專利名稱：一種微量多肽及蛋白質(zhì)含量的測(cè)定方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種多肽及蛋白質(zhì)含量的測(cè)定，特別是微量(低至幾微克)多肽及蛋白質(zhì)含量的測(cè)定方法。
背景技術(shù)：
蛋白質(zhì)含量測(cè)定法，是生物化學(xué)研究中最常用、最基本的分析方法之一。目前蛋白質(zhì)含量測(cè)定有兩類方法，一類是利用蛋白質(zhì)的物理化學(xué)性質(zhì)，即折射率、比重、紫外吸收等測(cè)定得知；另一類是利用化學(xué)方法測(cè)定蛋白質(zhì)含量，即定氮法，雙縮尿法(Biuret法)、Folin-酚試劑法(Lowry法)、紫外吸收法和考馬斯亮藍(lán)法(Bradford法)。
其中Bradford法和Lowry法靈敏度最高，比紫外吸收法靈敏10～20倍，比Biuret法靈敏100倍以上。值得注意的是，除定氮法外，這后四種方法都將多肽或蛋白質(zhì)分子作為一個(gè)反應(yīng)單元參與化學(xué)反應(yīng)，而多肽蛋白質(zhì)分子的序列、結(jié)構(gòu)、性質(zhì)多種多樣，即使同一種蛋白質(zhì)溶液用這四種方法測(cè)定，也有可能得出四種不同的結(jié)果，所以，它們并不能在任何條件下都適用于任何形式的蛋白質(zhì)。
這些方法中，定氮法雖然比較復(fù)雜，但較準(zhǔn)確，往往以定氮法測(cè)定的蛋白質(zhì)作為其他方法的標(biāo)準(zhǔn)蛋白質(zhì)，它是將樣品與濃硫酸共熱，含氮有機(jī)物即分解產(chǎn)生氨(消化)，氨又與硫酸作用，變成硫酸氨。經(jīng)強(qiáng)堿堿化使之分解放出氨，借蒸汽將氨蒸至酸液中，根據(jù)此酸液被中和的程度可計(jì)算得樣品之氮含量。由于每一種多肽及蛋白質(zhì)都有其恒定的含氮量，通過總氮量的測(cè)定即可求得多肽和蛋白質(zhì)的含量。但凱氏定氮法最低可檢測(cè)出的多肽蛋白質(zhì)也只有0.3mg，對(duì)于微克級(jí)的某些基因工程或其它來源的多肽及蛋白質(zhì)，這個(gè)方法并不適用。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的在于提供一種微量多肽及蛋白質(zhì)含量的測(cè)定方法，采用本發(fā)明所述的定氮法可以對(duì)僅有微量樣品情況下的多肽和蛋白質(zhì)進(jìn)行精確的含量測(cè)定。
本發(fā)明的整體技術(shù)構(gòu)思是多肽蛋白質(zhì)樣品經(jīng)硫酸消化后，生成硫酸銨，硫酸銨被氫氧化鈉分解放出氨，加入奈氏試劑，用分光光度計(jì)測(cè)定銨鹽，并轉(zhuǎn)換成氮含量。
該測(cè)定方法由如下步驟組成一種微量多肽及蛋白質(zhì)含量的測(cè)定方法，其特征在于它由如下步驟組成A、檢測(cè)試劑的制備a、稱取0.2-0.5g硒酸鈉，0.1-0.2g硫酸銅，加1.5-2.5N硫酸溶解成500ml作為消化劑；濃硫酸14-42ml，加入100-150ml水中，冷卻后稀釋為1.5-2.5N硫酸；氫氧化鈉20-60g，加水溶解至500ml得到1-3N氫氧化鈉；b、奈氏試劑的制備將20-30g碘化鉀加水20-30ml溶解制成碘化鉀溶液；二氯化汞8-14g加熱溶于160ml水制成二氯化汞溶液；將60-80g氫氧化鉀加水至350ml溶解制成氫氧化鉀溶液；然后將上述二氯化汞溶液倒入碘化鉀溶液中，直至生成的紅色沉淀不再溶解為止；再將此混合液倒入氫氧化鉀溶液中，混勻，加水至500ml，靜止取上清；c、標(biāo)準(zhǔn)硫酸銨溶液的制備(含氮量0.02-0.06mg/ml)取硫酸銨干燥至恒重后，稱取0.4720-1.4159g加水至100ml溶解、搖勻，得到含氮量1-3mg/ml標(biāo)準(zhǔn)溶液、冷藏；取上述標(biāo)準(zhǔn)溶液1ml，用水稀釋至50ml搖勻；B、檢測(cè)方法a、在含氮8～10μg的待測(cè)樣品中加入消化液1ml，玻璃珠兩粒，于通風(fēng)櫥內(nèi)加熱，使被加熱液體保持微沸狀態(tài)；消化至溶液呈淡綠色(3-5小時(shí))后，加大火力繼續(xù)消化至溶液澄清(1-2小時(shí))；冷卻后，加入10ml水稀釋，再依次加入奈氏試劑0.5ml，2N氫氧化鈉，搖勻，放置10-25分鐘，于390-410nm與460-480nm波長(zhǎng)比色；b、標(biāo)準(zhǔn)硫酸銨曲線量取標(biāo)準(zhǔn)硫酸銨溶液(含氮量為0.02-0.06mg/ml)5份于燒瓶中，每份為0.1-0.5ml，分別補(bǔ)水至0.5ml，加入消化液1ml，玻璃珠兩粒，與待測(cè)樣品同時(shí)消化，按B步驟中的a法操作；C、計(jì)算出總氮量，從而計(jì)算出蛋白含量。
本發(fā)明各步驟的具體工藝條件和工藝參數(shù)是所述的C步驟中總氮量的計(jì)算采用直線回歸法。
奈氏試劑的制備中將60-80g氫氧化鉀加水至350ml，緩緩溶解于棕色瓶中。
B步驟中，將加入消化液和玻璃珠后的待測(cè)樣品或標(biāo)準(zhǔn)硫酸銨溶液置通風(fēng)櫥內(nèi)的可調(diào)火力電爐上加熱。
標(biāo)準(zhǔn)硫酸銨溶液的制備步驟中，干燥溫度為100℃。
檢測(cè)試劑制備的步驟a中，濃硫酸的密度為1.84kg/L。
本發(fā)明取得的技術(shù)進(jìn)步在于本檢測(cè)方法中檢測(cè)試劑和儀器易購；該檢測(cè)方法解決了現(xiàn)有方法不適用于微量樣品中對(duì)多肽和蛋白質(zhì)進(jìn)行精確含量測(cè)定的問題，可以精確檢測(cè)微克級(jí)的某些基因工程或其它來源的多肽及蛋白質(zhì)。
具體實(shí)施例方式
以下結(jié)合實(shí)施例對(duì)本發(fā)明做進(jìn)一步的描述A、檢測(cè)試劑的制備a、稱取0.3g硒酸鈉，0.1g硫酸銅，加2N硫酸溶解成500ml作為消化劑。濃硫酸(密度1.84kg/L)28ml，加入150ml水中，冷卻后以水稀釋至500ml成為2N硫酸。氫氧化鈉40g，加水溶解至500ml得到2N氫氧化鈉。
b、奈氏試劑的制備將25g碘化鉀加水26ml溶解，二氯化汞11.0g加熱溶于160ml水，69g氫氧化鉀，加水緩緩溶解于500ml刻度棕色瓶中，加水至350ml；然后將上述二氯化汞飽和溶液倒入碘化鉀溶液中，直至生成的紅色沉淀不再溶解為止。再將此混合液倒入氫氧化鉀溶液中，混勻，加水至500ml，靜止一段時(shí)間，取上清應(yīng)用。
c、標(biāo)準(zhǔn)硫酸銨溶液的制備(含氮量0.04mg/ml)取硫酸銨于100℃干燥至恒重，精密稱重0.9439g，用水溶解，小心洗入100ml容量瓶中，并加水至刻度，搖勻，得到含氮量2mg/ml標(biāo)準(zhǔn)溶液，保存冰箱中備用。取標(biāo)準(zhǔn)硫酸銨貯備液1ml，置于50ml容量瓶中，加水至刻度，搖勻即可。
B、檢測(cè)方法a、取待測(cè)樣品(含氨9μg)置于凱氏燒瓶或大試管中，加入消化液1ml，玻璃珠兩粒，置通風(fēng)櫥內(nèi)的可調(diào)火力電爐上加熱，使管內(nèi)液體保持微沸狀態(tài)，消化至溶液呈淡綠色(3-5小時(shí))，加大火力，繼續(xù)消化至溶液澄清(1-2小時(shí))，取下冷卻后，加入10ml水稀釋，再依次加入奈氏試劑0.5ml，2N氫氧化鈉，搖勻，放置15分鐘，于400nm與470nm波長(zhǎng)比色。
b、標(biāo)準(zhǔn)硫酸銨曲線精密量取標(biāo)準(zhǔn)硫酸銨溶液(含氮量為0.04mg/ml)0.1、0.2、0.3、0.4和0.5ml于凱氏燒瓶中，補(bǔ)足水至0.5ml，加入消化液1ml，玻璃珠兩粒，與待測(cè)樣品同時(shí)消化，同法操作。
C、采用直線回歸法求出總氮量，再計(jì)算出蛋白含量。
權(quán)利要求
1.一種微量多肽及蛋白質(zhì)含量的測(cè)定方法，其特征在于它由如下步驟組成A、檢測(cè)試劑的制備a、稱取0.2-0.5g硒酸鈉，0.1-0.2g硫酸銅，加1.5-2.5N硫酸溶解成500ml作為消化劑；濃硫酸14-42ml，加入100-150ml水中，冷卻后稀釋為1.5-2.5N硫酸；氫氧化鈉20-60g，加水溶解至500ml得到1-3N氫氧化鈉；b、奈氏試劑的制備將20-30g碘化鉀加水20-30ml溶解制成碘化鉀溶液；二氯化汞8-14g加熱溶于160ml水制成二氯化汞溶液；將60-80g氫氧化鉀加水至350ml溶解制成氫氧化鉀溶液；然后將上述二氯化汞溶液倒入碘化鉀溶液中，直至生成的紅色沉淀不再溶解為止；再將此混合液倒入氫氧化鉀溶液中，混勻，加水至500ml，靜止取上清；c、標(biāo)準(zhǔn)硫酸銨溶液的制備(含氮量0.02-0.06mg/ml)取硫酸銨干燥至恒重后，稱取0.4720-1.4159g加水至100ml溶解、搖勻，得到含氮量1-3mg/ml標(biāo)準(zhǔn)溶液、冷藏；取上述標(biāo)準(zhǔn)溶液1ml，用水稀釋至50ml搖勻；B、檢測(cè)方法a、在含氮8～10μg的待測(cè)樣品中加入消化液1ml，玻璃珠兩粒，于通風(fēng)櫥內(nèi)加熱，使被加熱液體保持微沸狀態(tài)；消化至溶液呈淡綠色(3-5小時(shí))后，加大火力繼續(xù)消化至溶液澄清(1-2小時(shí))；冷卻后，加入10ml水稀釋，再依次加入奈氏試劑0.5ml，2N氫氧化鈉，搖勻，放置10-25分鐘，于390-410nm與460-480nm波長(zhǎng)比色；b、標(biāo)準(zhǔn)硫酸銨曲線量取標(biāo)準(zhǔn)硫酸銨溶液(含氮量為0.02-0.06mg/ml)5份于燒瓶中，每份為0.1-0.5ml，分別補(bǔ)水至0.5ml，加入消化液1ml，玻璃珠兩粒，與待測(cè)樣品同時(shí)消化，按B步驟中的a法操作；C、計(jì)算出總氮量，從而計(jì)算出蛋白含量。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種微量多肽及蛋白質(zhì)含量的測(cè)定方法，其特征在于所述的C步驟中總氮量的計(jì)算采用直線回歸法。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種微量多肽及蛋白質(zhì)含量的測(cè)定方法，其特征在于所述的奈氏試劑的制備中將60-80g氫氧化鉀加水至350ml，緩緩溶解于棕色瓶中。
4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種微量多肽及蛋白質(zhì)含量的測(cè)定方法，其特征在于所述的B步驟中，將加入消化液和玻璃珠后的待測(cè)樣品或標(biāo)準(zhǔn)硫酸銨溶液置通風(fēng)櫥內(nèi)的可調(diào)火力電爐上加熱。
5.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種微量多肽及蛋白質(zhì)含量的測(cè)定方法，其特征在于所述的標(biāo)準(zhǔn)硫酸銨溶液的制備步驟中，干燥溫度為100℃。
6.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種微量多肽及蛋白質(zhì)含量的測(cè)定方法，其特征在于所述的檢測(cè)試劑制備的步驟a中，濃硫酸的密度為1.84kg/L。
全文摘要
本發(fā)明涉及一種多肽及蛋白質(zhì)含量的測(cè)定，特別是微量(低至幾微克)多肽及蛋白質(zhì)含量的測(cè)定方法。本發(fā)明的工作原理是多肽蛋白質(zhì)樣品經(jīng)硫酸消化后，生成硫酸銨，硫酸銨被氫氧化鈉分解放出氨，加入奈氏試劑，用分光光度計(jì)測(cè)定銨鹽，并轉(zhuǎn)換成氮含量。本發(fā)明由檢測(cè)試劑的制備、檢測(cè)方法、蛋白含量計(jì)算等步驟組成。它克服了現(xiàn)有技術(shù)存在的不適用于微量樣品中對(duì)多肽和蛋白質(zhì)進(jìn)行精確含量測(cè)定的問題，具有檢測(cè)試劑和儀器易購、可精確檢測(cè)微克級(jí)的某些基因工程或其它來源的多肽及蛋白質(zhì)等優(yōu)點(diǎn)。
文檔編號(hào)G01N21/33GK1687745SQ20051001242
公開日2005年10月26日 申請(qǐng)日期2005年3月25日 優(yōu)先權(quán)日2005年3月25日
發(fā)明者周兆平, 林楓, 邱崗峰, 周國(guó)衛(wèi), 于志江, 王玉樹, 歐陽藩 申請(qǐng)人:深圳國(guó)家生化工程技術(shù)開發(fā)中心