睪酮、雌二醇、17-羥基孕酮、孕酮、甲狀腺素、促甲狀腺激素、促卵泡激素和促黃體生成激素。如本文中所用，"特異性結(jié)合試劑"是與靶分析物特異性結(jié)合的試劑，如上所述，所述耙分析物選自以下抗原傳染性疾病、激素、生長(zhǎng)因子、治療藥物、濫用藥物及濫用藥物的代謝產(chǎn)物。如本文中所用，"抗原"是一種當(dāng)其被引入哺乳動(dòng)物或鳥(niǎo)類中時(shí)刺激抗體生成的物質(zhì)。本發(fā)明優(yōu)選的抗原包括人免疫缺陷病毒(HIV)蛋白質(zhì)，特別是病毒包膜蛋白HIV-1的gpl20和gp41、以及HIV-2的gp36。如本文中所用，"抗體"指由基本上由免疫球蛋白基因或免疫球蛋白基因片段編碼的一或多個(gè)多肽組成的蛋白質(zhì)。公認(rèn)的免疫球蛋白基因包括k、x、a、y、s、s以及n恒定區(qū)基因，以及極大量的免疫球蛋白可變區(qū)基因?？贵w的輕鏈分為K或l重鏈分為y、H、a、6或s，其進(jìn)而決定免疫球蛋白的類型分別為IgG、IgM、IgA、IgD和IgE。已知抗體(也稱免疫球蛋白)的基本結(jié)構(gòu)單元包含四聚體。每個(gè)四聚體由兩對(duì)相同的多肽鏈組成，每對(duì)具有一個(gè)輕鏈(約25kD)和一個(gè)重鏈(約50-70kD)。每個(gè)鏈的N端定義一個(gè)主要負(fù)責(zé)抗原識(shí)別的約100到110個(gè)或更多個(gè)氨基酸的可變區(qū)。術(shù)語(yǔ)可變區(qū)輕鏈(Vj和可變區(qū)重鏈(Vh)分別指這些輕鏈和重鏈?？贵w可作為完整的免疫球蛋白或作為通過(guò)以各種肽酶消化而產(chǎn)生的大量良好表征的片段而存在。因此，例如胃蛋白酶區(qū)域產(chǎn)生F(ab，)2，F(xiàn)(ab，)2是Fab的二聚體，F(xiàn)ab自身為通過(guò)二硫鍵與VH-VHl相連的輕鏈。F(ab，)2可在溫和條件下被還原以破壞絞鏈區(qū)的二硫鍵連接從而將F(ab，)2二聚體轉(zhuǎn)化為Fab，單體。Fab，單體基本上是具有鉸鏈區(qū)一部分的Fab(關(guān)于其它抗體片段的更詳細(xì)描述參見(jiàn)FundamentalImmunology,W.E.Paul,Ed.,RavenPress,N.Y.,1993)。雖然各種抗體片段是根據(jù)完整抗體的消化而定義的，但技術(shù)人員將會(huì)知曉這樣的Fab，片段可通過(guò)化學(xué)或通過(guò)利用重組DNA方法從頭合成。因此，如本文中所用術(shù)語(yǔ)抗體還包括抗體片段，所述抗體片段通過(guò)修飾完整抗體而產(chǎn)生或使用重組DNA方法從頭合成。如本文中所用，術(shù)語(yǔ)"基質(zhì)"指能支持流體流動(dòng)的不溶性材料?；|(zhì)材料可為天然來(lái)源的和/或合成來(lái)源的，吸水的(bibulous)或不吸水的、纖維狀的或顆粒狀的。本發(fā)明的基質(zhì)可形成為相同材料或不同材料混合物的連續(xù)條帶，所述不同材料沿著共同條帶連續(xù)分布，或者不連續(xù)分布以形成在條帶不同區(qū)域具有不同物理或化學(xué)性質(zhì)的區(qū)帶。作為替代，可由相同或不同的基質(zhì)材料形成一系列離散的墊，并將用于測(cè)定的試劑加到每個(gè)墊上。然后可將墊放置成彼此流體連通以形成連續(xù)的流路。用于構(gòu)建本發(fā)明基質(zhì)的材料可為惰性的或可與一種或多種本發(fā)明的試劑反應(yīng)，前提是所述材料在實(shí)施本文所述發(fā)明中仍是不溶性的?；|(zhì)材料可選自無(wú)機(jī)粉末，比如二氧化硅和氧化鋁；玻璃纖維濾紙；天然聚合材料特別是基于纖維素的材料比如濾紙、層析紙；合成或改性的天然聚合物比如硝酸纖維素、醋酸纖維素、聚氯乙烯、聚丙烯酰胺、交聯(lián)葡聚糖、瓊脂糖；以及其組合。在一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，所述基質(zhì)為硝酸纖維素膜。在本發(fā)明另一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，玻璃纖維濾紙用作樣品墊的基質(zhì)，聚酯材料用作偶聯(lián)物墊的基質(zhì)，硝酸纖維素膜用作檢測(cè)區(qū)和對(duì)照區(qū)墊的基質(zhì)。"吸水的，，(bibulous)指某些吸收性材料在流體流經(jīng)該材料期間支持差異性不同溶質(zhì)遷移速率的能力。因此，具有吸水性質(zhì)的吸收性材料能基于物理和/或化學(xué)性質(zhì)將溶質(zhì)進(jìn)行層析分離。如本文所使用的，術(shù)語(yǔ)"標(biāo)記物"指直接或間接地通過(guò)分析物特異性結(jié)合伴侶與分析物特異性結(jié)合的可檢測(cè)原子或分子結(jié)構(gòu)。本發(fā)明的標(biāo)記物可以被物理或化學(xué)檢測(cè)。優(yōu)選的標(biāo)記物是當(dāng)結(jié)合時(shí)對(duì)棵眼可見(jiàn)的，以指示陽(yáng)性檢測(cè)結(jié)果。本發(fā)明的標(biāo)記物選自膠體金顆粒；元素或金屬溶膠顆粒，包括硒、銀、鐵或碳；其它珠狀顆粒，包括有色乳膠、脂質(zhì)體、以及染料顆粒；在本發(fā)明一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，所述標(biāo)記物為膠體金顆粒。這些標(biāo)記物是本領(lǐng)域中所熟知的，并被描述在例如G.FrensNature,241，20-22(1973)和美國(guó)專利No.4,313,734中，其公開(kāi)內(nèi)容以其整體通過(guò)參考引入本文中。用在本發(fā)明中的"膠體金"指微細(xì)金顆粒的溶膠，其能夠無(wú)限地保持于水性懸液中。如本文中所使用，"捕獲試劑"是特異性地結(jié)合到靶抗體的任何分子。本發(fā)明的捕獲試劑優(yōu)選地以確定模式固定于基質(zhì)，典型地為與流路垂直的線。優(yōu)選的捕獲試劑是抗IgG、IgM或IgA的抗體；蛋白A、蛋白G或伴刀豆球蛋白A。如本文中所使用，本發(fā)明的"第一捕獲試劑"是與標(biāo)記物偶聯(lián)的捕獲試劑。優(yōu)選地，所述第一捕獲試劑是抗IgG、IgM或IgA的抗體；蛋白A、蛋白G或伴刀豆球蛋白A。在一個(gè)更優(yōu)選的實(shí)施方案中，蛋白A或蛋白G與標(biāo)記物偶聯(lián)，形成偶聯(lián)物。用在本發(fā)明中的"蛋白A"指由金黃色葡萄球菌(5te/;/^/o"""s產(chǎn)生的高度穩(wěn)定的表面受體，其能與大量物種的免疫球蛋白尤其是IgG的Fc部分相結(jié)合(Boyle，M.D.P.andK.J.Reis.BacterialFcReceptors.Biotechnology5:697-703，1987)。一個(gè)蛋白A分子能同時(shí)結(jié)合至少2個(gè)IgG分子(Sj6quist,J.，Meloun,B.andHjelm，H.ProteinAisisolatedfromi9鄉(xiāng)/y;/。cocc"s冊(cè)fdi51afterdigestionwithlysostaphin.EurJBiochem29:572-578,1972)。用在本發(fā)明中的"蛋白G"指來(lái)自鏈球菌的以高親和力與IgG結(jié)合的細(xì)胞表面相關(guān)蛋白。其具有三個(gè)高度同源的IgG結(jié)合結(jié)構(gòu)域(參見(jiàn)Lian,etal"1992.JournalofMol.Biol.228:1219-1234和DerrickandWigley.1994.JournalofMol.Biol.243:906-918)。如本文中所用，"第二捕獲試劑"是固定于對(duì)照區(qū)以捕獲被第一捕獲試劑所捕獲之抗體的捕獲試劑。合適的本發(fā)明第二捕獲試劑是抗IgG、IgM或IgA的抗體、蛋白A、蛋白G或伴刀豆球蛋白A。在一個(gè)更優(yōu)選的實(shí)施方案中，所述第二捕獲試劑包括來(lái)自不同于提供口腔流體之物種的抗IgG抗體。甚至更優(yōu)選地，此第二捕獲試劑是抗人IgG抗體；最優(yōu)選地，此第二捕獲試劑是山羊抗人IgG抗體。如本文中所用，"流路"指當(dāng)口腔流體樣品經(jīng)過(guò)基質(zhì)時(shí)所經(jīng)的路線。所述流路優(yōu)選為單一路線，但可包括幾條路線，其中每條路線相對(duì)于其它路線而言可以同時(shí)、依序或獨(dú)立地支持液體流動(dòng)。"下游"指液體通過(guò)基質(zhì)時(shí)遠(yuǎn)離液體施加點(diǎn)的定向流路。"上游"指液體通過(guò)基質(zhì)時(shí)朝向液體施加點(diǎn)的定向流路。在第二個(gè)方面，本發(fā)明提供生產(chǎn)側(cè)向流免疫層析檢測(cè)試條的方法，其包括a)將偶聯(lián)物在偶聯(lián)物墊上劃條紋；b)將特異性結(jié)合試劑固定到檢測(cè)區(qū)和對(duì)照區(qū)墊的檢測(cè)區(qū)并將第二捕獲試劑固定到對(duì)照區(qū)；c)用封閉劑封閉每個(gè)墊；和e)對(duì)齊所得墊使得相互之間流體連通。將偶聯(lián)物在偶聯(lián)物墊上劃條紋偶聯(lián)物以下述方式沉積在偶聯(lián)物墊的基質(zhì)中當(dāng)其與口腔流體樣品接觸時(shí)，其在流體流中很容易遷移。為實(shí)現(xiàn)此點(diǎn)，偶聯(lián)物墊的基質(zhì)由網(wǎng)狀粘合(spun-bonded)的聚酯制成。將偶聯(lián)物與劃條紋溶液一起利用例如接觸尖端或氣溶膠尖端在墊上劃條紋。在劃條紋之前，優(yōu)選將偶聯(lián)物穩(wěn)定化。例如，可在20%蔗糖、5%海藻糖和0.1%過(guò)氧化氫脲中將偶聯(lián)物穩(wěn)定化。當(dāng)口腔流體樣品流經(jīng)偶聯(lián)物墊時(shí)，偶聯(lián)物被溶解并加入通過(guò)檢測(cè)試條的流體流。將特異性結(jié)合試劑固定到檢測(cè)區(qū)使用本領(lǐng)域技術(shù)人員所知的方法，適用于本發(fā)明的特異性結(jié)合試劑可從任何來(lái)源包括天然、化學(xué)合成或重組生產(chǎn)而獲得。例如，優(yōu)選的SEQIDNo.1至5的肽部分可使用固相肽合成技術(shù)化學(xué)合成，或通過(guò)可操作性將編碼期望肽的核酸連接到表達(dá)栽體中并在合適宿主中表達(dá)所述核酸而進(jìn)行重組生產(chǎn)。一旦分離，可使用已知技術(shù)將所述肽生物素化?？墒褂萌魏伪绢I(lǐng)域技術(shù)人員所知的方法將合適的抗原固定到基質(zhì)，所述方法不破壞抗原對(duì)靶抗體的特異性結(jié)合。優(yōu)選地，對(duì)于重組蛋白抗原而言，抗原不經(jīng)進(jìn)一步修飾而被直接固定到基質(zhì)上。優(yōu)選地，使用生物素/鏈親合素連接子將合成肽抗原固定到基質(zhì)上，最優(yōu)選地，將抗原偶聯(lián)到生物素并與鏈親合素復(fù)合，然后將鏈親合素偶聯(lián)到基質(zhì)。對(duì)于吸水性基質(zhì)，使用本領(lǐng)域技術(shù)人員公知的技術(shù)，通常在封閉之前將復(fù)合物的鏈親合素偶聯(lián)到基質(zhì)。優(yōu)選地，在含有至少4:1比率的鏈親合素結(jié)合位點(diǎn)等價(jià)物對(duì)比每一生物素結(jié)構(gòu)的溶液中實(shí)現(xiàn)偶聯(lián)，盡管其它比率比如0.5:1、1:1、2:1、3:1和5:1以及所有中間(分?jǐn)?shù))比率也包括在內(nèi)，作為本發(fā)明的一部分。對(duì)于吸水性基質(zhì)，最終復(fù)合物可筒單地施加到基質(zhì)材料并干燥，隨后用用合適的封閉劑進(jìn)行封閉。具有足夠高分子量而可以直接與基質(zhì)結(jié)合的合適抗原比如很多重組蛋白不必通過(guò)生物素/鏈親合素連接子的方法來(lái)附著。適用于本發(fā)明的示例性抗原肽的氨基酸序列見(jiàn)于SEQIDNo:l至5。將抗原固定到基質(zhì)優(yōu)選以用于濃縮標(biāo)記抗體偶聯(lián)物的方式進(jìn)行，所述抗體偶聯(lián)物特異性地結(jié)合固定化抗原。通過(guò)濃縮標(biāo)記的抗體偶聯(lián)物，由標(biāo)記物產(chǎn)生的信號(hào)被強(qiáng)化，從而提高靈敏度并盡可能減小獲得錯(cuò)誤結(jié)果的可能性。將第二捕獲試劑固定到對(duì)照區(qū)上對(duì)照區(qū)含有第二捕獲試劑，且優(yōu)選被固定在對(duì)照區(qū)內(nèi)以形成濃縮標(biāo)記物偶聯(lián)物的對(duì)照線。采用已知技術(shù)，包括上述用于固定化抗原的技術(shù)，將適用于本發(fā)明的第二捕獲試劑固定到基質(zhì)?？墒褂蒙锼?鏈親合素連接子將第二捕獲試劑固定到基質(zhì)，在此情況下，最優(yōu)選地，如上所述，在將鏈親合素偶聯(lián)到基質(zhì)之前將第二捕獲試劑偶聯(lián)到生物素并以鏈親合素與之符合。優(yōu)選地，捕獲試劑比如山羊抗人IgGF(ab，)2可不使用生物素/鏈親合素連接子而被直接固定到基質(zhì)上。將墊用封閉劑封閉盡管可使用固有吸水性的基質(zhì)材料制作本發(fā)明的墊，但流經(jīng)本發(fā)明檢測(cè)試條的流體流動(dòng)優(yōu)選在本質(zhì)上為非吸水性的。通過(guò)應(yīng)用封閉劑，可將吸水性材料轉(zhuǎn)化為表現(xiàn)出非吸水性流動(dòng)特性的材料。這些封閉劑可為去污劑、糖或蛋白質(zhì)，其可阻礙產(chǎn)生吸水特性的相互作用力。示例性的蛋白質(zhì)封閉劑包括牛血清白蛋白自身或其甲基化或琥珀?；问?，動(dòng)物全血清(例如馬或胎牛血清)，以及其它的血液蛋白。優(yōu)選的封閉劑是鳥(niǎo)類血清比如鵝或火雞血清，最優(yōu)選雞血清。蛋白封閉劑的其它實(shí)例包括酪蛋白和脫脂奶粉?；谌ノ蹌┑姆忾]劑選自非離子型、陽(yáng)離子型、陰離子型和兩性離子型，其選擇是基于被封閉基質(zhì)的性質(zhì)。Tween20是用于封閉膜的特別有用的去污劑?？捎米鞣忾]劑的示例性的糖包括蔗糖和果糖?？赏ㄟ^(guò)用有效濃度的封閉劑溶液處理所述墊以去除不希望的表面反應(yīng)性來(lái)施加封閉劑。一般而言，此處理釆用封閉溶液在約室溫下進(jìn)行數(shù)分鐘到數(shù)小時(shí)，所述封閉溶液比如1-20mg/ml蛋白質(zhì)的蛋白質(zhì)溶液。所得涂敷材料然后通過(guò)空氣干燥、凍干或其它干燥方法被永久地吸附到表面。使用固有吸水性但可轉(zhuǎn)變?yōu)榉俏鲃?dòng)特性的基質(zhì)對(duì)于固定特異性結(jié)合試劑和第二捕獲試劑尤其有用。例如，可在施加封閉劑之前將第二捕獲試劑施加到基質(zhì)并可在原位固定。一旦第二捕獲試劑已被固定到基質(zhì)，然后可施加封閉劑。例如，在操作本發(fā)明期間，將本發(fā)明的封閉劑以足以阻止靼抗體與基質(zhì)材料間相互作用的量施加到樣品墊。用于樣品墊的一種特別有利的封閉劑是鳥(niǎo)類血清，更優(yōu)選雞血清。在一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，樣品墊用含有以下成分的溶液浸透聚乙烯吡咯烷酮、牛血清白蛋白、鳥(niǎo)類血清、硼酸鹽和/或碳酸鹽緩沖液(約0.5M)、以及TritonX-100或Tween-20去污劑。對(duì)由玻璃纖維材料制成的樣品墊，最優(yōu)選的樣品封閉緩沖液由以下組成40%雞血清(熱滅活并無(wú)菌過(guò)濾)、0.25M碳酸氫鉀、0.05M磷酸氫二鉀、0.1%Tween80、100mM錫酸鉀以及0.2%過(guò)氧化氫脲，其pH在8.2到8.5。將墊壓縮以除去過(guò)量的緩沖液并將墊在3ox:干燥過(guò)夜。此方法的一個(gè)優(yōu)點(diǎn)是樣品墊的可濕性和毛細(xì)作用增加。封閉緩沖液的組成和pH隨墊的材料類型而變化。例如，通過(guò)將由聚酯材料制成的偶聯(lián)物墊浸入含有以下成分的緩沖液中而將其封閉聚乙烯吡咯烷酮、雞血清、牛血清白蛋白、0.1。/。過(guò)氧化氫脲、100mM錫酸鉀以及碳酸鉀和/或硼酸鹽緩沖劑。然后將偶聯(lián)物墊在50C并強(qiáng)迫通風(fēng)干燥120分鐘，然后環(huán)境溫度下空氣干燥過(guò)夜。對(duì)于由硝酸纖維素膜制成的檢測(cè)區(qū)和對(duì)照區(qū)墊而言，最優(yōu)選的樣品封閉緩沖液組成是在pH7.8+/-0.1緩沖的鉀鹽溶液中的0.15%牛血清白蛋白、0.075Tween20。在第三個(gè)方面，本發(fā)明提供用于檢測(cè)口腔流體中分析物的側(cè)向流免疫層析方法，其包括(a)用與側(cè)向流免疫層析檢測(cè)試條分開(kāi)的收集器收集口腔流體；(b)將收集器投入一定體積的樣品緩沖液中以將口腔流體釋放到緩沖液中而得到混合物；(c)將如上所述的側(cè)向流免疫層析檢測(cè)試條置于混合物中約15-60分鐘；(d)通過(guò)觀察對(duì)照區(qū)信號(hào)的存在來(lái)確定檢測(cè)的有效性，并通過(guò)觀察檢測(cè)區(qū)信號(hào)的存在來(lái)確定分析物的存在。上述方法的原理見(jiàn)于以下?？谇涣黧w被基質(zhì)通過(guò)毛細(xì)作用帶走并沿測(cè)定檢測(cè)試條向上遷移。其將偶聯(lián)物再水化，比如試條上微紅色的蛋白A-膠體金試劑，并且樣品中的IgG與偶聯(lián)物結(jié)合而形成IgG/偶聯(lián)物復(fù)合物。所述IgG/偶聯(lián)物復(fù)合物繼續(xù)沿試條向上遷移，并首先到達(dá)檢測(cè)試條上含有特異性結(jié)合試劑的檢測(cè)區(qū)，其中所述特異性結(jié)合試劑能特異性地與靶分析物結(jié)合，并且復(fù)合物被固定于檢測(cè)區(qū)并出現(xiàn)信號(hào)，例如微紅色的有色線。這指示反應(yīng)性或陽(yáng)性結(jié)果。檢測(cè)區(qū)中沒(méi)有信號(hào)指示樣品不含有靶分析物并構(gòu)成非反應(yīng)性或陰性結(jié)果。IgG/偶聯(lián)物復(fù)合物繼續(xù)沿測(cè)定試條向上遷移直到其到達(dá)對(duì)照區(qū)。對(duì)照區(qū)含有第二捕獲試劑，例如固定于測(cè)定檢測(cè)試條的線中的山羊抗人F(ab，)2IgG片段。剩余的IgG/偶聯(lián)物復(fù)合物與固定化F(ab，)2片段結(jié)合，并出現(xiàn)信號(hào)，例如微紅色的有色線。此信號(hào)的出現(xiàn)是測(cè)試正常工作且含有IgG的證據(jù)。無(wú)論樣品對(duì)于耙分析物而言是反應(yīng)性的還是非反應(yīng)性的，在進(jìn)行所有的有效檢測(cè)期間都將有信號(hào)在對(duì)照區(qū)出現(xiàn)。樣品繼續(xù)經(jīng)過(guò)對(duì)照區(qū)遷移進(jìn)入最終的吸收墊，其幫助拉動(dòng)IgG/偶聯(lián)物復(fù)合物通過(guò)試條并清除任何背景顏色。在此方面，可用于本測(cè)試的樣品收集器能從口腔收集口腔粘膜滲出物，已知所述口腔粘膜滲出物具有其它產(chǎn)品(例如參見(jiàn)美國(guó)專利No.5,103,836)所需的更高的診斷性IgG。事實(shí)上，在一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，用于本測(cè)定的收集器是現(xiàn)成的未處理的聚酯拭子，即TexwipeLargeAlphaSwab，TX714A(TexwipeInc.,UpperSaddleRiverNJ)。在此方面的一個(gè)實(shí)施方案中，用于稀釋口腔流體的樣品緩沖液為以pH7.2+M).2磷酸鉀緩沖的0.15M氯化鈉、0.1%TritonX-IOO、15%熱滅活雞血清、30jig/ml親合素、0.2%Tween80、0.2%TetronicT-卯4和0.0285%(活性成分)ProClin950。用于稀釋口腔流體的樣品緩沖液的體積是1000nl。在另一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，此方法還包括在步驟(b)和步驟(c)之間取出混合物試樣(aliquot)的步驟。在一個(gè)具體實(shí)施方案中，所述試樣的體積為200nl。當(dāng)正確操作時(shí)，第二捕獲試劑將繼續(xù)結(jié)合所有標(biāo)記的抗體偶聯(lián)物，直至未結(jié)合的標(biāo)記抗體偶聯(lián)物被消耗殆盡，或第二捕獲試劑被飽和。因?yàn)樯踔羴?lái)自健康哺乳動(dòng)物的口腔流體樣品含有內(nèi)源性IgG，且與標(biāo)記物偶聯(lián)的標(biāo)記試劑的摩爾量?jī)?yōu)選超過(guò)固定化抗原的摩爾量，標(biāo)記的抗體偶聯(lián)物應(yīng)該總是可用于結(jié)合第二捕獲試劑，在對(duì)照線產(chǎn)生信號(hào)。因此，檢測(cè)不到對(duì)照線的信號(hào)指示或者缺乏足夠量的人IgG以產(chǎn)生可見(jiàn)線，或者檢測(cè)試條有缺陷，或者試條操作不當(dāng)。典型地，在所述檢測(cè)試條插入口腔流體之后15至60分鐘之間可^見(jiàn)察到標(biāo)記物信號(hào)，更優(yōu)選地在15至45分鐘之間，最優(yōu)選地在15至30分鐘之間。在檢測(cè)開(kāi)始之后早于15分鐘或遲于60分鐘讀取檢測(cè)結(jié)果可能給出錯(cuò)誤的結(jié)果。通過(guò)如上所述的有色標(biāo)記物產(chǎn)生的信號(hào)通常能不經(jīng)進(jìn)一步處理而直接從檢測(cè)試條檢測(cè)到。熒光標(biāo)記物可能需要熒光計(jì)進(jìn)4亍檢測(cè)。在本領(lǐng)域技術(shù)人員所熟知的方法中，使用銀鹽溶液可增強(qiáng)由金屬溶膠標(biāo)記物產(chǎn)生的信號(hào)。與之相似，當(dāng)使用酶時(shí)，標(biāo)記物必須與酶標(biāo)記物的底物接觸，以產(chǎn)生可檢測(cè)產(chǎn)物。因此，這些增強(qiáng)方法偏離了釆用有色顆粒標(biāo)記物和溶膠進(jìn)行的常規(guī)一步法測(cè)定，因?yàn)樵跈z測(cè)標(biāo)記物之前基質(zhì)必需與顯像液(銀鹽或底物溶液)進(jìn)行接觸。在一個(gè)最優(yōu)選的實(shí)施方案中，本發(fā)明提供一種檢測(cè)試條，其含有代表HIV-1gp41和HIV-2gp36包膜蛋白之免疫決定區(qū)的重組蛋白質(zhì)或合成肽，以及山羊抗人IgGF(ab，)2片段抗體捕獲程序性對(duì)照，它們分別固定到檢測(cè)區(qū)和對(duì)照區(qū)的硝酸纖維素膜上。圖1舉例說(shuō)明根據(jù)本發(fā)明的一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方案的口腔流體快速免疫層析檢測(cè)的程序，其中圖1-1到1-15舉例說(shuō)明檢測(cè)的步驟。為進(jìn)行測(cè)試，以聚酯拭子擦拭對(duì)象的上下齒齦，然后將所述拭子置于試管中約1000nl口腔流體樣品緩沖液(pH7.2+M).2磷酸鉀緩沖的0.15M氯化鈉、0.1%TritonX-IOO、15%熱滅活雞血清、30ng/ml親合素、0.2%Tween80、0.2%TetronicT-904以及0.0285%(活性成分)ProClin950)中并在試管中混合。壓出拭子中的流體并棄掉，將200nl此標(biāo)本混合物轉(zhuǎn)移到潔凈試管以進(jìn)行測(cè)定。將測(cè)定試條豎直地放入含有200pl標(biāo)本混合物的試管中。當(dāng)稀釋的標(biāo)本沿測(cè)定試條向上遷移時(shí)，其使試條上微紅色蛋白A-膠體金試劑再水化，且標(biāo)本中IgG與蛋白A/膠體金顆粒結(jié)合而形成IgG/偶聯(lián)物復(fù)合物。所述IgG/偶聯(lián)物復(fù)合物繼續(xù)沿試條向上遷移，首先到達(dá)測(cè)定試條的檢測(cè)區(qū)(所述檢測(cè)區(qū)含有能與抗HIV抗體結(jié)合的HIV抗原)并被固定于檢測(cè)區(qū)的抗原線上且出現(xiàn)微紅色的有色線。這指示反應(yīng)性或陽(yáng)性結(jié)果。線的強(qiáng)度并不與標(biāo)本中存在的抗體量成比例。檢測(cè)區(qū)中缺少有色線指示標(biāo)本不含有抗HIV抗體。IgG/偶聯(lián)物復(fù)合物繼續(xù)沿測(cè)定試條向上遷移直到其到達(dá)對(duì)照區(qū)。對(duì)照區(qū)含有固定于測(cè)定試條上線中的山羊抗人F(ab，)2IgG片段抗體。剩余的IgG/偶聯(lián)物復(fù)合物與固定化F(ab，)2片段結(jié)合，且出現(xiàn)微紅色的有色線。對(duì)照線的出現(xiàn)是檢測(cè)運(yùn)行正常且含有IgG的證據(jù)。無(wú)論樣品對(duì)HIV-1或HIV-2的抗體是反應(yīng)性的還是非反應(yīng)性的，在進(jìn)行所有有效的檢測(cè)期間微紅色對(duì)照線都將在對(duì)照區(qū)出現(xiàn)。標(biāo)本繼續(xù)遷移經(jīng)過(guò)對(duì)照區(qū)進(jìn)入最終的吸收墊，所述吸收墊幫助拉動(dòng)IgG/偶聯(lián)物復(fù)合物通過(guò)試條并清除任何背景顏色。在將測(cè)定試條引入稀，標(biāo)本中20分鐘但不超過(guò)45分鐘之后，對(duì)結(jié)，進(jìn)行解釋。在結(jié)果。剩余的稀釋樣品可用于其它檢測(cè)，比如確證性試驗(yàn)。圖2舉例說(shuō)明根據(jù)本發(fā)明的一種優(yōu)選實(shí)施方案的口腔流體快速免疫層析檢測(cè)的三種可能的結(jié)果，其中圖2A、2B和2C分別代表陰性、陽(yáng)性和無(wú)效的結(jié)果。圖2A顯示非反應(yīng)性結(jié)果，其中僅在對(duì)照區(qū)出現(xiàn)單一線，提示在口腔流體樣品中缺少活性抗HIV-1或抗HIV-2抗體。此檢測(cè)結(jié)果被解釋為HIV抗體陰性。圖2B顯示反應(yīng)性結(jié)果，其中檢測(cè)線和對(duì)照線均出現(xiàn)，即在檢測(cè)試條上兩線分別出現(xiàn)在檢測(cè)區(qū)和對(duì)照區(qū)。這些線中一條可比另一條更深。反應(yīng)性結(jié)果意味著已經(jīng)在口腔流體樣品中檢測(cè)到抗HIV-1/2抗體。此檢測(cè)結(jié)果被解釋為初步的HIV抗體陽(yáng)性。圖2C顯示無(wú)效結(jié)果，其中在對(duì)照區(qū)沒(méi)有對(duì)照線。即使在檢測(cè)區(qū)出現(xiàn)檢測(cè)線，結(jié)果也是無(wú)效的。無(wú)效測(cè)試應(yīng)采用新的檢測(cè)試條進(jìn)行重復(fù)測(cè)試。上述實(shí)施方案可以以替代方式進(jìn)行設(shè)計(jì)，其包括金溶膠之外替代性標(biāo)記物。例如，其它標(biāo)記物包括但不限于元素或金屬溶膠比如硒、銀、鐵或碳，其它的珠狀顆粒比如有色乳膠、脂質(zhì)體、以及染色顆粒。能特異性捕獲口腔流體樣品中抗體的其它第一捕獲試劑包括但不限于抗IgM或IgA的抗體；蛋白G,或伴刀豆球蛋白A。第二捕獲試劑也可配制成包括但不限于替代配體，比如蛋白A或蛋白G。在第四個(gè)方面，本發(fā)明提供用于檢測(cè)口腔流體分析物的試劑盒，其包括上述的一次性使用的側(cè)向流免疫層析檢測(cè)試條。檢測(cè)試條封閉于千燥的容器中。每個(gè)試劑盒可任選地包括樣品緩沖液、口腔流體收集器、提供所附檢測(cè)試條使用說(shuō)明的包裝插頁(yè)、裝有用于對(duì)檢測(cè)試條進(jìn)行質(zhì)量檢驗(yàn)的陽(yáng)性和陰性對(duì)照的小管、可用于確定本發(fā)明的測(cè)定何時(shí)完成的計(jì)時(shí)器、和/或生物危險(xiǎn)品處理容器。在此方面的一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方案中，樣品緩沖液為pH7.2+/-0.2磷酸鉀緩沖的溶液，其還含有0.15M氯化鈉、0.1%TritonX-IOO、15%熱滅活雞血清、30ng/ml親合素、0.2%Tween80、0.2%TetronicT-904以及0.0285%(活性成分)ProClin950。盡管為清楚和便于理解，已通過(guò)舉例說(shuō)明和實(shí)例的方式詳細(xì)地描述了上述發(fā)明，但對(duì)本領(lǐng)域的普通技術(shù)人員來(lái)說(shuō)顯而易見(jiàn)，根據(jù)本發(fā)明的教導(dǎo)，可對(duì)其做出各種變化和修改而不違背所附權(quán)利要求的精神和范圍。除了通過(guò)檢測(cè)口腔流體中HIV抗體來(lái)診斷HIV以外，本發(fā)明可容易地配置用于許多病癥的診斷，這些病癥需要對(duì)口腔流體中的分析物進(jìn)行免疫檢測(cè)。特別容易使用本發(fā)明的概念用于性傳播疾病檢測(cè)，比如梅毒抗體和肝炎病毒抗體。實(shí)施例以下實(shí)施例將舉例說(shuō)明本發(fā)明而非對(duì)其進(jìn)行限制。實(shí)施例l:免疫層析檢測(cè)試條的生產(chǎn)在本實(shí)施例中提供了用于快速HIV-1/2口腔流體抗體檢測(cè)的檢測(cè)試條，其中使用玻璃纖維材料作為樣品墊的基質(zhì)，使用聚酯材料作為偶聯(lián)物墊的基質(zhì)，使用硝酸纖維素膜作為檢測(cè)和對(duì)照墊的基質(zhì)。將1英寸的S&SS-33玻璃纖維材料用封閉緩沖液浸泡，所述封閉緩沖液由以下組成40。/。正常雞血清(熱滅活)、0.25M碳酸氫鉀、0.05M磷酸氫二鉀、0.1%Tween80、100mM錫酸鉀和0.2%過(guò)氧化氫脲，其pH在8.2至8.5，于室溫下(15-30。C)在低濕度房間里干燥8小時(shí)，然后在千燥容器中于5or;過(guò)夜，并干燥保存。通過(guò)使用氣溶膠尖端將蛋白A金偶聯(lián)物在墊上劃條紋，從聚酯膜制備偶聯(lián)物墊。在劃條紋之前，將偶聯(lián)物在20%蔗糖、5%海藻糖、100mM錫酸鉀以及0.1%過(guò)氧化脲中穩(wěn)定化。然后將所述墊浸入含有聚乙烯吡咯烷酮、雞血清、牛血清白蛋白以及碳酸鹽緩沖劑的緩沖液中并在50匸使用強(qiáng)制通風(fēng)干燥50分鐘。HIV抗原可偶聯(lián)到檢測(cè)區(qū)墊，其包括使用鏈親和素/生物素連接子。為了劃條紋，分別以300ng/試條和0.15ng/試條將合成的HIV-1肽和合成的HIV-2肽(例如SEQIDNo:1至5)施加于檢測(cè)墊。由1.2mg/mlHIV-1、0.06mg/mlHIV-2、4.36mg/ml親合素和0.05%異丙醇組成的溶液被用于在檢測(cè)墊上劃條紋。將1mg/ml山羊抗人IgGFcF(ab)2施加于對(duì)照墊。對(duì)于使用重組HIV-1/重組HIV-2的檢測(cè)試條而言，將在0.001%Tween80、5%蔗糖和2%曱醇中的0.4-0.7ng/試條的gp41蛋白和0.04-0.08ng/試條的gp36蛋白施加于檢測(cè)區(qū)，并將在5%蔗糖、2%甲醇和O.OlM碳酸鉀pH8.4中的0.175ng/試條的山羊抗人IgGF(ab，)2施加于對(duì)照區(qū)。將如上處理的檢測(cè)區(qū)和對(duì)照區(qū)用封閉劑封閉，所述封閉劑由在pH7.8+/-0.1磷酸鉀緩沖液中的0.15%牛血清白蛋白、0.075%Tween20組成。然后將所得墊對(duì)齊以使之相互流體連通，使得偶聯(lián)物墊位于樣品墊的下游；檢測(cè)和對(duì)照區(qū)墊位于偶聯(lián)物墊的下游，以使對(duì)照區(qū)位于檢測(cè)區(qū)的下游。實(shí)施例2:口腔流體快速免疫層析檢測(cè)提供使用本發(fā)明試條的口腔流體快速免疫層析檢測(cè)，如圖1-1至圖1-15所示。首先，通過(guò)輕輕地倒轉(zhuǎn)瓶子約3次來(lái)混合樣品緩沖液(以pH7.2+/-0.2磷酸鉀緩沖的0.15M氯化鈉、0.1%TritonX-IOO、15%熱滅活雞血清、30ng/ml親合素、0.2%Tween80、0.2%TetronicT腸卯4和0.0285%(活性成分)ProClin950)。從瓶子取下瓶蓋(圖1-1)并將緩沖液充填到滴管中至刻線(圖1-2)。將滴管的全部?jī)?nèi)容物分配至試管中(圖1-3)。然后取下一支由包所提供的潔凈拭子。抓住拭子手柄。避免觸及拭子的織物端。隨后，施加適當(dāng)壓力并輕柔地以拭子織物端來(lái)回地擦拭上齒齦線。在口的一角開(kāi)始輕柔而緩慢地擦拭直至到達(dá)口的另一角(圖1-4)，然后沿上齒齦線擦拭返回出發(fā)點(diǎn)(約5-6秒)(圖1-5)。然后轉(zhuǎn)動(dòng)拭子以使用拭子的另一側(cè)擦拭下齒齦(圖1-6)。使用拭子的另一側(cè)輕柔而緩慢地來(lái)回擦拭下齒齦線。在口的一角開(kāi)始(圖1-7)，在口的另一角結(jié)束，然后沿下齒齦線擦拭返回出發(fā)處(約5-6秒)(圖8)。立即將拭子放于盛有樣品緩沖液的管中(圖1-9)。緊握拭子手柄。將拭子往復(fù)插入樣品緩沖液管中6-8次，靠住管壁摩擦拭子的兩側(cè)(圖1-10)。從管中取出拭子(圖1-11)。樣品現(xiàn)在已準(zhǔn)備好用于檢測(cè)。轉(zhuǎn)移200nl此樣品到空試管。將使用以下的測(cè)定試條檢測(cè)此試樣。如果要對(duì)樣品進(jìn)行多于一個(gè)檢測(cè)試條的檢測(cè)，可將多個(gè)200nl試樣轉(zhuǎn)移到單個(gè)空試管。打開(kāi)裝有測(cè)定試條的罐。從罐中取出一個(gè)測(cè)定試條并立刻重新蓋好罐。避免用手觸及試條中央的膜表面。將測(cè)定試條置于含有200jil稀釋標(biāo)本的管中，使測(cè)定試條上的箭頭指向下(圖1-12)。將計(jì)時(shí)器設(shè)定為20分鐘，或記錄將測(cè)定試條加至樣品的時(shí)間(圖1-13)。20分鐘以后讀取檢測(cè)結(jié)果(圖1-14)。然后將試條、管和拭子棄于生物危險(xiǎn)品廢物容器中(圖1-15)。實(shí)施例3:確定試劑盒的靈敏度、特異性和準(zhǔn)確度在本實(shí)施例中測(cè)定口腔流體檢測(cè)的靈敏度、特異性和準(zhǔn)確度。在泰國(guó)曼谷的泰國(guó)紅十字會(huì)匿名HIV診所(ThaiRedCrossAnonymousHIVClinic)進(jìn)行口腔流體HIV側(cè)向檢測(cè)的外部驗(yàn)證試驗(yàn)，試驗(yàn)開(kāi)始于2004年4月，完成于2004年6月。986名前往泰國(guó)紅十字會(huì)的匿名HIV診所并且當(dāng)前未接受逆轉(zhuǎn)錄病毒治療的對(duì)象接受自愿HIV抗體檢測(cè)和咨詢。采用對(duì)象的順序檢測(cè)進(jìn)行本研究，事先不知道結(jié)果。此外，37名已知陽(yáng)性且接受抗逆轉(zhuǎn)錄病毒治療(ARV)的對(duì)象也接受自愿的HIV抗體檢測(cè)和咨詢。給予對(duì)象機(jī)會(huì)以自愿同意提供額外樣品由這些試驗(yàn)進(jìn)行檢測(cè)。在匿名HIV診所中^f吏用的參考方法是用于初步篩選的OrgenicsRapidHIV-1/-2BloodTest,DoublecheckTMII。4吏用Bio-RadGenScreenTMHIV-1/2Version2ELISA和/或FujirebioSerodia-HIV(HIV畫(huà)lonly)ParticleAgglutinationTest確i人本檢測(cè)的反應(yīng)性標(biāo)本。靈敏度表示為以參比檢測(cè)的陽(yáng)性數(shù)除以快速口腔流體檢測(cè)的陽(yáng)性數(shù)所得的百分?jǐn)?shù)。特異性表示為以參比檢測(cè)的陰性數(shù)除以快速口腔流體檢測(cè)的陰性數(shù)所得的百分?jǐn)?shù)。準(zhǔn)確度表示為對(duì)象總數(shù)除以快速口腔流體檢測(cè)和參比檢測(cè)間結(jié)果一致的數(shù)目所得的百分?jǐn)?shù)。結(jié)果見(jiàn)于下表。表1.快速HIV-1/2口腔流體檢測(cè)-重組HIV-1/合成HIV-2肽<table>tableseeoriginaldocumentpage25</column></row><table>權(quán)利要求1.一種用于檢測(cè)口腔流體中分析物的側(cè)向流免疫層析檢測(cè)試條，其基本上由樣品墊、偶聯(lián)物墊、檢測(cè)區(qū)和對(duì)照區(qū)墊組成，所述墊由至少一種基質(zhì)材料制成，其中所述偶聯(lián)物墊位于所述樣品墊的下游，并且用偶聯(lián)物在其上劃條紋；所述檢測(cè)區(qū)和對(duì)照區(qū)墊位于偶聯(lián)物墊的下游，且含有檢測(cè)區(qū)和對(duì)照區(qū)，其中所述檢測(cè)區(qū)固定有特異性結(jié)合靶分析物的特異性結(jié)合試劑；且所述對(duì)照區(qū)固定有第二捕獲試劑。2.根據(jù)權(quán)利要求1的檢測(cè)試條，其中所述待檢測(cè)的分析物選自抗以下之抗原的抗體傳染性疾病、激素、生長(zhǎng)因子、治療藥物、濫用藥物及濫用藥物的代謝產(chǎn)物。3.根據(jù)權(quán)利要求1的檢測(cè)試條，其中所述基質(zhì)材料選自無(wú)機(jī)粉末，比如二氧化硅和氧化鋁；玻璃纖維濾紙；天然聚合材料尤其是基于纖維素的材料、層析紙；合成或改性的天然聚合物比如硝酸纖維素、醋酸纖維素、聚氯乙烯、聚丙烯酰胺、交聯(lián)葡聚糖、瓊脂糖；以及其組合。4.根據(jù)權(quán)利要求3的檢測(cè)試條，其中所述用于樣品墊的基質(zhì)材料是玻璃纖維濾紙。5.根據(jù)權(quán)利要求3的檢測(cè)試條，其中所述用于偶聯(lián)物墊的基質(zhì)材料是聚酯材料。6.根據(jù)權(quán)利要求3的檢測(cè)試條，其中所述用于檢測(cè)墊和對(duì)照墊的基質(zhì)材料是硝酸纖維素膜。7.根據(jù)權(quán)利要求1的檢測(cè)試條，其中所述偶聯(lián)物包含與第一捕獲試劑偶聯(lián)的標(biāo)記物，所述第一捕獲試劑捕獲口腔流體的內(nèi)源性抗體。8.根據(jù)權(quán)利要求7的檢測(cè)試條，其中所述標(biāo)記物選自膠體金顆粒；元素或金屬溶膠顆粒，包括硒、銀、鐵或碳；其它珠狀顆粒，包括有色乳膠、脂質(zhì)體和染料顆粒。9.根據(jù)權(quán)利要求7或8的檢測(cè)試條，其中所述標(biāo)記物是膠體金顆粒。10.根據(jù)權(quán)利要求7的檢測(cè)試條，其中所述第一捕獲試劑選自抗IgG、IgM或IgA的抗體，蛋白A,蛋白G和伴刀豆球蛋白A。11.根據(jù)權(quán)利要求8的檢測(cè)試條，其中所述第一捕獲試劑是蛋白A。12.根據(jù)權(quán)利要求1的檢測(cè)試條，其中所述特異性結(jié)合試劑選自以下的抗原傳染性疾病、激素、生長(zhǎng)因子、治療藥物、濫用藥物及濫用藥物的代謝產(chǎn)物。13.根據(jù)權(quán)利要求12的檢測(cè)試條，其中所述傳染性疾病的抗原是代表HIV蛋白免疫決定區(qū)的重組或合成肽。14.根據(jù)權(quán)利要求13的檢測(cè)試條，其中所述HIV蛋白是HIV包膜蛋白。15.根據(jù)權(quán)利要求14的檢測(cè)試條，其中所述HIV包膜蛋白選自HIV-1的gpl20和gp41以及HIV國(guó)2的gp36。16.根據(jù)權(quán)利要求1的檢測(cè)試條，其中所述第二捕獲試劑選自抗IgG、IgM或IgA的抗體，蛋白A，蛋白G和伴刀豆球蛋白A。17.根據(jù)權(quán)利要求16的檢測(cè)試條，其中所述抗IgG抗體是山羊抗人IgG抗體。18.生產(chǎn)由權(quán)利要求1-17中任一項(xiàng)所定義之側(cè)向流免疫層析檢測(cè)試條的方法，其包括a)將所述偶聯(lián)物在所述偶聯(lián)物墊上劃條紋；b)將所述特異性結(jié)合試劑固定到所述檢測(cè)區(qū)和對(duì)照區(qū)墊的檢測(cè)區(qū)上；c)將所述第二捕獲試劑固定到所述檢測(cè)區(qū)和對(duì)照區(qū)墊的對(duì)照區(qū)上；d)用封閉劑封閉每個(gè)墊；和e)對(duì)齊所得墊使之相互流體連通。19.根據(jù)權(quán)利要求18的方法，其中所述偶聯(lián)物在劃條紋之前在筒單或復(fù)合糖溶液中被穩(wěn)定化。20.根據(jù)權(quán)利要求19的方法，其中所述糖溶液含有蔗糖、海藻糖、錫酸鉀和過(guò)氧化氳脲。21.根據(jù)權(quán)利要求18的方法，其中使用生物素/鏈親合素連接子將所述特異性結(jié)合試劑固定到檢測(cè)區(qū)上。22.根據(jù)權(quán)利要求18的方法，其中使用生物素/鏈親合素連接子將所述特異性結(jié)合試劑固定到對(duì)照區(qū)上。23.根據(jù)權(quán)利要求18的方法，其中所述封閉劑含有非離子型、陽(yáng)離子型、陰離子型和兩性離子型的去污劑；糖，包括蔗糖、果糖；或蛋白質(zhì)，包括牛血清白蛋白、動(dòng)物全血清、酪蛋白和脫脂奶粉。24.根據(jù)權(quán)利要求19的方法，其中所述動(dòng)物全血清為胎牛血清。25.根據(jù)權(quán)利要求19的方法，其中所述動(dòng)物全血清為鳥(niǎo)類血清。26.根據(jù)權(quán)利要求21的方法，其中所述鳥(niǎo)類血清選自鵝血清、火雞血清和雞血清。27.檢測(cè)口腔流體中分析物的側(cè)向流免疫層析方法，其包括(a)使用與由權(quán)利要求1-17中任一項(xiàng)所定義之側(cè)向流免疫層析測(cè)試試條分開(kāi)的收集器收集口腔流體；(b)將收集器投入一定體積的樣品緩沖液中以將口腔流體釋放到緩沖液中而得到混合物；(c)將前述權(quán)利要求中任一項(xiàng)所定義之側(cè)向流免疫層析測(cè)試試條放入混合物中；和(d)在檢測(cè)開(kāi)始的15-60分鐘內(nèi)，通過(guò)觀察對(duì)照區(qū)信號(hào)的存在來(lái)確定檢測(cè)的有效性，并通過(guò)觀察檢測(cè)區(qū)信號(hào)的存在來(lái)確定分析物的存在。28.根據(jù)權(quán)利要求27的方法，其中步驟(a)中的收集器是未處理的聚酯拭子。29.才艮據(jù)權(quán)利要求28的方法，其中所述拭子為T(mén)exwipeLargeAlphaSwabTX714A。30.根據(jù)權(quán)利要求27的方法，其中所述樣品緩沖液是pH7.2+M).2磷酸鉀緩沖溶液。31.根據(jù)權(quán)利要求30的方法，其中所述溶液還含有0.15M氯化鈉、0.1%TritonX畫(huà)100、15。/。熱滅活雞血清、30ng/ml親合素、0.2%Tween80、0.2%TetronicT-卯4以及0.0285%(活性成分)ProClin950。32.根據(jù)權(quán)利要求27的方法，其中所述樣品緩沖液的體積為100033.根據(jù)權(quán)利要求27的方法，其中所述方法還包括在步驟(b)和步驟(C)之間取出混合物之試樣的步驟。34.根據(jù)權(quán)利要求33的方法，其中所述試樣的體積為200nl。35.根據(jù)權(quán)利要求27的方法，其中所述信號(hào)是有色線。36.根據(jù)權(quán)利要求35的方法，其中所述有色線是微紅色線。37.根據(jù)權(quán)利要求27的方法，其中在20-45分鐘內(nèi)觀察所述信號(hào)。38.用于檢測(cè)口腔流體中分析物的試劑盒，其包含至少一個(gè)由權(quán)利要求1-17中任一項(xiàng)所定義的側(cè)向流免疫層析檢測(cè)試條。39.根據(jù)權(quán)利要求38的試劑盒，其中所述檢測(cè)試條被封閉于干燥的容器中。40.根據(jù)權(quán)利要求38的試劑盒，其中所述試劑盒還包含樣品緩沖液、和至少一個(gè)用于收集口腔流體的收集器。41.根據(jù)權(quán)利要求40的試劑盒，其中所述樣品緩沖液是pH7.2+/-0.2的磷酸鉀緩沖溶液。42.才艮據(jù)權(quán)利要求41的試劑盒，其中所述溶液還含有0.15M氯化鈉、0.1%TritonX-100、15。/。熱滅活雞血清、30jig/ml親合素、0.2%Tween80、0.2%TetronicT-卯4以及0.0285%(活性成分)ProClin950。43.根據(jù)權(quán)利要求40的試劑盒，其中所述收集器是未處理的聚酯拭子。44.根據(jù)權(quán)利要求43的試劑盒，其中所述拭子為T(mén)exwipeLargeAlphaSwabTX714A。45.根據(jù)權(quán)利要求38至44中任一項(xiàng)的試劑盒，其中所述試劑盒還包含裝有用于對(duì)檢測(cè)試條進(jìn)行質(zhì)量檢驗(yàn)之陽(yáng)性和陰性對(duì)照的小管。全文摘要本發(fā)明涉及口腔流體快速免疫層析檢測(cè)。更具體地，本發(fā)明涉及與用于檢測(cè)口腔流體中分析物的側(cè)向流免疫層析試條相分離的口腔流體收集拭子，其基本上由樣品墊、偶聯(lián)物墊、檢測(cè)區(qū)和對(duì)照區(qū)墊組成，所述墊由至少一種基質(zhì)材料制成，其中所述偶聯(lián)物墊位于所述樣品墊下游，并且用偶聯(lián)物在其上劃條紋；檢測(cè)和對(duì)照區(qū)墊位于偶聯(lián)物墊下游，其中所述檢測(cè)區(qū)固定有與靶分析物特異性結(jié)合的特異性結(jié)合試劑；檢測(cè)區(qū)下游的對(duì)照區(qū)固定有第二捕獲試劑。本發(fā)明還涉及生產(chǎn)所述試條的方法、通過(guò)使用所述試條檢測(cè)口腔流體中分析物的側(cè)向流免疫層析方法、以及包含此試條的試劑盒。文檔編號(hào)G01N33/52GK101495865SQ200580049809公開(kāi)日2009年7月29日申請(qǐng)日期2005年5月20日優(yōu)先權(quán)日2005年5月20日發(fā)明者保羅·羅伯特·史密斯,托比·德沃拉赫·戈特弗里德,格倫·邁克爾·福德,約翰·邁克爾·恩尼斯,羅納德·威廉·明克,詹姆斯·理查德·喬治申請(qǐng)人:克利普特生物醫(yī)藥公司