專利名稱：檢測β3腎上腺素受體突變基因的方法及用于該方法的核酸探針和試劑盒的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及檢測β3腎上腺素能受體突變基因的方法，以及用于該方法的核酸探針和試劑盒。
背景技術(shù)：
β3腎上腺素能受體(B3AR)在白色脂肪細(xì)胞的脂解和棕色脂肪細(xì)胞的熱生成方面起著主要的作用。據(jù)說B3AR氨基酸序列64-位色氨酸替換為精氨酸(Trp64Arg)這一突變的存在可使安靜狀態(tài)代謝量降低200kcal，并與腹部脂肪型肥胖和胰島素抵抗相關(guān)聯(lián)。
如果導(dǎo)致B3AR中Trp64Arg突變(也稱為“B3AR Trp64Arg突變”)的突變存在，就會在突變位置形成限制酶識別位點(diǎn)。因此，可用如下方法檢測突變用PCR擴(kuò)增DNA以便包括突變位置的部分能被擴(kuò)增，用限制酶消化擴(kuò)增產(chǎn)物并用電泳確定DNA是否被消化(PCR-RFLP)(例如參見Japanese Journal of Clinical Pathology，vol.44，8，pp.778-782，1996)。
由于PCR擴(kuò)增了幾個(gè)分子的模板幾十億次，所以即使痕量的污染物也可能導(dǎo)致假陽性或假陰性結(jié)果。在PCR-RFLP中，PCR之后擴(kuò)增產(chǎn)物需要收集并進(jìn)行限制酶處理，故擴(kuò)增產(chǎn)物可能污染隨后的反應(yīng)系統(tǒng)。因此，可能獲得假陽性或假陰性結(jié)果。
此外，PCR結(jié)束后用限制酶處理DNA，然后進(jìn)行電泳。因此檢測所需的時(shí)間變得非常長。此外，因?yàn)槌绦驈?fù)雜，很難自動化。
更進(jìn)一步地，用PCR擴(kuò)增包含突變的區(qū)域、然后用熒光染料標(biāo)記的核酸探針進(jìn)行解鏈曲線分析、在解鏈曲線分析結(jié)果的基礎(chǔ)上進(jìn)行突變分析，這樣的方法是公知的(Clinical Chemistry，vol.46，5，pp.631-635，2000；日本專利申請公開號(Kokai)No.2002-119291)。
發(fā)明公開本發(fā)明的一個(gè)目的是鑒別一種有效檢測B3AR Trp64Arg突變的淬滅探針，從而提供一種檢測B3AR Trp64Arg突變的方法以及用于該方法的試劑盒。
有關(guān)使用探針的上述方法的文獻(xiàn)僅僅教導(dǎo)了關(guān)于探針的設(shè)計(jì)，探針應(yīng)當(dāng)設(shè)計(jì)為當(dāng)具有熒光染料末端標(biāo)記的淬滅探針與靶核酸雜交時(shí)，探針-核酸雜交體的兩個(gè)或更多核苷酸對應(yīng)該在末端部分形成至少一個(gè)G-C對。對于B3AR Trp64Arg突變，本發(fā)明的發(fā)明人設(shè)計(jì)了滿足上述條件的淬滅探針并嘗試了檢測。然而，不容易獲得能夠檢測的淬滅探針。
本發(fā)明的發(fā)明人發(fā)現(xiàn)，基于包含B3AR Trp64Arg突變的特定區(qū)域設(shè)計(jì)淬滅探針，通過使用淬滅探針的解鏈曲線分析能夠檢測B3ARTrp64Arg突變。
本發(fā)明提供以下內(nèi)容。
(1)一種核酸探針，其末端用熒光染料標(biāo)記，其中熒光染料的熒光隨雜交而減少，其中所述核酸探針具有的核苷酸序列從SEQ ID NO1的核苷酸序列的第183位核苷酸開始、具有8～30個(gè)核苷酸的長度并且探針的5’末端用熒光染料標(biāo)記，或者核酸探針具有的核苷酸序列在SEQ ID NO2的核苷酸序列的第196位核苷酸終止、具有7～30個(gè)核苷酸的長度并且探針的3’末端用熒光染料標(biāo)記。
(2)根據(jù)(1)所述的核酸探針，其中核酸探針具有SEQ ID NOS8-12的任一核苷酸序列。
(3)一種檢測突變的方法，包括使用熒光染料標(biāo)記的核酸探針并測定熒光染料的熒光而對具有單核苷酸多態(tài)性位點(diǎn)的核酸進(jìn)行解鏈曲線分析，并在解鏈曲線分析結(jié)果的基礎(chǔ)上檢測突變，其中單核苷酸多態(tài)性是編碼β3腎上腺素能受體的核酸的核苷酸序列的一個(gè)突變，該突變導(dǎo)致β3腎上腺素能受體氨基酸序列64-位色氨酸被精氨酸替換的突變，并且所述核酸探針是如(1)或(2)中所定義的核酸探針。
(4)根據(jù)(3)所述的方法，其中包含在樣品中的核酸中的含有單核苷酸多態(tài)性位點(diǎn)的區(qū)域被擴(kuò)增以獲得顯示單核苷酸多態(tài)性的核酸。
(5)根據(jù)(4)所述的方法，其中通過使用DNA聚合酶的方法進(jìn)行擴(kuò)增。
(6)根據(jù)(5)所述的方法，其中在核酸探針存在時(shí)進(jìn)行擴(kuò)增。
(7)用于如(3)中所定義方法的試劑盒，其包括一種末端用熒光染料標(biāo)記的核酸探針，其中熒光染料的熒光隨雜交而減少，所述核酸探針具有的核苷酸序列從SEQ ID NO1的核苷酸序列的第183位核苷酸開始、具有8～30個(gè)核苷酸的長度并且探針的5’末端用熒光染料標(biāo)記，或者核酸探針具有的核苷酸序列在SEQ ID NO2的核苷酸序列的第196位核苷酸終止、具有7～30個(gè)核苷酸的長度并且探針的3’末端用熒光染料標(biāo)記。
(8)根據(jù)(7)所述的試劑盒，其中核酸探針具有SEQ ID NOS8-12的任一核苷酸序列。
(9)根據(jù)(7)或(8)所述的試劑盒，其進(jìn)一步包括引物，用于擴(kuò)增包含編碼β3腎上腺素能受體的核酸中核苷酸序列中的突變的區(qū)域，所述突變導(dǎo)致β3腎上腺素能受體氨基酸序列64位色氨酸被精氨酸替換的突變，所述擴(kuò)增通過使用DNA聚合酶的方法進(jìn)行。
附圖的簡單描述

圖1顯示不能鑒別突變的淬滅探針的位置。
圖2顯示能夠鑒別突變的淬滅探針的位置。
圖3顯示實(shí)施例1的方法(使用探針5FL-wt-1-16)在基因組DNA的絕對量方面的靈敏度。
圖4顯示實(shí)施例1的方法(使用探針5FL-wt-1-16)的再現(xiàn)性。
圖5顯示實(shí)施例1的方法(使用探針3T-mt-2-20)在基因組DNA的絕對量方面的靈敏度。
圖6顯示實(shí)施例1的方法(使用3T-mt-2-20)的再現(xiàn)性。
實(shí)施本發(fā)明的最佳方式<1>本發(fā)明的探針和本發(fā)明的檢測方法本發(fā)明的探針是一種末端用熒光染料標(biāo)記的核酸探針，其中熒光染料的熒光隨雜交而減少，所述核酸探針具有的核苷酸序列從SEQ IDNO1的核苷酸序列的第183位核苷酸開始、具有8～30個(gè)核苷酸的長度并且探針的5’末端用熒光染料標(biāo)記，或者核酸探針具有的核苷酸序列在SEQ ID NO2的核苷酸序列的第196位核苷酸終止、具有7～30個(gè)核苷酸的長度并且探針的3’末端用熒光染料標(biāo)記。
本發(fā)明的探針可能與專利文獻(xiàn)1描述的淬滅探針是相似的，除了它具有的核苷酸序列是從SEQ ID NO1的核苷酸序列(在B3ARTrp64Arg突變中具有野生型核苷酸的序列)的第183位核苷酸開始并具有8～30個(gè)核苷酸的長度，或者核苷酸序列在SEQ ID NO2的核苷酸序列(在B3AR Trp64Arg突變中具有突變型核苷酸的序列)的第196位核苷酸終止并具有7～30個(gè)核苷酸的長度。用于本發(fā)明的淬滅探針的核苷酸序列的例子包括SEQ ID NOS8～12的核苷酸序列。作為熒光染料，專利文獻(xiàn)1中描述的那些都可以使用，其特定的例子包括FAM(商標(biāo))、TAMRA(商標(biāo))、BODIPY(商標(biāo))FL等等。熒光染料可以以常規(guī)方式結(jié)合到寡核苷酸上，例如通過專利文獻(xiàn)1中描述的方法。
本發(fā)明的檢測方法是用于檢測突變的方法，其通過使用熒光染料標(biāo)記的核酸探針并測定熒光染料的熒光而對具有單核苷酸多態(tài)性位點(diǎn)的核酸進(jìn)行解鏈曲線分析，并在解鏈曲線分析結(jié)果的基礎(chǔ)上檢測突變，其特征在于單核苷酸多態(tài)性是B3AR Trp64Arg突變，并且核酸探針是本發(fā)明的探針。
本發(fā)明的檢測方法可根據(jù)核酸擴(kuò)增和解鏈曲線分析(Tm分析)的常規(guī)方法進(jìn)行，不同之處是擴(kuò)增的是包含編碼B3AR的DNA中的B3AR Trp64Arg突變的區(qū)域，以及使用的是本發(fā)明的探針。
作為核酸擴(kuò)增方法，優(yōu)選使用聚合酶的方法，其例子包括PCR、ICAN、LAMP等等。當(dāng)通過使用聚合酶的方法進(jìn)行擴(kuò)增時(shí)，優(yōu)選在本發(fā)明的探針存在時(shí)進(jìn)行擴(kuò)增。擴(kuò)增的反應(yīng)條件和其他條件可由本領(lǐng)域技術(shù)人員根據(jù)使用的探針容易地調(diào)整。在該方法中，核酸擴(kuò)增后只分析探針的Tm，因此反應(yīng)結(jié)束后不必處理擴(kuò)增產(chǎn)物。這樣就沒有污染擴(kuò)增產(chǎn)物的危險(xiǎn)。進(jìn)一步地，因?yàn)闄z測是用擴(kuò)增所需的同一設(shè)備進(jìn)行的，甚至不必移動容器。因此該方法的自動化也是容易的。
作為例子，將在下面通過涉及使用PCR的方法進(jìn)一步說明該方法。用于PCR的引物對可按照設(shè)計(jì)常規(guī)PCR引物對的同樣方式進(jìn)行設(shè)計(jì)，除了其要設(shè)計(jì)成應(yīng)當(dāng)能夠擴(kuò)增本發(fā)明的探針可雜交的區(qū)域。引物的長度和Tm通常分別是10-40聚體以及40-70℃，優(yōu)選15-25聚體以及55-60℃。引物對中的引物可以長度不同。然而，引物的Tm值優(yōu)選是基本相同的(差別通常在2℃之內(nèi))。Tm值是根據(jù)最鄰近方法計(jì)算的值。引物對的例子包括一個(gè)引物對，其包括具有SEQ ID NO2和3的核苷酸序列的引物。
PCR優(yōu)選在本發(fā)明的探針存在時(shí)進(jìn)行。這使得能夠在擴(kuò)增反應(yīng)結(jié)束后不用對擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行任何操作而分析Tm。引物的Tm值和PCR反應(yīng)條件可由本領(lǐng)域技術(shù)人員根據(jù)使用的探針容易地調(diào)整。
PCR反應(yīng)混合物的組成的代表性例子如下。
表1

進(jìn)一步地，溫度循環(huán)的代表性例子如下，該溫度循環(huán)通常重復(fù)25～40次。
(1)變性90～98℃、1～60秒(2)退火60～70℃、10～60秒(3)延伸60～75℃、10～180秒當(dāng)退火和延伸一步進(jìn)行時(shí)，可以涉及例如60～70℃、10～180秒的條件。
Tm分析可以按常規(guī)方式進(jìn)行，除了測定的是結(jié)合到本發(fā)明的探針上的熒光染料的熒光。熒光測定可以使用具有適合熒光染料的波長的激發(fā)光并測定發(fā)射波長的光強(qiáng)。Tm分析中的升溫速度通常是0.1～1℃每秒。用于Tm分析的反應(yīng)混合物的組成并不特別限定，只要探針和核酸能夠互相雜交，所述核酸具有與探針核苷酸序列互補(bǔ)的序列。然而，單價(jià)陽離子的濃度通常是1.5～5mM，pH通常是7～9。因?yàn)槭褂肈NA聚合酶的擴(kuò)增方法例如PCR的反應(yīng)混合物通常滿足這些條件，擴(kuò)增后的反應(yīng)混合物本身能夠用于Tm分析。
B3AR Trp64Arg突變的檢測可以在常規(guī)方式Tm分析結(jié)果的基礎(chǔ)上進(jìn)行。本發(fā)明檢測方法的檢測不僅包括檢測突變存在與否，而且還定量突變型DNA并確定野生型DNA與突變型DNA的比例。
<2>本發(fā)明的試劑盒本發(fā)明的試劑盒是用于本發(fā)明的第二種檢測方法的試劑盒。該試劑盒的特征在于包括一種末端用熒光染料標(biāo)記的核酸探針，其中熒光染料的熒光隨雜交而減少(淬滅探針)，所述核酸探針具有的核苷酸序列從SEQ ID NO1的核苷酸序列的第183位核苷酸開始、具有8～30個(gè)核苷酸的長度并且探針的5’末端用熒光染料標(biāo)記，或者核酸探針具有的核苷酸序列在SEQ ID NO2的核苷酸序列的第196位核苷酸終止、具有7～30個(gè)核苷酸的長度并且探針的3’末端用熒光染料標(biāo)記。
對淬滅探針的說明見上述關(guān)于本發(fā)明的探針。
本發(fā)明的試劑盒除了淬滅探針，還可以包括本發(fā)明檢測方法中核酸擴(kuò)增所需的試劑，特別是用于采用DNA聚合酶進(jìn)行的擴(kuò)增的引物。
在本發(fā)明的試劑盒中，可以包括分開的淬滅探針、引物和其他試劑，或者其一部分可以作為混合物提供。
實(shí)施例將用下面的實(shí)施例對本發(fā)明進(jìn)行更明確的說明。
實(shí)施例1在包含人B3AR基因Trp64Arg突變位點(diǎn)的核苷酸序列(SEQ IDNO1)的基礎(chǔ)上設(shè)計(jì)表2所示引物，以便能夠擴(kuò)增包含Trp64Arg突變的區(qū)域。在表2中，位置是用SEQ ID NO1的核苷酸序列的核苷酸號表示的。
表2

然后設(shè)計(jì)表3所示的末端具有C的探針。在表3中，位置是用SEQID NO1的核苷酸序列的核苷酸號表示的。此外，核苷酸序列中的大寫字母表示B3AR Trp64Arg突變位點(diǎn)，3’末端的(P)表示被磷酸化。探針用BODIPY(商標(biāo))FL或TAMRA(商標(biāo))按常規(guī)方式標(biāo)記。
表3

PCR和Tm分析使用基因組DNA作為樣品、用Smart CyclerSystem(Cephied)在如下所示條件下進(jìn)行。Tm分析中的激發(fā)波長和檢測波長分別是450～495nm和505～537nm(BODIPY FL)以及527～555nm和565～605nm(TAMRA)。
表4


表5反應(yīng)條件50℃，2min↓95℃，2min↓95℃，1sec66℃，18sec(50個(gè)循環(huán))↓Tm分析(1℃/sec)用每種探針進(jìn)行PCR和Tm分析。結(jié)果，只有當(dāng)用探針3T-mt-2-20、5FL-wt-1-20、5FL-wt-1-18、5FL-wt-1-16和5FL-wt-1-15時(shí)，才可觀察到Tm分析中能夠分析的熒光強(qiáng)度變化。探針相對于包含B3AR Trp64Arg突變的核苷酸序列的位置示于圖1和2。圖中所示野生型序列和突變型序列分別相當(dāng)于SEQ ID NOS1和2的核苷酸序列中核苷酸號171～205。此外，圖中的F表示熒光染料?；趫D1和2所示位置，可以認(rèn)為，探針能否用于Tm分析取決于結(jié)合熒光染料的C的位置，探針長度并非那么重要，只要其包括了多態(tài)性位點(diǎn)。
下面用探針5FL-wt-1-16檢測在基因組DNA絕對量方面的靈敏度和再現(xiàn)性。
使用包含0、20、200和2000個(gè)拷貝的基因組DNA(野生型)樣品重復(fù)上述方法。結(jié)果示于圖3。從圖3可見，其表明基因組DNA即使20個(gè)拷貝也可被檢測到。
然后制備具有野生型序列的質(zhì)粒(與上述質(zhì)粒相同，除了核酸序列SEQ ID NO1的核苷酸285是A)。通過混合野生型質(zhì)粒和突變型質(zhì)粒制備十個(gè)樣品(wt/mt)。對這些樣品中的每一個(gè)以及只有野生型質(zhì)粒的樣品(wt/wt)和只有突變型質(zhì)粒的樣品(wt/wt)重復(fù)上述方法。結(jié)果示于圖4。從圖4可見，其表明該方法的再現(xiàn)性是極好的。
進(jìn)一步地，用探針3T-mt-2-20而不是5FL-wt-1-16按類似方式檢測在基因組DNA絕對量方面的靈敏度和再現(xiàn)性。結(jié)果示于圖5和6。從圖5和6可見，其表明靈敏度和再現(xiàn)性是極好的。
在圖3～6中，縱軸代表熒光強(qiáng)度的基本導(dǎo)數(shù)的負(fù)值(-dF/dt)，橫軸代表溫度(℃)。
工業(yè)實(shí)用性按照本發(fā)明，提供了有效檢測B3AR Trp64Arg突變的淬滅探針，以及進(jìn)一步提供了用它和相應(yīng)試劑盒檢測B3AR Trp64Arg突變的方法。因?yàn)門m分析是在幾十秒內(nèi)完成的，檢測所需時(shí)間可顯著減少。按照本發(fā)明優(yōu)選的實(shí)施方案，其中在探針存在下核酸的擴(kuò)增和Tm分析是組合的，在核酸擴(kuò)增后只分析探針的Tm，因此不必在反應(yīng)結(jié)束后處理擴(kuò)增產(chǎn)物。這樣，就沒有污染擴(kuò)增產(chǎn)物的危險(xiǎn)。其次，因?yàn)闄z測可用擴(kuò)增所需的同一設(shè)備進(jìn)行，甚至不必移動容器。因此，該方法的自動化也是容易的。
序列表<110>Arkray，Inc.
<120>檢測β3腎上腺素受體突變基因的方法及用于該方法的核酸探針和試劑盒<130>G867-OPC4054<150>JP 2003-114381<151>2003-04-18<160>12<210>1<211>1227<212>DNA<213>智人<220>
<221>等位基因<222>190<400>1atggctccgt ggcctcacga gaacagctct cttgccccat ggccggacct ccccaccctg60gcgcccaata ccgccaacac cagtgggctg ccaggggttc cgtgggaggc ggccctagcc120ggggccctgc tggcgctggc ggtgctggcc accgtgggag gcaacctgct ggtcatcgtg180gccatcgcct ggactccgag actccagacc atgaccaacg tgttcgtgac ttcgctggcc240gcagccgacc tggtgatggg actcctggtg gtgccgccgg cggccacctt ggcgctgact300ggccactggc cgttgggcgc cactggctgc gagctgtgga cctcggtgga cgtgctgtgt360gtgaccgcca gcatcgaaac cctgtgcgcc ctggccgtgg accgctacct ggctgtgacc420aacccgctgc gttacggcgc actggtcacc aagcgctgcg cccggacagc tgtggtcctg480gtgtgggtcg tgtcggccgc ggtgtcgttt gcgcccatca tgagccagtg gtggcgcgta540ggggccgacg ccgaggcgca gcgctgccac tccaacccgc gctgctgtgc cttcgcctcc600aacatgccct acgtgctgct gtcctcctcc gtctccttct accttcctct tctcgtgatg660ctcttcgtct acgcgcgggt tttcgtggtg gctacgcgcc agctgcgctt gctgcgcggg720gagctgggcc gctttccgcc cgaggagtct ccgccggcgc cgtcgcgctc tctggccccg780gccccggtgg ggacgtgcgc tccgcccgaa ggggtgcccg cctgcggccg gcggcccgcg840cgcctcctgc ctctccggga acaccgggcc ctgtgcacct tgggtctcat catgggcacc900ttcactctct gctggttgcc cttctttctg gccaacgtgc tgcgcgccct ggggggcccc960tctctagtcc cgggcccggc tttccttgcc ctgaactggc taggttatgc caattctgcc1020ttcaacccgc tcatctactg ccgcagcccg gactttcgca gcgccttccg ccgtcttctg1080
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<221>等位基因<222>190<400>2atggctccgt ggcctcacga gaacagctct cttgccccat ggccggacct ccccaccctg60gcgcccaata ccgccaacac cagtgggctg ccaggggttc cgtgggaggc ggccctagcc120ggggccctgc tggcgctggc ggtgctggcc accgtgggag gcaacctgct ggtcatcgtg180gccatcgccc ggactccgag actccagacc atgaccaacg tgttcgtgac ttcgctggcc240gcagccgacc tggtgatggg actcctggtg gtgccgccgg cggccacctt ggcgctgact300ggccactggc cgttgggcgc cactggctgc gagctgtgga cctcggtgga cgtgctgtgt360gtgaccgcca gcatcgaaac cctgtgcgcc ctggccgtgg accgctacct ggctgtgacc420aacccgctgc gttacggcgc actggtcacc aagcgctgcg cccggacagc tgtggtcctg480gtgtgggtcg tgtcggccgc ggtgtcgttt gcgcccatca tgagccagtg gtggcgcgta540ggggccgacg ccgaggcgca gcgctgccac tccaacccgc gctgctgtgc cttcgcctcc600aacatgccct acgtgctgct gtcctcctcc gtctccttct accttcctct tctcgtgatg660ctcttcgtct acgcgcgggt tttcgtggtg gctacgcgcc agctgcgctt gctgcgcggg720gagctgggcc gctttccgcc cgaggagtct ccgccggcgc cgtcgcgctc tctggccccg780gccccggtgg ggacgtgcgc tccgcccgaa ggggtgcccg cctgcggccg gcggcccgcg840cgcctcctgc ctctccggga acaccgggcc ctgtgcacct tgggtctcat catgggcacc900ttcactctct gctggttgcc cttctttctg gccaacgtgc tgcgcgccct ggggggcccc960tctctagtcc cgggcccggc tttccttgcc ctgaactggc taggttatgc caattctgcc1020ttcaacccgc tcatctactg ccgcagcccg gactttcgca gcgccttccg ccgtcttctg1080tgccgctgcg gccgtcgcct gcctccggag ccctgcgccg ccgcccgccc ggccctcttc1140ccctcgggcg ttcctgcggc ccggagcagc ccagcgcagc ccaggctttg ccaacggctc1200gacggggctt cttggggagt ttcttag1227<210>3<211>20<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>引物<400>3gccagcgaag tcacgaacac 20<210>4<211>14<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>引物<400>4ggcgctggcg gtgc14<210>5<211>16<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>探針<400>5ccatcgcccg gactcc 16<210>6<211>19<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>探針<400>6ccatcgcccg gactccgag 19
<210>7<211>19<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>探針<400>7gtcatcgtgg ccatcgccc 19<210>8<211>20<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>探針<400>8cgtggccatc gcccggactc 20<210>9<211>20<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>探針<400>9catcgcctgg actccgagac 20<210>10<211>18<212>DNA<213>人工序列
<220>
<223>探針<400>10catcgcctgg actccgag18<210>11<211>16<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>探針<400>11catcgcctgg actccg 16<210>12<211>15<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>探針<400>12catcgcctgg actcc 1權(quán)利要求
1.一種核酸探針，其末端用熒光染料標(biāo)記，其中熒光染料的熒光隨雜交而減少，所述核酸探針具有的核苷酸序列從SEQ ID NO1所示核苷酸序列的第183位核苷酸開始、具有8～30個(gè)核苷酸的長度并且探針的5’末端用熒光染料標(biāo)記，或者核酸探針具有的核苷酸序列在SEQ ID NO2所示核苷酸序列的第196位核苷酸終止、具有7～30個(gè)核苷酸的長度并且探針的3’末端用熒光染料標(biāo)記。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的核酸探針，其中核酸探針具有SEQ IDNOS8-12的任一核苷酸序列。
3.一種檢測突變的方法，包括使用熒光染料標(biāo)記的核酸探針并測定熒光染料的熒光而對具有單核苷酸多態(tài)性位點(diǎn)的核酸進(jìn)行解鏈曲線分析，并在解鏈曲線分析結(jié)果的基礎(chǔ)上檢測突變，其中單核苷酸多態(tài)性是編碼β3腎上腺素能受體的核酸的核苷酸序列的一個(gè)突變，該突變導(dǎo)致β3腎上腺素能受體氨基酸序列64位色氨酸被精氨酸替換的突變，并且所述核酸探針是如權(quán)利要求1或2中所定義的核酸探針。
4.根據(jù)權(quán)利要求3所述的方法，其中包含在樣品中的核酸中的含有單核苷酸多態(tài)性位點(diǎn)的區(qū)域被擴(kuò)增以獲得顯示單核苷酸多態(tài)性的核酸。
5.根據(jù)權(quán)利要求4所述的方法，其中通過使用DNA聚合酶的方法進(jìn)行擴(kuò)增。
6.根據(jù)權(quán)利要求5所述的方法，其中在核酸探針存在時(shí)進(jìn)行擴(kuò)增。
7.用于如權(quán)利要求3中所定義方法的試劑盒，其包括一種末端用熒光染料標(biāo)記的核酸探針，其中熒光染料的熒光隨雜交而減少，所述核酸探針具有的核苷酸序列從SEQ ID NO1的核苷酸序列的第183位核苷酸開始、具有8～30個(gè)核苷酸的長度并且探針的5’末端用熒光染料標(biāo)記，或者核酸探針具有的核苷酸序列在SEQ ID NO2的核苷酸序列的第196位核苷酸終止、具有7～30個(gè)核苷酸的長度并且探針的3’末端用熒光染料標(biāo)記。
8.根據(jù)權(quán)利要求7所述的試劑盒，其中核酸探針具有SEQ IDNOS8-12的任一核苷酸序列。
9.根據(jù)權(quán)利要求7或8所述的試劑盒，其進(jìn)一步包括引物，用于擴(kuò)增包含編碼β3腎上腺素能受體的核酸中核苷酸序列中的突變的區(qū)域，所述突變導(dǎo)致β3腎上腺素能受體氨基酸序列64位色氨酸被精氨酸替換的突變，所述擴(kuò)增通過使用DNA聚合酶的方法進(jìn)行。
全文摘要
用PCR擴(kuò)增核酸探針，所述探針中包含堿基序列突變的區(qū)域?qū)е铝甩?腎上腺素受體氨基酸序列64－位的色氨酸被替換為精氨酸的突變(B3AR Trp64Arg突變)，所述探針的一端用熒光染料標(biāo)記，并在雜交時(shí)顯示出熒光染料的熒光減少。該探針具有的堿基序列從SEQ IDNO1所示堿基序列的183－位堿基開始、由8～30個(gè)堿基組成并在5’末端用熒光染料標(biāo)記，或者其堿基序列在SEQ ID NO2所示堿基序列的196－位堿基終止、由7～30個(gè)堿基組成并在3’末端用熒光染料標(biāo)記。使用該核酸探針測定熒光染料的熒光以進(jìn)行解鏈曲線分析。基于解鏈曲線分析結(jié)果來檢測突變。
文檔編號G01N33/58GK1809638SQ200480017019
公開日2006年7月26日 申請日期2004年4月16日 優(yōu)先權(quán)日2003年4月18日
發(fā)明者平井光春 申請人:愛科來株式會社