專利名稱：使用表面增強(qiáng)相干反斯托克斯拉曼光譜學(xué)檢測(cè)少量分子的方法和設(shè)備的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及利用光譜學(xué)的分子檢測(cè)和/或表征的領(lǐng)域。更具體地，本發(fā)明一般地涉及在生物學(xué)、生物化學(xué)和化學(xué)測(cè)試中使用的方法和設(shè)備，并特別涉及利用表面增強(qiáng)相干反斯托克斯拉曼光譜學(xué)(surface enhanced coherent anti-Stokes Raman spectroscopy，SECARS)對(duì)例如核酸的分子進(jìn)行檢測(cè)、識(shí)別或測(cè)序的方法、儀器以及儀器的使用。
背景技術(shù)：
對(duì)來自生物學(xué)樣本或者其他樣本的少量(＜1000)分子的靈敏和準(zhǔn)確的檢測(cè)和/或識(shí)別已經(jīng)被證明是很難達(dá)到的目標(biāo)，在醫(yī)學(xué)診斷學(xué)、病理學(xué)、毒物學(xué)、環(huán)境采樣、化學(xué)分析、法醫(yī)學(xué)以及許多其他的領(lǐng)域具有廣泛的潛在用途。已經(jīng)嘗試過使用拉曼光譜學(xué)(Ramanspectroscopy)和/或表面等離子共振實(shí)現(xiàn)這個(gè)目標(biāo)。當(dāng)光通過所關(guān)心的介質(zhì)時(shí)，一定的量變得偏離其原始方向。這種現(xiàn)象叫做散射。由于a)光被介質(zhì)吸收，b)介質(zhì)中的電子激發(fā)到更高的能態(tài)，和c)隨后的來自介質(zhì)的在不同波長上的光發(fā)射，一些被散射光在頻率上和原始激發(fā)光不同。當(dāng)頻率差和所關(guān)心介質(zhì)的分子振動(dòng)能級(jí)匹配時(shí)，這個(gè)過程叫做拉曼散射。拉曼發(fā)射光譜的波長是樣本中吸收光的分子的化學(xué)組成和結(jié)構(gòu)的特征，而光散射的強(qiáng)度依賴于樣本中分子的濃度以及分子的結(jié)構(gòu)。當(dāng)拉曼散射中發(fā)射的光波長比激發(fā)光波長更長時(shí)，這叫做斯托克斯拉曼散射。當(dāng)發(fā)射光的波長比激發(fā)光波長更短時(shí)，這叫做反斯托克斯拉曼散射。
在樣本中，激發(fā)光束和各別分子之間發(fā)生拉曼相互作用的概率非常低，導(dǎo)致了拉曼分析的低靈敏度和有限的適用性?！肮鈱W(xué)截面(optical cross section)”是指示由特定分子或粒子引發(fā)的光學(xué)事件發(fā)生概率的術(shù)語。當(dāng)光子打在分子上時(shí)，幾何上打在分子上的光子中只有一些在光學(xué)上和所述分子相互作用。所述截面是幾何截面和光學(xué)事件概率的乘積(multiple)。光學(xué)截面包括吸收截面(用于光子吸收過程)、瑞利散射截面或散射截面(用于瑞利散射)，以及拉曼散射截面(用于拉曼散射)(見Biomedical Optics Course(生物醫(yī)學(xué)光學(xué)教程)，Oregon Graduate Institute(俄勒岡研究生院)，可在http:/lomlc.ogi.edu/classroom/ece532/class3/muadefinition.html以及http://omlc.ogi.edu/classroom/ece532/class3/musdefinition.html.得到)。
對(duì)于少量分子的光學(xué)檢測(cè)和光譜學(xué)，期望大于10-16cm2/分子或更大的截面，并且大于10-21cm2/分子或更大的截面是必須的。典型的自發(fā)拉曼散射技術(shù)具有大約10ucm2/分子的截面，因此不適于單分子檢測(cè)。
已經(jīng)觀察到接近粗糙的銀表面的分子顯示出增強(qiáng)的拉曼散射，這種增強(qiáng)高達(dá)6到7個(gè)數(shù)量級(jí)。這種表面增強(qiáng)拉曼光譜(SERS)效應(yīng)和等離子共振現(xiàn)象相關(guān)，其中，由于金屬中導(dǎo)電電子的集體耦合(collective coupling)，金屬表面響應(yīng)入射的電磁輻射而表現(xiàn)出顯著的光學(xué)共振。實(shí)際上，金屬表面能夠起到增強(qiáng)電磁輻射的定域效應(yīng)(localized effect)的微型“天線”的作用。對(duì)于拉曼光譜分析，位于這樣的表面附近的分子表現(xiàn)出更加高的靈敏度。
通常，通過使用被附著到(attach to)作為光譜測(cè)量設(shè)備的樣本室的一部分的基底的粗糙金屬膜，或者通過將作為懸浮液的一部分的金屬納米粒子或膠體引入樣本室來實(shí)現(xiàn)SERS。然后，將樣本施加到這些金屬表面。SERS技術(shù)能給出強(qiáng)的強(qiáng)度增強(qiáng)，高達(dá)1014到1016倍，但只是對(duì)于接近單分子檢測(cè)范圍的某些分子(例如染料分子、腺嘌呤、血色素和酪氨酸)(見Kneipp等人，Physical Review E，57(6)R6281-R6284(1998)；Nie等人，Science，2751102(1997))。但是，對(duì)于大多數(shù)其他分子，使用SERS技術(shù)的增強(qiáng)仍舊在103到106的范圍內(nèi)，這遠(yuǎn)遠(yuǎn)低于單分子檢測(cè)所需的范圍。
相干反斯托克斯拉曼散射(Coherent anti-Stokes Raman scattering，CARS)是一種四波混頻過程，它將中心頻率分別在ωp和ωsd的泵浦拉曼光束或光波與斯托克斯光束組合使用。當(dāng)將ωp-ωs調(diào)諧成與分子中的給定振動(dòng)模式共振時(shí)，從在2ωp-ωs的反斯托克斯頻率處所得出的(resultant)散射光中可以觀察到增強(qiáng)強(qiáng)度的CARS信號(hào)。和自發(fā)拉曼散射不同，CARS高度靈敏，并且能夠在存在由單光子激發(fā)引起的背景熒光下被檢測(cè)。(見Cheng等人，J.Phys.Chem.1051277(2001))。CARS技術(shù)給出大約105倍的強(qiáng)度增強(qiáng)，這產(chǎn)生了在大約10-25cm2/分子范圍內(nèi)的截面，對(duì)于單分子的光學(xué)檢測(cè)和光譜學(xué)來說還是太小了。
理論上，如果將CARS和SERS技術(shù)組合使用，則對(duì)于大范圍的分子，始終能夠觀察到高達(dá)大約10-21到10-16cm2/分子的截面。在這個(gè)范圍內(nèi)的增強(qiáng)將始終處于單分子檢測(cè)的范圍內(nèi)。使用金屬膜SERS技術(shù)((Chen等人，Phys.Rev.Lett.43946(1979)；Y.R.Shen，The Principles of Non-Linear Optics(非線性光學(xué)原理)，John Willey&Sons，1984，p.492).)已經(jīng)展示了SERS和CARS，表面增強(qiáng)相干反斯托克斯拉曼散射(此后的SECARS)的組合。但是，使用這種金屬膜技術(shù)觀察到的增強(qiáng)并不在允許單分子檢測(cè)的范圍內(nèi)。使用SERS金屬膜技術(shù)的增強(qiáng)一般不像針對(duì)使用懸浮金屬粒子的SERS技術(shù)所觀察到的增強(qiáng)那么多。此外，為了獲得109到1018倍或者更大的SECARS增強(qiáng)，必須針對(duì)每一種類型的分子仔細(xì)地調(diào)整特定條件。
在實(shí)現(xiàn)這些用于檢測(cè)少量分子的增強(qiáng)時(shí)的部分問題是檢測(cè)少量分子的能力既是靈敏度問題，也是背景噪聲問題。如果要檢測(cè)溶液中的特定熒光分子，則它必須是從與溶劑相關(guān)聯(lián)的背景中可區(qū)分的。為了使得背景影響最小，必須使用可能的最小樣本體積。這是因?yàn)檫@樣的事實(shí)，即背景和樣本體積成比例，而來自分子的信號(hào)卻獨(dú)立于樣本體積的。因此，少量分子的拉曼檢測(cè)可以使用10pL或更少的樣本體積。在這種規(guī)模上利用了SERS和CARS技術(shù)的組合的微器件目前不可獲得并且是未知的。存在對(duì)使用拉曼光譜學(xué)提高來自分子的信號(hào)增強(qiáng)的方法以及用于采用SECARS來檢測(cè)少量分子的設(shè)備的需求。


為了使本發(fā)明可以被更好地理解，現(xiàn)在將僅通過舉例并參考附圖描述它的幾個(gè)實(shí)施方案，在附圖中圖1是根據(jù)本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施方案的同步SECARS系統(tǒng)的原理圖，所述同步SECARS系統(tǒng)使用各種光學(xué)裝置聚焦光束并且還收集來自樣本的拉曼散射光；圖2示出了圖1的樣本室區(qū)域。該圖的標(biāo)度是使得拉曼活性表面被定位在距分析物(analyte)幾十納米以內(nèi)，以便實(shí)現(xiàn)本發(fā)明的增強(qiáng)；圖3是100納摩爾濃度脫氧腺苷一磷酸(dAMP)的SECARS光譜。這對(duì)應(yīng)于大約1000個(gè)dAMP分子。A代表dAMP的處于730cm-1的SECARS信號(hào)(它對(duì)應(yīng)于742nm，泵浦激光為785nm)并產(chǎn)生大約70,000次計(jì)數(shù)。B代表處于785nm的泵浦激光信號(hào)。C代表處于833nm的斯托克斯激光信號(hào)。光譜被收集了100毫秒。泵浦和斯托克斯激光大約2皮秒一個(gè)脈沖。泵浦激光的平均功率大約是500毫瓦，并且斯托克斯激光的平均功率是大約300毫瓦。
圖4是脫氧腺苷一磷酸(dAMP)在相同的100納摩爾濃度的比較SERS光譜。A代表處于730cm-1的dAMP的SERS信號(hào)(它對(duì)應(yīng)于833nm，泵浦激光為785nm)并且只產(chǎn)生大約1,500次計(jì)數(shù)。光譜被收集了100毫秒。泵浦激光工作于連續(xù)波模式。泵浦激光的平均功率是大約500毫瓦，并且不使用斯托克斯激光。
圖5是脫氧腺苷酸(dAMP)也在100納摩爾濃度的比較CARS光譜。A代表dAMP的處于730cm-1的CARS信號(hào)(它對(duì)應(yīng)于742nm，泵浦激光為785nm)，產(chǎn)生大約2,500次計(jì)數(shù)。B代表處于785nm的泵浦激光信號(hào)。C代表處于833nm的斯托克斯激光信號(hào)。光譜也被收集了100毫秒。泵浦和斯托克斯激光大約2皮秒一個(gè)脈沖。泵浦激光的平均功率大約是500毫瓦，并且斯托克斯激光的平均功率是大約300毫瓦。利用100毫秒光譜收集時(shí)間不能獲取100納摩爾dAMP的CARS光譜。
圖6是脫氧腺苷酸(dAMP)在100皮摩爾濃度的SECARS。平均來說，在這個(gè)濃度只有單個(gè)dAMP分子產(chǎn)生信號(hào)。dAMP的SECARS信號(hào)(A)處于730cm-1(它對(duì)應(yīng)于742nm，泵浦激光為785nm)，產(chǎn)生大約27,000次計(jì)數(shù)。B代表處于785nm的泵浦激光信號(hào)。C代表處于833nm的斯托克斯激光信號(hào)。光譜被收集了100毫秒。泵浦和斯托克斯激光大約2皮秒一個(gè)脈沖。泵浦激光的平均功率大約是500毫瓦，并且斯托克斯激光的平均功率是大約300毫瓦。
具體實(shí)施方案定義為了本公開的目的，下列術(shù)語具有下列含義。未定義的術(shù)語根據(jù)其平常且一般的含義來使用。
如這里所使用的，″a″或″an″可以表示一個(gè)或超過一個(gè)的項(xiàng)目。
如這里所使用的，“大約”表示在一個(gè)值的百分之十以內(nèi)。例如，“大約100”將表示在90和110之間的值。
如這里所使用的，“多個(gè)”項(xiàng)目表示兩個(gè)或更多個(gè)所述項(xiàng)目。
如這里所使用的，“微米通道(microchannel)”是任何具有在1微米(μm)和999μm之間的截面直徑的通道，而“納米通道(nanochannel)”則是任何具有在1納米(nm)和999nm之間的截面直徑的通道。在本發(fā)明的某些實(shí)施方案中，“納米通道或者微米通道”可以是直徑為大約999μm或者更小?！拔⒘黧w通道(″microfluidic channel)”是液體在其中可以通過微流體流動(dòng)而移動(dòng)的通道。通道直徑、流體粘度和流動(dòng)速率對(duì)微流體流動(dòng)的影響在本領(lǐng)域是公知的。
如這里所使用的，“可操作地耦合”表示在裝置和/或系統(tǒng)的兩個(gè)或更多個(gè)單元之間存在功能性相互作用。例如，如果將拉曼檢測(cè)器195安排成使得它能夠在單分子分析物210(例如核酸)通過樣本室175、納米通道、微米通道或微流體通道185時(shí)對(duì)其進(jìn)行檢測(cè)，則拉曼檢測(cè)器195可以被“可操作地耦合”到流經(jīng)室(flow through cell)(樣本室)175、納米通道、微米通道或微流體通道185。又例如，如果計(jì)算機(jī)200能獲取、處理、儲(chǔ)存和/或傳送關(guān)于由拉曼檢測(cè)器檢測(cè)到的拉曼信號(hào)的數(shù)據(jù)，則拉曼檢測(cè)器195可以被“可操作地耦合”到計(jì)算機(jī)200。
如這里所使用的，術(shù)語“分析物”210表示對(duì)于檢測(cè)和/或識(shí)別所關(guān)心的任何原子、化學(xué)試劑(chemical)、分子、化合物、組合物或聚集體。分析物的實(shí)施例包括但不限于氨基酸、肽、多肽、蛋白質(zhì)、糖蛋白、脂蛋白、核苷、核苷酸、寡核苷酸、核酸、糖、碳水化合物、寡糖、多糖、脂肪酸、類脂、激素、代謝物、細(xì)胞因子(cytokine)、趨化因子(chemokine)、受體、神經(jīng)遞質(zhì)、抗原、變態(tài)反應(yīng)原、抗體、底物(substrate)、代謝物、輔因子、抑制劑、藥(drug)、藥物(pharmaceutical)、營養(yǎng)素、朊毒體(prion)、毒素、毒物、爆炸物、殺蟲劑、化學(xué)戰(zhàn)劑、生物危險(xiǎn)制劑、放射性同位素、維生素、雜環(huán)芳香族化合物、致癌物質(zhì)、誘變劑、鎮(zhèn)靜劑、安非他明、巴比妥酸鹽、迷幻劑、廢物(waste product)和/或污染物。在本發(fā)明的某些實(shí)施方案中，如下面公開的那樣，可以用一個(gè)或更多個(gè)拉曼標(biāo)記(Raman label)來標(biāo)記一個(gè)或更多個(gè)分析物。
使用術(shù)語“標(biāo)記”指任何原子、分子、化合物或組合物，它們可以被用來識(shí)別被所述標(biāo)記附著的分析物210。在本發(fā)明的各種實(shí)施方案中，這種附著(attachment)可以是共價(jià)的或非共價(jià)的。在非限制性的實(shí)施例中，標(biāo)記可以是熒光性的、磷光性的、發(fā)光的(luminescent)、電致發(fā)光的、化學(xué)發(fā)光的，或者可以是任何大基團(tuán)(bulky group)，或者可以表現(xiàn)出拉曼或其他光譜特性。
“拉曼標(biāo)記”可以是任何能夠產(chǎn)生可檢測(cè)拉曼信號(hào)的有機(jī)或無機(jī)分子、原子、復(fù)合物或結(jié)構(gòu)，包括但不限于合成分子、染料、自然產(chǎn)生的色素(例如藻紅蛋白)、有機(jī)納米結(jié)構(gòu)(例如C60、巴基球(buckyball)和碳納米管)、金屬納米結(jié)構(gòu)(例如金或銀納米粒子或納米棱鏡(nanoprism))以及納米規(guī)模的半導(dǎo)體(例如量子點(diǎn)(quantum dot))。下面公開了許多拉曼標(biāo)記的實(shí)施例。本領(lǐng)域普通技術(shù)人員將發(fā)現(xiàn)，這些實(shí)施例不是限制性的，并且“拉曼標(biāo)記”包含在本領(lǐng)域公知的可通過拉曼光譜學(xué)檢測(cè)的任何有機(jī)或無機(jī)原子、分子、化合物或結(jié)構(gòu)。
如這里所使用的，術(shù)語“納米晶體硅(nanocrystalline silicon)”指包括納米規(guī)模的硅晶體的硅，典型地在從1到100納米(nm)的尺寸范圍內(nèi)?！岸嗫坠琛?20指已經(jīng)被刻蝕或者被處理以形成多孔結(jié)構(gòu)。
表面增強(qiáng)相干反斯托克斯拉曼光譜學(xué)本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施方案涉及通過使用表面增強(qiáng)相干反斯托克斯拉曼光譜學(xué)(此后的“SECARS”)——表面增強(qiáng)拉曼光譜學(xué)(此后的“SERS”)與相干反斯托克斯拉曼散射(此后的“CARS”)的組合——檢測(cè)少量(＜1000)分子的設(shè)備和方法。本發(fā)明的設(shè)備和方法涉及在目標(biāo)區(qū)域發(fā)出不同拉曼波長的斯托克斯光和泵浦光，所述目標(biāo)區(qū)域由要被檢測(cè)和/或識(shí)別的分子和拉曼活性表面之間的界面所限定。在一個(gè)實(shí)施方案中，拉曼活性表面可操作地耦合到一個(gè)或更多個(gè)拉曼檢測(cè)單元195。
參考圖1，在一個(gè)實(shí)施方案中，設(shè)備從源120和125分別提供兩個(gè)輸入激發(fā)電磁輻射束或波130和135。這些源可以各自包括普通光源，帶有合適的濾光器和準(zhǔn)直器，或者優(yōu)選地，利用兩個(gè)二極管激光器、固體激光器、離子激光器等等來提供這些源。這些激光器可以具有任何特定的尺寸；但是，因?yàn)槿藗兤谕麑?shí)施本發(fā)明的方法以作為微器件的一部分，所以優(yōu)選使用微激光器(microlaser)。合適的源包括但不限于來自SpectraPhysics的166型514.5nm線氬離子激光器、氪離子激光器(Innova 70，Coherent)的647.1nm線；處于337nm的氮激光器(Laser Science Inc.)；處于325nm的氦鎘激光器(Liconox，見No.6,174,677號(hào)美國專利)；Nd:YLF激光器，和/或各種離子激光器和/或染料激光器；垂直腔表面發(fā)射激光器(“VCSEL”)(德克薩斯州Richardson的Honeywell或馬薩諸塞州Southbridge的Schott)；其他微激光器，例如納米線激光器(見Huang等人，Science(科學(xué))2921897(2001))；處于532nm波長的倍頻Nd:YAG激光器或者處于700nm和1000nm之間的任何波長的倍頻鈦:藍(lán)寶石激光器；或者發(fā)光二極管。
表面增強(qiáng)CARS的信號(hào)強(qiáng)度依賴于輸入泵浦束的強(qiáng)度；但是，界面上的最大激光強(qiáng)度經(jīng)常受光學(xué)損傷的限制。由于這個(gè)原因，最好使用具有高峰值功率的比典型的連續(xù)波激光束更短的泵浦脈沖激光束。連續(xù)波(“CW”)激光器在高峰值功率水平通常供給微瓦到瓦，而脈沖激光器在以相同的平均功率工作時(shí)，在高峰值功率水平供給千瓦到千兆瓦。這產(chǎn)生了仍舊在光學(xué)損傷閾值以下的更強(qiáng)的信號(hào)。脈沖的寬度從大約100納秒到大約80飛秒變動(dòng)。通常，從大約100飛秒到大約7皮秒的脈沖寬度產(chǎn)生最佳的結(jié)果，取決于束的峰值功率和譜線寬度。
可以使用脈沖激光束或者CW激光束。當(dāng)使用激光時(shí)，輸入束必須同步，以便確保這些束的交迭(overlap)。這可以通過合適的激光控制器或者其他類型的同步電子裝置110來實(shí)現(xiàn)。商業(yè)上可獲得的可使用的電子設(shè)備的實(shí)施例包括但不限于Lok-to-Clock設(shè)備(Spectra-Physics)或SynchroLock設(shè)備(Coherent)。這些電子設(shè)備可能需要未在圖中繪出的額外的光電二極管和分束器用于其工作。另外的實(shí)施方案使用光學(xué)參量振蕩器(OPO)，所述光學(xué)參量振蕩器接受輸入的單個(gè)激光束并產(chǎn)生兩個(gè)處于不同可調(diào)諧波長的同步束。
可以調(diào)整泵浦波的波矢量以便滿足表面相位匹配條件2k1-k2＝ka(ωa)＝K′(ωa)其中，k1是第一束的波矢量；k2是第二束的波矢量；ka(ωa)是反斯托克斯信號(hào)的波矢量；K′(ωa)是表面EM波的波矢量。
有幾種將這兩束光傳遞到樣本的方法。如圖1中所示，SECARS設(shè)備的一個(gè)實(shí)施方案可以使用標(biāo)準(zhǔn)的全場(chǎng)光學(xué)裝置(full field optics)或共焦光學(xué)裝置(confocal optics)，例如反射鏡145和150，以及分色鏡(dichoric mirror)155和/或棱鏡140的串聯(lián)，將輸入束130和135導(dǎo)入樣本室。這些束可以通過半圓柱鏡(直角或者等邊的)或物鏡160聚焦，物鏡160由例如玻璃或石英的透明材料制成。這些聚焦透鏡的實(shí)施例，包括但不限于可從尼康、蔡斯、奧林巴斯和Newport獲得的顯微鏡物鏡，例如6X物鏡(Newport，Model L6X)或100X物鏡(尼康，Epi 100x消色差透鏡)。使用聚焦透鏡160將激發(fā)束聚焦在包含拉曼活性表面和分析物的區(qū)域上，并收集來自所述樣本的拉曼散射光。
這些束可以可選擇地通過改變束的性質(zhì)或者降低背景信號(hào)的其他設(shè)備，例如偏振器、狹縫、額外的透鏡、全息分束器和/或陷波濾波器、單色儀、二色濾光器、帶通濾波器、反射鏡、遮光濾光器，以及共焦針孔，等等。例如，全息分束器(Kaiser Optical Systems，Inc.，HB 647-26N18型)為激發(fā)束135和被發(fā)射的拉曼信號(hào)產(chǎn)生了直角幾何構(gòu)形?？梢允褂萌⑾莶V波器(Kaiser Optical Systems，Inc.)降低瑞利散射輻射。同樣地，在光譜上可以純化激發(fā)束130和135，例如利用帶通濾波器(Corion)。
聚焦透鏡將光165聚焦在光學(xué)上可透射的樣本室175中，在圖2A和2B中更詳細(xì)地示出了樣本室175。如圖2A和B中所示，光被聚焦在包含通常被示為210的要被檢測(cè)的分析物和拉曼活性表面之間的界面的區(qū)域中，在下面更詳細(xì)地描述了拉曼活性表面。
本發(fā)明的某些實(shí)施方案是關(guān)于使用各種形式的拉曼表面。例如，拉曼活性表面包括但不限于金屬表面，220和230，或270和280，例如一層或更多層用金屬或其他導(dǎo)電材料涂敷的納米晶體和/或多孔硅；粒子240，例如金屬納米粒子；粒子的聚集體250，例如金屬納米粒子聚集體；粒子膠體(240及離子化合物260)，例如金屬納米粒子膠體；或它們的組合。
從分析物和拉曼活性表面之間的界面發(fā)射的反斯托克斯輻射束190從樣本室傳出，并作為相干束傳播，所述相干束被共焦或標(biāo)準(zhǔn)光學(xué)裝置收集，并可選擇地耦合到單色儀，用于光譜分解(spectral dissociation)。利用拉曼檢測(cè)器195檢測(cè)所述束。反斯托克斯束的高度方向性的輸出使得即使在存在很強(qiáng)的發(fā)光背景下也允許其檢測(cè)。
拉曼檢測(cè)單元拉曼檢測(cè)單元并非特別重要，并且可以是任何具有足以檢測(cè)少量特定分析物分子的靈敏度和速度的通用光學(xué)檢測(cè)器?？膳c冷卻型電荷耦合器件(“CCD”)陣列比擬的靈敏度是足夠的。檢測(cè)的速度在毫秒到納秒范圍以內(nèi)。拉曼檢測(cè)單元可以包括大面積或小面積檢測(cè)器、檢測(cè)器陣列，等等。這種檢測(cè)器的實(shí)施例包括光電二極管、雪崩光電二極管、CCD陣列、互補(bǔ)金屬氧化物半導(dǎo)體(CMOS)陣列，強(qiáng)化CCD，等等。優(yōu)選CCD、CMOS和雪崩光電二極管。差分檢測(cè)器195產(chǎn)生指示貫穿反斯托克斯波或束190位置的光強(qiáng)變化的電輸出信號(hào)；支配強(qiáng)吸收的SECARS效應(yīng)將發(fā)生在由被測(cè)試樣本中的材料所確定的特定角度或強(qiáng)度。這些電信號(hào)被采樣/計(jì)數(shù)并被數(shù)字化，并通過相關(guān)聯(lián)的電路(未示出)饋至適當(dāng)?shù)臄?shù)據(jù)分析裝備(統(tǒng)稱200)，所述數(shù)據(jù)分析裝備可以包括信息處理和控制系統(tǒng)或計(jì)算機(jī)。
拉曼檢測(cè)單元15的實(shí)施例包括但不限于帶有作為單光子計(jì)數(shù)模型(RCA C31034型或者Burle Indus.C3103402型；見No.5,306,403號(hào)美國專利)工作的砷化鎵光電倍增管的Spex 1403型雙光柵分光光度計(jì)；配備有紅增強(qiáng)強(qiáng)化電荷耦合器件(red-enhancedintensified charge-coupled device，RE-ICCD)檢測(cè)系統(tǒng)(Princeton Instruments)的ISA HR-320攝譜儀；傅立葉變換攝譜儀(基于麥克爾干涉儀)，電荷注入器件；光電二極管陣列，包括雪崩光電二極管陣列；InGaAs檢測(cè)器；電子倍增CCD；強(qiáng)化CCD和/或光電晶體管陣列。
信息處理和控制系統(tǒng)或計(jì)算機(jī)和數(shù)據(jù)分析在本發(fā)明的某些實(shí)施方案中，所述裝置可以包括信息處理系統(tǒng)或計(jì)算機(jī)200。所公開的實(shí)施方案不限制所使用的信息處理系統(tǒng)或計(jì)算機(jī)200的類型。示例性的信息處理系統(tǒng)或計(jì)算機(jī)可以包括用于溝通信息的總線和用于處理信息的處理器。在本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施方案中，所述處理器是從Pentium系列處理器中選擇的，包括但不限于可從英特爾公司(SantaClara，CA)獲得的PentiumII系列、PentiumIII系列以及Pentium4系列處理器。在本發(fā)明另外的實(shí)施方案中，所述處理器可以是Celeron、Itanium、Pentium Xeon處理器(英特爾公司，Santa Clara，CA)。在本發(fā)明各種其他的實(shí)施方案中，所述處理器可以基于Intel體系結(jié)構(gòu)，例如IntelIA-32或IntelIA-64體系結(jié)構(gòu)。另外也可以使用其他的處理器。
信息處理和控制系統(tǒng)或計(jì)算機(jī)200還可以包括隨機(jī)訪問存儲(chǔ)器(RAM)或其他的動(dòng)態(tài)儲(chǔ)存設(shè)備、只讀存儲(chǔ)器(ROM)或其他靜態(tài)儲(chǔ)存和數(shù)據(jù)儲(chǔ)存設(shè)備，例如磁盤或光盤及其對(duì)應(yīng)設(shè)備的。信息處理和控制系統(tǒng)或計(jì)算機(jī)200還可以包括本領(lǐng)域已知的任何外圍設(shè)備，例如存儲(chǔ)器、顯示設(shè)備(例如陰極射線管或液晶顯示器(LCD))、字母數(shù)字輸入設(shè)備(例如鍵盤)、光標(biāo)控制設(shè)備(例如鼠標(biāo)、跟蹤球或光標(biāo)方向鍵)，以及通訊設(shè)備(例如調(diào)制解調(diào)器、網(wǎng)絡(luò)接口卡或用于耦合到以太網(wǎng)、令牌環(huán)或其他類型的網(wǎng)絡(luò)的接口設(shè)備)。
來自檢測(cè)單元195的數(shù)據(jù)可以由處理器處理，并且數(shù)據(jù)被儲(chǔ)存在存儲(chǔ)器(例如主存儲(chǔ)器)中。關(guān)于標(biāo)準(zhǔn)分析物的發(fā)射分布圖的數(shù)據(jù)也可以儲(chǔ)存在存儲(chǔ)器(例如主存儲(chǔ)器或者ROM)中。處理器可以比較來自分析物分子210的樣本和拉曼活性表面的發(fā)射光譜，以便識(shí)別樣本中分析物的類型。例如，當(dāng)檢測(cè)到作為核苷酸識(shí)別的一部分的交迭的信號(hào)，信息處理系統(tǒng)可以執(zhí)行諸如減去背景信號(hào)以及“堿基識(shí)別(base-calling)”確定的過程。要理解，不同配備的計(jì)算機(jī)200可以用于某些實(shí)施。因此，在本發(fā)明的不同實(shí)施方案中，系統(tǒng)的結(jié)構(gòu)可能變化。
雖然這里公開的方法可以在被編程的處理器控制之下執(zhí)行，但是在本發(fā)明另外的實(shí)施方案中，這些過程可以全部或部分地由任何可編程或硬編碼邏輯實(shí)施，例如現(xiàn)場(chǎng)可編程門陣列(FPGA)、TTL邏輯或?qū)Ｓ眉呻娐?ASIC)。此外，所公開的方法可以由被編程的通用計(jì)算機(jī)200部件和/或定制硬盤部件的組合執(zhí)行。
跟隨著數(shù)據(jù)收集操作，通常將數(shù)據(jù)報(bào)告給數(shù)據(jù)分析操作。為了使分析操作更容易，通常將使用例如如上所述的數(shù)字計(jì)算機(jī)來分析檢測(cè)單元195所獲取的數(shù)據(jù)。通常，將針對(duì)接收和儲(chǔ)存來自檢測(cè)單元195的數(shù)據(jù)以及針對(duì)所述被收集的數(shù)據(jù)的分析和報(bào)告適當(dāng)?shù)貙?duì)計(jì)算機(jī)編程。
在本發(fā)明的某些實(shí)施方案中，可以使用定制設(shè)計(jì)軟件包來分析從檢測(cè)單元195獲取的數(shù)據(jù)。在本發(fā)明另外的實(shí)施方案中，可以使用信息處理系統(tǒng)或計(jì)算機(jī)200以及可公開獲得的軟件包執(zhí)行數(shù)據(jù)分析。可獲得的用于DNA序列分析的軟件的非限制性實(shí)施例包括PRISMTMDNA測(cè)序分析軟件(Applied Biosystems，加利福尼亞州的Foster City)、SequencherTM包(密歇根州Ann Arbor的Gene Codes)，以及可通過國家生物技術(shù)信息機(jī)構(gòu)在網(wǎng)站、www.nbif.org/links/1.4.1.php獲得的各種軟件包。
拉曼活性表面A.納米粒子、聚集體，以及膠體在本發(fā)明的某些實(shí)施方案中，拉曼活性表面由金屬納米粒子240提供，金屬納米粒子240可以單獨(dú)使用或者與其他的拉曼活性表面組合使用，用于進(jìn)一步增強(qiáng)從分析物210的少量分子獲取的拉曼信號(hào)，其他的拉曼活性表面例如具有230的金屬涂敷多孔硅基底220。在本發(fā)明的各種實(shí)施方案中，納米粒子是銀、金、鉑、銅、鋁或其他導(dǎo)電材料，盡管可以使用任何能夠提供SECARS信號(hào)的納米粒子。特別優(yōu)選由銀或金制成的粒子。
粒子或膠體表面可以具有各種形狀和尺寸。在本發(fā)明的各種實(shí)施方案中，可以使用直徑在1納米(am)和2微米(μm)之間的納米粒子。在本發(fā)明可供選擇的實(shí)施方案中，可以使用2nm到1μm、5nm到500nm、10nm到200nm、20nm到100nm、30nm到80nm、40nm到70nm或50nm到60nm直徑的納米粒子。在本發(fā)明的某些實(shí)施方案中，可以使用具有10到50nm、50到100nm或大約100nm平均直徑的納米粒子。如果與其他拉曼活性表面(例如金屬涂敷多孔硅基底)組合使用，則納米粒子的尺寸將取決于所使用的其他表面。例如，可以選擇具有230的金屬涂敷多孔硅220中的孔的直徑，以便所述納米粒子適于在這些孔里。
納米粒子在形狀上可以大致是球形的、圓柱形的、三角形的、桿狀的、帶棱的(edgy)、多面的(multi-faceted)、棱柱形的(prism)、或者有尖頭的(pointy)，盡管可以使用任何規(guī)則或不規(guī)則形狀的納米粒子。制備納米粒子的方法發(fā)是已知的(例如見No.6,054,495、6,127,120、6,149,868號(hào)美國專利；Lee和Meisel，J.Phys.Chem.863391-3395，1982)。在Jin等的“Photoinduced conversion of silver nanospheres to nanoprisms(從銀納米球到納米棱柱的光誘導(dǎo)轉(zhuǎn)化)”，Science 2941901，2001中描述了納米棱鏡。也可以從商業(yè)來源獲取納米粒子(例如Nanoprobes Inc.，Yaphank，NY；Polysciences，Inc.，Warrington，PA)膠體和聚集體在本發(fā)明的某些實(shí)施方案中，納米粒子可以是單一納米粒子240，和/或納米粒子的隨機(jī)膠體(240及離子化合物260)。納米粒子膠體通過標(biāo)準(zhǔn)技術(shù)合成，例如通過將諸如NaCl的離子化合物260添加到納米粒子240中(見Lee和Meisel，J.Phys.Chem863391(1982)；J.Hulteen等人，″Nanosphere LithographyA materials general fabrication process forperiodic particle array surfaces，(納米球光刻法用于周期粒子陣列表面的材料常規(guī)制作方法)″J.Vac.Sci.Technol.A 131553-1558(1995))。
可以利用“耗盡機(jī)制(depletion mechanism)”來誘導(dǎo)聚集體，其中，由于納米粒子從兩種緊密接近的納米粒子之間的區(qū)域耗盡，添加非吸附性納米粒子有效地導(dǎo)致了吸引電勢(shì)(見J.Chem.Phys.，110(4)2280(1999))。
在本發(fā)明其他的實(shí)施方案中，納米粒子240可以被交聯(lián)，以產(chǎn)生特定的納米粒子聚集體250，例如二聚體、三聚體、四聚體或其他聚集體。用于SECARS檢測(cè)的“熱點(diǎn)”的形成可以和特定聚集體250或納米粒子膠體(240及離子化合物260)相關(guān)聯(lián)。本發(fā)明的某些實(shí)施方案可以使用不同尺寸的聚集體或膠體的非均勻混合物(heterogeneous mixture)，而其他的實(shí)施方案可以使用納米粒子240和/或聚集體250或膠體(240及離子化合物260)的同質(zhì)群體(homogenous population)。在本發(fā)明的某些實(shí)施方案中，可以利用已知技術(shù)，例如在蔗糖梯度溶液中的超速離心來濃縮或純化包含選擇數(shù)量的納米粒子的聚集體250(二聚體、三聚體等)。在本發(fā)明的各種實(shí)施方案中，使用尺寸大約為100、200、300、400、500、600、700、800、900到100nm或更大的納米粒子聚集體250或膠體(240及離子化合物260)。在本發(fā)明的特定實(shí)施方案中，納米粒子聚集體250或膠體(240及離子化合物260)的尺寸可以在大約100nm和大約200nm之間。
交聯(lián)納米粒子形成聚集體的方法在本領(lǐng)域也是已知的(參見，例如Feldheim，″Assembly of metal nanoparticle arrays using molecular bridges，(采用分子橋的金屬納米粒子陣列集合)”The Electrochemical Society Interface，F(xiàn)all，2001，pp.22-25)。例如，金納米粒子可以被交聯(lián)，例如，采用帶有末端硫醇或巰基的雙官能連接體(linker)化合物(Feldheim，2001)。在本發(fā)明的一些實(shí)施方案中，可以利用硫醇基在兩端衍生單連接體化合物。在與金納米粒子反應(yīng)以后，所述連接體就將形成納米粒子二聚體，所述的納米粒子二聚體被所述連接體的長度所隔開。在本發(fā)明的其他實(shí)施方案中，可以使用具有三個(gè)、四個(gè)或更多個(gè)硫醇基的連接體，以便同時(shí)附著多個(gè)納米粒子(Feldheim，2001)。相對(duì)于連接體化合物使用過量納米粒子防止多交聯(lián)(multiple cross-link)形成和納米粒子沉淀。利用本領(lǐng)域已知的標(biāo)準(zhǔn)合成方法也可以形成銀納米粒子的聚集體。
在本發(fā)明的其他實(shí)施方案中，納米粒子240聚集體250或膠體(240及離子化合物260)可以被共價(jià)地附著到分析物210的分子樣本。在本發(fā)明可選的實(shí)施方案中，分析物210的分子樣本可以被直接附著到納米粒子240，或者可以被附著到連接體化合物，所述連接體化合物被共價(jià)或非共價(jià)地結(jié)合到所述的納米粒子聚集體250。
也可以使用各種已知的用于交聯(lián)納米粒子的方法將分析物210的分子附著到納米粒子或其他的拉曼活性表面。預(yù)期用來附著分析物210的分子的連接體化合物幾乎可以具有任意長度，從大約0.05、0.1、0.2、0.5、0.75、1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、27、30、35、40、45、50、55、60、65、60、80、90到100納米甚至更大的長度的范圍。本發(fā)明的某些實(shí)施方案可以使用不同長度的連接體。
在被公開的本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施方案中，當(dāng)分析物210的分子沿通道185往下運(yùn)動(dòng)時(shí)，它們可以被附著到納米粒子240，形成分子-納米粒子復(fù)合物。在本發(fā)明的某些實(shí)施方案中，可供交聯(lián)反應(yīng)發(fā)生的時(shí)間長度可能非常有限。這些實(shí)施方案可以利用具有快速反應(yīng)速度的高反應(yīng)性交聯(lián)基團(tuán)，例如環(huán)氧化物基團(tuán)、疊氮基基團(tuán)、芳基疊氮基基團(tuán)、三嗪基團(tuán)或重氮基基團(tuán)。在本發(fā)明的某些實(shí)施方案中，可以通過用例如激光的強(qiáng)光曝光使交聯(lián)基團(tuán)光活化。例如，重氮基或疊氮基化合物的光活化分別導(dǎo)致高反應(yīng)性的卡賓和氮賓部分(moiety)的形成。在本發(fā)明的某些實(shí)施方案中，可以選擇反應(yīng)性基團(tuán)以使它們只能將納米粒子240附著到分析物210而不能使納米粒子240彼此交聯(lián)。能夠結(jié)合到分析物210的反應(yīng)交聯(lián)基團(tuán)的選擇和制備在本領(lǐng)域是已知的。在本發(fā)明可選的實(shí)施方案中，分析物210自身可以被共價(jià)改性，例如利用能夠附著到金納米粒子240的巰基基團(tuán)。
在本發(fā)明其他的實(shí)施方案中，可以用衍生的硅烷，例如氨基硅烷、3-縮水甘油氧基丙基三甲氧基硅烷(GOP)或氨丙基三甲氧基硅烷(APTS)涂敷納米粒子或者其他拉曼活性表面?？梢允褂霉柰槟┒说姆磻?yīng)性基團(tuán)形成交聯(lián)的納米粒子240的聚集體。預(yù)期所使用的連接體化合物幾乎可以具有任意長度，范圍從大約0.05、0.1、0.2、0.5、0.75、1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、21、22、23、24、25、27、30、35、40、45、50、55、60、65、70、80、90到100nm甚至更大的長度變化。本發(fā)明的某些實(shí)施方案可以使用不同長度的連接體。也可以使用標(biāo)準(zhǔn)方法將這些被改性的硅烷共價(jià)地附著到分析物210。
在本發(fā)明的另一個(gè)可選的實(shí)施方案中，納米粒子在其被附著到連接體化合物之前可以被改性成包含各種反應(yīng)性基團(tuán)。在商業(yè)上可獲得經(jīng)過改性的納米粒子，例如來自Nanoprobes，Inc.(紐約州的Yaphank)的Nanogold納米粒子。可以利用每個(gè)納米粒子所附著的單個(gè)或多個(gè)馬來酰亞胺、胺或其他的基團(tuán)獲得Nanogold納米粒子。為了使在電場(chǎng)中操縱納米粒子更容易，也可以獲得帶正電或帶負(fù)電形式的Nanogold納米粒子?？梢詫⑦@種經(jīng)過改性的納米粒子附著到各種已知的連接體化合物以便提供納米粒子的二聚體、三聚體或其他的聚集體。
所使用的連接體化合物的類型不是限制性的，只要它導(dǎo)致產(chǎn)生將在溶液中不沉淀的小的納米粒子聚集體250和/或分析物。在本發(fā)明的某些實(shí)施方案中，連接體基團(tuán)可以包括苯乙炔聚合物(Feldheim，2001)。另外，連接體基團(tuán)可以包括聚四氟乙烯、聚乙烯吡咯烷酮、聚苯乙烯、聚丙烯、聚丙烯酰胺、聚乙烯或其他已知的聚合物。使用的連接體化合物不限于聚合物，而是可以包括其他類型的分子，例如硅烷、鏈烷、衍生的硅烷或衍生的鏈烷。在本發(fā)明的特定實(shí)施方案中，可以使用化學(xué)結(jié)構(gòu)相對(duì)簡單的連接體化合物，例如鏈烷或硅烷，以便避免干擾由分析物發(fā)射的拉曼信號(hào)。
另外，所使用的連接體化合物可以包含單個(gè)反應(yīng)性基團(tuán)，例如硫醇基。包含單個(gè)被附著的連接體化合物的納米粒子可以自聚集為二聚體，例如通過附著到兩個(gè)不同納米粒子的連接體化合物的非共價(jià)相互作用。例如，連接體化合物可以包括鏈烷硫醇。跟隨著將硫醇基附著到金納米粒子，鏈烷基團(tuán)傾向于通過疏水作用而締合(associate)。在本發(fā)明其他可選的實(shí)施方案中，連接體化合物可以在任一端包含不同的官能團(tuán)。例如，連接體化合物可以在一端包含巰基，以便允許附著到金納米粒子，并且在另一端包含不同的反應(yīng)性基團(tuán)，以便允許附著到其他的連接體化合物。在本領(lǐng)域已知很多這樣的反應(yīng)性基團(tuán)，并且它們可以在本方法和裝置中使用。
在本發(fā)明其他的實(shí)施方案中，分析物210可以與納米粒子240的表面緊密締合，或者可以非常接近納米粒子240(在大約0.2到1.0nm之間)。如這里所使用的，術(shù)語“與……緊密締合”指被附著(共價(jià)或非共價(jià))或吸附在拉曼活性表面上的分析物分子樣本。本領(lǐng)域的熟練技術(shù)人員將認(rèn)識(shí)到，為了通過SECARS產(chǎn)生表面增強(qiáng)拉曼信號(hào)，不要求分析物210的分子樣本共價(jià)附著到納米粒子240。
b.金屬涂敷和非金屬涂敷的納米晶體和/或多孔硅在本領(lǐng)域已知各種產(chǎn)生粗糙或高表面面積表面的方法，例如納米晶體硅(例如Petrova-Koch等人，″Rapid-thermal-oxidized porous silicon-the superior photoluminescent Si，(快速熱氧化的多孔硅——優(yōu)良的光致發(fā)光硅)″Appl.Phys.Lett.61943，1992；Edelberg等人，″Visible luminescence from nanocrystalline silicon films produced by plasma enhancedchemical vapor deposition，(來自由等離子增強(qiáng)化學(xué)汽相沉積制備的納米晶體硅膜的可見光發(fā)光)″Appl.Phys.Lett.，681415-1417，1996；Schoenfeld等人，″Formation of Si quantumdots in nanocrystalline silicon，(在納米晶體硅中硅量子點(diǎn)的形成)″Proc.7th Int.Conf.onModulated Semiconductor Structures，Madrid(第七屆調(diào)制半導(dǎo)體結(jié)構(gòu)國際會(huì)議(馬德里)論文集)，pp.605-608，1995；Zhao等人，″Nanocrystalline Sia material constructed by Siquantum dots，(納米晶體硅由硅量子點(diǎn)構(gòu)建的材料)″lst Int.Con，on Low DimensionalStructures and Devices，Singapore(第一屆低維結(jié)構(gòu)和器件國際會(huì)議(新加坡))，pp.467-471，1995；Lutzen等人，″Structural characteristics of ultrathin nanocrystalline silicon films formedby annealing amorphous silicon(由退火非晶硅形成的超薄納米晶體硅膜的結(jié)構(gòu)特征)″，J.Vac.Sci.Technology B 162802-05，1998；No.5,770,022、5,994,164、6,268,041、6,294,442、6,300,193號(hào)美國專利)。這里所公開的方法和裝置不受產(chǎn)生粗糙或高表面面積基底的方法限制，并且預(yù)期可以使用任何已知的方法。
例如，產(chǎn)生納米晶體硅的方法包括但不限于硅(Si)注入富硅氧化物并退火；利用金屬成核催化劑的固相結(jié)晶化；化學(xué)汽相沉積；PECVD(等離子增強(qiáng)化學(xué)氣相沉積)；氣體蒸發(fā)；氣相熱解；氣相光熱解(photopyrolysis)；電化學(xué)刻蝕；硅烷和聚硅烷的等離子分解；高壓液相還原-氧化反應(yīng)；非晶硅層的快速退火；使用LPCVD(低壓化學(xué)汽相沉積)沉積非晶硅層，跟著是RTA(快速熱退火)周期；使用硅陽極的等離子電弧沉積和硅的激光燒蝕(laser ablation)(No.5,770,022、5,994,164、6,268,041、6,294,442、6,300,193號(hào)美國專利)。依賴于工藝，從1到100nm或更大的任何尺寸的Si晶體可以作為芯片上的薄層、單獨(dú)的層和/或聚集的晶體來被形成。在本發(fā)明的某些實(shí)施方案中，可以使用包括附著到基底層220的納米晶體硅的薄層。
但是，針對(duì)起始材料的組成，這些實(shí)施方案不受限制，并且，在本發(fā)明可選的實(shí)施方案中，預(yù)期可以利用其他的材料，唯一的要求是材料必須能夠形成可用拉曼敏感金屬涂敷的基底220或270，如圖2中舉例說明的那樣。
在本發(fā)明的某些實(shí)施方案中，例如為了優(yōu)化金屬涂敷的多孔硅(具有230的220)的等離激元共振頻率，可以選擇硅晶體的尺寸和/或形狀和/或多孔硅中的孔尺寸處于預(yù)先確定的限度以內(nèi)(例如見No..6,344,272號(hào)美國專利)。通過控制涂敷多孔硅220的金屬層230的厚度，也可以調(diào)整等離激元共振頻率(No.6,344,272號(hào)美國專利)。用于控制納米規(guī)模硅晶體的技術(shù)是已知的(例如No.5,994,164和6,294,442號(hào)美國專利)。
1.多孔硅如上面所討論的那樣，粗糙表面基底220不限于純硅，而是也可以包括氮化硅、鍺和/或其他已知的用于芯片制造的材料。也可以存在其他的少量材料，例如金屬成核催化劑和/或摻雜劑。唯一的要求是基底材料必須能夠形成可用拉曼敏感金屬或其他的導(dǎo)電或半導(dǎo)體材料230或280涂敷的基底220或270，如圖2中舉例說明的那樣。多孔硅具有高達(dá)783m2/cm3的大表面積，為表面增強(qiáng)拉曼光譜學(xué)技術(shù)提供了非常大的表面。
如本領(lǐng)域已知的那樣，可以通過在電化學(xué)池(electrochemical cell)中利用稀釋的氫氟酸(HF)刻蝕硅基底產(chǎn)生多孔硅220。在某些情況下，最初可以以低電流密度在HF中刻蝕硅。在形成初始孔以后，可以從電化學(xué)池中將硅除去并在非常稀的HF中刻蝕，以便加寬在電化學(xué)池中形成的孔。硅基底的組成也將影響孔尺寸，取決于硅是否被摻雜、摻雜劑的類型以及摻雜程度。摻雜對(duì)硅孔尺寸的影響在本領(lǐng)域是已知的。對(duì)于本發(fā)明的涉及檢測(cè)和/或識(shí)別大生物分子的實(shí)施方案，可以選擇大約2nm到100nm或200nm的孔尺寸。在本發(fā)明的特定實(shí)施方案中，還可以選擇多孔硅中孔的取向。例如，被刻蝕的1，0，0晶體結(jié)構(gòu)將具有取向垂直于晶體的孔，而1，1，1或1，1，0晶體結(jié)構(gòu)將具有對(duì)角取向沿著晶軸的孔。晶體結(jié)構(gòu)對(duì)孔取向的影響在本領(lǐng)域也是已知的。為了增強(qiáng)拉曼信號(hào)并降低背景噪聲，晶體組成和孔隙性也可以被調(diào)節(jié)，以便改變多孔硅的光學(xué)性質(zhì)。多孔硅的光學(xué)性質(zhì)在本領(lǐng)域是公知的(例如Cullis等人，J.Appl.Phys.82909-965，1997；Collins等人，Physics Today 5024-31，1997)。
在本發(fā)明的各種實(shí)施方案中，通過用例如聚甲基丙烯酸甲酯的任何已知的抗蝕劑化合物涂敷，可以保護(hù)硅晶片的一些部分免受HF刻蝕。使用例如光刻法的平版印刷方法將硅晶片的一些被選擇的部分暴露給HF刻蝕在本領(lǐng)域是公知的。為了控制用被用于拉曼光譜學(xué)的多孔Si腔的尺寸和形狀，選擇性刻蝕可能是有用的。在本發(fā)明的某些實(shí)施方案中，可以使用直徑大約是1μm(微米)的多孔硅腔。在本發(fā)明的其他實(shí)施方案中，可以使用寬度大約是1μm的多孔硅溝槽或通道。多孔硅腔的尺寸不是限制性的，并且預(yù)期可以使用任何尺寸或形狀的多孔硅腔。例如，對(duì)于尺寸為1μm的激發(fā)激光，1μm的腔尺寸可能是有用的。
上面公開的示范性方法對(duì)于產(chǎn)生多孔硅基底220不是限制性的，并且預(yù)期可以使用任何本領(lǐng)域已知的方法。用于制作多孔硅基底220的方法的非限制性實(shí)施例包括硅晶片或柵網(wǎng)(mesh)的陽極浸蝕；電鍍；以及沉積含硅/氧的材料，跟著是受控退火(例如Canham，″Silicon quantum wire array fabrication by electrochemical and chemical dissolution of wafers，(通過晶片的電化學(xué)和化學(xué)溶解制造硅量子線陣列)″Appl.Phys.Lett.571046，1990；No.5,561,304、6,153,489、6,171,945、6,322,895、6,358,613、6,358,815、6,359,276號(hào)美國專利)。在本發(fā)明的各種實(shí)施方案中，多孔硅層220可以被附著到一個(gè)或更多個(gè)支撐層，例如本體硅、石英、玻璃和/或塑料。在某些實(shí)施方案中，可以使用例如氮化硅的刻蝕停止層控制刻蝕的深度。
在本發(fā)明某些可選的實(shí)施方案中，預(yù)期在金屬涂敷230之前或之后，可以對(duì)多孔硅基底220進(jìn)行額外的改性。例如，在刻蝕以后，多孔硅基底220可以被使用本領(lǐng)域已知的方法氧化為氧化硅和/或二氧化硅。例如可以使用氧化來提高多孔硅基底220的機(jī)械強(qiáng)度和穩(wěn)定性?；蛘?，具有230的金屬涂敷的硅基底220可以受到進(jìn)一步的刻蝕，以便除去硅材料，剩下可以保持中空或者可以用其他材料填充的金屬殼，所述其他材料例如額外的拉曼活性材料。
2.硅基底的金屬涂敷可以通過本領(lǐng)域已知的任何方法，利用例如金、銀、鉑、銅或鋁的拉曼活性材料涂敷硅基底220或270。非限制性的示例性方法包括電鍍；陰極電遷移；金屬蒸發(fā)和濺射；使用籽晶來催化鍍覆(plating)(例如使用銅/鎳籽晶來鍍覆金)；離子注入；擴(kuò)散；或本領(lǐng)域已知的任何其他用于在硅基底220或270上鍍覆薄金屬層的方法。(例如見Lopez和Fauchet，″Erbium emission form porous silicon one-dimensional photonic band gap structures，(鉺發(fā)射形成多孔硅一維光子帶隙結(jié)構(gòu))″Appl.Phys.Lett.773704-6，2000；No.5,561,304、6,171,945、6,359,276號(hào)美國專利。)金屬涂敷的另一種非限制性實(shí)施例包括無電鍍鍍覆(例如Gole等人，″Patterned metallization of porous silicon from electroless solution for directelectrical contact，(用于直接電接觸體的由無電鍍?nèi)芤哼M(jìn)行的多孔硅圖案化敷金屬法)″J.Electrochem.Soc.1473785，2000)。可以控制金屬層的組成和/或厚度以便優(yōu)化具有230的金屬涂敷的硅220或具有280的金屬涂敷的硅270的等離激元共振頻率。
在本發(fā)明可選的實(shí)施方案中，用于分析物檢測(cè)的拉曼活性表面可以包括被選擇的不同類型的拉曼活性表面的組合，例如金屬涂敷、納米晶體、多孔硅基底與金屬涂敷的納米晶體、多孔硅納米粒子的固定化膠體(immobilized colloid)的組合。這種組成將具有非常高的拉曼活性金屬表面面積，對(duì)于在溶液中的分析物具有相對(duì)較小的通道。盡管這對(duì)于例如大蛋白質(zhì)或核酸的大的分析物分子不那么有利，但是它可以對(duì)小分子分析物(例如單個(gè)核苷或氨基酸)提供更好的靈敏度和檢測(cè)。
流動(dòng)路徑，通道以及微型機(jī)電系統(tǒng)(MEMS)如在圖1中舉例說明的那樣，在本發(fā)明的某些實(shí)施方案中，分析物210的分子樣本被沿著例如微流體通道、納米通道或微米通道185和/或樣本室175的流動(dòng)路徑或通道向下移動(dòng)，并經(jīng)過裝置的檢測(cè)單元195。根據(jù)這些實(shí)施方案，拉曼活性表面和分析物可以被合并到更大的裝置和/或系統(tǒng)中。在某些實(shí)施方案中，拉曼活性表面可以被合并到微型機(jī)電系統(tǒng)中(MEMS)。
MEMS是集成系統(tǒng)，包括機(jī)械元件、傳感器、致動(dòng)器以及電子裝置。所有那些部件可以通過已知的微制造技術(shù)在公共芯片(common chip)上制造，所述公共芯片包括硅基的或等效的襯底(例如Voldman等人，Ann.Rev.Biomed.Eng.1401-425，1999)。可以使用MEMS的傳感器部件來測(cè)量機(jī)械、熱學(xué)、生物學(xué)、化學(xué)、光學(xué)和/或磁現(xiàn)象。電子裝置可以處理來自傳感器的信息并控制致動(dòng)器部件，例如泵、閥、加熱器、冷卻器、過濾器，等等，從而控制MEMS的功能。
a.集成芯片制造可替換地，在本發(fā)明的某些實(shí)施方案中，使用已知的芯片制造方法，可以合并具有230的金屬涂敷的多孔硅層220或具有280的非多孔硅層270，作為MEMS半導(dǎo)體芯片的樣本室的主要部分。在可選的實(shí)施方案中，具有230的金屬涂敷的多孔硅220腔可以被從硅晶片分割出，并被合并到在芯片和/或其他器件中。
此外，可以使用集成電路(IC)工藝(例如CMOS、雙極型或BICMOS工藝)制造MEMS的電子部件?？梢允褂靡阎挠糜谟?jì)算機(jī)芯片制造的光刻和刻蝕方法對(duì)它們進(jìn)行圖案化?？梢允褂孟嗳莸摹帮@微機(jī)械加工”工藝制造微機(jī)械部件，所述“顯微機(jī)械加工”工藝選擇性地刻蝕掉硅晶片的一些部分或者添加新的結(jié)構(gòu)層，以便形成機(jī)械和/或機(jī)電部件。MEMS制造中的基本技術(shù)包括在襯底上沉積材料薄膜、利用光刻成像或其他已知的平版印刷方法，在所述膜的頂部施加被圖案化的掩模，以及，選擇性地刻蝕所述膜。薄膜可以具有在幾納米到100微米范圍內(nèi)的厚度。使用的沉積技術(shù)可以包括化學(xué)過程，例如化學(xué)汽相沉積(CVD)、電沉積、外延(epitaxy)和熱氧化，以及物理過程，像物理汽相沉積(PVD)和鑄造。針對(duì)本發(fā)明的某些實(shí)施方案可以使用制造納米機(jī)電系統(tǒng)的方法。(參見，例如Craighead，Science 2901532-36，2000)b.微流體通道和微米通道在本發(fā)明的一些實(shí)施方案中，拉曼活性表面可以連接到各種填充了流體的分隔間(compartment)，例如微流體通道、納米通道和/或微米通道。裝置的這些以及其他部件可以作為單個(gè)單元形成，例如以半導(dǎo)體芯片和/或微毛細(xì)管或微流體芯片中已知的芯片的形式?；蛘撸钚员砻婵梢詮墓杈谱?，并被附著到裝置的其他部件。在所公開的裝置中可以使用任何已知的供在這種芯片中使用的材料，包括硅、二氧化硅、氮化硅、聚二甲基硅氧烷(PDMS)、聚甲基丙烯酸甲酯(PMMA)、塑料、玻璃、石英，等等。
在本發(fā)明的某些實(shí)施方案中，預(yù)期通道185將具有在大約3nm和大約1μm之間的直徑。在本發(fā)明的特定實(shí)施方案中，可以選擇通道185的直徑在尺寸上略微小于激發(fā)激光束。在計(jì)算機(jī)芯片制造和/或微毛細(xì)管芯片制造領(lǐng)域，用于芯片的批量制造的技術(shù)是公知的。可以通過技術(shù)上已知的任何方法制造這些芯片，例如通過光刻和刻蝕、激光燒蝕、噴射模塑、鑄造、分子束外延、蘸水筆式納米光刻法(dip-pen nanolithography)、CVD制造、電子束或聚焦離子束技術(shù)或壓印(imprinting)技術(shù)。非限制性實(shí)施例包括利用可流動(dòng)、光學(xué)上透明的材料的常規(guī)模塑，所述材料例如塑料或玻璃；二氧化硅的光刻和干法刻蝕；使用聚甲基丙烯酸甲酯抗蝕劑圖案化二氧化硅基底上的鋁掩模的電子束光刻，跟著是反應(yīng)離子刻蝕；針對(duì)本發(fā)明的某些實(shí)施方案可以使用用于制造納米機(jī)電系統(tǒng)的方法(參見，例如Craighead，Science 2901532-36，2000)。在商業(yè)上可從例如Caliper Technologies Inc.(加利福尼亞州的Mountain View)以及ACLARA BioSciences Inc.(加利福尼亞州的MountainView)的來源獲得各種形式的微制造芯片。
對(duì)于可以被暴露給例如蛋白質(zhì)、肽、核酸、核苷酸等的各種單個(gè)生物分子的填充了流體的分隔間，可以通過涂敷對(duì)被暴露給這些分子的表面進(jìn)行改性，例如將表面從疏水的轉(zhuǎn)換為親水的表面和/或降低分子對(duì)表面的吸附。例如玻璃、硅、石英和/或PDMS的常見芯片材料的表面改性在本領(lǐng)域是已知的(例如No.6,263,286號(hào)美國專利)。這些改性可以包括但不限于用商業(yè)上可獲得的毛細(xì)管涂料(capillary coatings)(賓夕法尼亞州Bellafonte的Supelco)、帶有各種官能團(tuán)(例如聚乙烯氧化物或丙烯酰胺)的硅烷或者任何其他本領(lǐng)域已知的涂料來涂敷。
為了使分析物210檢測(cè)更容易，本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施方案包括對(duì)于處在所使用的激發(fā)和發(fā)射頻率的電磁輻射是透明的材料?？梢允褂貌Ａ?、硅、石英或任何其他的在用于拉曼光譜學(xué)的頻率范圍內(nèi)一般是透明的材料。在一些實(shí)施方案中，納米通道或微米通道185可以由和用于使用噴射模塑或其他已知的技術(shù)制造加載腔180的相同的材料制造。對(duì)于樣本室，任何幾何構(gòu)形、形狀和尺寸是可能的，因?yàn)榭梢院雎曰蛘哐a(bǔ)償由這個(gè)部件所導(dǎo)致的任何折射。排列最好是使得來自透鏡160的會(huì)聚光束中的所有光線放射狀地通過光學(xué)上可透射的樣本室175，從而不經(jīng)受折射。光學(xué)上可透射的樣本室175和通道185可以是微流體器件的一部分，微流體器件例如在Keir等人，Anal.Chem.741503-1508(2002)中公開的那種。
在例如Jacobsen等人(Anal.Biochem，209278-283，1994)；Effenhauser等人(Anal.Chem.662949-2953，1994)；Harrison等人(Science 261895-897，1993)以及No.5,904,824號(hào)美國專利中已經(jīng)討論了微流體器件的微制造，包括微毛細(xì)管電泳器件的微制造。
c.納米通道通過已知的方法可以制備更小直徑的通道，例如納米通道185，所述已知的方法包括但不限于涂敷微米通道185的內(nèi)部以便縮小直徑，或者使用納米光刻法(nanolithography)、聚焦電子束、聚焦離子束或聚焦原子激光技術(shù)。
納米通道185的制造可以利用本領(lǐng)域已知的任何用于納米規(guī)模制造的技術(shù)。下列技術(shù)僅僅是示范性的。例如，可以使用高吞吐量(high-throughput)電子束光刻系統(tǒng)(可在http://www.mdatechnology.net/techsearch.asp？articleid＝510處獲得)制造納米通道185。可以使用電子束光刻技術(shù)在硅芯片上寫小到5nm的特征?？梢圆皇褂醚谀６鴪D案化涂敷在硅表面上的例如聚甲基丙烯酸甲酯的靈敏抗蝕劑(sensitive resist)。電子束陣列可以將場(chǎng)發(fā)射集群與微米通道放大器進(jìn)行組合，以便提高電子束的穩(wěn)定性，允許在低電流下工作。在本發(fā)明的某些實(shí)施方案中，SoftMaskTM計(jì)算機(jī)控制系統(tǒng)可以用來控制在硅或其他芯片上的納米規(guī)模特征的電子束光刻。
在本發(fā)明可選的實(shí)施方案中，可以使用聚焦原子激光產(chǎn)生納米通道185(例如Bloch等人，″Optics with an atom laser beam，(帶有原子激光束的光學(xué)裝置)″Phys.Rev.Lett.87123-321，2001)。聚焦原子激光可被用于光刻，和標(biāo)準(zhǔn)激光或聚焦電子束非常類似。這些技術(shù)能夠在芯片上產(chǎn)生微米規(guī)模或者甚至納米規(guī)模的結(jié)構(gòu)。在本發(fā)明另外的可選實(shí)施方案中，可以使用蘸水筆式納米光刻法來形成納米通道103(例如Ivanisevic等人，Dip-PenNanolithography on Semiconductor Surfaces，(在半導(dǎo)體表面上的蘸水筆式納米光刻法)″J.Am.Chem.Soc.，1237887-7889，2001)。蘸水筆式納米光刻法使用原子力顯微技術(shù)在例如硅芯片的表面上沉積分子?？梢杂?0nm的空間分辨率形成尺寸小至15nm的特征?？梢酝ㄟ^組合使用蘸水筆式納米光刻法和常規(guī)的光刻技術(shù)形成納米規(guī)模的通道185。例如，通過標(biāo)準(zhǔn)光刻法可以在抗蝕劑層中形成微米規(guī)模的線。使用蘸水筆式納米光刻法，通過在所述抗蝕劑的邊緣上沉積額外的抗蝕劑化合物，可以使得所述線的寬度(以及刻蝕以后通道185的對(duì)應(yīng)直徑)變窄。在刻蝕了更細(xì)的線以后，可以形成納米規(guī)模的通道185?？商鎿Q地，可以使用原子力顯微技術(shù)去除光致抗蝕劑以便形成納米規(guī)模的特征。
在本發(fā)明另外的可選實(shí)施方案中，可以使用離子束光刻法在芯片上生成納米通道185(例如Siegel，″Ion Beam Lithography，(離子束光刻法)″VLSI Electronics，MicrostructureScience(VLSI電子學(xué)，微結(jié)構(gòu)科學(xué))，Vol.16，Einspruch和Watts編，Academic Press，New York，1987)。無需使用掩模，可以使用精細(xì)聚焦的離子束在抗蝕劑層上直接寫特征，例如納米通道185。可替換地，寬離子束可以與掩模組合使用，以便形成規(guī)模上小至100nm的特征。使用化學(xué)刻蝕，例如利用氫氟酸，將被曝光的未受抗蝕劑保護(hù)的硅除去。熟練技術(shù)人員將發(fā)現(xiàn)，上面所公開的技術(shù)不是限制性的，并且可以利用本領(lǐng)于已知的任何方法形成納米通道185。
可以很容易地使得這些技術(shù)適合在所公開的方法和裝置中使用。在本發(fā)明的一些實(shí)施方案中，可以使用本領(lǐng)域已知的技術(shù)，由和被用于制造加載腔(loading chamber)180的相同的材料制造微毛細(xì)管。
在本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施方案中，由例如硅基材料的適當(dāng)?shù)亩栊圆牧现瞥傻木o湊的微流體器件被壓印，以便要被分析的分子樣本和拉曼活性表面可以被制造或輸送到樣本室中。玻璃窗提供了聚焦激光斑的觀察窗(view)，并且封閉溶液與周圍環(huán)境隔開，這對(duì)于對(duì)空氣敏感的分子很重要。所述的室可以具有用惰性氣體吹掃溶液的口(port)。此外，所述的室可以具有如下尺寸的口所述尺寸允許包含要被測(cè)試的分析物的樣本以及拉曼活性納米粒子、聚集體和膠體流入所述的池，彼此相互接觸并流出所述的室，從而允許樣本在測(cè)試期間被恒定地補(bǔ)充，這確保了最大的靈敏度。
d.流動(dòng)路徑在本發(fā)明的某些實(shí)施方案中，可以利用本領(lǐng)于已知的任何方法，例如微流體、納米流體、流體聚焦(hydrodynamic focusing)或電滲透，操縱納米粒子240進(jìn)入微流體通道、納米通道或微米通道185。例如，在本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施方案中，要被檢測(cè)的分析物210和/或納米粒子、聚集體或膠體可以通過加載腔180引入，并利用溶劑的總體流動(dòng)向下向樣本室175和/或微流體通道、納米通道和/或微米通道185移動(dòng)。在本發(fā)明的其他實(shí)施方案中，可以使用微毛細(xì)管電泳向下輸送分析物210到樣本室175和/或微流體通道、納米通道和/或微米通道185。微毛細(xì)管電泳通常涉及使用可以填充或未填充特定分離介質(zhì)的細(xì)毛細(xì)管或通道。響應(yīng)被施加的電場(chǎng)，例如在檢測(cè)單元一側(cè)為正而相反一側(cè)為負(fù)，發(fā)生適當(dāng)帶電的分子種類的電泳，例如帶負(fù)電的分析物210的電泳。盡管電泳經(jīng)常用于被同時(shí)添加到微毛細(xì)管的組分的混合物的顆粒離析，但是它也能被用來輸送尺寸類似的分析物210。因?yàn)槟承┓治鑫?10比其他一些更大，因此將遷移得更慢，所以樣本室175和/或流動(dòng)路徑185的長度以及對(duì)應(yīng)的通過檢測(cè)單元195的穿越時(shí)間可以被保持最小，以便在檢測(cè)或識(shí)別不同類型的分析物時(shí)防止有差別的遷移而不使分析物210的順序混亂?？商鎿Q地，也可以選擇填充微毛細(xì)管的分離介質(zhì)，以使分析物210的沿樣本室175和/或流動(dòng)路徑185向下的遷移速率類似或者相同。微毛細(xì)管電泳方法已經(jīng)由例如Woolley和Mathies(Proc.Natl.Acad.Sci.USA 9111348-352，1994)公開過。
在本發(fā)明的一些實(shí)施方案中，通過使用電勢(shì)梯度(electrical gradient)，使用帶電的連接體化合物或者帶電的納米粒子240可以使操縱納米粒子240更容易一些。在本發(fā)明的其他實(shí)施方案中，樣本室175和/或流動(dòng)路徑185可以包含具有相對(duì)較高粘度的水溶液，例如甘油溶液。這種高粘度的溶液可以起到降低流動(dòng)速度并提高例如可用于將分析物210交聯(lián)到納米粒子240的反應(yīng)時(shí)間的作用。在本發(fā)明其他的實(shí)施方案中，樣本室175和/或流動(dòng)路徑185可以包含非水溶液，包括但不限于有機(jī)溶劑。
可以通過各種方式將要被分析的分析物的樣本和金屬微?；蚰z體表面?zhèn)鬟f到樣本室。例如，金屬微?；蚰z體表面能夠被傳遞到要被分析的分子樣本，要被分析的分子樣本可以被傳遞到金屬微?；蚰z體表面，或者要被分析的分子和金屬微?；蚰z體表面可以被同時(shí)傳遞。如圖1和圖2中所示，可以利用泵送樣本或以其他方式允許樣本通過通道185流入樣本室的設(shè)備自動(dòng)地傳遞要被分析的分子樣本和/或金屬微粒或膠體表面。這樣的設(shè)備包括線性微流體器件。在另一個(gè)實(shí)施方案中，可以通過利用試管、移液管或其他的這種手工傳遞設(shè)備，將一滴或幾滴樣本溶液直接放入樣本室中，手工地傳遞要被分析的分子的樣本和/或金屬微?；蚰z體表面。其他的輸送分析物分子樣本和拉曼活性表面的方法也是可能的。當(dāng)分析物的分子樣本通過樣本室175流動(dòng)時(shí)，輸出反斯托克斯束190被更改/改變，這在測(cè)試期間被持續(xù)地監(jiān)測(cè)。
從這些圖很清楚，SECARS設(shè)備的光學(xué)儀器用來將拉曼活性表面引入到要被利用CARS類型的設(shè)備檢測(cè)和/或識(shí)別的分析物(SERS)附近。作為線性微流體器件的一部分，可以用各種方式組合納米粒子、聚集體或膠體和要被分析的分析物。這些包括a)將分析物的分子樣本附著或吸附隨后流入樣本室的納米粒子、聚集體或膠體；b)將分析物的分子樣本流入樣本室，所述樣本室具有被固定化在所述樣本室內(nèi)的納米粒子、聚集體或膠體；或c)將納米粒子、聚集體或膠體和分析物的分子樣本流經(jīng)具有分叉的微流體通道的器件，所述器件將流入的納米粒子、聚集體或膠體和流入的分析物的分子樣本混和，并且一旦納米粒子、聚集體或膠體被與分析物的分子樣本完全混和，則允許進(jìn)行光學(xué)測(cè)量。
預(yù)期了幾種不同的實(shí)施方案，用于在微米規(guī)模上實(shí)現(xiàn)這種技術(shù)，包括但不限于使用各種波長、波導(dǎo)、光耦/泵浦束的選擇，等等，以便實(shí)現(xiàn)精確的發(fā)射取向，所述精確的發(fā)射取向允許檢測(cè)和識(shí)別僅少量分析物分子的樣本。如上所述，必須選擇拉曼光的兩個(gè)單獨(dú)的波長與目標(biāo)分析物的振動(dòng)能級(jí)對(duì)應(yīng)，并取高方向性輸出的方向。例如，為了在735cm-1探測(cè)腺嘌呤環(huán)呼吸模式，激發(fā)光可以被調(diào)諧到785nm并且斯托克斯光可以被調(diào)諧到833nm，以使它們的能級(jí)差和735cm-1的振動(dòng)能級(jí)匹配。
拉曼標(biāo)記本發(fā)明的某些實(shí)施方案涉及將標(biāo)記附著一個(gè)或更多個(gè)分析物210的分子，以使通過拉曼檢測(cè)單元195對(duì)它們的測(cè)量更容易?？捎糜诶庾V學(xué)的標(biāo)記的非限制性實(shí)施例包括TRIT(四甲基羅丹明異硫醇(tetramethyl rhodamine isothiol))、NBD(7-硝基苯-2-氧-1，3-二唑(7-nitrobenz-2-oxa-1，3-diazole))、德克薩斯紅色染料(Texas Red dye)、鄰苯二甲酸、對(duì)苯二酸、間苯二酸、甲酚紫(Cresyl fast violet)、甲酚藍(lán)紫(cresyl blue violet)、亮甲酚藍(lán)(brilliant cresy blue)、對(duì)氨基苯甲酸、赤蘚紅、生物素、洋地黃毒苷、5-羧基-4′，5′-二氯-2′，7′-二甲氧基-熒光素、5-羧基-2′，4′，5′，7′-四氯熒光素、5-羧基熒光素、5-羧基羅丹明、6-羧基羅丹明，6-羧基四甲基氨基酞菁素、偶氮甲堿、菁藍(lán)、黃嘌呤、琥珀酰熒光素(succinylfluoresceins)、氨基吖啶、量子點(diǎn)、碳納米管、富勒烯(fullerenes)、有機(jī)氰化物(例如異氰化物)，等等?？梢詮纳虡I(yè)來源獲得這些以及其他拉曼標(biāo)記(例如俄勒岡州尤金的Molecular Probes，；俄勒岡州圣路易斯的Sigma Aldrich Chemical Co.)，和/或通過本領(lǐng)域已知的方法合成(參見Chem.Commun.，724(2003))。
多環(huán)芳香化合物可以起到拉曼標(biāo)記的作用，這在本領(lǐng)域是已知的。其他可用于本發(fā)明的特定實(shí)施方案的標(biāo)記包括氰化物、硫醇、氯、溴、甲基、磷和硫。在本發(fā)明的某些實(shí)施方案中，碳納米管可以用作拉曼標(biāo)記。在拉曼光譜學(xué)中標(biāo)記的使用是已知的(例如No.5,306,403和6,174,677號(hào)美國專利)。本領(lǐng)域的熟練技術(shù)人員將發(fā)現(xiàn)所使用的拉曼標(biāo)記應(yīng)該產(chǎn)生可辨識(shí)的拉曼光譜，并且可以特定地與不同類型的分析物210結(jié)合或締合。
標(biāo)記可以直接附著分析物210的分子，或者可以通過各種連接體化合物被附著。下面進(jìn)一步描述在所公開的方法中使用的交聯(lián)試劑和連接體化合物?？商鎿Q地，可以從商業(yè)來源獲得共價(jià)地附著拉曼標(biāo)記的分子(例如印地安那州印第安納波利斯的Roche MolecularBiochemicals；威斯康星州麥迪遜的Promega Corp.；德克薩斯州奧斯汀的Ambion，Inc.；新澤西皮斯卡塔韋的Amersham Pharmacia Biotech)。在商業(yè)上可獲得包含被設(shè)計(jì)成與其他分子(例如核苷酸)共價(jià)反應(yīng)的反應(yīng)性基團(tuán)的拉曼標(biāo)記(例如俄勒岡州尤金的MolecularProbes)。制備被標(biāo)記的分析物的方法是已知的(例如No.4,962,037、5,405,747、6,136,543、6,210,896號(hào)美國專利)。
在本發(fā)明的增強(qiáng)之后存在兩種主要的理論，但是沒有一個(gè)被很好地理解，而且對(duì)本發(fā)明的描述也不重要。
從前面的描述將理解，本發(fā)明的傳感器的響應(yīng)時(shí)間和本發(fā)明的方法只受到不同的檢測(cè)設(shè)備及其相關(guān)聯(lián)的采樣和計(jì)算電路特性的限制。商業(yè)上可獲得的集成前置放大器提供了幾皮秒范圍內(nèi)的響應(yīng)時(shí)間。這些超快的響應(yīng)時(shí)間使得監(jiān)測(cè)初始的瞬態(tài)過程以及在測(cè)試或分析期間可能發(fā)生的其他轉(zhuǎn)換成為可能，并且也允許進(jìn)行快速的校準(zhǔn)檢測(cè)。本發(fā)明使得在比樣本的有關(guān)成分和金屬或半導(dǎo)體微?；蚰z體表面之間完成化學(xué)結(jié)合所花費(fèi)的時(shí)間還要短的時(shí)間量程上確定期望的反射率特性成為可能。
本發(fā)明的高分辨率、快速反應(yīng)時(shí)間以及緊湊的設(shè)計(jì)允許本發(fā)明的方法和設(shè)備被用于許多生物學(xué)的、生物化學(xué)的和化學(xué)的應(yīng)用，在這些應(yīng)用中檢測(cè)和識(shí)別少量的特定分析物的分子是有用的。這些設(shè)備和方法的一個(gè)特別的應(yīng)用是通過檢測(cè)和識(shí)別少量被標(biāo)記和未被標(biāo)記的核苷酸分子對(duì)聚合物進(jìn)行測(cè)序，所述的聚合物例如單鏈核酸，像DNA或RNA，所述核苷酸分子被從核酸鏈順序地切割。例如，核苷酸和金屬粒子都可以通過微米通道中的水/緩沖液引入微型化的樣本室供檢測(cè)。
提供了下面的實(shí)施例，用于進(jìn)一步說明本發(fā)明的特定方面和實(shí)踐。這些實(shí)施例描述了本發(fā)明的特定實(shí)施方案，但是不要被理解為對(duì)本發(fā)明的范圍或者所附權(quán)利要求的限制。
實(shí)施例1SECARS設(shè)置1
這種設(shè)置包括兩個(gè)激光器一個(gè)激光器即泵浦激光器，發(fā)射泵浦束，而另一個(gè)激光器即斯托克斯激光器，發(fā)射斯托克斯束。泵浦激光器以76MHz重復(fù)頻率產(chǎn)生10nJ的脈沖，具有1皮秒的脈沖寬度。斯托克斯激光器以76MHz重復(fù)頻率產(chǎn)生6nJ的脈沖，具有1皮秒的脈沖寬度。泵浦和斯托克斯激光器通過和電子控制器連接(來自Coherent的SynchroLock AP)同步工作，所述電子控制器同步兩個(gè)激光器產(chǎn)生的輸出脈沖的定時(shí)(timing)。來自Coherent(加利福尼亞州Santa Clara)的兩個(gè)鈦藍(lán)寶石激光器提供泵浦和斯托克斯束。這兩個(gè)束利用由Chroma(佛蒙特州Brattleboro)制造的分色鏡在空間上交迭。這些束被調(diào)諧到特定波長，以便這兩個(gè)束的能級(jí)差和目標(biāo)分析物的某個(gè)振動(dòng)能級(jí)匹配。這些束通過顯微物鏡(蔡司)傳遞到微流體通道的檢測(cè)窗區(qū)域上。
反應(yīng)腔、微流體通道和微米通道的制備Borofloat玻璃晶片(加利福尼亞州Santa Ana的Precision Glass&Optics)在濃縮的HF(氫氟酸)中預(yù)先刻蝕一短時(shí)間段，并在等離子增強(qiáng)化學(xué)汽相沉積(PECVD)系統(tǒng)(PEII-A，加利福尼亞州San Jose的Technics West)中沉積無定形硅犧牲層之前被清潔。用六甲基二硅氮烷(HMDS)給晶片打底，用光致抗蝕劑(馬薩諸塞Marlborough的Shipley1818)旋涂并軟烘(soft-baked)。使用接觸掩模對(duì)準(zhǔn)器(mask aligner)(加利福尼亞州San Jose的Quintel Corp.)，利用一個(gè)或更多個(gè)掩模設(shè)計(jì)來曝光所述光致抗蝕劑層，并且使用Microposit顯影劑濃縮液(Shipley)和水的混合物除去被曝光的光致抗蝕劑。經(jīng)過顯影的晶片被硬烘(hard-baked)，并且在PECVD反應(yīng)器中使用CF4(四氟化碳)等離子體除去被曝光的無定形硅。利用濃縮的HF化學(xué)刻蝕晶片，以便產(chǎn)生反應(yīng)腔和微流體通道或微米通道。剩余的光致抗蝕劑被剝離，并且無定形硅被除去。
通過這種方案的變化形成納米通道。使用如上所述的標(biāo)準(zhǔn)光刻法形成集成芯片的微米規(guī)模的特征。薄抗蝕劑層被涂敷在芯片上。使用原子力顯微術(shù)/掃描隧道探針從芯片表面移走5到10nm寬的抗蝕劑帶。芯片被用稀釋的HF簡單地刻蝕以便在芯片表面上產(chǎn)生納米規(guī)模的凹槽。在當(dāng)前的非限制性實(shí)施例中，制備具有500nm和1μm之間直徑的通道。
利用金剛石鉆頭(俄亥俄州Westerville的Crystalite)將接觸孔鉆入被刻蝕的晶片。通過在可編程真空爐(Centurion VPM，J.M.Ney，加利福尼亞州Yucaipa)中將兩個(gè)互補(bǔ)的被刻蝕并鉆孔的板相互熱接合(thermally bonding)來制備完成的芯片。在反應(yīng)腔和微流體通道之間插入具有2500道爾頓分子量截?cái)嗟哪猃堖^濾器，以便防止核酸外切酶離開反應(yīng)空。
納米粒子制備根據(jù)Lee和Meisel(J.Phys.Chem.863391-3395，1982)制備銀納米粒子。從Polysciences，Inc.(賓夕法尼亞州Warrington)或Nanoprobes，Inc.(紐約州Yaphank)購買金納米粒子。尺寸5、10、15、20、40和60nm的金納米粒子可從Polysciences獲得，尺寸1.4nm的金納米粒子可從Nanoprobes，Inc.獲得。在當(dāng)前的非限制性實(shí)施例中使用60nm的金納米粒子。
金納米粒子與具有從5nm到50nm變化的鏈長度的鏈烷二硫醇(alkane dithiol)反應(yīng)。連接體化合物在鏈烷的兩端均包含硫醇基以便與金納米粒子反應(yīng)。使用相對(duì)于連接體化合物過量的納米粒子，并且連接體化合物被緩慢地添加到納米粒子，以避免形成大的納米粒子聚集體。室溫下培育2小時(shí)以后，通過在1M蔗糖中的超速離心將納米粒子聚集體與單個(gè)納米粒子分離。電子顯微術(shù)揭示，利用這種方法制備的聚集體每個(gè)聚集體包含2到6個(gè)納米粒子。聚集的納米粒子被利用微流體流加載到微米通道中。在微米通道遠(yuǎn)端的收縮(constriction)保持納米粒子聚集體處于原處。
多孔基底制備如上所述，利用陽極刻蝕、電化學(xué)刻蝕制備基底。更具體地說，通過將高度硼摻雜的P型硅晶片在包含乙醇和HF的含水電解溶液中經(jīng)受刻蝕制備所述基底，基于所述溶液的總體積，HF按體積以大約15％的濃度存在(按體積15％的HF)。陽極化處理由施加通過室(在鉑陰極和硅陽極之間)的受計(jì)算機(jī)控制的恒穩(wěn)電流執(zhí)行。由5個(gè)周期的兩種不同的電流密度設(shè)置產(chǎn)生多層多孔硅。一種這樣的設(shè)置是5mA/cm2持續(xù)20秒，這提供了具有大約42％的孔隙率和大約80nm厚度的層。其他的設(shè)置是30mA/cm2持續(xù)10秒，這提供了具有大約63％的孔隙率和大約160nm厚度的層。所形成的基底是圓形，盤狀，具有大約1英寸的直徑。盡管一般可以認(rèn)為所形成的基底是同質(zhì)的，但是當(dāng)將基底的中心部分與基底的邊緣部分比較時(shí)，存在細(xì)微差別(例如孔隙率、厚度等)。這樣的層可以被歸于層形成過程的本質(zhì)。當(dāng)將朝著基底的中心部分激發(fā)的光(截面直徑大約1微米)的光發(fā)射光譜和向著基底的邊緣部分激發(fā)的光進(jìn)行比較時(shí)，所述細(xì)微差別是明顯的。
核酸的制備和核酸外切酶處理根據(jù)Sambrook等人(1989)純化人染色體DNA。在用Bam H1消化后，將基因組DNA片段插入到pBluescriptII噬菌粒載體(加利福尼亞州La Jolla的Stratagene，Inc.)的多克隆位點(diǎn)中，并在大腸桿菌中生長。在涂布到含有氨芐青霉素的瓊脂糖平板上之后，選取單個(gè)克隆并令其生長用于測(cè)序?；蚪MDNA插入物的單鏈DNA拷貝通過用輔助噬菌體共轉(zhuǎn)染來進(jìn)行挽救。在蛋白酶K∶十二烷基磺酸鈉(SDS)的溶液中消化后，對(duì)DNA進(jìn)行苯酚抽提，然后通過加入乙酸鈉(pH6.5，約0.3M)和0.8體積的2-丙醇對(duì)其進(jìn)行沉淀。將含有DNA的沉淀物重懸浮在Tris-EDTA緩沖液中，并儲(chǔ)存在-20℃，直至使用。瓊脂糖凝膠電泳顯示了純化DNA的單一的帶。
與已知的pBluescript序列互補(bǔ)的M13正向引物位于基因組DNA插入物的旁邊，是從Midland Certified Reagent Company(德克薩斯州Midland)購買的。對(duì)引物進(jìn)行共價(jià)修飾，使其含有連接于該寡核苷酸5’端的生物素部分。該生物素基團(tuán)通過(CH2)6間隔物與引物的5’-磷酸共價(jià)連接。允許生物素標(biāo)記的引物與由pBluescript載體制備的ssDNA模板分子雜交。然后根據(jù)Dorre等人(Bioimaging 5139-152，1997)將引物-模板復(fù)合體附著鏈霉抗生物素包被的珠子上。以合適的DNA稀釋度，將單個(gè)引物-模板復(fù)合體附著到單個(gè)珠子上。將含有單個(gè)引物-模板復(fù)合體的珠子插入到測(cè)序裝置的反應(yīng)室中。
將引物-模板與修飾的T7 DNA聚合酶(俄亥俄州Cleveland的United StatesBiochemical Corp.)一同溫育。反應(yīng)混合物含有未標(biāo)記的脫氧腺苷-5’-三磷酸(dATP)和脫氧鳥苷-5’-三磷酸(dGTP)，洋地黃毒苷-標(biāo)記的脫氧尿苷-5’-三磷酸(洋地黃毒苷-dUTP)和羅丹明-標(biāo)記的脫氧胞苷-5’-三磷酸(羅丹明-dCTP)。允許聚合反應(yīng)于37℃進(jìn)行2小時(shí)。在合成洋地黃毒苷和羅丹明標(biāo)記的核酸之后，將模板鏈與標(biāo)記的核酸分開，并將模板鏈、DNA聚合酶和未摻入的核苷酸洗出反應(yīng)室。在本發(fā)明的替換性實(shí)施方案中，用于聚合反應(yīng)的所有脫氧核苷三磷酸都是未標(biāo)記的。在其他替換性實(shí)施方案中，單鏈核酸可以被直接測(cè)序而無需互補(bǔ)鏈的聚合反應(yīng)。
通過向反應(yīng)室中加入核酸外切酶III來啟動(dòng)核酸外切酶活性。將反應(yīng)混合物維持在pH8.0和37℃。當(dāng)核苷酸由核酸的3’端釋放時(shí)，它們由微流體沿著微流體通道進(jìn)行運(yùn)送。在微米通道的入口處，由電極形成的電勢(shì)梯度驅(qū)動(dòng)核苷酸從微流體通道出來，進(jìn)入微米通道。當(dāng)核苷酸通過堆積的(packed)納米粒子時(shí)，它們被暴露于來自激光的激發(fā)輻射。通過下文所述的拉曼檢測(cè)儀檢測(cè)拉曼發(fā)射光譜。
核苷酸的拉曼檢測(cè)來自分子樣本的拉曼散射光被同一顯微物鏡收集，并經(jīng)過分色鏡到達(dá)拉曼檢測(cè)器。拉曼檢測(cè)器包括聚焦透鏡、攝譜儀和陣列檢測(cè)器。聚焦透鏡聚焦拉曼散射光通過攝譜儀的入口狹縫。攝譜儀(RoperScientific)包括按光的波長對(duì)其進(jìn)行分散的光柵。被分散的光在陣列檢測(cè)器(RoperScientific的后照明深耗盡CCD攝像機(jī))上成像。陣列檢測(cè)器被連接到控制器電路，所述電路被連接到用于數(shù)據(jù)轉(zhuǎn)移和檢測(cè)器功能控制的計(jì)算機(jī)。
拉曼檢測(cè)器能夠檢測(cè)和識(shí)別移經(jīng)檢測(cè)器的單個(gè)未被標(biāo)記的分子。將激光器和檢測(cè)器安排成使得分子樣本在其通過納米通道或微米通道中密堆積的納米粒子區(qū)域時(shí)被激發(fā)和檢測(cè)。納米粒子被交聯(lián)，形成拉曼檢測(cè)的“熱點(diǎn)”。通過使核苷酸通過納米粒子熱點(diǎn)，拉曼檢測(cè)的靈敏度被提高了許多個(gè)數(shù)量級(jí)。
通過利用試管、移液管或其他的這種手工傳遞設(shè)備，將一滴或幾滴樣本溶液直接放入樣本室中，手工地傳遞要被分析的分子的樣本和金屬納米粒子。
分子樣本和膠體銀粒子被分別引入微流體芯片，并在所述的流到達(dá)檢測(cè)窗之前混合。當(dāng)分子樣本和銀膠體的混合物被兩個(gè)激光束激發(fā)時(shí)產(chǎn)生SECARS信號(hào)。導(dǎo)致電子返回到較低能態(tài)的拉曼發(fā)射信號(hào)被用于激發(fā)的同一顯微物鏡收集，并且束路徑中的另一個(gè)分色鏡將信號(hào)引向拉曼光譜檢測(cè)器，一種雪崩光電二極管檢測(cè)器(EG&G)。使用信號(hào)放大器和模數(shù)轉(zhuǎn)換器將所述信號(hào)轉(zhuǎn)換為數(shù)字輸出。使用計(jì)算機(jī)記錄所述數(shù)字輸出并在數(shù)學(xué)上處理數(shù)據(jù)。
實(shí)施例2SECARS設(shè)置2在另一種SECARS設(shè)置中，來自Spectra-Physics(加利福尼亞的Mountain View)的鈦藍(lán)寶石激光器產(chǎn)生脈沖激光束。激光脈沖由可從Spectra-Physics獲得的光學(xué)參量振蕩器(OPO)使用，所述振蕩器產(chǎn)生了處于兩個(gè)不同波長的兩個(gè)同步束。通過轉(zhuǎn)動(dòng)OPO內(nèi)的光學(xué)晶體，兩個(gè)束之間的波長差可以改變。使用微光學(xué)裝置，由OPO產(chǎn)生的兩個(gè)束被傳遞到微流體通道的檢測(cè)窗區(qū)域。兩個(gè)束的角度被設(shè)置成匹配相位匹配條件(Fayer，UltrafastInfrared and Raman spectroscopy(超速紅外和拉曼光譜學(xué))，Marcel-Dekker，2001)，在所述條件下最有效率地產(chǎn)生SECARS信號(hào)。膠體銀粒子已經(jīng)被附著到微流體通道的下表面(例如氟化鈣或氟化鎂窗)。當(dāng)分子樣本被引入微流體通道時(shí)，分子暫時(shí)吸附到附著在表面上的膠體銀粒子上或者移動(dòng)得更靠近所述膠體銀粒子。當(dāng)分子被所述兩個(gè)束激發(fā)時(shí)，SECARS信號(hào)被作為相干單向束產(chǎn)生。SECARS信號(hào)的方向再次由相位匹配條件確定。光電倍增管(EG&G)被置于SECARS信號(hào)的方向，并收集所述信號(hào)。放大器和A/D轉(zhuǎn)換器以及計(jì)算機(jī)可以被用于數(shù)據(jù)捕獲、顯示和處理。
實(shí)施例3SECARS設(shè)置3在可替換的SECARS設(shè)置中，由兩個(gè)鈦藍(lán)寶石激光器(Coherent的Mira)產(chǎn)生激發(fā)束。利用二色干涉濾光器(由Chroma或Omega Optical制造)將來自兩個(gè)激光器的激光脈沖交迭為與被收集束共線的幾何構(gòu)形。交迭束通過顯微物鏡(Nikon LU系列)，并聚焦在目標(biāo)分析物所處的拉曼活性基底上。所述拉曼活性基底是金屬納米粒子。分析物被與氯化鋰鹽混合。來自分析物的拉曼散射光被同一顯微物鏡收集，并被第二個(gè)分色鏡反射到拉曼檢測(cè)器。所述拉曼檢測(cè)器包括帶通濾波器、聚焦透鏡、攝譜儀，以及陣列檢測(cè)器。帶通濾波器衰減激光束并傳送來自分析物的信號(hào)。聚焦透鏡聚焦拉曼散射光通過攝譜儀的入口狹縫。攝譜儀(Acton Research)包括按光波長對(duì)其進(jìn)行分散的光柵。被分散的光成像在陣列檢測(cè)器(RoperScientific的后照明深耗盡CCD攝像機(jī))上。陣列檢測(cè)器被連接到控制電路，所述控制電路連接到用于數(shù)據(jù)轉(zhuǎn)移和檢測(cè)器功能控制的計(jì)算機(jī)。結(jié)果示于圖3和圖6中。
比較實(shí)施例4SERS設(shè)置1圖4通過使用單個(gè)鈦:藍(lán)寶石激光器而產(chǎn)生。激光器以連續(xù)波模式或脈沖模式產(chǎn)生處于近紅外波長(700nm到1000nm)的0.5-1.0瓦激光束。激光束通過分色鏡和顯微物鏡，并聚焦在目標(biāo)分析物所處的拉曼活性基底上。所述拉曼活性基底是金屬納米粒子或金屬涂敷的納米結(jié)構(gòu)。分析物被與氯化鋰鹽混合。來自分析物的拉曼散射光被同一顯微物鏡收集，并被分色鏡反射到拉曼檢測(cè)器。所述拉曼檢測(cè)器包括陷波濾波器、聚焦透鏡、攝譜儀，以及陣列檢測(cè)器。陷波濾波器(Kaiser Optical)衰減激光束并傳送來自分析物的信號(hào)。聚焦透鏡聚焦拉曼散射光通過攝譜儀的入口狹縫。攝譜儀(Acton Research)包括按光波長對(duì)其進(jìn)行分散的光柵。被分散的光成像在陣列檢測(cè)器(RoperScientific的后照明深耗盡CCD攝像機(jī))上。陣列檢測(cè)器被連接到控制電路，所述控制電路連接到用于數(shù)據(jù)轉(zhuǎn)移和檢測(cè)器功能控制的計(jì)算機(jī)。
比較實(shí)施例5CARS設(shè)置1在CARS設(shè)置中，由兩個(gè)鈦藍(lán)寶石激光器(Coherent的Mira)產(chǎn)生激發(fā)束。利用二色干涉濾光器(由Chroma或Omega Optical制造)將來自兩個(gè)激光器的激光脈沖交迭為和被收集束共線的幾何構(gòu)形。交迭束通過顯微物鏡(Nikon LU系列)，并聚焦在目標(biāo)分析物所處的拉曼活性基底上。不使用拉曼活性基底。分析物被直接引入樣本室。來自分析物的拉曼散射光被同一顯微物鏡收集，并被第二個(gè)分色鏡反射到拉曼檢測(cè)器。所述拉曼檢測(cè)器包括帶通濾波器、聚焦透鏡、攝譜儀，以及陣列檢測(cè)器。帶通濾波器衰減激光束并傳送來自分析物的信號(hào)。聚焦透鏡聚焦拉曼散射光通過攝譜儀的入口狹縫。攝譜儀(ActonResearch)包括按光波長對(duì)其進(jìn)行分散的光柵。被分散的光成像在陣列檢測(cè)器(RoperScientific的后照明深耗盡CCD攝像機(jī))上。陣列檢測(cè)器被連接到控制電路，所述控制電路連接到用于數(shù)據(jù)轉(zhuǎn)移和檢測(cè)器功能控制的計(jì)算機(jī)。結(jié)果示于圖5中。
圖3與圖4和圖5的比較顯示，當(dāng)與單獨(dú)的SERS比較時(shí)，SECARS技術(shù)顯示在靈敏度上提高了25倍，當(dāng)與單獨(dú)使用CARS比較時(shí)，在靈敏度上提高了30,000,000倍。靈敏度上30,000,000倍的提高使得少量分子(小于1000、100或10個(gè)分子乃至單個(gè)分子)檢測(cè)具有可行性。
上面的實(shí)施例展示了本發(fā)明的高分辨率SECARS設(shè)備和方法的新穎性和實(shí)用性。僅僅是為了理解清晰而給出了對(duì)本發(fā)明的優(yōu)選實(shí)施方案的前述詳細(xì)描述，并且不應(yīng)該由此理解為任何不必要的限制，因?yàn)樾薷膶?duì)于熟練技術(shù)人員來說將是清楚的。不偏離本發(fā)明的范圍可以作出如前面給出的那樣的本發(fā)明的變化，因此，只應(yīng)施加由所附權(quán)利要求指示的這些限制。
權(quán)利要求
1.一種檢測(cè)或識(shí)別分析物的方法，包括a)將分析物的少于大約103個(gè)分子暴露給至少一個(gè)拉曼活性表面；b)用處于第一波長的激光束照射至少一個(gè)分子和所述表面之間的界面，以使所述分子產(chǎn)生處于第二波長的自發(fā)斯托克斯拉曼發(fā)射和處于第三波長的自發(fā)反斯托克斯拉曼發(fā)射；c)與b)基本同時(shí)地，用處于所述第二波長的第二束照射所述分子和所述表面之間的所述界面，以使來自所述分子的處于所述第三波長的所述反斯托克斯拉曼發(fā)射的強(qiáng)度增加；以及d)通過在b)和c)之后利用拉曼檢測(cè)單元檢測(cè)或識(shí)別來自所述界面的處于所述第三波長的所述反斯托克斯發(fā)射的強(qiáng)度變化，檢測(cè)或識(shí)別所述分析物。
2.如權(quán)利要求1所述的方法，包括將分析物的少于大約102個(gè)分子暴露給至少一個(gè)拉曼活性表面。
3.如權(quán)利要求1所述的方法，包括將分析物的少于大約10個(gè)分子暴露給至少一個(gè)拉曼活性表面。
4.如權(quán)利要求1所述的方法，包括將分析物的單個(gè)分子暴露給至少一個(gè)拉曼活性表面。
5.如權(quán)利要求1所述的方法，還包括移動(dòng)所述分析物通過通道。
6.如權(quán)利要求5所述的方法，還包括在含水介質(zhì)中檢測(cè)和識(shí)別所述分析物。
7.如權(quán)利要求1所述的方法，其中，所述表面由選自由用金屬或?qū)щ姴牧贤糠蟮墓杌?；金屬或?qū)щ娂{米粒子；金屬或?qū)щ娂{米粒子的聚集體；金屬或?qū)щ娂{米粒子的膠體；以及它們的組合；所組成的組中的一項(xiàng)來提供。
8.如權(quán)利要求1所述的方法，其中，所述分析物選自由氨基酸、肽、多肽、蛋白質(zhì)、糖蛋白、脂蛋白、核苷、核苷酸、寡核苷酸、核酸、糖、碳水化合物、寡糖、多糖、脂肪酸、類脂、激素、代謝物、細(xì)胞因子、趨化因子、受體、神經(jīng)遞質(zhì)、抗原、變態(tài)反應(yīng)原、抗體、底物、代謝物、輔因子、抑制劑、藥、藥物、營養(yǎng)素、朊毒體、毒素、毒物、爆炸物、殺蟲劑、化學(xué)戰(zhàn)劑、生物危險(xiǎn)制劑、細(xì)菌、病毒、放射性同位素、維生素、雜環(huán)芳香族化合物、致癌物質(zhì)、誘變劑、鎮(zhèn)靜劑、安非他明、巴比妥酸鹽、迷幻劑、廢物和污染物組成的組。
9.如權(quán)利要求8所述的方法，其中，所述分析物是核苷、核苷酸、寡核苷酸、核酸、氨基酸、肽、多肽或蛋白質(zhì)。
10.如權(quán)利要求9所述的方法，其中，所述分析物是核酸。
11.如權(quán)利要求1所述的方法，其中，所述分析物與拉曼活性表面緊密締合。
12.如權(quán)利要求1所述的方法，其中，所述拉曼活性表面用有機(jī)化合物來共價(jià)地改性。
13.如權(quán)利要求5所述的方法，其中，所述通道選自由微流體通道、納米通道、微米通道及它們的組合所組成的組。
14.如權(quán)利要求13所述的方法，其中，所述納米粒子尺寸在大約1nm和2μm之間。
15.如權(quán)利要求13所述的方法，其中，所述納米粒子的所述尺寸選自由大約10到50nm、大約50到100nm、大約10到100nm、大約100nm和大約200nm所組成的組。
16.如權(quán)利要求7所述的方法，其中，所述金屬選自由金、銀、銅、鉑、鋁及它們的組合所組成的組。
17.如權(quán)利要求1所述的方法，其中，所述拉曼檢測(cè)的器件選自由光電二極管、雪崩光電二極管、電荷耦合器件陣列、CMOS陣列、強(qiáng)化電荷耦合器件以及它們的組合所組成的組。
18.如權(quán)利要求1所述的方法，還包括將所述分析物的所述檢測(cè)到的強(qiáng)度與先前識(shí)別的分析物進(jìn)行比較，以便能夠確定所述分析物的所述的身份。
19.如權(quán)利要求1所述的方法，其中，所述方法具有至少大約為每分子10-22cm2的光學(xué)截面。
20.如權(quán)利要求1所述的方法，其中，所述方法具有至少大約為每分子10-20cm2的光學(xué)截面。
21.如權(quán)利要求1所述的方法，其中，所述方法具有至少大約為每分子10-19cm2的光學(xué)截面。
22.如權(quán)利要求1所述的方法，其中，所述方法具有至少大約為每分子10-18cm2的光學(xué)截面。
23.如權(quán)利要求1所述的方法，其中，所述方法具有至少大約為每分子10-17cm2的光學(xué)截面。
24.如權(quán)利要求1所述的方法，其中，所述方法具有至少大約為每分子10-16cm2的光學(xué)截面。
25.如權(quán)利要求1所述的方法，其中，所述方法具有至少大約為每分子10-15cm2的光學(xué)截面。
26.如權(quán)利要求1所述的方法，其中，所述方法具有至少大約為每分子10-14cm2的光學(xué)截面。
27.如權(quán)利要求1所述的方法，其中，所述方法具有至少大約為每分子10-13cm2的光學(xué)截面。
28.如權(quán)利要求1所述的方法，其中，所述方法具有至少大約為每分子10-12cm2的光學(xué)截面。
29.如權(quán)利要求1所述的方法，其中，所述分析物用一個(gè)或更多個(gè)可辨識(shí)的拉曼標(biāo)記來標(biāo)記。
30.如權(quán)利要求1所述的方法，還包括施加電場(chǎng)來使所述分析物移動(dòng)通過所述通道。
31.如權(quán)利要求1所述的方法，其中，每一種類型的分析物產(chǎn)生獨(dú)特的拉曼信號(hào)。
32.一種用于檢測(cè)分析物的少于大約103個(gè)分子的設(shè)備，所述設(shè)備包括(a)用于產(chǎn)生處于第一波長的第一束電磁輻射的裝置；(b)用于產(chǎn)生處于第二波長的第二束電磁輻射的裝置；所述第二波長不同與所述第一波長；(c)樣本室；(d)用于將所述分析物和拉曼活性表面引入所述樣本室的裝置；(e)用于將所述第一束和所述第二束聚焦在所述分析物和所述拉曼活性表面之間的界面上的光學(xué)裝置；以及(f)用于檢測(cè)從所述分析物和所述拉曼活性表面之間的所述界面發(fā)射的光強(qiáng)、被定位來接收所述發(fā)射的裝置。
33.如權(quán)利要求32所述的設(shè)備，其中，所述用于產(chǎn)生第一束電磁輻射的裝置和所述用于產(chǎn)生第二束電磁輻射的裝置包括兩個(gè)脈沖激光器。
34.如權(quán)利要求32所述的設(shè)備，其中，所述光學(xué)裝置包括顯微物鏡、反射鏡、棱鏡，或它們的組合。
35.如權(quán)利要求32所述的設(shè)備，其中，所述樣本室包括(a)樣本室主體，所述樣本室主體的材料將所述樣本與環(huán)境空氣隔離；(b)所述樣本室主體中的窗，所述窗的材料對(duì)電磁輻射透明；以及(c)至少一個(gè)口，用于引入和除去所述分析物和可選擇地引入和移走所述拉曼活性表面。
36.如權(quán)利要求32所述的設(shè)備，其中，所述用于將分析物和拉曼活性表面引入所述樣本室的裝置包括微流體器件。
37.如權(quán)利要求32所述的設(shè)備，其中，所述用于檢測(cè)從所述界面發(fā)射的光強(qiáng)的裝置是差分光檢測(cè)器件，所述的差分光檢測(cè)器件選自由光電二極管、雪崩光電二極管、電荷耦合器件陣列、CMOS陣列、強(qiáng)化電荷耦合器件以及它們的組合所組成的組。
38.一種用于檢測(cè)分析物的少于大約103個(gè)分子的設(shè)備，所述設(shè)備包括a)反應(yīng)腔；b)與所述反應(yīng)腔流體連通的第一通道；c)與所述第一通道流體連通的第二通道；d)與所述第一和所述第二通道流體連通的樣本室；e)所述流經(jīng)室中的眾多納米粒子、納米粒子聚集體、納米粒子膠體，或金屬涂敷的基底。f)激光器；以及g)可操作地耦合到所述流經(jīng)室的表面增強(qiáng)、相干反斯托克斯拉曼檢測(cè)器。
39.如權(quán)利要求38所述的設(shè)備，其中，所述拉曼檢測(cè)器包括CCD攝像機(jī)或光電二極管陣列。
40.如權(quán)利要求38所述的設(shè)備，其中，所述CCD攝像機(jī)或光電二極管陣列可操作地耦合到數(shù)據(jù)處理單元。
41.如權(quán)利要求38所述的設(shè)備，其中，所述數(shù)據(jù)處理單元包括計(jì)算機(jī)。
42.如權(quán)利要求38所述的設(shè)備，還包括第一電極和第二電極，所述電極將單個(gè)分析物從所述第一通道移動(dòng)進(jìn)入所述第二通道中。
43.如權(quán)利要求38所述的設(shè)備，其中，所述第一通道是微流體通道。
44.如權(quán)利要求38所述的設(shè)備，其中，所述第二通道是納米通道或微米通道。
45.如權(quán)利要求38所述的設(shè)備，其中，所述納米粒子是金屬。
46.如權(quán)利要求45所述的設(shè)備，其中，所述金屬包括銀、金、鉑、銅和/或鋁。
47.如權(quán)利要求38所述的設(shè)備，還包括可操作地耦合到所述拉曼檢測(cè)器的流經(jīng)室，其中，流經(jīng)過所述樣本室內(nèi)部的所述金屬涂敷的納米晶體多孔硅基底。
48.如權(quán)利要求38所述的設(shè)備，其中，所述金屬涂敷的基底被結(jié)合在集成芯片或者微機(jī)電系統(tǒng)(MEMS)中。
49.如權(quán)利要求38所述的設(shè)備，其中，所述檢測(cè)單元包括激光器和CCD攝像機(jī)。
全文摘要
在此所公開的設(shè)備和方法涉及使用表面增強(qiáng)相干反斯托克斯拉曼光譜學(xué)以高分辨率和快速的響應(yīng)時(shí)間來檢測(cè)、識(shí)別和/或量化例如核酸的分析物。在本發(fā)明的某些實(shí)施方案中，少量例如核苷酸的分析物210的分子樣本經(jīng)過微流體通道、微米通道或納米通道185和包含拉曼活性表面的樣本室175，并通過表面增強(qiáng)相干反斯托克斯拉曼光譜學(xué)(SECARS)而被檢測(cè)。本發(fā)明的其他實(shí)施方案有關(guān)于用于分析物檢測(cè)的裝置。
文檔編號(hào)G01N21/65GK1954199SQ200480037756
公開日2007年4月25日 申請(qǐng)日期2004年10月6日 優(yōu)先權(quán)日2003年10月17日
發(fā)明者T-W·庫, 米尼奧·山川, 克里斯托弗·格斯 申請(qǐng)人:英特爾公司