專利名稱：戶塵螨的培養(yǎng)收集及其過敏原診斷和治療制劑的制備方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于變態(tài)反應(yīng)藥物制備領(lǐng)域，尤其是涉及戶塵螨(Dermatophagoides pterronyssinus簡(jiǎn)稱Der p)的培養(yǎng)、收集方法以及戶塵螨過敏原的提取方法，本發(fā)明也公開了戶塵螨提取液中Der p1含量的測(cè)定以及建立戶塵螨過敏患者標(biāo)準(zhǔn)血清庫(kù)的建立等。
背景技術(shù)：
過敏性疾病已成為影響人們身體健康的重要問題。其中塵螨為最重要的室內(nèi)過敏原，其是一種普遍存在的生物，肉眼一般看不見，主要存在于居室內(nèi)，如地毯、枕頭、床墊、沙發(fā)、窗簾。塵螨生存能力強(qiáng)，主要以人體皮屑為食物，消除塵螨過敏原也因此非常困難。在全世界范圍內(nèi)，居室內(nèi)最優(yōu)勢(shì)的螨是戶塵螨和粉塵螨，主要致敏蛋白組分是第一組分(Der p1)。目前，在美國(guó)有約5000萬人患?jí)m螨過敏病，為第六大慢性病，發(fā)病率20-40％；在全世界范圍內(nèi)也呈逐年上升趨勢(shì)，我國(guó)4.8億人患病，發(fā)病率37％(80年代統(tǒng)計(jì))。
過敏原制劑可用于過敏性疾病的體內(nèi)、體外特異性診斷及脫敏治療，是診斷和治療過敏性疾病的基礎(chǔ)，其質(zhì)量的優(yōu)劣直接影響億萬過敏性疾病患者的健康。1998年，WHO對(duì)脫敏治療的療效和安全性給予充分肯定，指出脫敏治療是唯一影響過敏性疾病自然進(jìn)程的治療方法，能有效阻止過敏性鼻炎發(fā)展為過敏性哮喘。標(biāo)準(zhǔn)化過敏原制劑的研制和使用是過敏性疾病診斷和治療的必然趨勢(shì)。
目前，國(guó)外的過敏原粗制劑為過敏原原料經(jīng)提取、透析和無菌過濾后制成的粗提液，包含全部過敏原組分，其具有如下缺點(diǎn)1)以W/V為單位，主要致敏成分含量不穩(wěn)定，不能真實(shí)反應(yīng)過敏原的生物效價(jià)和有效成分；2)批間有效成分變異可達(dá)1000倍，影響診斷和治療的精確性和安全性；3)無質(zhì)控標(biāo)準(zhǔn)，不利于藥品監(jiān)督管理，各國(guó)家、地區(qū)的產(chǎn)品之間的研究資料無法比較。同時(shí)，作為一個(gè)附加值較高的科技產(chǎn)品，標(biāo)準(zhǔn)化過敏原制劑擁有巨大的市場(chǎng)，前景看好。國(guó)外高質(zhì)量產(chǎn)品的進(jìn)入，將對(duì)我國(guó)民族過敏原生產(chǎn)工業(yè)帶來巨大沖擊1、增加國(guó)家醫(yī)療支出和人民負(fù)擔(dān)，2、由于地區(qū)差異和地理環(huán)境不同，多數(shù)國(guó)外過敏原產(chǎn)品不適于我國(guó)過敏人群，過分依賴國(guó)外試劑，將使治療和診斷局限，3、存在生物安全性的問題。
本發(fā)明人經(jīng)過多年的研究形成了本發(fā)明。國(guó)內(nèi)外對(duì)于塵螨的培養(yǎng)方法有多種有的使用蝦皮或魚粉；有的使用人皮屑；還有人使用奶粉。這些方法均含有大量的致敏物質(zhì)。對(duì)于過敏患者有高度的危險(xiǎn)性，并且容易形成假陽(yáng)性反應(yīng)。本發(fā)明的培養(yǎng)方法避免了上述缺點(diǎn)，降低了過敏患者皮試和脫敏治療時(shí)的風(fēng)險(xiǎn)，大大提高了臨床醫(yī)療的安全性。本發(fā)明在避免上述假陽(yáng)性反應(yīng)的同時(shí)也降低了戶塵螨點(diǎn)刺試驗(yàn)的假陽(yáng)性(即大大提高了對(duì)戶塵螨過敏診斷的特異性)。國(guó)內(nèi)外收集塵螨的方法有避光法、爬盤法和飽和鹽水法。上述方法收集的塵螨純度不高，本發(fā)明的飽和鹽水結(jié)合過篩網(wǎng)方法，大大提高了塵螨收集的純度。另外，本發(fā)明應(yīng)用蛋白質(zhì)提取及分析技術(shù)，確定了最佳的戶塵螨過敏原提取過程；制備了多克隆抗體，然后采用交叉免疫電泳檢測(cè)過敏原總組成成分；建立了戶塵螨過敏患者特異性IgE抗體庫(kù)；根據(jù)主要致敏組份(第一組分)的等電點(diǎn)和分子量，采用分子篩和離子交換技術(shù)進(jìn)行初步分離，得到相對(duì)純化的主要過敏原組份，采用高壓液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用儀器，得到了純化的主要過敏原組份；用質(zhì)譜分析技術(shù)驗(yàn)證了主要致敏蛋白的氨基酸序列，用放射免疫吸附抑制實(shí)驗(yàn)及戶塵螨過敏患者特異性IgE抗體庫(kù)驗(yàn)證了純化的主要過敏原組分免疫活性；用主要過敏原組分制備單克隆抗體以控制戶塵螨過敏原制劑質(zhì)量；另外，發(fā)明人利用自行制備的多抗和單抗控制戶塵螨過敏原制劑質(zhì)量，建立了標(biāo)準(zhǔn)化戶塵螨過敏原制劑的內(nèi)部參考品和內(nèi)部參考標(biāo)準(zhǔn)。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的一個(gè)目的在于提供一種戶塵螨的培養(yǎng)和收集方法。
本發(fā)明的另一個(gè)目的是提供一種戶塵螨過敏原的提取方法。
本發(fā)明的再一個(gè)目的為提供一種測(cè)定戶塵螨提取液中Der p1含量的方法。
本發(fā)明的目的是通過如下技術(shù)方案實(shí)現(xiàn)的1.戶塵螨的培養(yǎng)和收集在20-25℃，70-75％相對(duì)濕度，用透氣帶蓋的塑料培養(yǎng)瓶培養(yǎng)戶塵螨。飼料為酵母粉30％，豆粉35.2％，玉米粉3.2％，糖35.2％，豬油3.7％，維生素和鹽配方(/100g飼料)Vit A 904.579 IU，VitD 201.729 IU，Vit B12.001mg，Vit B27.525mg，Vit B61.189mg，Vit B120.945mg，Vit C60.519mg，Vit K310.490mg，Vit D30.755mg，煙酸9.888mg，生物素0.040mg，葉酸0.312mg，泛酸鈣8.875mg，肌醇12.104mg，NaCl103.477mg，F(xiàn)eSO463.701mg，ZnSO44.711mg，MnSO41.705mg，Vit E10.11mg。不含魚粉、蝦皮、人皮屑等動(dòng)物蛋白。收集方法利用飽和食鹽水漂浮法及50-200目篩網(wǎng)收集或利用避光法收集，凍干收集的戶塵螨，得到戶塵螨過敏原標(biāo)準(zhǔn)化制劑的原料。
2.戶塵螨過敏原的提取方法將凍干的戶塵螨經(jīng)過丙酮脫脂，用Coca’s液溶解，1∶10至1∶20比例(W/V)提取。提取的時(shí)候先4℃超聲2-3次，每次2-3分鐘，然后再4℃提取4-24小時(shí)，4℃，10000rpm離心15分鐘，取上清液經(jīng)過濾紙和0.2μm濾器過濾得到戶塵螨提取液原液。
3.戶塵螨提取液中Der p1含量的測(cè)定(雙夾心單克隆抗體法)將經(jīng)過HPLC純化的抗Der P1單克隆抗體溶解在PBS溶液中。用NaHCO3緩沖液按比例稀釋Der P1單克隆抗體至2μg/ml。包被聚乙烯板，孵育過夜。用含Tween-20，pH7.4的PBS緩沖液(PBS-T)洗板。
加入含BSA的PBS-T，室溫孵育。PBS-T洗板。
加入稀釋的過敏原標(biāo)準(zhǔn)品或樣品。室溫孵育。
使用過敏原標(biāo)準(zhǔn)品(ST-DP1)等比稀釋制備Der P1標(biāo)準(zhǔn)曲線。在酶標(biāo)板的A1和B1孔加入PBS-T，然后再加入Der P1標(biāo)準(zhǔn)品。混勻，然后轉(zhuǎn)移若干液體進(jìn)入下一個(gè)PBS-T，形成多個(gè)稀釋梯度。A11、B11、A12、B12孔應(yīng)該僅含有PBS-T作為空白對(duì)照。
塵土或過敏原樣品常規(guī)稀釋。用PBS-T洗板，然后加入稀釋的生物素化抗Der P1的單克隆抗體。室溫孵育。
用PBS-T洗板，然后加入稀釋的鏈霉素卵蛋白-過氧化酶(SigMA公司S5512)。然后再使用PBS-T按比例稀釋。室溫孵育半小時(shí)。
用PBS-T洗板，然后加入用枸櫞酸磷酸緩沖液溶解的ABTS顯色，顯色時(shí)還要加入按比例稀釋的H2O2。當(dāng)405nm光密度值在2.0-4.0時(shí)讀板。
4.建立戶塵螨過敏患者標(biāo)準(zhǔn)血清庫(kù)戶塵螨中度過敏患者的標(biāo)準(zhǔn)有過敏性鼻炎或/和過敏性哮喘癥狀，瑞典法馬西亞公司immunoCAP的RAST試驗(yàn)(過敏原放射性吸附試驗(yàn))檢測(cè)戶塵螨(d1)過敏等級(jí)為3-4級(jí)。RAST檢測(cè)(RAST FEIA)的基本原理為將包被有變應(yīng)原的固相載體與陽(yáng)性血清反應(yīng)，如血清中含有針對(duì)此種變應(yīng)原的特異性IgE，則可形成抗原抗體復(fù)合物，孵育和沖洗后，加酶標(biāo)抗IgE抗體，再進(jìn)行孵育，即形成抗原-IgE-抗IgE復(fù)合物，沖洗后加底物，此復(fù)合物與底物作用產(chǎn)生熒光物質(zhì)。特異性IgE的含量越高，熒光吸收值越高。
戶塵螨中度過敏患者的采集根據(jù)戶塵螨中度過敏患者的標(biāo)準(zhǔn)，在簽署知情同意書后，收集20-30個(gè)戶塵螨中度過敏患者血清，每例采集20ml血清，等量混合稀釋后，用含0.5％牛血清白蛋白及0.05％疊氮鈉溶液稀釋至吸光值在10-30KU/L，2ml塑料離心管分裝，凍干保存血清，即為戶塵螨過敏患者標(biāo)準(zhǔn)血清庫(kù)。
5.戶塵螨提取液過敏原總生物活性測(cè)定通過RAST抑制試驗(yàn)檢測(cè)提取液的過敏原總活性，采用凍干復(fù)溶法確保過敏原總活性的相對(duì)恒定，過敏原總生物活性的單位用過敏原單位(AU)表示。
采用Pharmacia的CAP系統(tǒng)，進(jìn)行戶塵螨過敏原放射性吸附抑制試驗(yàn)(RAST inhibition，簡(jiǎn)稱RAST抑制試驗(yàn))。RAST抑制試驗(yàn)是在上述RAST FEIA基礎(chǔ)上加以改變而形成的。即先將一系列不同量的某種變應(yīng)原與相應(yīng)的陽(yáng)性血清即過敏患者血清反應(yīng)，再進(jìn)行上述RAST步驟，由于變應(yīng)原抑制了陽(yáng)性血清中一定數(shù)量的特異性IgE，致使熒光吸收值下降。變應(yīng)原含量越高，對(duì)特異性IgE的抑制作用越強(qiáng)，熒光吸收值越低。
RAST抑制試驗(yàn)是對(duì)戶塵螨過敏原總體生物活性(即抗原性)的分析，它不能反映過敏原中單一組分的抗原性。在戶塵螨的有關(guān)試驗(yàn)中，血清池一般由10個(gè)以上病人的血清等量組成。
RAST抑制試驗(yàn)可采用放免法、酶標(biāo)法、熒光酶標(biāo)法的各檢測(cè)系統(tǒng)進(jìn)行測(cè)定。由于CAP系統(tǒng)具有較高的靈敏度和特異度，操作簡(jiǎn)便，故本發(fā)明采用瑞典法馬西亞公司的UniCAP體外過敏原檢測(cè)系統(tǒng)進(jìn)行。
6.戶塵螨過敏原組分的測(cè)定采用SDS-PAGE檢測(cè)戶塵螨提取液的蛋白質(zhì)成分，Western Blotting檢測(cè)戶塵螨的主要過敏原成分，其中，一抗為標(biāo)準(zhǔn)血清庫(kù)中的標(biāo)準(zhǔn)血清，結(jié)果表明至少含有24KD和14KD兩種蛋白質(zhì)組分。
7.戶塵螨過敏原點(diǎn)刺液的制備在得到合格的戶塵螨提取液后，按1∶1的比例加入等量的甘油，0.4％的苯酚，采用凍干復(fù)溶法確保提取液中Der p1的含量在100-200μg/ml，然后分裝在點(diǎn)刺液小瓶?jī)?nèi)即制得戶塵螨點(diǎn)刺液。
8.戶塵螨過敏原脫敏制劑的制備在得到合格的戶塵螨提取液后，按不同的稀釋比例加入Coca’s液和0.4％的苯酚，制備成一系列不同濃度的戶塵螨脫敏制劑。每瓶戶塵螨脫敏制劑的總?cè)萘靠刹灰粯樱赃_(dá)到方便病人和節(jié)約的目的。戶塵螨脫敏制劑中，Der p 1的最高濃度含量為20μg/ml。
9.戶塵螨過敏原點(diǎn)刺液急性毒性試驗(yàn)在加甘油前進(jìn)行戶塵螨過敏原點(diǎn)刺液的急性毒性試驗(yàn)，取5只6周-8周，體重在17-22克的BALB/c小鼠，每只小鼠腹腔內(nèi)注射0.5ml戶塵螨過敏原點(diǎn)刺液原液，觀察1周，根據(jù)是否有小鼠死亡來判斷過敏原點(diǎn)刺液的毒性。


圖1酶標(biāo)板示意圖，其中的A11、B11、A12、B12孔僅含有1％BSA PBS-T作為空白對(duì)照。A1至A10、B1至B10孔為Der p1標(biāo)準(zhǔn)品的標(biāo)準(zhǔn)曲線測(cè)定復(fù)孔，其含量從250至0.5ng/ml等比稀釋。
實(shí)施例1戶塵螨過敏原提取液中Der p1含量的測(cè)定經(jīng)過HPLC純化的抗Der P1單克隆抗體5H8是以2mg/ml儲(chǔ)備液的濃度溶解在PBS溶液中。用50mM pH9.6的NaHCO3緩沖液，按1∶1000比例稀釋抗Der P1單克隆抗體5H8(即10μl/10ml)Der P1單克隆抗體至2μg/ml。包被聚乙烯板，4℃孵育過夜。用含0.05％Tween-20，pH7.4的PBS緩沖液(PBS-T)洗板3次。
加入含1％BSA的PBS-T 100μl/孔，室溫孵育半小時(shí)。PBST洗板3次。
加入100μl/孔稀釋的過敏原標(biāo)準(zhǔn)品或樣品。室溫孵育1小時(shí)。
使用過敏原標(biāo)準(zhǔn)品(ST-DP1)等比稀釋制備Der P1標(biāo)準(zhǔn)曲線。Der P1標(biāo)準(zhǔn)品的稀釋范圍為0.5-250ng/ml。在酶標(biāo)板的A1和B1孔加入180μl 1％BSA的PBS-T，然后再加入20μl Der P1標(biāo)準(zhǔn)品。混勻，然后轉(zhuǎn)移100μl液體進(jìn)入下一個(gè)含有100μl 1％BSA的PBS-T，形成10個(gè)稀釋梯度。A11、B11、A12、B12孔應(yīng)該僅含有1％BSA PBS-T作為空白對(duì)照。
塵土或過敏原樣品常規(guī)2倍稀釋，從1∶10到1∶80。
用PBS-T洗板3次，然后加入100μl稀釋的生物素化抗Der P1的單克隆抗體4C1(BI-4C1)。此抗體溶液含有50％甘油，應(yīng)該使用1％BSA PBS-T按1∶1000比例稀釋(即10μl/10ml)。室溫孵育1小時(shí)。
用PBS-T洗板3次，然后加入100μl稀釋的鏈霉素卵蛋白-過氧化酶(Sig MA公司S5512，使用1ml雙蒸水復(fù)溶0.25mg粉末)。然后再使用1％BSA PBS-T按1∶1000比例稀釋(即10μl/10ml)。室溫孵育半小時(shí)。
用PBS-T洗板3次，然后加入100μl用70m MpH7.4枸櫞酸磷酸緩沖液溶解的1m MAB T S顯色，顯色時(shí)還要加入按1∶1000比例稀釋的30％H2O2(即10μl/10ml AB T S)。當(dāng)405nm光密度值在2.0-4.0時(shí)讀板。
Der P1標(biāo)準(zhǔn)品含有2500ng/ml Der P1，并且已經(jīng)經(jīng)過與WHO/IUIS的戶塵螨參考標(biāo)準(zhǔn)品(NIBSC 82/518)的對(duì)比標(biāo)準(zhǔn)化。WHO/IUIS的戶塵螨參考標(biāo)準(zhǔn)品(NIBSC 82/518)含有的Der P1含量為12.5μg/ml。
實(shí)施例2戶塵螨過敏原提取液中過敏原總生物活性的測(cè)定1).戶塵螨過敏原血清池的建立根據(jù)戶塵螨中度過敏患者的標(biāo)準(zhǔn)，在簽署知情同意書后，收集30個(gè)戶塵螨中度過敏患者血清，每例采集20ml血清，等量混合稀釋后，用含0.5％牛血清白蛋白及0.05％疊氮鈉溶液稀釋至吸光值在10-30KU/L，2ml塑料離心管分裝，凍干保存血清，即為戶塵螨過敏患者標(biāo)準(zhǔn)血清庫(kù)。
2).試劑1×PBS

3).材料a).待檢變應(yīng)原為Trizol提取的戶塵螨過敏原，與無水乙醇混合后置于-40℃冰箱保存，10000g×10min，取沉淀用1×PBS原體積復(fù)溶b).戶塵螨變應(yīng)原CAP，粉塵螨變應(yīng)原CAPc).抗IgE CAP與上述CAP完全相同，但纖維素顆粒結(jié)合的不是變應(yīng)原，而是羊抗人IgE，供繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線d).IgE標(biāo)準(zhǔn)品共有6個(gè)濃度，分別為0.35、0.7、3.5、17.5、50和100KUa/L。
e).酶標(biāo)記的鼠抗人IgE(酶標(biāo)二抗)，所用酶為β-半乳糖苷酶(β-galactosidase)f).底物為4-甲基傘桂-β-半乳糖苷(4-Methylumbelliferyl-β-D-galactoside)g).終止液為碳酸鈉溶液、沖洗液為PBS溶液4).儀器采用Pharmacia的全自動(dòng)UniCAP 100 System，操作軟件為UniCAP100versionl.61/009。
5).操作方法a).戶塵螨浸液的稀釋原液濃度為8.9mg/ml，用1×PBS分別稀釋為0.0089mg/ml，0.089mg/ml，0.89mg/ml和8.9mg/ml，即10-3，10-2，10-1和原液。
b).陽(yáng)性血清的抑制取Eppendoff管7支，每管均加入復(fù)溶后的陽(yáng)性血清20μl分別加入戶塵螨浸液160μl，，在4℃的條件下孵育12小時(shí)c).同時(shí)取陰性血清20μl，加入1×PBS160μl，按上述同樣處理，作為陰性對(duì)照d).輸入測(cè)試樣本項(xiàng)目包括用于制作標(biāo)準(zhǔn)曲線的12個(gè)抗IgECAP和戶塵螨及粉塵螨sIgECAP。
e).加入血清樣本及IgE標(biāo)準(zhǔn)品(每種濃度皆為雙份)。
f).加入試劑酶標(biāo)記的羊抗人IgE(酶標(biāo)二抗)，β-半乳糖苷酶(β-galactosidase)，底物4-甲基傘桂-β-半乳糖苷(4-Methylunbelliferryl-β-galactosidase)，終止液，沖洗液及其附屬液。
g).計(jì)算機(jī)自動(dòng)測(cè)試各測(cè)試樣本的熒光吸光度值。
h).將IgE標(biāo)準(zhǔn)品的吸光度和相應(yīng)的濃度在半對(duì)數(shù)紙上繪制成標(biāo)準(zhǔn)曲線。
i).根據(jù)測(cè)得的血清熒光吸光度值在標(biāo)準(zhǔn)曲線上讀出相應(yīng)的sIgE含量，上述兩個(gè)步驟由計(jì)算機(jī)完成。
j).按CAP System提供的RAST的方法對(duì)陽(yáng)性血清，抑制后的陽(yáng)性血清，陰性血清進(jìn)行戶塵螨sIgE測(cè)定，記錄其吸光值。
k).同時(shí)用IgE標(biāo)準(zhǔn)品制備標(biāo)準(zhǔn)曲線6.數(shù)據(jù)處理a).用陽(yáng)性血清(陽(yáng)性血清OD值是陽(yáng)性血清20μl+PBS60μl混合液的OD值)和抑制后的陽(yáng)性血清吸光度值分別減去陰性對(duì)照的吸光度值b).用a).所得值除以未用變應(yīng)原抑制的血清吸光度值即最大吸光度值
c).用100％減去b).所得比值即為過敏原放射性吸附抑制的百分率(簡(jiǎn)稱RAST抑制試驗(yàn)百分率)d).以血清樣本處理時(shí)所用的變應(yīng)原量的對(duì)數(shù)作自變量，RAST抑制試驗(yàn)百分率為因變量，在半對(duì)數(shù)紙上作直線回歸，并對(duì)RAST抑制曲線進(jìn)行t檢驗(yàn)分析。
RAST抑制試驗(yàn)百分率要達(dá)到50％以上。
實(shí)施例3戶塵螨過敏原點(diǎn)刺液急性毒性試驗(yàn)在加甘油前后分別進(jìn)行戶塵螨過敏原點(diǎn)刺液的急性毒性試驗(yàn)，取5只6周-8周，體重在17-22克的BALB/c小鼠，每只小鼠腹腔內(nèi)注射0.5ml戶塵螨過敏原點(diǎn)刺液原液，觀察1周，根據(jù)是否有小鼠死亡來判斷過敏原點(diǎn)刺液的毒性。戶塵螨過敏原點(diǎn)刺液急性毒性試驗(yàn)表明如果合格的戶塵螨點(diǎn)刺液在加入甘油后進(jìn)行急性毒性試驗(yàn)則所有的小鼠均死亡；其原因可能為甘油導(dǎo)致小鼠腹腔內(nèi)出現(xiàn)高滲環(huán)境，導(dǎo)致小鼠血容量降低、脫水，產(chǎn)生低血容量休克而死亡。這些小鼠腹腔的病理活檢及病理切片未發(fā)現(xiàn)其它器質(zhì)性病變。如果加入甘油前進(jìn)行急性毒性試驗(yàn)則合格的戶塵螨點(diǎn)刺液無小鼠死亡。
實(shí)施例4戶塵螨過敏原標(biāo)準(zhǔn)化點(diǎn)刺液的靈敏度和特異度。
在北京協(xié)和醫(yī)院變態(tài)反應(yīng)科進(jìn)行1000例的戶塵螨過敏原標(biāo)準(zhǔn)化點(diǎn)刺液的臨床點(diǎn)刺試驗(yàn)。每例患者在簽署知情同意書后，接受點(diǎn)刺試驗(yàn)以診斷是否存在戶塵螨過敏。所用點(diǎn)刺針為清華大學(xué)生產(chǎn)的點(diǎn)刺針(醫(yī)療器材準(zhǔn)字號(hào)蘇鹽藥管械(準(zhǔn))字2004第1010015號(hào))。經(jīng)過500例的戶塵螨過敏原標(biāo)準(zhǔn)化點(diǎn)刺液的臨床點(diǎn)刺試驗(yàn)表明與目前，國(guó)際公認(rèn)的戶塵螨過敏的體外檢測(cè)方法比較，該標(biāo)準(zhǔn)化點(diǎn)刺液的靈敏度為91％，特異度度為92％。
權(quán)利要求
1.一種培養(yǎng)和收集戶塵螨(Dermatophagoides pterronyssinus簡(jiǎn)稱Derp)的方法，其包括a).在20-25℃，70-75％相對(duì)濕度條件下，用透氣帶蓋的塑料培養(yǎng)瓶培養(yǎng)戶塵螨；b)利用飽和食鹽水漂浮法及50-200目篩網(wǎng)收集。
2.根據(jù)權(quán)利要求1的方法，其特征在于培養(yǎng)戶塵螨的飼料含有酵母粉30％，豆粉35.2％，玉米粉3.2％，糖35.2％，豬油3.7％，不含魚粉、蝦皮、人皮屑等動(dòng)物蛋白，其中每100g飼料含Vit A 904.579 IU，VitD 201.729 IU，Vit B1 2.001mg，Vit B2 7.525mg，Vit B6 1.189mg，Vit B12 0.945mg，Vit C 60.519mg，Vit K3 10.490mg，Vit D3 0.755mg，煙酸9.888mg，生物素0.040mg，葉酸0.312mg，泛酸鈣8.875mg，肌醇12.104mg，NaCl 103.477mg，F(xiàn)eSO463.701mg，ZnSO44.711mg，MnSO41.705mg，Vit E 10.11mg。
3.一種提取戶塵螨過敏原的方法，包括步驟將由權(quán)利要求1或2獲得的凍干戶塵螨進(jìn)行丙酮脫脂，用Coca’s液溶解，1∶10至1∶20比例(W/V)提取。
4.根據(jù)權(quán)利要求3的方法，其特征在于提取時(shí)先4℃超聲2-3次，每次2-3分鐘，然后再4℃提取4-24小時(shí)，4℃下10000rpm離心15分鐘，取上清液經(jīng)過濾紙和0.2μm濾器過濾。
5.一種采用雙夾心單克隆抗體法測(cè)定戶塵螨提取液中戶塵螨過敏原第一組分(Der p1)含量的方法，其包括步驟a).將經(jīng)過HPLC純化的抗Der P1單克隆抗體溶解在PBS溶液中；b).用NaHCO3緩沖液稀釋Der P1單克隆抗體，包被聚乙烯板，孵育過夜，用含Tween-20，pH7.4的PBS緩沖液(PBS-T)洗板；c).加入含BSA的PBS-T，室溫孵育，用PBS-T洗板。d).加入稀釋的過敏原標(biāo)準(zhǔn)品或樣品，室溫孵育；e).使用過敏原標(biāo)準(zhǔn)品等比稀釋制備Der P1標(biāo)準(zhǔn)曲線，其中空白對(duì)照僅含有PBS-T；f).塵土或過敏原樣品常規(guī)稀釋，用PBS-T洗板，然后加入稀釋的生物素化抗Der P1的單克隆抗體，室溫孵育；g).用PBS-T洗板，加入稀釋的鏈霉素卵蛋白-過氧化酶，然后再使用PBS-T按比例稀釋，室溫孵育半小時(shí)；h).用PBS-T洗板，然后加入用枸櫞酸磷酸緩沖液溶解的AB T S顯色，顯色時(shí)還要加入按比例稀釋的H2O2；i).讀板。
6.根據(jù)權(quán)利要求5的方法，其特征在于步驟b)中用NaHCO3緩沖液，按1∶1000比例稀釋Der P1單克隆抗體，用含0.05％Tween-20，pH7.4的PBS緩沖液洗板3次。
7.根據(jù)權(quán)利要求5或6的方法，其特征在于步驟f)中塵土或過敏原樣品常規(guī)2倍稀釋1∶10-1∶80。
8.根據(jù)權(quán)利要求7的方法，其特征在于當(dāng)405nm光密度值在2.0-4.0時(shí)讀板。
9.根據(jù)權(quán)利要求5或6的方法，其特征在于單克隆抗體溶液含有50％甘油。
10.一種測(cè)定在加入甘油之前的戶塵螨過敏原點(diǎn)刺液急性毒性的方法，包括步驟取6周-8周齡體重為17-22克的BALB/c小鼠，在每只小鼠腹腔內(nèi)注射0.5ml戶塵螨過敏原點(diǎn)刺液原液，觀察1周，根據(jù)是否有小鼠死亡來判斷過敏原點(diǎn)刺液的毒性。
全文摘要
本發(fā)明公開了戶塵螨(Dermatophagoidespterronyssinus簡(jiǎn)稱Der p)的培養(yǎng)和收集、戶塵螨過敏原提取以及測(cè)定戶塵螨提取液中戶塵螨過敏原第一組分(Der pl)含量的方法。其中戶塵螨提取液中Der pl含量的測(cè)定采用雙夾心單克隆抗體法。另外，本發(fā)明還公開了戶塵螨過敏患者標(biāo)準(zhǔn)血清庫(kù)的建立以及戶塵螨提取液過敏原總生物活性的測(cè)定。本發(fā)明的戶塵螨的培養(yǎng)和收集以及戶塵螨過敏原提取的方法與測(cè)定戶塵螨提取液中Der pl含量的方法均具有操作方便、快速的特點(diǎn)。
文檔編號(hào)G01N33/53GK1763174SQ20051009335
公開日2006年4月26日 申請(qǐng)日期2005年8月26日 優(yōu)先權(quán)日2005年8月26日
發(fā)明者孫勁旅, 張宏譽(yù), 尹佳, 黎明 申請(qǐng)人:中國(guó)醫(yī)學(xué)科學(xué)院北京協(xié)和醫(yī)院