專利名稱：生物芯片和生物芯片試劑盒,及其制造方法和使用方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種生物芯片，具有井，在其底部設(shè)置由具有均等孔徑的直細(xì)孔構(gòu)成的濾器；以及由該生物芯片和容器構(gòu)成的生物芯片試劑盒；和探針載體微粒相互作用的分析物物質(zhì)中的靶物質(zhì)與探針之間的反應(yīng)或相互作用方法；從分析物中B/F分離靶物質(zhì)的方法；將靶物質(zhì)從分析物中分離分級(jí)的方法；以及被檢測(cè)物質(zhì)中的靶物質(zhì)和生物探針的反應(yīng)、相互作用的檢測(cè)·鑒定方法。
背景技術(shù)：
雙鏈DNA，例如即使通過加熱作為單鏈DNA的時(shí)，也因?yàn)槠錁?gòu)造是互補(bǔ)的，所以具有相互結(jié)合的性質(zhì)，利用該性質(zhì)確立了Northern雜交法。因此，以往用限制性內(nèi)切酶等將具有適當(dāng)長(zhǎng)度特定序列的DNA片段化，或?qū)⒑铣傻墓丫酆塑账嶙鳛樘结樖褂?，檢索具有與其互補(bǔ)序列的DNA片段和寡聚核苷酸等，將該檢索作為標(biāo)準(zhǔn)方法。
但是，Northern雜交法操作復(fù)雜，即使在處理少量分析物時(shí)，也存在不能在短時(shí)間內(nèi)處理的問題。因此，開發(fā)了DNA芯片，作為應(yīng)用Northern雜交法的簡(jiǎn)便處理方法，在載玻片等基板上高密度地固定上述寡聚核苷酸等，可以用短時(shí)間進(jìn)行分析的方法，現(xiàn)在，正被廣泛地使用。
作為該DNA芯片的代表示例，在硅等平面基板上固定寡聚核苷酸。該芯片是，在基板上固定1堿基之后，使該堿基和其他堿基分別結(jié)合，可以生成伸長(zhǎng)到具有20～30個(gè)堿基的長(zhǎng)度，在光照射下或在有酸存在的條件下，使具有規(guī)定的堿基序列的寡聚核苷酸直接在芯片上合成，從而制造DNA芯片。例如在特開昭63-27000號(hào)公報(bào)中記載了在硅等基板上In Situ合成寡聚核苷酸等的DNA芯片。
或者，可以使cDNA或預(yù)合成的適當(dāng)長(zhǎng)度的寡聚核苷酸等核酸在基板上結(jié)合而制成，在該方法中，將準(zhǔn)備分離的核酸從微粒載體中分離，將其用點(diǎn)樣器在規(guī)定位置進(jìn)行點(diǎn)樣，即使用布朗(Brown)法。
但是，在前者方法中，由于在芯片上合成堿基序列，如果在一部分堿基序列中發(fā)生合成錯(cuò)誤，則導(dǎo)致其整個(gè)芯片為劣質(zhì)品。其結(jié)果，芯片的成品率變?yōu)閥4np。這里，y是一次堿基合成工序中正合成概率，n是堿基數(shù)，p是探針數(shù)。因此，探針數(shù)增加時(shí)，成品率按幾何級(jí)數(shù)下降。這里，設(shè)置備用的探針，并設(shè)置代替不良探針的探針，因此基板面積變大。
另外，在后者方法中，DNA的點(diǎn)樣量和點(diǎn)樣位置取決于點(diǎn)樣器的精度等，很難得到良好的再現(xiàn)性。
而且，在這些微陣列或DNA芯片中，可能搭載有關(guān)一個(gè)分析物的數(shù)萬項(xiàng)目的核酸等探針，數(shù)萬項(xiàng)目的同時(shí)也能夠有其他項(xiàng)目檢查，探針被固定在基板上，分析物和探針的反應(yīng)成為固定的探針和液體中分析物的反應(yīng)，即被稱為固液反應(yīng)。一般地，固液反應(yīng)的反應(yīng)效率差，即與分析物的雜交反應(yīng)需要數(shù)小時(shí)。
而且，為了高精度地檢測(cè)具有目標(biāo)堿基序列的核酸，需要在狹窄的空間中高效率固定具有與該核酸互補(bǔ)序列的核酸(以下稱為“探針”)?？晒潭ㄔ诖祟惢迳系纳鲜鎏结樀臄?shù)量根據(jù)每個(gè)探針的占有面積和DNA芯片自身的大小來確定，在物理上超過一定數(shù)量以上的固定是不可能的。因此，正如現(xiàn)在正在使用的DNA芯片，在使其浸入分析物并反應(yīng)的這類芯片中，因?yàn)榇嬖诳赡苁褂玫姆治鑫锏牧糠浅Ｉ俚那闆r，所以芯片自身為小的較好。
但是，如果降低芯片的大小尺寸，則因?yàn)榭梢怨潭ㄌ结樀拿娣e也隨之變小，且空間狹窄而導(dǎo)致檢測(cè)信號(hào)變?nèi)?，從而檢測(cè)靈敏度下降。
為改良上述問題點(diǎn)，最近，制造并銷售在3D膠上固定有上述探針的芯片(例如，參照Analyticai Clinica Acta第444卷p.69-78(2001年))。在上述芯片中，探針被立體固定在3D膠上，由于探針密度很高，檢測(cè)信號(hào)的強(qiáng)度也變高，但噪聲信號(hào)強(qiáng)度也隨之變高，因此S/N比沒有提高，很難大幅改善檢測(cè)精度。這里，作為噪聲信號(hào)強(qiáng)度上升的因素，認(rèn)為是很難除去通過在3D膠上固定有上述探針的芯片和分析物的非特異反應(yīng)而形成的生成物。
另外，還開發(fā)了一種芯片捆扎中空線后，在上述中空線內(nèi)壁上使探針結(jié)合，形成三維化探針，由此使探針密度上升(參照特開2000-181074號(hào)公報(bào))。
而且，近年還開發(fā)了一種生物芯片可以使用具有垂直各向異性細(xì)孔的多孔質(zhì)氧化鋁基板，在該垂直孔的內(nèi)壁上固定探針，以三維構(gòu)造提高探針密度，而且利用使孔垂直地變空的泄放(Blow down)構(gòu)造，使分析物和探針反應(yīng)后，清洗除去非靶物質(zhì)(參照特表平9-504864號(hào)公報(bào)(國(guó)際公開第01/12846號(hào)公報(bào)))。
像這樣在使探針與中空線的內(nèi)壁或多孔質(zhì)氧化鋁的細(xì)孔內(nèi)壁結(jié)合的上述任意一種方法中，為了把探針固定在固定壁上，需要在分析物與探針反應(yīng)時(shí)，分析物接近或接觸被固定了的探針。但是，該探針的大小與反應(yīng)空間體積相比極其微小，用反應(yīng)空間的刻度尺觀察，探針只不過是以從固定壁稍微突起出來的，分析物接近或接觸探針的概率極低。因此，在上述方法中，需要長(zhǎng)時(shí)間的攪拌方可產(chǎn)生反應(yīng)。
而且，像這樣在三維構(gòu)造的內(nèi)壁上固定探針時(shí)，如果將孔的深度設(shè)置得很深，孔內(nèi)壁的表面張力變大，使檢測(cè)體和清洗液等的輸入排出變得困難。
如上所述，還可實(shí)行一種方法代替向固定壁固定探針，讓微粒承載探針，在含有該探針載體微粒的溶液中，使探針載體微粒和分析物中的靶物質(zhì)進(jìn)行反應(yīng)。該方法中，在探針載體微粒在溶液中向三維空間分散時(shí)，因?yàn)樘结樰d體微粒和分析物可以相互移動(dòng)，具有反應(yīng)性非常高的特點(diǎn)。例如，已知檢測(cè)·鑒定方法使分析物中的靶物資與乳膠微粒表面的探針特效反應(yīng)，通過B/F(Bound form/Free form)分離，解析特效地與探針反應(yīng)結(jié)合后的靶物質(zhì)的內(nèi)容。
在ucleic Acid Research第14卷p.5037-5048(1986年)中，記載了一種方法使檢測(cè)體的靶物質(zhì)和承載微粒的核酸探針在溶液中雜交之后，離心分離除去未反應(yīng)的分析物。這種方法現(xiàn)在被廣泛使用。但是，像這樣使用離心分離時(shí)，需要分離時(shí)間，而且分離性能不是那么高的問題。
在日本專利特開昭63-27000號(hào)公報(bào)、特許第2975603號(hào)公報(bào)中，記載了一種方法作為承載探針的微粒使用磁性微粒，通過磁體固定該磁性微粒，并清洗除去未反應(yīng)的分析物。該方法現(xiàn)在也被廣泛使用。但是，磁性微粒一般為了發(fā)揮磁特性而需要大小為1微米以上，由于含有鐵酸鹽(ferrite)等金屬磁性成分導(dǎo)致比重很大，容易沉降和凝聚、還需要注意保存性和操作性。
在特開昭63-27000號(hào)公報(bào)中，記載了一種方法使分析物的靶核酸和承載微粒的核酸探針在溶液中雜交之后，用濾紙進(jìn)行過濾清洗，測(cè)定來自在濾紙上被濃縮的反應(yīng)的信號(hào)。該方法也被廣泛使用。但是，在該方法中，作為微粒使用的乳膠微粒的量非常多，不但需要過濾時(shí)間，而且濾紙容易堵塞。
而且，上述文獻(xiàn)中記載的、使用探針載體微粒的任意一種方法都不能對(duì)于一個(gè)種類的分析物進(jìn)行通過多個(gè)探針多項(xiàng)目同時(shí)檢查(Mutiplex Assay)或多項(xiàng)同時(shí)分離分級(jí)。
作為使用探針載體微粒進(jìn)行多項(xiàng)目同時(shí)檢查的方法，添加了用于識(shí)別多個(gè)探針的識(shí)別標(biāo)記微粒，提出了使用該微粒的方法。例如在美國(guó)專利第5,736,330號(hào)公報(bào)、特開昭62-81566號(hào)公報(bào)、特公平7-54324號(hào)公報(bào)中，記載了一種方法使用經(jīng)熒光著色的多個(gè)微?；蛭⒘Ｖ睆讲煌亩鄠€(gè)微粒，微粒分別承載不同的探針，用顏色和粒徑等特別設(shè)定探針的種類，用流式細(xì)胞器(Flow cytometer)檢測(cè)分析物和探針載體微粒的反應(yīng)。該方法現(xiàn)在也被廣泛使用。
但是，在該方法中，用附帶濾器的96孔板過濾與分析物反應(yīng)的探針載體微粒，或用離心分離等方法經(jīng)B/F分離之后，注入流式細(xì)胞器進(jìn)行檢測(cè)。這時(shí)，分析物一度用附帶濾器的板或離心分離用離心分離管被處理，之后為了能掛在流式細(xì)胞器中，而增加工序的同時(shí)，有可能通過板、管產(chǎn)生污染和分析物的附著造成的減損。
而且，在用顏色識(shí)別的方法中，用于識(shí)別的顏色的種類有限，利用一定波長(zhǎng)范圍內(nèi)和光強(qiáng)度的組合可以進(jìn)行分光的光大約100種，因此，大約100種的顏色和強(qiáng)度的組合，即有同時(shí)檢查的限度為100種探針。
其他，在特開平11-243997號(hào)公報(bào)中，記載了通過微粒大小及其形狀識(shí)別微粒的方法。而且，在特開2000-346842號(hào)公報(bào)中，記載了一種方法將微粒以一維或二維排列，為了區(qū)分種類不同探針微粒，將大小不同的微微粒作為分離隔壁使用。
在上述各文獻(xiàn)中記載的、識(shí)別微粒進(jìn)行多項(xiàng)目同時(shí)檢查的任意一種方法中，為了識(shí)別微粒而通過流式細(xì)胞器來進(jìn)行檢測(cè)。但是，在該通過流式細(xì)胞器的方法中，使微粒流入細(xì)管中，由于向該細(xì)管的透明部分照射激光，連續(xù)地識(shí)別微粒，存在花費(fèi)檢測(cè)時(shí)間的問題。而且，為了縮短檢測(cè)時(shí)間，而不花費(fèi)識(shí)別一個(gè)微粒的時(shí)間，有可能降低檢測(cè)精度。而且，流式細(xì)胞器的細(xì)管價(jià)格昂貴，交換替換每個(gè)分析物的細(xì)管的費(fèi)用也是問題。因此，清洗替換每個(gè)分析物的細(xì)管是必要的，為了充分地進(jìn)行清洗更需要時(shí)間。
在生物芯片中，作為它的探針可以是固定有DNA片段或寡聚核苷酸的DNA芯片；其他還有固定有抗原以及抗體等蛋白質(zhì)、或者與這些蛋白質(zhì)特效反應(yīng)或相互作用的化學(xué)物質(zhì)的蛋白質(zhì)芯片等，上述問題在這些蛋白質(zhì)芯片等中同樣存在。
這些DNA芯片以及蛋白質(zhì)芯片通過固定在基板上的各種探針，可以應(yīng)用于生物具有的基因的功能分析；為了確認(rèn)各種感染病等疾病的患者狀況，而進(jìn)行的臨床檢查；基因多型解析；被稱為對(duì)癥(Tailor-made)治療的、根據(jù)患者的基因序列的治療醫(yī)藥的選定；用于醫(yī)藥品開發(fā)的化學(xué)物質(zhì)或蛋白的篩選或化學(xué)物質(zhì)的毒性篩選；其他各種篩選等。
但是，為了應(yīng)用到上述各種用途，在現(xiàn)在正在使用的生物芯片中檢測(cè)靈敏度不充分。例如，為了能在最初期發(fā)現(xiàn)疾病，有必要在疾病的最初期階段中，檢測(cè)從細(xì)胞向細(xì)胞外移動(dòng)的、極其微量的疾病由來的標(biāo)記，但用現(xiàn)有生物芯片的檢測(cè)靈敏度來檢測(cè)該極微量的標(biāo)記是不夠的，需要更高靈敏度的生物芯片。
而且，為了能得到有關(guān)患者所患疾病狀態(tài)的正確信息，使診斷誤差減到最小，用單一的探針是不充分的，要使用多個(gè)不同探針進(jìn)行多項(xiàng)目同時(shí)檢查。因此，期望能夠以高檢測(cè)靈敏度進(jìn)行多項(xiàng)目同時(shí)檢查的生物芯片。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明為了解決上述現(xiàn)有技術(shù)的問題而研發(fā)，其目的是提供一種可以在短時(shí)間使分析物中的靶物質(zhì)和探針高效率地反應(yīng)；B/F分離效率高；以高靈敏度進(jìn)行檢測(cè)·鑒定的生物芯片及其制造方法。
另外，本發(fā)明的目的是提供一種生物芯片試劑盒，在多個(gè)由井(well)形成的生物芯片之間、或者在多個(gè)由井構(gòu)成的生物芯片和多個(gè)由井構(gòu)成的容器之間，可以直接在井之間進(jìn)行液體的收受。
而且，本發(fā)明的目的是提供以下方法
使用該生物芯片，從一個(gè)分析物中分離分級(jí)至少一種以上的靶物質(zhì)的分離分級(jí)方法；從多數(shù)分析物中同時(shí)并行地分離至少一種以上靶物質(zhì)的分離分級(jí)方法；從一個(gè)分析物中分離至少一種以上靶物質(zhì)的試驗(yàn)方法；從多數(shù)分析物中同時(shí)并行地分離至少一種以上靶物質(zhì)的試驗(yàn)方法。
(i)本發(fā)明的生物芯片的特征是，具有底部設(shè)置有濾器的井，所述濾器包括按均等孔間隔形成的具有均等孔徑的直細(xì)孔。
(ii)本發(fā)明的生物芯片的特征是，在(i)中所述的生物芯片中，上述濾器的厚度為1～10μm。
(iii)本發(fā)明的生物芯片的特征是，在(i)或(ii)中所述的生物芯片中，上述濾器的開口面積比為15～60％。
(iv)本發(fā)明的生物芯片的特征是，在(i)～(iii)任意一項(xiàng)所述的生物芯片中，上述濾器的表面材質(zhì)為二氧化硅、二氧化鈦或氧化鋁。
(v)本發(fā)明的生物芯片的特征是，在(i)～(iv)任意一項(xiàng)所述的生物芯片中，具有彼此整體形成的多個(gè)上述井。
(vi)本發(fā)明的生物芯片的特征是，在(i)～(iv)任意一項(xiàng)所述的生物芯片中，具有單個(gè)的上述井。
(vii)本發(fā)明的生物芯片的特征是，在(i)～(vi)任意一項(xiàng)所述的生物芯片中，在上述井中的濾器的上側(cè)或下側(cè)，設(shè)置有補(bǔ)強(qiáng)用肋部。
(viii)本發(fā)明的生物芯片的特征是，在(vii)中所述的生物芯片中，上述補(bǔ)強(qiáng)用肋部呈形成有多個(gè)貫通孔的一體形狀。
(ix)本發(fā)明的生物芯片的特征是，在(vii)或(viii)中所述的生物芯片中，上述補(bǔ)強(qiáng)用肋部直接與上述濾器結(jié)合。
(x)本發(fā)明的生物芯片的特征是，在(vii)或(viii)中所述的生物芯片中，上述補(bǔ)強(qiáng)用肋部是與上述濾器用相同的材料連續(xù)延伸形成的。
(xi)本發(fā)明的生物芯片的特征是，在(i)～(x)任意一項(xiàng)所述的生物芯片中，在上述井的底部，在距其圓周邊緣規(guī)定寬度內(nèi)，設(shè)置未形成濾器細(xì)孔的無孔部。
(xii)本發(fā)明的生物芯片的特征是，在(i)～(xi)任意一項(xiàng)所述的生物芯片中，在底部設(shè)置第一濾器的同時(shí)，以把井夾在中間的方式，在第一濾器的相反一側(cè)設(shè)置第二濾器。
(xiii)本發(fā)明的生物芯片的特征是，在(i)～(xii)任意一項(xiàng)所述的生物芯片中，在上述井中收容具有分散了探針載體微粒的分散液。
(xiv)本發(fā)明的生物芯片的特征是，上述微粒的粒徑與濾器的孔徑的比率為粒徑/孔徑＝1.1～2.5，并且粒徑＜孔間隔＜粒徑×10。
(xv)本發(fā)明的生物芯片的特征是，上述微粒的粒徑、濾器的孔徑以及孔間隔滿足粒徑＞孔徑+孔間隔/2的關(guān)系。
(xvi)本發(fā)明的生物芯片的特征是，在(xiii)中所述的生物芯片中，在上述井中收容具有分散了探針載體微粒的分散液，該探針載體微粒具有用于提供探針識(shí)別信息的至少一種識(shí)別手段。
(xvii)本發(fā)明的生物芯片的特征是，在(xvi)中所述的生物芯片中，上述識(shí)別手段為從探針載體微粒的顏色、形狀、粒徑以及基因序列中選擇至少一種。
(xviii)本發(fā)明的生物芯片的特征是，在(xvi)或(xvii)中所述的生物芯片中，在全部上述識(shí)別手段的探針識(shí)別信息相同的多個(gè)探針載體微粒被收容在同一井中，并且對(duì)于收納于各井中的多個(gè)探針載體微粒的上述探針識(shí)別信息相同。
(xix)本發(fā)明的生物芯片的特征是，在(xvi)或(xvii)中所述的生物芯片中，在全部上述識(shí)別手段的探針識(shí)別信息相同的多個(gè)探針載體微粒被收容在同一井中，并且對(duì)于收納于各井中的多個(gè)探針載體微粒的上述探針識(shí)別信息不同。
(xx)本發(fā)明的生物芯片的特征是，在(xvi)或(xvii)中所述的生物芯片中，在至少一種上述識(shí)別手段的探針識(shí)別信息不同的多個(gè)探針載體微粒被收容在同一井中，并且對(duì)于收納于各井中的多個(gè)探針載體微粒，在其全部識(shí)別手段中的上述探針識(shí)別信息的構(gòu)成相同。
(xxi)本發(fā)明的生物芯片的特征是，在(xvi)或(xvii)中所述的生物芯片中，在至少一種上述識(shí)別手段的探針識(shí)別信息不同的多個(gè)探針載體微粒被收容在同一井中，并且對(duì)于被收納于各井中的多個(gè)探針載體微粒，在其全部識(shí)別手段中的上述探針識(shí)別信息的構(gòu)成不同。
(xxii)本發(fā)明的生物芯片試劑盒的特征是，具有容器，該容器或者收容(i)～(xxi)任意一項(xiàng)所述的生物芯片中的彼此整體形成的多個(gè)井或單個(gè)井，或者與上述井連接。
(xxiii)本發(fā)明的生物芯片試劑盒的特征是，在(xxii)中所述的生物芯片試劑盒中，上述容器與上述井形成為一體。
(xxiv)本發(fā)明的生物芯片試劑盒的特征是，在(xxii)中所述的生物芯片試劑盒中，上述容器與上述井相互獨(dú)立地形成。
(xxv)本發(fā)明的生物芯片試劑盒的特征是，在(xxii)～(xxiv)任意一項(xiàng)所述的生物芯片試劑盒中，上述容器具有與上述生物芯片的井相對(duì)應(yīng)的井。
(xxvi)本發(fā)明的生物芯片試劑盒的特征是，在(xxv)中所述的生物芯片試劑盒中，在上述容器的井底部形成貫通孔。
(xxvii)本發(fā)明的生物芯片試劑盒的特征是，在(xxv)或(xxvi)中所述的生物芯片試劑盒中，將上述生物芯片與上述容器連接，以使對(duì)應(yīng)的井相互聯(lián)結(jié)。
(xxviii)本發(fā)明的生物芯片試劑盒的特征是，在(xxii)～(xxvii)任意一項(xiàng)所述的生物芯片試劑盒中，上述容器是使用形成有貫通孔的板和未形成貫通孔的板中的至少一種，通過層疊多個(gè)上述板而形成的。
(xxix)本發(fā)明的生物芯片試劑盒的特征是，將(i)～(xxi)任意一項(xiàng)所述的多個(gè)生物芯片彼此之間相連接，以使對(duì)應(yīng)的井相互聯(lián)結(jié)。
(xxx)本發(fā)明的生物芯片試劑盒的特征是，在(xxii)～(xxix)任意一項(xiàng)所述的生物芯片試劑盒中，將設(shè)置在上述生物芯片的井側(cè)部下端的平坦部和設(shè)置在分離的上述容器或上述生物芯片的井側(cè)部上端的平坦部直接連接，并使井相互聯(lián)結(jié)。
(xxxi)本發(fā)明的生物芯片試劑盒的特征是，在(xxii)～(xxix)任意一項(xiàng)所述的生物芯片試劑盒中，在上述生物芯片的井側(cè)部下端設(shè)置有，與分離的上述容器或上述生物芯片的井側(cè)部上端所設(shè)凸部相嵌合的定位用的凹部；或與分離的上述容器或上述生物芯片的井側(cè)部上端所設(shè)凹部相嵌合的定位用凸部。
(xxxii)本發(fā)明的生物芯片的制造方法的特征是，在制造(i)～(xxi)任意一項(xiàng)所述的生物芯片時(shí)，對(duì)于用不同組分的材質(zhì)形成的至少由兩層構(gòu)成的板，通過蝕刻圖案進(jìn)行蝕刻，從一側(cè)蝕刻到二層的邊界而形成井孔，同時(shí)通過蝕刻圖樣進(jìn)行蝕刻，從另一側(cè)蝕刻到二層的邊界而形成濾器孔，由此得到井和濾器結(jié)合的生物芯片。
(xxxiii)本發(fā)明的生物芯片的制造方法的特征是，在制造(i)～(xxi)任意一項(xiàng)所述的生物芯片時(shí)，通過蝕刻硅晶片分別制造濾器、肋以及井，然后將其層疊。
(xxxiv)本發(fā)明的生物芯片試劑盒的操作方法的特征是，在收容在容器與生物芯片的井獨(dú)立地形成的(xxii)～(xxxi)中任意一項(xiàng)所述的生物芯片試劑盒的該容器中的溶液內(nèi)，通過使生物芯片的井上下移動(dòng)，使在該容器內(nèi)的溶液與井內(nèi)的探針載體微粒和/或溶液相接觸。
(xxxv)本發(fā)明的生物芯片試劑盒的操作方法的特征是，通過使收容在(xxii)～(xxxi)中任意一項(xiàng)所述的生物芯片試劑盒的容器中的溶液的界面上下移動(dòng)，使在該容器內(nèi)的溶液與井內(nèi)的探針載體微粒和/或溶液相接觸。
(xxxvi)本發(fā)明的生物芯片試劑盒的操作方法的特征是，使(xxii)～(xxxi)中任意一項(xiàng)所述的生物芯片試劑盒所具有用于連接生物芯片的容器和芯片之間、或在該芯片中的井相互之間產(chǎn)生壓差，由此產(chǎn)生井內(nèi)的液體和探針載體微粒的接觸、液體在井之間的移動(dòng)，或二者同時(shí)產(chǎn)生。
(xxxvii)本發(fā)明的生物芯片試劑盒的操作方法的特征是，使(xxii)～(xxxi)中任意一項(xiàng)所述的生物芯片試劑盒所具有用于連接生物芯片的容器和芯片之間、或該芯片中的井相互之間產(chǎn)生壓差，由此產(chǎn)生井內(nèi)的液體和探針載體微粒的接觸、液體在井之間的移動(dòng)，或二者同時(shí)產(chǎn)生。
(xxxviii)本發(fā)明的生物芯片試劑盒的操作方法的特征是，在(xxxiv)～(xxxvii)任意一項(xiàng)所述的方法中，通過使上述容器內(nèi)的溶液和井內(nèi)的探針載體微粒和/或溶液接觸，對(duì)生物芯片內(nèi)的內(nèi)容物進(jìn)行混合、擴(kuò)散、反應(yīng)、分離或清洗。
(xxxix)本發(fā)明的生物芯片試劑盒的操作方法的特征是，在(xxxiv)～(xxxviii)任意一項(xiàng)所述的方法中，向上述生物芯片的各井中投入相同的分析物。
(xl)本發(fā)明的生物芯片試劑盒的操作方法的特征是，在(xxxiv)～(xxxviii)任意一項(xiàng)所述的方法中，向上述生物芯片的各井中投入彼此不同的分析物。
(xli)本發(fā)明的分析物中的靶物質(zhì)和探針的反應(yīng)方法的特征是，包括以下步驟
將特定的微粒放置在(xxii)～(xxxi)任意一項(xiàng)所述的試劑盒中生物芯片的井內(nèi)，形成(xviii)～(xxii)任意一項(xiàng)所述的芯片；向上述生物芯片的井內(nèi)，投入含有分析物的溶液，使該分析物和所有井內(nèi)的上述微粒形成可能接觸的狀態(tài)；以及在生物芯片容器所收容的上述溶液中使井上下移動(dòng)、或使收容在生物芯片容器中的上述溶液的界面上下移動(dòng)，或者通過施加壓差使井內(nèi)外的溶液循環(huán)，從而使分析物中的靶物質(zhì)和探針反應(yīng)。
(xlii)本發(fā)明的從分析物中B/F分離靶物質(zhì)的方法，其特征是，包括以下步驟將特定微粒放置在(xxii)～(xxxi)任意一項(xiàng)所述的試劑盒的生物芯片的井中，形成(xviii)～(xxii)任意一項(xiàng)所述的芯片；向上述生物芯片的井內(nèi)，投入含有分析物的溶液，使該分析物和所有井內(nèi)的上述微粒形成可能接觸的狀態(tài)；使上述溶液的界面高度降低到低于井底部的濾器的下表面，從而將未與上述微粒所承載的探針反應(yīng)的分析物從各井內(nèi)除去；以及向生物芯片的井中投入清洗液，通過上述容器使清洗液在該生物芯片的井中循環(huán)，向該生物芯片的井內(nèi)外輸入排出清洗液，并從井中排出清洗液，從而清洗去除探針結(jié)合的靶物質(zhì)以外的物質(zhì)。
(xliii)本發(fā)明的分析物中靶物質(zhì)的分離分級(jí)方法，其特征是，包括以下步驟
將特定微粒放置在(xxx)或(xxxi)中所述的試劑盒中的生物芯片的井中，形成(xviii)～(xxi)任意一項(xiàng)所述的芯片；向上述生物芯片的井內(nèi)，投入含有分析物的溶液，使該分析物和所有井內(nèi)的上述微粒形成可能接觸的狀態(tài)；使上述溶液的界面高度降低到低于井底部的濾器的下表面，將未與上述微粒所承載的探針反應(yīng)的分析物從各井內(nèi)除去；向生物芯片的井中投入清洗液，通過上述容器使清洗液在該生物芯片的井中循環(huán)，向該生物芯片的井內(nèi)外輸入排出清洗液，并從井中排出清洗液，從而清洗去除探針結(jié)合的靶物質(zhì)以外的物質(zhì)；以及使在上述生物芯片的井側(cè)部下端設(shè)置的凹部、凸部或平滑部與在容器上端具有的與其對(duì)應(yīng)的凸部、凹部或平滑部嵌合，然后向生物芯片的井中投入分離劑溶液，由此從上述微粒中分離分析物中的靶物質(zhì)，并移動(dòng)到上述容器的井中。
(xliv)本發(fā)明的分析物中的靶物質(zhì)和探針相互作用的檢測(cè)·鑒定方法，其特征是，包括以下步驟將特定微粒放置在(xxii)～(xxxi)任意一項(xiàng)所述的試劑盒中的生物芯片的井內(nèi)，形成(xviii)～(xxi)任意一項(xiàng)所述的芯片；向上述生物芯片的井內(nèi)，投入含有分析物的溶液，使該分析物和所有井內(nèi)的上述微粒形成可能接觸的狀態(tài)；使上述溶液的界面高度降低到低于井底部的濾器的下表面，將未與上述微粒所承載的探針反應(yīng)的分析物從各井內(nèi)除去；
向生物芯片的井中投入清洗液，通過上述容器使清洗液在該生物芯片的井中循環(huán)，向該生物芯片的井內(nèi)外輸入排出清洗液，并從井中排出清洗液，從而清洗去除探針結(jié)合的靶物質(zhì)以外的物質(zhì)；使井內(nèi)的微粒定位于濾器的細(xì)孔內(nèi)；以及檢測(cè)·鑒定上述微粒所承載的探針和分析物的靶物質(zhì)之間的反應(yīng)或相互作用。
(xlv)本發(fā)明的分析物中的靶物質(zhì)和探針相互作用的檢測(cè)·鑒定方法，其特征是，在(xliv)所述的方法中，對(duì)于每個(gè)微粒檢測(cè)兩方面信息，即微粒的探針識(shí)別信息，以及上述微粒所承載的探針和分析物的靶物質(zhì)之間的反應(yīng)或相互作用的信息。
(xlvi)本發(fā)明的分析物中的靶物質(zhì)和探針相互作用的檢測(cè)·鑒定方法，其特征是，在(xliv)所述的方法中，對(duì)于各井中的微粒，識(shí)別上述微粒上所承載的探針識(shí)別信息，然后計(jì)測(cè)有關(guān)探針和分析物中的靶物質(zhì)的相互作用，以基于各微粒的相互作用的狀態(tài)信息，計(jì)算出以井為單位的相互作用信息。
根據(jù)本發(fā)明，提供了一種可以在短時(shí)間使分析物中的靶物質(zhì)和探針高效率地反應(yīng)；B/F分離效率高；可進(jìn)行高靈敏度的定量檢測(cè)的生物芯片及其制造方法。
而且，根據(jù)本發(fā)明，提供一種生物芯片試劑盒，在多個(gè)由井構(gòu)成的生物芯片之間、或者在多個(gè)由井構(gòu)成的生物芯片和多個(gè)由井構(gòu)成的容器之間，可以直接在井之間進(jìn)行液體的收受。
而且，根據(jù)本發(fā)明，提供使用該生物芯片，從一個(gè)分析物中分離至少一種以上的靶物質(zhì)的分離分級(jí)方法；從多數(shù)分析物中同時(shí)地分離至少一種以上的靶物質(zhì)的分離分級(jí)方法；從一個(gè)分析物中分離至少一種以上靶物質(zhì)的試驗(yàn)方法；從多數(shù)分析物中同時(shí)地分離至少一種及一種以上的靶物質(zhì)的試驗(yàn)方法。


圖1為本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施例中的生物芯片具有的井的底部一側(cè)的剖面圖；圖2為濾器的細(xì)孔示例的模式剖面圖；圖3為設(shè)置有補(bǔ)強(qiáng)用肋部的井的底部一側(cè)的模式剖面圖；圖4為在濾器表面上設(shè)置有補(bǔ)強(qiáng)用肋部的狀態(tài)俯視圖；圖5為在濾器表面上設(shè)置有補(bǔ)強(qiáng)用肋部的井底部的電子顯微鏡照片；圖6為設(shè)置有補(bǔ)強(qiáng)用肋部的井底部的模式剖面圖；圖7為設(shè)置有補(bǔ)強(qiáng)用肋部的井底部的模式剖面圖；
圖8為在補(bǔ)強(qiáng)用肋部設(shè)置有定位結(jié)合用凹部的井的底部模式剖面圖；圖9為在補(bǔ)強(qiáng)用肋部設(shè)置有定位結(jié)合用凹部的井的底部模式剖面圖；圖10為在井的底部上表面，從其圓周邊緣開始以規(guī)定寬度設(shè)置有無孔部的井的底部模式剖面圖；圖11為用光造模制造肋或井的方法的說明圖；圖12為本發(fā)明的實(shí)施例中的生物芯片的上表面圖以及A-A’剖面圖；圖13為本發(fā)明的實(shí)施例中生物芯片的上表面圖以及A-A’剖面圖；圖14為同時(shí)具有第一濾器和第二濾器的生物芯片的剖面圖；圖15為說明連接了生物芯片和容器的生物芯片試劑盒的制造方法的剖面圖；圖16為在形成生物芯片試劑盒的容器的底部或蓋部的板上，作為光學(xué)檢測(cè)使用了平滑透明的板的示例剖面圖；圖17為使用板形成容器的生物芯片試劑盒的示例剖面圖；圖18為將芯片多段設(shè)置的生物芯片試劑盒的示例剖面圖；圖19為制造由多個(gè)井構(gòu)成的芯片的方法的說明圖；圖20為本發(fā)明涉及的生物芯片的操作方法的說明圖；
圖21為說明本發(fā)明涉及的分析物中的靶物質(zhì)的分離分級(jí)方法以及檢測(cè)方法的一個(gè)工序的芯片剖面圖；圖22為說明本發(fā)明涉及的分析物中的靶物質(zhì)的分離分級(jí)方法以及檢測(cè)方法的一個(gè)工序的芯片剖面圖；圖23為說明本發(fā)明涉及的分析物中的靶物質(zhì)的分離分級(jí)方法的一個(gè)工序的芯片剖面圖；圖24為在容器的井底面上設(shè)置有細(xì)微的貫通孔的生物芯片試劑盒的剖面圖；圖25為說明本發(fā)明涉及的分析物中的靶物質(zhì)的檢測(cè)方法的一個(gè)工序的芯片剖面圖；圖26為井中收納有探針載體微粒的本發(fā)明的生物芯片的示例說明圖；圖27為在本發(fā)明的生物芯片的井中投入分析物的方法說明圖；圖28為將探針載體微粒定位于濾器孔上的電子顯微鏡照片；圖29為對(duì)芯片的各井的底部拍照的電子顯微鏡照片；圖30為使牛血清稀釋液流入實(shí)施例3的芯片的濾器中，從下容器的下蓋排出牛血清稀釋液時(shí)，表示排出量的總和與排出時(shí)間的關(guān)系的圖表；圖31為表示在芯片的孔徑和孔間隔不同的八種組合中，以18gf/cm2的壓差進(jìn)行與實(shí)施例3相同的試驗(yàn)結(jié)果的圖表。
具體實(shí)施例方式
以下，參照附圖對(duì)本發(fā)明進(jìn)行具體的說明。圖1為本發(fā)明的實(shí)施例中生物芯片具有的井的底部剖面圖。
如圖所示，該井16在其底部設(shè)置形成有細(xì)孔19的濾器18。該濾器18的構(gòu)成是，使分析物或者溶解或分散有分析物的媒體等液體通過的同時(shí)，在井16內(nèi)收容的、與分析物相互作用的探針載體微粒不向外部排出。
在本發(fā)明中，在濾器18上，按均等孔間隔形成有具有均等孔徑的直細(xì)孔。且，本說明書中所述“均等的孔徑”其意思是孔徑誤差小于等于CV(Coefficient of Variation)值的20％，優(yōu)選小于等于10％?？讖秸`差小于等于CV值的20％的細(xì)孔可以根據(jù)后述方法制造，可以使收容在井16內(nèi)的探針載體微粒和孔徑的尺寸差很微小。
對(duì)于以往使用的膜濾器等的孔徑，有10倍左右的差量，例如使用0.2μm孔徑的濾器時(shí)，實(shí)際上可以被過濾的粒徑為5μm左右。與之相比，使用上述具有均等孔徑的濾器時(shí)，由于濾器細(xì)孔的孔徑嚴(yán)格均等，可以使粒徑和孔之差很小，因此可以使孔徑更大，在提高濾器的過濾性的同時(shí)，還能降低過濾壓力。
上述具有均等孔徑的濾器中，其細(xì)孔的孔徑?jīng)]有特別的限制，通常為0.01μm～100μm，優(yōu)選0.1μm～50μm，更優(yōu)選0.5μm～15μm。
而且，所謂“均等孔間隔”的意思是孔間隔的誤差小于等于CV(Cofficient of Variation)值的15％。對(duì)于孔間隔沒有特別的限制，但由于孔間隔非常狹窄時(shí)，濾器的強(qiáng)度減弱，且當(dāng)孔間隔很大時(shí)，開口面積比下降，所以通常孔間隔為小于等于孔徑的2倍，且優(yōu)選為0.5μm～10μm。并且，所謂“孔間隔”是在鄰接的各孔之間的未開孔部分的最短距離。
而且，在本發(fā)明中，所謂“直”細(xì)孔的意思是細(xì)孔在路徑上未形成分支。例如，在一側(cè)濾器表面上形成的開口中心開始向另一側(cè)濾器表面做垂線；再從該另一側(cè)濾器表面上的開口中心開始向上述一側(cè)濾器表面做垂線時(shí)，即使兩垂線偏離，但是壓力損失的這一點(diǎn)并不那么嚴(yán)重，因此可以采用這類細(xì)孔。而且，也可以采用實(shí)質(zhì)上是該兩垂線沒有偏離，且濾器第一側(cè)(上表面?zhèn)?的孔徑與第二側(cè)(下表面?zhèn)?的孔徑不同的細(xì)孔。作為上述細(xì)孔形狀可以是例如圖2的(a)～(d)所示的形狀。與貫通方向垂直的細(xì)孔的剖面形狀沒有特別的限定，可以是圓柱、四棱錐、多棱錐中的任意一種，但從使彎液面(meniscus)最小的觀點(diǎn)來看，優(yōu)選鈍角形狀或圓形。但是，井的容積大于等于規(guī)定量，例如大于等于0.1微升時(shí)，彎液面就沒有問題，采用四棱柱或四棱錐等也沒有問題。
以上述直細(xì)孔形成濾器的細(xì)孔的長(zhǎng)度最小，因而，與細(xì)孔壁的接觸面積減小，可以使過濾所產(chǎn)生的加壓阻力達(dá)到最小。
而且，即使探針載體微粒堆積在濾器的第一側(cè)而引起堵塞時(shí)，微粒不能進(jìn)入濾器的內(nèi)部而停留在濾器表面(形成所謂的完全閉塞模型)，通過從濾器的第二側(cè)沖刷走(flushing)，可以輕易的使微粒從濾器表面向第一側(cè)分散。因此，可以再次解除濾器的堵塞使之循環(huán)使用，而延長(zhǎng)濾器的壽命。
如上所述，由于在濾器上以均等孔間隔形成具有均等孔徑的直細(xì)孔，探針載體微粒被排列在第一側(cè)的開口上，根據(jù)需要從第二側(cè)上沖刷分析物等液體，可以使微粒向第一側(cè)分散，從而可以容易地進(jìn)行分析物和探針載體微粒的反應(yīng)和檢測(cè)。
而且，不允許向?yàn)V器的第二側(cè)排出探針載體微粒，在需要100％捕捉微粒的情況下，沒有因考慮微粒大小等因素，以使濾器的孔徑大于微粒的最小直徑，而使透過系數(shù)和過濾效率降低的問題，就可以捕捉100％的微粒。
普通的濾紙和膜濾器的孔徑、孔間隔不是均等的，而且孔自身是三維的復(fù)雜構(gòu)造，在濾器內(nèi)部存在比濾器表面更細(xì)的孔。因此，濾液中所含微粒的一部分被濾器內(nèi)部的孔捕捉，產(chǎn)生被稱為中間閉塞模型的堵塞，為解除該堵塞，從第二側(cè)送入液體將存在于濾器的微粒從濾器內(nèi)向第一側(cè)取出時(shí)，通過沖刷的效果不充分，不能在第一側(cè)將所有微粒從濾器取出，被封在濾器內(nèi)，使用于檢測(cè)的微粒減少。而且，濾器的微粒捕捉效率是有比率的，為達(dá)到100％的捕捉效率，選擇“成為舊對(duì)象的粒徑分布的最小粒徑＞濾器徑分布的最大徑”的濾器，但由此透過系數(shù)和過濾效率降低。
在本發(fā)明中，濾器的厚度優(yōu)選1～10μm，更優(yōu)選2～7μm。當(dāng)濾器的厚度大于10μm時(shí)，過濾液體時(shí)的過濾阻力變大；當(dāng)濾器的厚度不足1μm時(shí)，濾器的機(jī)械強(qiáng)度不足。
在本發(fā)明中，濾器的開口面積比優(yōu)選15～60％，更優(yōu)選20～50％。當(dāng)開口面積比不足15％時(shí)，過濾效率降低；當(dāng)開口面積比大于60％時(shí)，濾器的機(jī)械強(qiáng)度不足。
濾器可以由具有細(xì)孔的各種形態(tài)的物質(zhì)構(gòu)成。具體來說可以是通過模具沖壓件，織布，在濾器上用激光或中子射線穿孔而形成的濾器；使樹脂或金屬薄膜受傷并通過張力擴(kuò)孔而形成的濾器；通過光刻使基材穿孔而形成的濾器；由樹脂成型的濾器等。
如上所述，具有由均等孔徑、以均等孔間隔形成的細(xì)孔的濾器，例如可以通過光刻法制造，向規(guī)定的有機(jī)或無機(jī)濾器涂布抗蝕劑，通過圖案蝕刻使漏空規(guī)定的孔形成濾器。為了確保具有規(guī)定機(jī)械強(qiáng)度的膜厚和規(guī)定的孔徑，需要進(jìn)行高方位(aspect)的蝕刻，還可以通過異向性蝕刻實(shí)施。
而且，也可以通過膨脹合金的方法來制造。例如，向厚度為30μm的不銹鋼箔用模具形成交錯(cuò)狀的切口，將其擴(kuò)張形成菱形的貫通孔。根據(jù)該方法，可以得到菱形孔的最大距離為30μm、開口面積比為60％左右的濾器。然后，將得到的膨脹合金濾器再用凸模具進(jìn)行沖壓處理，形成規(guī)定的凹面，由此得到一體形成的多個(gè)井?；蛘?，另外用樹脂或金屬制造蜂窩狀或圓球型等上下貫通的井群，在井群的底面涂布并干燥可塑性樹脂溶液，通過熱連接加熱了的濾器和井，來連接上述膨脹合金濾器和井群，從而形成井。
而且，如下所述，可以通過用樹脂將井側(cè)部和濾器一體成型的方法來制造。
作為生物芯片特別優(yōu)選的制造方法可以是用不同組成的多種材質(zhì)構(gòu)成的板，例如對(duì)于鋁/氧化鋁、金屬硅/二氧化硅、或金屬鈦/二氧化鈦等，通過分別從兩側(cè)進(jìn)行圖案蝕刻，形成濾器和井。具體來說，例如，通過對(duì)于氧化鋁、二氧化硅、二氧化鈦等金屬氧化物層，蝕刻至該金屬氧化物層和金屬層的邊界而形成濾器，然后對(duì)于鋁、金屬硅、金屬鈦等金屬層，蝕刻至該金屬層和金屬氧化物層的邊界，制造井和濾器相結(jié)合的生物芯片。
根據(jù)該方法，通過使用金屬和金屬氧化物等事先形成一體的多層材料，可以制造使濾器和井結(jié)合一體，不會(huì)發(fā)生從濾器和井之間的界面漏液等問題。
而且，由于作為濾器層可以使用氧化鋁、二氧化硅、二氧化鈦等透明材料，通過光檢測(cè)進(jìn)行檢測(cè)時(shí)，通過濾器層可以直接觀察到微粒的運(yùn)動(dòng)。
作為形成濾器的材料，在減小過濾阻力等方面，優(yōu)選與被收容在井中的溶液親和性高的材料，具體來看，優(yōu)選溶液為水系時(shí)，選擇親水性的材料；溶液為油性時(shí)，選擇親油性的材料。
作為親水性的有機(jī)材料可以使用，例如聚乙烯乙烯基樹脂、交聯(lián)聚乙烯醇樹脂、聚脲乙酸樹脂、聚酰胺樹脂、聚亞胺、乙酸纖維素樹脂、三乙酰纖維素、硝酸纖維素樹脂、環(huán)氧樹脂、2-甲基丙稀酰羥乙基磷酰膽堿和甲基丙稀酸酯的共聚物等各種丙稀酸酯的共聚物等。
作為親油性的有機(jī)材料可以使用，例如聚乙烯、聚丙稀、聚苯乙烯、聚甲基丙烯酸甲酯樹脂、液晶聚合物、聚碳酸酯、聚酰胺樹脂、聚亞胺、聚乙烯對(duì)苯二酸酯、聚乙烯萘酚酯、環(huán)烯烴、聚甲基戊烯、聚烯丙酯、聚砜、聚醚砜等。
而且，作為無機(jī)材料可以使用，例如鐵、鎳、銅、鋅、鋁、硅、鈦、鉭、鎂、鉬、鎢、銠、鈀、銀、金、白金、不銹鋼、黃銅、紅黃銅、青銅、磷青銅、鋁銅合金、鋁鎂合金、鋁鎂硅合金、鋁鋅合金、鐵鎳合金等金屬；二氧化硅、氧化鋁、二氧化鈦、氧化鋯、氧化坦等金屬氧化物；SiN、TiN、TaN等金屬氮化物；SiC、WC等金屬碳化物；金剛石、石墨、類金剛石炭(Diamond Like CarbonDLC)等碳材料；鈉鈣玻璃、硼硅酸玻璃、派熱克斯玻璃(商標(biāo))、石英玻璃等玻璃等。
而且，也可以在親油性材料的表面上實(shí)施等離子處理、電暈處理或離子處理等，形成羥基、羧基等。而且，也可以通過電鍍等在表面上形成親水性金屬或金屬氧化物；或者也可以鍍上例如2-甲基丙稀酰羥乙基磷酰膽堿和甲基丙稀酸酯的共聚物、聚乙二醇衍生物等親水性材料；或者也可以涂布縮水甘油甲基丙烯酸酯之后，使環(huán)氧基開環(huán)。
在上述中特別是，優(yōu)選表面材質(zhì)為氧化鋁、二氧化硅、二氧化鈦的作為濾器的材料。由于它們具有親水性，生物分析物的非特異性吸附很低，而且水系的分析物和清洗液容易浸入濾器內(nèi)。而且，不僅在表面而且通過在內(nèi)部也用相同的材質(zhì)，由于濾器透明，作為檢測(cè)方法而使用光學(xué)檢測(cè)方法時(shí)，可以通過透明的濾器容易地檢測(cè)·鑒定微粒探針和分析物標(biāo)記的反應(yīng)、相互作用。
用表面材質(zhì)為氧化鋁、二氧化硅、二氧化鈦的材料形成濾器時(shí)，也可以使用鋁、金屬硅或金屬鈦形成由濾器和井構(gòu)成的芯片，之后進(jìn)行氧化形成氧化鋁、二氧化硅、二氧化鈦；或者還可以準(zhǔn)備由鋁/氧化鋁、金屬硅/二氧化硅、金屬鈦/二氧化鈦構(gòu)成的板，使用該板形成井和濾器。
<井部>
一個(gè)生物芯片所具有的井的數(shù)量沒有特別的限定，可以根據(jù)容納的帶有探針的微粒的種類或微粒的個(gè)數(shù)任意設(shè)定，可以使用由單個(gè)井構(gòu)成的芯片或由形成一體的多個(gè)井構(gòu)成的芯片中的任意一種。而且，探針載體微粒的種類即使一種，可以在容納用于分離精制等的多數(shù)微粒時(shí)，設(shè)置多個(gè)井，在各井中分散容納相同的探針微粒。
如圖1的(a)、(b)所示，井可以由與濾器不同的材料形成，而且如圖1的(c)所示，也可以用與濾器實(shí)質(zhì)上相同的材料一體形成。而且，在圖1的(a)、(b)中濾器的材料和井的材料是用不同的材料形成的，但也可以用相同材料分別形成濾器和井之后，再將它們結(jié)合。
如圖1的(b)、(c)所示，井在濾器層中沒有形成濾器的部分，與濾器連接，對(duì)此優(yōu)選在機(jī)械強(qiáng)度好的面上實(shí)施。
井部的直徑和高度沒有特別的限定，可以根據(jù)所需微粒的個(gè)數(shù)和反應(yīng)的容積任意設(shè)定。井的直徑變大時(shí)，濾器表面的面積也變大，可能因向?yàn)V器施加的總壓力引起濾器彎曲或被破壞，但通過設(shè)置下述肋，可以避免該彎曲或破壞。
而且，在具有多個(gè)井的芯片中，這些井的直徑未必要相同，考慮到容納的微粒的數(shù)量和反應(yīng)容積，可以設(shè)置不同直徑的井。
由井側(cè)部構(gòu)成的井孔的形狀沒有特別的限定，為使彎液面最小優(yōu)選鈍角或圓形。
<補(bǔ)強(qiáng)用肋部>
上述在底部設(shè)置有濾器的井中，由于濾器的厚度薄，當(dāng)井的孔徑大或?yàn)V器的開口面積比大時(shí)，井底部的強(qiáng)度不足，在使用時(shí)等濾器容易破損或損傷。這里，在上述情況下，優(yōu)選在濾器的上表面一側(cè)或下表面一側(cè)設(shè)置肋狀的強(qiáng)度輔助裝置來補(bǔ)充增強(qiáng)井底部。
圖3為設(shè)置有上述補(bǔ)強(qiáng)用肋部的井的底部模型側(cè)向剖面圖。在圖3的(a)中，在濾器18的下表面一側(cè)設(shè)置具有突條部的肋部23。在圖3的(b)中，在濾器18的上表面一側(cè)設(shè)置肋部23。
圖4為在濾器18表面上側(cè)設(shè)置有補(bǔ)強(qiáng)用肋部23的狀態(tài)上表面示意圖。如圖所示，其形狀為形成有多個(gè)貫通孔29的一體狀，優(yōu)選在貫通孔29之間連接有肋。與貫通孔29的貫通方向大致垂直的截面不限定為圓形、矩形、六邊形這類多邊形等，為降低彎液面現(xiàn)象優(yōu)選圓形或六邊形等鈍角多邊形。在圖5中，表示實(shí)際在濾器上設(shè)置的補(bǔ)強(qiáng)用肋部的電子顯微鏡照片。
補(bǔ)強(qiáng)用肋部的肋高度根據(jù)井的底面積和肋的材質(zhì)，優(yōu)選10μm～2000μm，更優(yōu)選100μm～1000μm。
通過設(shè)置上述補(bǔ)強(qiáng)用肋部，提高了濾器的機(jī)械強(qiáng)度，使用芯片面積大的也可以。而且，即使濾器很薄也能獲得對(duì)機(jī)械壓力的耐性，同時(shí)由于可以使用濾器孔深度淺的濾器，可以進(jìn)一步降低過濾壓力。
補(bǔ)強(qiáng)用肋部可以如圖6的(a)所示與濾器分別形成并結(jié)合；或者如圖6的(b)、(c)所示，也可以用加成法等將肋或井材料打碎并填補(bǔ)而結(jié)合濾器18的細(xì)孔?？梢詫⒕膫?cè)壁20貫通濾器18并將其貫通的下端部作為補(bǔ)強(qiáng)用肋部23的一部分。
將另外形成的補(bǔ)強(qiáng)用肋部或井側(cè)壁與濾器結(jié)合時(shí)，優(yōu)選不使用連接劑而直接結(jié)合。直接結(jié)合是，通過層疊濾器和補(bǔ)強(qiáng)用肋部或井側(cè)壁而累積形成的方法等，也可以實(shí)施下述的方法。
在該方法中，由于不通過連接劑等而直接結(jié)合，可以消除在過濾時(shí)將補(bǔ)強(qiáng)用肋部或井側(cè)壁與濾器的界面剝離或過濾對(duì)象液進(jìn)入界面的問題。尤其在使用井的開口直徑小、井?dāng)?shù)量多的芯片時(shí)，井側(cè)壁和濾器的結(jié)合變得困難并以幾何級(jí)數(shù)增長(zhǎng)，在界面容易產(chǎn)生液漏，但是通過不使用連接劑將井和濾器直接結(jié)合時(shí)，可以解除液漏問題。而且，設(shè)置補(bǔ)強(qiáng)用肋部作為濾器的機(jī)械強(qiáng)度補(bǔ)充材料，與濾器連接不充分時(shí)，機(jī)械強(qiáng)度就不能得到提高。
但是，像這樣不使用連接劑而直接結(jié)合，使濾器和肋以充分的強(qiáng)度而一體化，從而提高機(jī)械強(qiáng)度。
而且，如圖7(a)、(b)所示，可以用與濾器相同材料連續(xù)地形成補(bǔ)強(qiáng)用肋部，由于是一體形成的，則具有理想的強(qiáng)度。這里所謂相同材料可以是和原素材相同的，例如將金屬硅的一部分氧化而得到氧化硅的二氧化硅/硅材料；將金屬硅的一部分碳化或氮化而得到SiC或SiN的硅/SiC、硅/SiN材料等；將上述視為相同材料。井的側(cè)壁也可以同樣地與濾器連續(xù)地形成。作為其制造方法，在預(yù)先制造濾器時(shí)，不使井或肋部穿孔，然后在形成井或肋時(shí)，在該部分進(jìn)行定位，形成井或肋，采用從相同的材料上切削或蝕刻而制造出濾器和補(bǔ)強(qiáng)用肋部或井側(cè)壁的方法等，通過后述方法進(jìn)行。
而且，在肋部23或井的側(cè)壁20的部分上，濾器18的細(xì)孔根據(jù)需要也可以不存在。具體來說，如圖1的(b)、(c)所示，制造濾器18時(shí)，預(yù)先形成沒有細(xì)孔的部分，將肋部23或井的側(cè)壁20定位在該沒有細(xì)孔的部分上制作；或者在通過加成法制造肋部23和濾器18時(shí)，可以同時(shí)實(shí)施孔填充方法。
如圖8的(a)、(b)以及圖9的(a)、(b)所示的井中，在濾器的下表面或上表面設(shè)置上述補(bǔ)強(qiáng)用肋部23，同時(shí)在該補(bǔ)強(qiáng)用肋部23中的井側(cè)部20的下端位置，形成與在另一容器上設(shè)置的凸部嵌合的定位用的凹部27。凹部27的具體形狀可以是對(duì)應(yīng)于在另一容器上設(shè)置的凸部形成適宜的形狀。即，在井上形成的凹部27是將規(guī)定的井內(nèi)的溶液移動(dòng)并替換至其他容器的規(guī)定的井時(shí)，具有作為容器連接器的陰型部分的溝，因與容器的陽型部分嵌合，可以使井內(nèi)的溶液不向容器的規(guī)定部分之外泄漏而移動(dòng)。定位用凹部的溝的形狀沒有特別限定，只要作為陰型部分可與在容器上設(shè)置有陽型部分的凸部嵌合即可。
而且，不設(shè)置井的定位用凹部或凸部，如圖8的(c)、圖9的(c)所示也可以不形成凹部27而形成平滑底面來進(jìn)行結(jié)合。該平滑面越平滑，面之間的結(jié)合就越牢固。例如，使用市售的半導(dǎo)體用硅晶片，尤其使用超平滑硅晶片時(shí)，可以獲得極其牢固的結(jié)合面。
通過設(shè)置上述定位用凹部的井而產(chǎn)生的液體移動(dòng)，在分別具有多個(gè)收容有移動(dòng)溶液的井和具有相應(yīng)的多個(gè)井的容器的情況下，能有效在相對(duì)應(yīng)的井之間同時(shí)并行地轉(zhuǎn)移全部對(duì)應(yīng)井中的溶液。而且，也可以適用于從具有多個(gè)井的容器向具有相對(duì)應(yīng)的井的芯片進(jìn)行的液體移動(dòng)，或者在多個(gè)芯片之間進(jìn)行的液體移動(dòng)。
具有上述溝的肋可以通過下述各種方法可以與通常使用的肋相同地進(jìn)行制造。井側(cè)部的寬度和形狀沒有特別的限定，井側(cè)部的寬度優(yōu)選大于等于100μm，更優(yōu)選大于等于20μm小于等于10mm，最優(yōu)選大于等于300μm小于等于5mm。當(dāng)井側(cè)部的寬度不足100μm時(shí)，使定位用凹部與容器的凸部嵌合變得困難；或者當(dāng)結(jié)合平滑面時(shí)，由于定位偏差使結(jié)合面積變小。當(dāng)井側(cè)部的寬度超過10mm時(shí)，在規(guī)定面積中井所占據(jù)的部分變得過小，而使芯片的制成率降低。
上述定位結(jié)合用的凹部與是否是補(bǔ)強(qiáng)用肋部23的一部分無關(guān)，而形成于井的側(cè)部20的下端。另一方面上述在井的下端形成的凹部也可以是凸部或平滑部，此時(shí)，在與相應(yīng)的容器或芯片上應(yīng)該形成嵌合用的凹部或者平滑部。
在圖10所示的井中，在井的底部上表面，從其圓周邊緣規(guī)定的寬度內(nèi)，設(shè)置無孔部28，該無孔部28上不形成濾器18的細(xì)孔19。
作為該無孔部28的規(guī)定寬度，從井底部的圓周邊緣開始優(yōu)選為5μm～50μm，更優(yōu)選10μm～30μm。尤其，如圖10的(b)所示，優(yōu)選無孔部28的表面為傾斜的。若沒有該無孔部，在肋或井的壁邊緣設(shè)置有細(xì)孔時(shí)，微粒滯留在壁邊緣上，或還有堆積等現(xiàn)象發(fā)生。通過設(shè)置無孔部，井和濾器間的連接部上的機(jī)械強(qiáng)度提高，且剝離的可能性降低。而且，可以防止溶液發(fā)生從井或肋的壁邊緣向中心部移動(dòng)的層流，產(chǎn)生微粒滯留或堆積在井或肋的壁邊緣上的現(xiàn)象。而且，在下述光學(xué)檢測(cè)時(shí)，為了使在壁邊緣沒有微粒，可以通過從井壁的光反射來防止阻礙壁邊緣上微粒的檢測(cè)。
具有該無孔部的井可以通過下述方法進(jìn)行制造預(yù)先在特定的區(qū)域制造設(shè)置有無孔帶的濾器，使井或補(bǔ)強(qiáng)用肋部定位到無孔帶并結(jié)合；或通過加成法在無孔帶上層疊井或補(bǔ)強(qiáng)用肋部等。而且圖10的(b)所示，無孔部28的表面傾斜的構(gòu)造可以在預(yù)先形成濾器部之后，在井的高度方向進(jìn)行濕法蝕刻，通過殘留蝕刻殘部而形成。
以下，對(duì)上述井的各種制造方法進(jìn)行說明。
第一方法是通過電鍍層疊濾器等的方法。在本方法中，預(yù)先準(zhǔn)備進(jìn)行了導(dǎo)電性處理的基板，在其上用抗蝕劑等進(jìn)行印刻圖形，將未電鍍的部分用抗蝕劑保護(hù)，通過使電流流過基板和電鍍?nèi)芤褐g，只在基板的規(guī)定部分形成金屬或離子性聚合物材料。
首先，準(zhǔn)備進(jìn)行了導(dǎo)電性處理的基板，在其上涂布抗蝕劑。將該抗蝕劑在導(dǎo)電性基板上形成膜之后，準(zhǔn)備光掩膜并用UV光進(jìn)行曝光顯像，在導(dǎo)電性薄板上形成濾器的反向圖案的抗蝕柱(post)。通過上述方法圖案的界限依賴于抗蝕劑的析像度，例如通過使用THB-110N(商品名，JSR株式會(huì)社制)，可以制造圖案誤差5μm、縱橫尺寸比為2的抗蝕柱。
然后，在這些柱之間，根據(jù)電鍍法使交流或直流電流流過金屬或離子性樹脂而進(jìn)行電性填充。作為根據(jù)電鍍法被填充的金屬材料可以使用金、鎳、銅、鐵、鐵鎳合金等。作為用于鎳電鑄的電鍍液可以使用氨基磺酸鎳浴(60％氨基磺酸溶液700g/l、溴化鎳5g/l、硼酸35g/l的混合溶液，浴溫50℃)等；作為銅電鍍液可以使用硫酸銅浴(硫酸銅200g/l、硫酸60g/l、氯離子30mg/l的混合溶液，浴溫30℃)等；作為鐵電鍍液可以使用氨基磺酸鐵浴(氨基磺酸鐵400g/l、氨基磺酸胺30g/l、福爾馬林100mg/l的混合溶液，浴溫46℃)等。例如，使用氨基磺酸鎳浴時(shí)，通過電壓6V、電流密度3A/dm2的直流電10至20左右，可以得到厚度為5μm的電鍍物。
而且，作為通過電鍍法被填充的樹脂材料可以使用環(huán)氧樹脂、丙烯酸樹脂、聚酰亞胺樹脂等。作為這些樹脂可以使用例如株式會(huì)社清水Ekote公司制造的、日本PAINT株式會(huì)社的PowerTop U等丙烯酸樹脂。
而且不論金屬、樹脂都可以添加各種添加劑，例如通過添加二氧化硅、二氧化鈦、氧化鋁等金屬氧化物微粒、氟素樹脂微粒等，可以使形成的膜的化學(xué)性質(zhì)變化。
然后，在樹脂電鑄時(shí)，通過最后加熱到約200℃，使樹脂硫化(cure)的同時(shí)，煅燒除去抗蝕劑。在使用電鍍法時(shí)，例如通過除膜器THB-S1(商品名，JSR株式會(huì)社制)來除去抗蝕劑。
如上所述制造濾器之后，可以用與形成濾器的方法相同的方法，再使用電鍍法制造井或補(bǔ)強(qiáng)用肋部。即，與上述相同地在濾器上形成保護(hù)膜，然后進(jìn)行光刻，通過電鍍法進(jìn)行材料填充。這種情況下，通常為使井的高度大于等于濾器的厚度，要求保護(hù)膜也變厚，因此優(yōu)選將保護(hù)膜層疊干膜抗蝕劑使用。通常，一次形成線寬和厚度的比大于2的電鍍物很困難，在上述情況下，要反復(fù)數(shù)次通過光刻和電鍍法形成電鍍物的操作才能形成規(guī)定高度的井。
在第二方法中，通過蝕刻方法制造濾器、井、補(bǔ)強(qiáng)用肋部中至少一種。蝕刻的對(duì)象物是，對(duì)于能夠形成濾器的物質(zhì)不限定為金屬、金屬氧化物、有機(jī)物等，但是特別優(yōu)選的是機(jī)械強(qiáng)度高的材料，具體來說，例如液晶聚合物、聚碳酸酯、聚酰胺樹脂、聚亞胺、聚乙烯對(duì)苯二酸酯、聚乙烯萘酚酯、聚烯丙酯、聚砜、聚醚砜等工程塑料；鐵、鎳、銅、鋅、鋁、硅、鈦、鉭、鎂、鉬、鎢、銠、鈀、銀、金、白金、不銹鋼、黃銅、紅黃銅、青銅、磷青銅、鋁銅合金、鋁鎂合金、鋁鎂硅合金、鋁鋅鎂合金、鐵鎳合金等金屬；二氧化硅、氧化鋁、二氧化鈦、氧化鋯、氧化坦等金屬氧化物；SiN、TiN、TaN等金屬氮化物；SiC、WC等金屬碳化物；金剛石、石墨、類金剛石炭(Diamond LikeCarbonDLC)等碳材料；鈉鈣玻璃、硼硅酸玻璃、派熱克斯玻璃(商標(biāo))、石英玻璃等玻璃等。
可以根據(jù)通常的方法進(jìn)行蝕刻。但是，縱橫尺寸比過大的蝕刻可能發(fā)生孔徑或形狀不均等，實(shí)際上通過通常的化學(xué)蝕刻得到的縱橫尺寸比小于等于5，優(yōu)選小于等于3。但是，因在該縱橫尺寸比的范圍內(nèi)主動(dòng)使用形成倒圓錐形的濾器，也可以得到過濾性良好的濾器。
而且，通過蝕刻制造井或肋形狀時(shí)，優(yōu)選縱橫尺寸比大于等于5，根據(jù)材料的各向異性蝕刻可以進(jìn)行縱橫尺寸比大于等于5的蝕刻。例如，利用硅等單晶材料對(duì)于KOH水溶液或乙二胺·鄰苯二酚(EDP)、4甲基氫氧化胺(TMAH)等蝕刻液表現(xiàn)出的很大的結(jié)晶依賴性的性質(zhì)。使用硅的情況下，(111)面的蝕刻速度相對(duì)于其他結(jié)晶面相當(dāng)慢，使用將(110)面作為表面的硅晶片，并使掩模材料的開口邊與(111)面的方向一致來進(jìn)行化學(xué)蝕刻，可以進(jìn)行縱橫尺寸比為100左右的蝕刻。這些方法記載于精密工學(xué)會(huì)、編著《納米級(jí)加工技術(shù)》，日刊工業(yè)新聞社(1993)。
而且，根據(jù)需要，可以進(jìn)行應(yīng)用等離子的反應(yīng)性離子蝕刻(RIE)。例如用在SF6中含有氟里昂系的氯元素氣體的氣體，進(jìn)行與基板垂直異性的蝕刻。這些方法記載于《’02最新半導(dǎo)體處理技術(shù)》、Press Joumal社(2001)。
尤其，優(yōu)選由不同組成的多種材質(zhì)構(gòu)成的板，例如對(duì)于鋁/氧化鋁、金屬硅/二氧化硅、或金屬鈦/二氧化鈦等，分別從兩側(cè)進(jìn)行圖案蝕刻而形成濾器和井的方法。具體來說，例如對(duì)于氧化鋁、二氧化硅、二氧化鈦等金屬氧化物層，光刻至該金屬氧化物層與金屬層的邊界而形成濾器，然后對(duì)于鋁、金屬硅、金屬鈦等金屬層，光刻至該金屬層與金屬氧化物層的邊界，通過該方法制作井和濾器結(jié)合生物芯片。
根據(jù)該方法，可以通過使用預(yù)先準(zhǔn)備的金屬和金屬氧化物等一體形成的復(fù)層材料，使濾器和井結(jié)合一體，不存在從濾器和井之間的界面產(chǎn)生漏液等問題。
而且，由于作為濾器的一層可以使用氧化鋁、二氧化硅、二氧化鈦等透明材料，因而利用光檢測(cè)進(jìn)行檢測(cè)時(shí)，通過濾器層可以直接觀察到微粒的運(yùn)動(dòng)。
作為上述復(fù)層材料可以使用，例如將鋁板表面氧化到規(guī)定厚度而得到氧化鋁的鋁/氧化鋁板、同樣地氧化金屬鈦的金屬鈦/二氧化鈦板、帶有氧化膜的硅晶片、或SOI(Silicone On Insulator)晶片等。
而且，可以通過蝕刻法蝕刻硅晶片，分別形成濾器、肋以及井，利用硅晶片的平滑性將其層疊而得到芯片。這種情況下，用于制造濾器、肋以及井的硅晶片的厚度分別適宜地設(shè)定，蝕刻方法也可以分別對(duì)于各個(gè)濾器、肋以及井使用干法蝕刻和濕法蝕刻。
在該方法中，與用相同材料蝕刻濾器和肋或井的方法相比，不必打開具有斜坡的孔，打開濾器、肋以及井上分別設(shè)定了直徑的貫通孔之后，由于只將它們層疊構(gòu)成，所以制造簡(jiǎn)便。而且，根據(jù)硅的平滑性進(jìn)行結(jié)合，由于不使用連接劑而結(jié)合界面，所以可以制造不存在從界面產(chǎn)生的液漏，并且剝離強(qiáng)度高的芯片。
為了以規(guī)定的位置間隔層疊濾器、肋以及井，優(yōu)選在其上預(yù)先設(shè)置定位結(jié)合用標(biāo)記，根據(jù)該標(biāo)記進(jìn)行定位結(jié)合。而且，在溶液中層疊時(shí)，為了防止從層疊板的橫向偏差而產(chǎn)生層疊面的剝離，優(yōu)選加緊層疊面。
在第三方法中，通過金屬的陽極氧化來制造濾器。作為對(duì)象金屬可以使用鋁、硅等。以下以鋁為例對(duì)具體示例說明。首先，準(zhǔn)備鋁板。根據(jù)情況鋁板優(yōu)選預(yù)先形成有側(cè)面比井的深度淺大約100μm左右的凹面的。例如井的深度為5mm、濾器的厚度為20μm時(shí)，準(zhǔn)備鋁板厚度為5.0mm并具有4.9mm凹面的鋁板。在凹面內(nèi)部，以維持陽極氧化步驟中的機(jī)械強(qiáng)度為目的，填充褐煤酸蠟、聚乙烯蠟(Clariant株式會(huì)社制)等蠟等的填充物，可以在濾器形成后通過熱熔融除去。
然后，在這些凹面的相反一側(cè)上，形成用于開設(shè)濾器孔的先導(dǎo)孔。該先導(dǎo)孔的誤差小于等于1μm，優(yōu)選小于等于0.5μm；其深度優(yōu)選大于等于0.1μm。該先導(dǎo)孔除通過使用模具沖壓的方法之外，也可以使用抗蝕劑光刻得到。
然后，將上述鋁在草酸或硫酸溶液中施加電壓的同時(shí)進(jìn)行陽極氧化。其具體方法記載于特開2003-11099號(hào)公報(bào)。通過陽極氧化制造濾器之后，為了使在鋁上形成有凹面的底面和濾器孔貫通，向鋁井的凹面滴入磷酸、氫氟酸、硝酸等強(qiáng)酸或它們的混合酸或氯化鐵。例如使用氯化鐵時(shí)，可以進(jìn)行50℃、20分鐘的蝕刻，將井底面貫通至濾器孔的表面。上述方法記載于應(yīng)用物理第69卷第5號(hào)(2000)、特開2000-258650號(hào)公報(bào)等。根據(jù)該陽極氧化的方法，可以制造孔徑為5～450nm、縱橫尺寸比約為100、大小為5～10mm左右的濾器。
在第四方法中，用樹脂的納米印刷(nanoprint)來制造濾器。首先，準(zhǔn)備用于通過納米印刷形成濾器的基板?；蹇梢允瞧交陌?，也可以是為了形成井孔而預(yù)先具有殘留厚度約100μm左右的底部的凹面的板。該凹面也可以與上述相同地填充蠟。
預(yù)先準(zhǔn)備的納米印刷用的模。模的制造方法沒有特別的限定，但對(duì)設(shè)置有孔徑小于等于幾十μm的孔的模的制造方法有限定，通常根據(jù)利用硅的結(jié)晶各向異性的各向異性蝕刻或X射線光刻的方法，即通過MEMS(Micro Electro Mechanical System)技術(shù)制得?；蛘呖梢允褂靡愿鶕?jù)MEMS技術(shù)制成的模為基礎(chǔ)，進(jìn)行金屬電鍍而得到的倒模。將上述預(yù)先準(zhǔn)備的鑄型安裝到加壓裝置。作為該納米印刷裝置可以使用Tectoria株式會(huì)社制造的NPHT-1、株式會(huì)社日立制作所的納米印刷裝置、明昌機(jī)工株式會(huì)社的納米印刷裝置等。
作為通過納米印刷成型的樹脂優(yōu)選流動(dòng)性良好的樹脂，液晶共聚物或結(jié)晶性尼龍樹脂等比較適合?；蛘哌€可以在對(duì)環(huán)氧樹脂或聚氨酯丙烯酸酯等低聚物加壓的同時(shí)，進(jìn)行光硬化或熱硬化。環(huán)氧樹脂或聚氨酯丙烯酸酯為液態(tài)樹脂，除此之外還可以使用預(yù)胎(pre-preg)膜狀的物質(zhì)。
根據(jù)上述納米印刷加壓成型的濾器不脫模而在底面殘留皮狀的樹脂，這樣成型失敗很少，且容易脫模。而且考慮到脫模的難易和模的損傷，形成的孔優(yōu)選縱橫尺寸比為小于等于10，更優(yōu)選小于等于5。
而且，成型時(shí)有目的地將皮部分作為井部而留下，另外可以通過挖空或蝕刻使該皮部分形成井。將膜殘?jiān)鳛榫玫那闆r下，具體來說從基板上剝離樹脂殘?jiān)∑?，可以?duì)剝離部分鉆孔或光刻至濾器部分而開設(shè)貫通孔?；蛘哌€可以進(jìn)行機(jī)械穿孔至一部分后，用酸或堿等蝕刻除去最后的幾十～幾百μm。
在第五方法中，用光造型制造肋或井。首先，通過上述電鑄、蝕刻、金屬陽極氧化、樹脂的納米印刷中任意一種方法制成濾器?；蛘哌€可以使用通過壓力加工、多孔金屬板法制造的濾器。將這些濾器作為基板，或?qū)V器固定在其他基板上，在其上形成井或肋。
具體來說，如圖11的(a)所示，將濾器18固定在基板71上，并設(shè)置到光造型機(jī)槽72，使支撐基板71的升降機(jī)73下降，向?yàn)V器18一側(cè)分流注入1層UV硬化樹脂，通過UV光照射使1層份的樹脂層的肋部23(或者井部)硬化。反復(fù)進(jìn)行升降機(jī)73的移動(dòng)和UV照射的操作直到層疊硬化了規(guī)定層后，將含有基板71的層疊體從UV樹脂液中取出，清洗未硬化部分，去掉基板71，并硫化而得到帶有肋或井濾器。
在利用該光造型的方法中，使濾器18位于下方，在其上方通過光造型形成閉合狀的肋部23或井時(shí)，很難排出在其內(nèi)部未硬化的樹脂，由于內(nèi)部的樹脂因表面張力而向上聚集，而有可能影響肋或井的形狀。因此，如圖11的(b)所示，優(yōu)選使濾器18位于上方，在其下方通過光造型成長(zhǎng)形成肋部23或井的方法。用于實(shí)施該方法的光造型裝置是市售的株式會(huì)社DENKEN制造的SLP-4000，且正在辦理造型的制造委托。而且，現(xiàn)有的光造型主要通過激光照射進(jìn)行光硬化性樹脂的硬化，上述情況中照射模式是一致的，可以通過光掩模進(jìn)行光照射來層疊UV樹脂，可以縮短造型時(shí)間。
在第六方法中，井或肋通過熱連接與濾器結(jié)合。例如，加熱濾器部分，將井或肋在非加熱的狀態(tài)下進(jìn)行熱連接結(jié)合。濾器部分是由導(dǎo)熱率良好的金屬或陶瓷制成的，肋是由熱可塑性材料成型加工而成的。使濾器的端面與加熱材料結(jié)合，利用高溫導(dǎo)電性加熱濾器而熱連接井和肋。
或者，利用電磁感應(yīng)加熱或電介質(zhì)加熱。在這里所使用的井或肋是通過電磁感應(yīng)加熱或電介質(zhì)加熱用不發(fā)熱的低介電率的材料即熱可塑性樹脂制造的。在這里所使用材料的介電率優(yōu)選小于等于3.5的。作為具體的樹脂材料可以使用，例如聚乙烯、聚丙稀、聚苯乙烯、聚甲基丙烯酸甲酯樹脂、液晶聚合物、聚碳酸酯、聚酰胺樹脂、聚乙烯對(duì)苯二酸酯、聚乙烯萘酚酯、環(huán)烯烴、聚甲基戊烯、聚烯丙酯、聚砜、聚醚砜等。
用某種方法使上述樹脂材料成型成預(yù)定的井或肋的形狀。井優(yōu)選裝載在濾器的多個(gè)井被全部一體地制造，作為其方法可以使用，通過噴射模塑法、加壓成形或異型擠壓成形制造多個(gè)具有空井孔的連續(xù)管，將管成為環(huán)形截面的方法；在板上用鉆等方法開設(shè)孔的方法等。
而且，在這里所使用的濾器材料優(yōu)選通過電介質(zhì)加熱方法被加熱的材料，優(yōu)選介電率大于等于3.8。具體來說，可以使用例如金、銀、鎳、銅、鐵、鋁、鈦、硅、不銹鋼、鉭、鉬等金屬；二氧化硅、氧化鋁、二氧化鈦等金屬氧化物；SiN等金屬氮化物；鈉鈣玻璃、硼硅酸玻璃、派熱克斯玻璃(商標(biāo))、石英玻璃等玻璃等?；蛘撸部梢允褂没旌嫌袩o機(jī)填充料的樹脂材料混合物。
在井和肋之間夾持濾器等，井和肋中的任意一個(gè)與濾器交迭，用固定夾具固定，或用樹脂輥?zhàn)拥葕A住并加壓進(jìn)行電磁感應(yīng)加熱或電介質(zhì)加熱，使濾器部分發(fā)熱，通過其發(fā)熱將井和肋熱溶接到濾器上。作為電磁感應(yīng)或電介質(zhì)加熱的頻率可以使用30kHz至300MHz，優(yōu)選1～100MHz。
在第七方法中，用連接劑將井結(jié)合到濾器。預(yù)先將連接劑涂布在井的側(cè)端面上，再貼附至濾器，根據(jù)需要進(jìn)行加熱結(jié)合?；蛘撸孟率龇椒ńY(jié)合，將Clariant Japan LICOWAX LP等蠟涂布于井上，再加熱濾器，并涂布冷卻。
在第八方法中，通過濾器的夾物模壓來制造井或肋。在夾物模壓中將預(yù)先制成的濾器插入模具模，通過進(jìn)行樹脂成型可以使濾器和樹脂一體成型。
在第九方法中，濾器和井分別采用磁性材料通過磁力結(jié)合。例如，濾器或井的任意一個(gè)使用強(qiáng)磁體，相對(duì)應(yīng)的井或?yàn)V器由磁體構(gòu)成，通過用磁體結(jié)合可以形成帶有濾器的井。作為強(qiáng)磁體可以使用鎳、鐵等；作為磁體可以使用鐵酸鹽、釤鈷磁體、釹系磁體、鋁鈷系磁體等。
濾器為磁體的情況下，例如在平滑的銅、鎳、鉻等與金連接性良好的金屬板的表面上，以幾十埃的厚度進(jìn)行金沉積，然后進(jìn)行制定圖案，即，在涂布光敏抗蝕劑之后，在形成濾器細(xì)孔的部分殘留抗蝕劑。然后進(jìn)行無電解鐵酸鹽電鍍，形成厚度為1～20μm的鐵酸鹽層之后，用抗蝕劑剝離液剝離抗蝕劑，最后從金沉積層剝?nèi)ヨF酸鹽層。該鐵酸鹽層電鍍可以以例如日本應(yīng)用磁氣學(xué)會(huì)志Vol22，No9，1998 1225-1232，日本應(yīng)用磁氣學(xué)會(huì)志Vol24，No4-2，2000 515-517的條件為準(zhǔn)實(shí)施。
上述將鐵酸鹽作為磁體，例如上述的通過電鑄鎳電鍍制造井，根據(jù)兩者的磁力而結(jié)合來制造帶有濾器的井。
而且，肋為磁體的情況下，例如可以使用激光照射用樹脂膠粘劑混合鐵酸鹽、釤系或釹系磁性粉形成薄片狀的塑性磁體片(例如株式會(huì)社MagX制造的)等，開設(shè)厚度為0.3mm～1mm左右的孔之后，與上述鎳鐵酸鹽濾器通過磁體結(jié)合，而形成帶有濾器的井。
在第十方法中，通過機(jī)械地嵌合使井和濾器結(jié)合。例如，在剝離通過上述鎳的電鍍法所制造的井上的抗蝕劑之前，還涂布抗蝕劑制定圖案，在井壁的上表面中心處設(shè)置比井的寬度只小50μm～100μm的錐形抗蝕劑溝。向該溝中，用錫或金等軟質(zhì)金屬、或者樹脂進(jìn)行電鍍來填充溝。然后，用剝離液剝離抗蝕劑，形成在鎳質(zhì)的井上具有高度與寬度大致相等的錫、金或樹脂等櫛齒狀凸部的凸構(gòu)造井。同時(shí)，在濾器一側(cè)也用抗蝕劑在相同位置，形成作為陰型部分的凹型形狀，與上述凸型的高度和寬度相等且比凸部更硬的鎳、聚酰亞胺樹脂等。然后，將兩者用輥?zhàn)拥燃訅憾鴻C(jī)械地嵌合，從而結(jié)合成帶有濾器的井。而且，也可以相反地在井壁上表面設(shè)置凹形狀，而在濾器一側(cè)設(shè)置凸形狀。
在本發(fā)明的生物芯片中，也可以是在井的底部設(shè)置第一濾器的同時(shí)，在其上側(cè)(通過井的相反側(cè))設(shè)置第二濾器的構(gòu)造。第二濾器在通過上述方法得到的在底部設(shè)有濾器的井內(nèi)，收容探針載體微粒；而且第二濾器可以通過用連接劑、磁力、機(jī)械嵌合、平滑面之間的平面結(jié)合、機(jī)械地夾緊來結(jié)合通過上述方法所得濾器的方法而設(shè)置；因此可以得到上下具有濾器的生物芯片。
而且，在各井的底部形成有濾器的生物芯片可以通過例如下述方法制造。
(1)如圖19的(a)所示，使濾器18形成波狀，將其凸頂部32和凹頂部34用構(gòu)成側(cè)壁20的適當(dāng)?shù)哪せ蛴脼V器連接，而形成各井16、16…的方法(2)如圖19的(b)所示，將由金屬或樹脂制成的濾器用沖壓模成型為按規(guī)定間隔設(shè)有凹部的形狀，將該凹部作為井16、16…的方法；或者還向一側(cè)面用粘結(jié)劑、磁體或機(jī)械嵌合等方法結(jié)合其它濾器或膜而形成具有封閉空間的井的方法(3)如圖19的(c)所示，在井16、16…的底壁22，用激光、加壓、光刻等穿設(shè)貫通孔形成濾器18的方法；或者還將濾器用粘結(jié)劑、磁體或機(jī)械嵌合結(jié)合在井上部的方法(4)如圖19的(d)所示，沒有底壁22而由側(cè)壁20形成井，在其底部連接濾器18的方法；或者還將濾器用粘結(jié)劑、磁體或機(jī)械嵌合結(jié)合并覆蓋在井上部的方法(5)對(duì)金屬、金屬氧化物、金屬/金屬氧化物或樹脂等用激光穿孔、機(jī)械加壓或光刻的方法。
本發(fā)明的生物芯片具有一體形成的多個(gè)井或單一井；在該井中收容分散有探針載體微粒的分散液。井所收容的微粒是比濾器細(xì)孔大的粒徑，使芯片的微粒靜置于濾器的孔中并進(jìn)行光學(xué)檢測(cè)時(shí)，探針載體微粒的粒徑和濾器細(xì)孔的孔徑為粒徑/孔徑＝1.1～2.5，并且粒徑＜孔間隔＜粒徑×10，更優(yōu)選粒徑＜孔間隔＜粒徑×4的關(guān)系。這里，所謂“孔間隔”是在鄰接的各孔之間孔不為空的部分的最短距離。
粒徑/孔徑小于1.1時(shí)，微粒進(jìn)入細(xì)孔，微粒不能從細(xì)孔脫離的概率增加。粒徑/孔徑大于2.5時(shí)，將含有微粒的溶液通過濾器過濾，微粒殘留在濾器上時(shí)，微粒不落在孔上，而隨機(jī)地或微粒互相交迭排列在濾器上的概率變高。為了防止微粒進(jìn)入細(xì)孔而不能脫離，上述關(guān)系優(yōu)選粒徑/孔徑＝1.15～2.0，更優(yōu)選粒徑/孔徑＝1.2～1.6。
而且，將芯片用于分離精制時(shí)，設(shè)定微粒的粒徑、濾器的孔徑以及孔間隔滿足粒徑＞孔徑+孔間隔/2的關(guān)系。滿足該關(guān)系時(shí)，將含有微粒的溶液通過濾器過濾，當(dāng)使微粒靜置在濾器上時(shí)，為使微粒不靜置在所有濾器孔上而使微粒靜置在至少一個(gè)孔間隔上，在至少大于等于50％的間隔上存在未被微粒阻塞的濾器孔，其結(jié)果是可以防止過濾阻力。
一個(gè)井所收容的全部微粒數(shù)根據(jù)用途而不同，用于分離分級(jí)的情況下是濾器細(xì)孔數(shù)的100倍～1/100倍，優(yōu)選是濾器細(xì)孔數(shù)的10倍～1/10倍的范圍；檢測(cè)·鑒定的情況下每個(gè)探針中微粒的絕對(duì)數(shù)為1～1000個(gè)，優(yōu)選1～500個(gè)，更優(yōu)選1～200個(gè)。一個(gè)井中的微粒數(shù)很多時(shí)，在過濾的時(shí)候使過濾阻力變大、過濾性能降低，或者濾器被破壞。在檢測(cè)·鑒定時(shí)即使有意義的微粒數(shù)為1000個(gè)也是充分的，數(shù)量更多也沒有意義還使過濾性變得困難。
向各井收容的探針載體微粒的絕對(duì)數(shù)是可以用下述方法控制。
即，投入微粒溶液時(shí)可一邊用流式細(xì)胞計(jì)逐個(gè)地控制微粒，一邊用CCD照相機(jī)等實(shí)際地計(jì)數(shù)每個(gè)微粒而將其投入?；蛘撸梢灶A(yù)先測(cè)定微粒溶液的微粒濃度，通過該溶液內(nèi)的微粒濃度和微粒的比重計(jì)算微粒數(shù)，根據(jù)該結(jié)果反算出微粒溶液量，并使用點(diǎn)樣器等投入，將近似的微粒數(shù)投入單位室中。而且，還可以使用分多次點(diǎn)樣規(guī)定數(shù)量的微粒，計(jì)數(shù)其每次點(diǎn)樣后的微粒數(shù)來算出不足量，點(diǎn)樣直至不足量近似于零的方法。
這里，微粒數(shù)最好具有某種程度的近似同一性，其誤差范圍優(yōu)選在CV值的20％以內(nèi)，更優(yōu)選10％以內(nèi)。
作為承載探針的微粒，只要直徑比濾器的細(xì)孔直徑大的微粒，沒有特別限定，可以使用有機(jī)微粒、無機(jī)微粒、有機(jī)無機(jī)微粒、相變凝膠體等的任意一種。
作為有機(jī)微粒可以使用，具體來說，將丁二烯系、苯乙烯系、二乙烯基苯系、丙烯腈系、丙烯酸脂系、異丁烯酸酯系、丙烯酰胺系、苯代三聚氰二胺系、尼龍系、聚乙烯醇系以及氟系等的單體，單獨(dú)地或二種以上組合使用的單體原料，通過乳化聚合或懸浮聚合得到的微粒。或者還可以使用從具有多孔質(zhì)均等孔的板擠壓樹脂而制成微粒的膜乳化等方法。這些微粒可以根據(jù)需要用分級(jí)機(jī)排列粒徑。
而且，還可以使用在聚合時(shí)或聚合后添加鐵酸鹽等磁性體而得到的物質(zhì)；或根據(jù)特開平10-83902等的方法將微粒鍍鐵酸鹽后得到的物質(zhì)；或纖維素、淀粉、瓊脂糖、半乳糖等天然交聯(lián)凝膠體；丙烯酰胺等合成交聯(lián)凝膠體。
這些粒徑的粒徑分布優(yōu)選CV值10％以內(nèi)，更優(yōu)選5％以內(nèi)。CV值大于10％時(shí)，微粒進(jìn)入濾器孔內(nèi)的概率變高。
關(guān)于苯乙烯的微粒，例如可以根據(jù)特開昭57-168163號(hào)公報(bào)記載的方法得到。
而且，磁性微粒，例如可以根據(jù)特開平11-176622號(hào)公報(bào)記載的方法得到。
作為無機(jī)系的微粒可以使用金屬氧化物微粒、金屬硫化物微粒、金屬微粒。
作為金屬氧化物微粒最優(yōu)選二氧化硅微粒，可以使用市售的各種二氧化硅微粒。
而且，可以使用市售的各種微粒，例如，IMMUTEX(商品名，JSR)、MCI凝膠體(商品名，三菱化學(xué))、Toypearl(商品名，Tosoh Corporation)、Daiso凝膠體(商品名，Daiso Co.，Ltd.)、Shodex(商品名，昭和電工)、Sunsphere(商品名，旭硝子)PL-PEGA、(商品名，Polymer Laboratories)、PL-CMS(商品名，Polymer Laboratories)、PL-PBS(商品名，PolymerLaboratories)、PL-DMA(商品名，Polymer Laboratories)、AM resin(商品名，Novabiochem)、P500(商品名，Toray Industries，Inc.)、Toraypearl(商品名，Toray Industries，Inc.)、Techpolymer(商品名，積水化成品工業(yè))、MP/MR series(商品名，綜研化學(xué))、BELLPEARL(商品名，鐘紡)、EPOSTER(商品名，日本觸媒工業(yè))、纖維素粉(Chisso Corp.，旭化成)、Sephacell(商品名，Amarsham-Pharmacia社)、Sephallose(商品名，Amarsham-Pharmacia社)等。
可以對(duì)上述微粒表面通過使用氨基、羧基、碳二亞胺基、環(huán)氧基、甲苯磺?；?、N-琥珀酰亞胺基、馬來酰亞胺基、硫醇基、亞硫酰基、羥基、三甲氧甲硅烷基、三乙酸腈基、苯并磺胺基、聚乙烯亞胺基、季銨基(tri-n-octylmethylammonium)、十八(碳烷)基等各種官能基；或γ-環(huán)氧丙氧基丙基三甲氧基硅烷等進(jìn)行表面修改，而形成探針結(jié)合點(diǎn)。
而且，進(jìn)行上述表面修改時(shí)，為使微粒承載的探針和分析物反應(yīng)時(shí)的空間排斥降低，可以將具有在碳元素?cái)?shù)為10～100的亞烴基的兩端結(jié)合官能基的構(gòu)造的化合物，例如乙二醇二縮水甘油酯衍生物、N-k-馬來酰亞胺十一烷酸、巰基丙基三甲氧基硅烷、杯丙二烯衍生物、液晶作為隔離物使用。而且，用氨基、羧基、硫羥基修改的寡聚核苷酸也可以作為隔離物或隔離物兼結(jié)合點(diǎn)使用。
作為承載探針的微粒，在使用有機(jī)微粒的情況下，其粒徑優(yōu)選0.02μm～120μm，更優(yōu)選0.1μm～60μm。粒徑小的情況下在操作性上產(chǎn)生難點(diǎn)，制造捕捉這些微粒的濾器變得困難，而且由于濾器孔很小使分析物容易堵塞。而且在粒徑大的情況下，由于空間排斥而使反應(yīng)率降低。
而且，根據(jù)需要優(yōu)選微粒為多孔質(zhì)或中空狀的。因此，即使在粒徑大的情況下，也可以防止因重量而引起微粒沉降而使與分析物的反應(yīng)性降低。
作為承載探針的微粒，使用無機(jī)微粒時(shí)，其粒徑優(yōu)選0.1μm～0.1mm，更優(yōu)選1μm～0.05mm。粒徑小的情況下在操作性上產(chǎn)生難點(diǎn)，尤其通過濾器的細(xì)孔捕捉微粒變得困難。而且在粒徑大的情況下，由于沉降而使反應(yīng)性降低。
而且，根據(jù)需要優(yōu)選微粒為多孔質(zhì)的。因此，即使在粒徑大的情況下，也可以防止因重量而引起微粒沉降等。
作為將探針載體微粒收容到各井的方法，可以使用預(yù)先將微粒投入對(duì)應(yīng)于各井的單元內(nèi)的方法?；蛘?，也可以使用將表面上具有探針結(jié)合點(diǎn)的微粒用點(diǎn)樣器投入各井中，然后，將對(duì)應(yīng)于規(guī)定的井的、種類不同的探針用點(diǎn)樣器等向?qū)?yīng)的井投入的方法。
在前者的方法中，作為向微粒結(jié)合探針的方法可以使用市售的各公司制造的固相合成機(jī)，例如寡聚核苷酸合成機(jī)、肽合成機(jī)、糖鏈合成機(jī)、根據(jù)組合化學(xué)的各種低分子化合物合成機(jī)等。在固相法中為了反應(yīng)和分離作為載體可以使用二氧化硅顆?；蚓垡蚁┒蚁┗轿⒘?，可以并用這些固相合成載體顆粒和收容在芯片10中的微粒載體，通過向芯片10點(diǎn)樣而收容用合成機(jī)合成的探針載體顆粒。這些合成機(jī)，尤其寡聚核苷酸合成機(jī)廣泛地被普及使用，現(xiàn)在，例如在傍晚設(shè)置合成機(jī)，在第二天早晨就能制成固化了寡聚核苷酸的微粒，只將其點(diǎn)樣而在極短的時(shí)間內(nèi)制成具有任意核苷酸的訂制芯片。
作為微粒中承載的探針可以使用，例如核酸、分子量500～100萬的蛋白質(zhì)、脂質(zhì)、糖鏈、細(xì)胞、蛋白質(zhì)表達(dá)細(xì)胞(protein expression cells)、寡聚核苷酸適配子(aptamer)、病毒、酶、分子量為50～100萬的具有藥理活性的先導(dǎo)化合物，或就特定生理活性作用的或可能具有特定生理活性作用的化學(xué)物質(zhì)等。
這里，作為分子量500～100萬的蛋白質(zhì)可以是，具體來說，合成肽、膜蛋白質(zhì)、酶、轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白、細(xì)胞因子、淋巴因子、IgA以及IgE等抗體、各種抗原、或具有蟲螢光素、熒光素酶、發(fā)光蛋白質(zhì)、綠熒光蛋白質(zhì)等生物發(fā)光機(jī)能的物質(zhì)。
作為脂質(zhì)可以是，具體來說，磷脂酸、磷脂酰環(huán)己六醇、漆酚、各種神經(jīng)節(jié)苷脂等。
寡聚核苷酸適配子是，蛋白質(zhì)、酶、染劑、氨基酸、核苷酸、成長(zhǎng)因子、基因表達(dá)調(diào)節(jié)因子、細(xì)胞粘著分子、與生物個(gè)體等具有結(jié)合能力的功能性核酸；具體來說，凝血酶適配子、彈性蛋白酶適配子、活性蛋白C、C型肝炎病毒的NS3蛋白酶適配子。
作為分子量為50～100萬的低分子先導(dǎo)化合物可以是，具體來說，基質(zhì)、輔酶、調(diào)節(jié)因子、凝集素、激素、神經(jīng)傳遞素、反義寡核苷酸、核糖酶、寡聚核苷酸適配子等配體、苯基哌啶衍生物、磺胺/磺酸衍生物、類固醇、前列腺素衍生物等醫(yī)藥候補(bǔ)物質(zhì)。
探針載體微?？梢跃哂杏糜谔峁┨结樧R(shí)別信息的至少一種識(shí)別手段，該識(shí)別信息用于識(shí)別探針的種類。作為該識(shí)別手段可以是探針載體微粒的顏色、形狀以及粒徑。
這些識(shí)別手段也可以多個(gè)組合使用，例如顏色和粒徑、顏色和形狀、顏色和基因序列等的組合。為將顏色作為識(shí)別手段，用染料、顏料、熒光染料等浸漬微粒并著色。關(guān)于這些染料、顏料、熒光體、磷光體，通過組合具有不同吸收、發(fā)光波長(zhǎng)及其顏色濃度的組合，可以得到更多的探針識(shí)別信息。例如，使用顏色的種類為2、顏色濃度為3的濃度，可以得到9種識(shí)別信息。作為染色微?？梢允褂美鏙SR的IMMUTEX等。而且，熒光粒子可以使用作為Molecular Probes，Inc.的FluoSpheres法luorescent microspheres銷售的羧基修飾、磺酸修飾、乙醛磺酸修飾、胺修飾粒子等。
這些顏色識(shí)別信息按下述方法檢測(cè)。首先，向進(jìn)行顏色標(biāo)識(shí)的微粒照射光源。當(dāng)顏色標(biāo)識(shí)為熒光體、磷光體時(shí)，需要對(duì)應(yīng)的熒光或磷光激發(fā)波長(zhǎng)光源。然后用CCD照相機(jī)、用光電子增幅管等對(duì)從微粒放出的熒光或磷光等進(jìn)行光學(xué)檢測(cè)，對(duì)得到的檢測(cè)信息進(jìn)行統(tǒng)計(jì)處理，獲得探針識(shí)別信息。
而且，當(dāng)以粒徑作為識(shí)別信息時(shí)，預(yù)先將粒徑大小按照各探針進(jìn)行改變。作為這些粒徑，從檢測(cè)敏感度來看，優(yōu)選使粒徑差大于等于0.3μm單位，更優(yōu)選大于等于0.5μm。
這樣，通過在井內(nèi)收容多個(gè)可以識(shí)別的探針載體微粒，在一個(gè)井中可以同時(shí)進(jìn)行多項(xiàng)檢測(cè)，從而縮短了反應(yīng)時(shí)間和操作步驟。而且，使用具有多個(gè)井的芯片，通過組合井的位置信息和多個(gè)可以識(shí)別的探針載體微粒，例如井?dāng)?shù)為100個(gè)井、可以識(shí)別的探針載體微粒的種類為100，因此可以得到收容了100×100＝10000種探針的生物芯片。
具有上述識(shí)別手段的探針載體微粒被收容于以下各井中。
(i)將在全部識(shí)別手段中的識(shí)別信息相同的多個(gè)探針載體微粒收容于相同的井中，同時(shí)對(duì)于收容于各井的多個(gè)探針微粒，識(shí)別信息相同。即，在一個(gè)井中收容了，顏色、粒徑等探針識(shí)別手段相同且顏色的種類、粒徑的大小等識(shí)別信息也相同的多個(gè)微粒。在各井間也收容相同的微粒。并且，預(yù)先明確了識(shí)別信息相同的情況下，可以忽略探針識(shí)別信息和探針識(shí)別的步驟。
(ii)將在全部識(shí)別手段中的識(shí)別信息相同的多個(gè)探針載體微粒收容于相同的井中，同時(shí)對(duì)于收容于各井的多個(gè)探針微粒，識(shí)別信息不同。即，在一個(gè)井中收容了，顏色、粒徑等探針識(shí)別手段相同且顏色的種類、粒徑的大小等識(shí)別信息也相同的多個(gè)微粒。但在各井間收容了相同識(shí)別手段的顏色種類、粒徑大小等識(shí)別信息不同的微粒。
(iii)將在至少一種識(shí)別手段中的識(shí)別信息不同的多個(gè)探針載體微粒收容于相同的井中，同時(shí)對(duì)于收容于各井的多個(gè)探針微粒，其全部識(shí)別手段中的上述識(shí)別信息的構(gòu)成相同。即，在一個(gè)井中收容了，對(duì)于顏色、粒徑等探針識(shí)別手段的至少一種，顏色種類、粒徑大小等識(shí)別信息不同的多個(gè)探針載體微粒。在各井間該識(shí)別信息的構(gòu)成相同。
(iv)將在至少一種識(shí)別手段中的識(shí)別信息不同的多個(gè)探針載體微粒收容于相同的井中，同時(shí)對(duì)于收容于各井的多個(gè)探針微粒，其至少一種識(shí)別手段中的上述識(shí)別信息的構(gòu)成不同。即，在一個(gè)井中收容了，對(duì)于顏色、粒徑等探針識(shí)別手段的至少一種，顏色種類、粒徑大小等識(shí)別信息不同的多個(gè)探針載體微粒。在各井間該識(shí)別信息的構(gòu)成不同。
對(duì)應(yīng)于試驗(yàn)的內(nèi)容，適宜地選擇井的數(shù)量以及收容于井中的探針載體微粒的構(gòu)成。例如，可以是圖26的(a)所示為單一的井中收容相同的探針載體微粒的狀態(tài)；圖26的(b)所示為單一的井中收容識(shí)別信息不同的探針載體微粒的狀態(tài)；圖26的(c)所示為多個(gè)井中收容相同的探針載體微粒的狀態(tài)；圖26的(d)所示為多個(gè)井中收容識(shí)別信息不同的探針載體微粒的同時(shí)，各井間識(shí)別信息的構(gòu)成相同的狀態(tài)；圖26的(e)所示為多個(gè)井中收容識(shí)別信息不同的探針載體微粒的同時(shí)，各井間識(shí)別信息的構(gòu)成不同的狀態(tài)等。
例如，向收容有上述探針載體微粒的井投入分析物時(shí)，如圖27的(a)所示，從井16的上述開口投入，還可以如圖27的(b)所示在容器12中收容的一分析物和各井16的底部接觸，或者如圖27的(c)所示在具有對(duì)應(yīng)于各井16的隔間的容器12中，在每個(gè)隔間中收容不同的分析物，通過使其與各井16的底部接觸，在各井16中收容不同的分析物。
<生物芯片試劑盒>
本發(fā)明的生物芯片試劑盒具有容器，該容器收容生物芯片和生物芯片的井，或者與生物芯片連接。
容器的材質(zhì)沒有特別的限定，可以使用有機(jī)材料以及無機(jī)材料中的任意一種。作為有機(jī)材料可以使用，具體來說，聚乙烯、聚乙烯乙酸乙烯樹脂、聚乙烯乙烯樹脂、聚丙烯、聚苯乙烯、聚丁二烯、聚丙烯腈樹脂、聚甲基丙烯酸甲酯樹脂、AS樹脂(丙烯腈和苯乙烯的共聚物)、ABS樹脂(丙烯腈和丁二烯和苯乙烯的共聚物)、AAS樹脂(丙烯腈和丙烯酸酯和苯乙烯的共聚物)、聚碳酸酯、聚酰胺樹脂、聚乙烯對(duì)苯二酸酯、聚乙烯萘酸酯(polyethylene naphthalate)、脂肪族聚酯、聚乳酸、聚羥基乙酸、脂肪族聚酰胺、脂環(huán)族聚酰胺、環(huán)烯、聚甲基戊烯、聚氯乙烯、多乙酸乙烯酯、多芳基化合物、聚砜、聚醚砜、聚酰亞胺、三醋酸纖維素、醋酸纖維素樹脂、硝酸纖維素樹脂、環(huán)氧樹脂、聚四氟乙烯、氟化乙烯丙烯共聚物、四氟乙烯全氟烷氧乙烯醚共聚物、聚氯三氟乙烯、乙烯基四氟乙烯共聚物、聚偏二氟乙烯、聚氟化乙烯、硅樹脂等。
作為這些有機(jī)材料的成形方法可以是，例如，注模成形、無壓成形、注射壓力成形、注射壓縮成形、壓縮成形、轉(zhuǎn)移成形、切削成形、光造型等。
作為無機(jī)材料可以使用，具體來說，鎳、銅、鐵、鋁、鈦、硅等金屬；二氧化硅、氧化鋁、二氧化鈦等金屬氧化物；鈉鈣玻璃、硼硅酸玻璃、派熱克斯玻璃(商標(biāo))、石英玻璃等玻璃等。
這些無機(jī)材料可以通過成型或表面處理加工等各種方法形成容器形狀，例如加壓成形、板蝕刻、激光打孔、噴沙、向樹脂或金屬容器的表面涂布等。
而且使用形成有孔的板或未形成有孔的板，對(duì)其任意一側(cè)或兩側(cè)進(jìn)行多層層疊，可以形成規(guī)定的容器。這些板為了防止從層疊部分泄漏液體，層疊部分的板面之間必須平滑。因此，將板研磨平滑，或使用硅晶片等平滑的板。結(jié)合這些平滑的板時(shí)，即使不使用連接劑等也能得到非常牢固的結(jié)合。
作為板使用硅晶片時(shí)，根據(jù)需要也可以使用形成有氧化膜，或者可以層疊板之后再進(jìn)行氧化。
使用上述板的容器按照例如下述方法制造。首先，準(zhǔn)備在容器底部使用的、具有微小空氣出入孔的板。要使用很深的空氣出入孔的深度時(shí)，根據(jù)需要層疊多張最下層的板。因此，層疊任意數(shù)量的具有與容器水平地切斷形狀相同的平滑的板，以形成規(guī)定深度的容器孔。容器孔的深度可以通過層疊多張相同形狀的板任意地控制。要在深度方向控制將容器的形狀時(shí)，例如要形成具有級(jí)差的孔形時(shí)，通過層疊不同形狀的板可以得到任意孔形。
對(duì)于配置于最上部的容器蓋上，可以使用開設(shè)與板垂直用于液體或氣壓出入的孔，或者也可以預(yù)先在板面上切溝，作為板層疊體的最上部的蓋。而且，為能進(jìn)行光學(xué)檢測(cè)，可以在層疊體的最上部或底部的板上使用透明的玻璃等材料。
通常，孔徑微小深度很深，即所謂高縱橫尺寸比的孔，在制作上很困難的，但通過上述方法可以制成具有任意縱橫尺寸比的孔的容器。
通過上述方法，可以制造具有與芯片井相對(duì)應(yīng)的孔的容器，也可以制造對(duì)于多個(gè)井共有一個(gè)孔的容器。
為了形成具有與芯片的井相對(duì)應(yīng)的井的容器，按照容器孔的深度層疊具有與井水平截面相同的孔形截面的板。
為了形成具有一個(gè)與多個(gè)井相對(duì)應(yīng)的孔的容器，按照容器孔的深度層疊孔徑能覆蓋大于等于多個(gè)井的水平截面面積的板。
而且，在容器底部設(shè)有孔的容器中，如上所述，形成容器底部的板可以使用預(yù)先開設(shè)有孔的板制成。通過在容器底部設(shè)置孔，例如，連接生物芯片的井和容器時(shí)，可以向生物芯片的井施加壓力，從容器底部的孔將容器的空氣排出，使生物芯片的井內(nèi)的液體向容器移動(dòng)。
容器底部的孔徑在孔徑大的情況下，由于容器中的液體泄漏，則需要小于等于一定尺寸的孔徑，其孔徑通過孔的深度或孔與液體的親和性來決定，通常為50μm～1mm，優(yōu)選0.1mm～0.5mm?？讖叫∮诘扔?0μm時(shí)，堵塞以及過濾阻力變大；孔徑大于等于1mm時(shí)，則可能產(chǎn)生液體泄漏。
可以使用生物芯片和容器，將相互對(duì)應(yīng)的相同直徑的井相連接構(gòu)成生物芯片試劑盒。這種情況下，在連接井的接續(xù)部中，通過使液體的移動(dòng)上流側(cè)的井的截面面積大于下流側(cè)的井的截面面積，可以使接續(xù)部上井的定位誤差最小。
生物芯片和容器可以通過連接在接續(xù)部上的凹/凸、凸/凹或超平滑面而連接。通過上述任意一種連接方法，可以防止液體從結(jié)合部向相鄰的井泄漏。
而且，將生物芯片之間按上述同樣方法，可以通過接續(xù)部上凹/凸、凸/凹或超平滑面之間的結(jié)合進(jìn)行連接。
通過生物芯片和容器的連接、或者生物芯片之間的連接，可以產(chǎn)生相互的井之間的溶液移動(dòng)，即所謂溶液的井之間的直接下流移動(dòng)。由于不需要用于移動(dòng)的注射器等移動(dòng)裝置，所以伴隨附著于注射器壁的溶液減少而不會(huì)產(chǎn)生污染等，而可以減少溶液移動(dòng)所需的時(shí)間。
生物芯片和容器相連接的生物芯片試劑盒，可以例如用以下方法制造。這里在示例的方法中，容器是通過層疊使用具有貫通孔的板和未形成孔的板中任意一種的多個(gè)板層疊形成。
如圖15的(a)所示的生物芯片試劑盒通過下述方法制造。首先，準(zhǔn)備通過蝕刻硅晶片形成有貫通孔的與生物芯片10具有相同厚度的板87a和；任意厚度的板87b和；蝕刻硅晶片而形成有氣體或液體的出入口或液體出入溝的板87c。然后，通過在板87c’上定位并層疊板87b’還有板87a’，制造設(shè)置了具有二級(jí)級(jí)差的孔的層疊板。向該層疊板的板87a’的孔插入生物芯片10將貼合的單側(cè)芯片，制造生物芯片和容器相重合的半部分生物芯片試劑盒。同樣地，層疊87a、87b、87c制造層疊板，然后插入生物芯片10將貼合的單側(cè)芯片，制造同樣的半部分生物芯片試劑盒。
然后，將結(jié)合了探針的微粒通過從井的開放面點(diǎn)樣等方法收容于上述半部分生物芯片試劑盒中。使收容該微粒的半部分生物芯片試劑盒作為下部，另一半部分生物芯片試劑盒作為上部，通過使它們具有的井相向面對(duì)而結(jié)合。因此，制成容器合芯片成為一體的生物芯片試劑盒。這時(shí)，根據(jù)預(yù)先設(shè)置的定位結(jié)合標(biāo)記使上下試劑盒定位結(jié)合，可以正確地定位。
而且，如圖15的(b)所示的生物芯片試劑盒，準(zhǔn)備具有寬的最外側(cè)上下端面的芯片，可以將生物芯片10的上下端面層疊到，蝕刻硅晶片而形成貫通孔的板87b(87b’)的一個(gè)端面上。
如圖16的(a)所示，對(duì)于形成容器的底部或蓋部的板，作為光學(xué)檢測(cè)用，可以使用例如由石英玻璃等構(gòu)成的、平滑透明的板94。光學(xué)檢測(cè)是為了觀察填充于濾器的微粒的反應(yīng)而實(shí)施的。根據(jù)如同圖所示的結(jié)構(gòu)，可以使從底部或蓋部到濾器的距離最小，從而提高光學(xué)系統(tǒng)的開口面積比。但是，這種情況下，收容液體的容器的容積變小，可能造成收容的分析物和清洗液不充足。在這種情況下，如圖16的(b)所示，在液體的出入口88處，安裝連接有泵90的管89，通過管89使液體循環(huán)；或者使液體只在試劑盒內(nèi)和上下管安裝口的一定部分中上下移動(dòng)，將管的一部分作為試劑盒容器緩沖器使用，來解決容器的容積不足。
如圖17的(a)所示，通過層疊多張板87b(87b’)，可以擴(kuò)大容器的容積。而且，如圖17的(b)所示，使板87b(87b’)的孔徑遞變，從而可以使容器內(nèi)表面傾斜。這種情況下，從出入口88向容器內(nèi)部的方向上，容器直徑逐漸變大，階梯狀地使容器內(nèi)表面傾斜，從而可以使溶液從生物芯片的各井均勻地輸入排出。
如圖17的(c)所示，具有與生物芯片10相對(duì)應(yīng)的井16而獨(dú)立存在的井91，對(duì)應(yīng)于該井的孔92可以連接在其底部形成的容器。該容器底部的孔92的直徑，根據(jù)孔的高度優(yōu)選100～500μm，更優(yōu)選150～300μm?？讖酱笥?00μm時(shí)，液體可能從容器底面流出；孔徑小于100μm時(shí)，加減壓時(shí)的阻力變大。
在上述的容器中設(shè)有徑的生物芯片試劑盒中，根據(jù)微粒結(jié)合探針使分析物中的靶物質(zhì)B/F分離之后，通過任何分離方法從微粒中分離靶物質(zhì)，然后向上容器和下容器施加壓差，可以使生物芯片10的井16中的靶物質(zhì)向下容器的井91移動(dòng)。為了向各井均等地施加壓差，上容器、下容器中的任意一個(gè)優(yōu)選形成具有共通于生物芯片中各井的收容空間的容器。
容器的容積可以通過，如上所述，層疊任意張具有開孔的板來調(diào)整到任意容積。而且，容器的底部或蓋部中至少一個(gè)是透明板，檢測(cè)時(shí)將透明板作為下部，使微粒填充濾器孔，通過透明板進(jìn)行光學(xué)檢測(cè)；另外，還可以分離被微粒捕捉的靶物質(zhì)液并移動(dòng)至與生物芯片的井對(duì)應(yīng)的容器的井。
如圖18的(a)所示，生物芯片10之間也可以通過對(duì)應(yīng)的井進(jìn)行連接。而且，如圖18的(b)所示，在各生物芯片10之間，可以設(shè)置具有與這些井對(duì)應(yīng)的孔93的容器。
向多段配置于容器內(nèi)的各生物芯片的各井中，放入具有相同探針的微粒時(shí)，通過對(duì)多段芯片中收容的帶有探針的微粒進(jìn)行B/F分離，可以提高B/F分離能力。而且，分別向多段芯片的第一段和第二段放入具有不同探針的微粒時(shí)，可以使用所謂Two Step In Vitro Selection用工具等。
圖12以及圖13是表示本發(fā)明的生物芯片試劑盒的一個(gè)實(shí)施例的上表面如以及A-A’剖面圖。如圖12以及圖13所示，生物芯片試劑盒14具有容器12和生物芯片10。
生物芯片10由在側(cè)壁20上分割的多個(gè)井16、16…構(gòu)成。在這些井16、16…中，例如，收容所承載探針的種類在各個(gè)井16不同的探針載體微粒。
井16的底壁22由濾器18形成。該濾器18阻擋收容于井16的探針載體微粒，同時(shí)使具有使用該生物芯片10進(jìn)行分離、檢測(cè)等的分析物、各種緩沖液；清洗液；分離劑；標(biāo)記試劑；二次抗體；感光劑；蛋白質(zhì)分解酶、離子化劑等的各種溶液通過。
向容器12的內(nèi)部導(dǎo)入的上述各種溶液可以通過濾器18出入全部單元。即，上述各種溶液可以通過濾器18，并通過與井16鄰接的、由芯片10和容器12之間的間隙構(gòu)成的上述各種溶液的收容室26，從濾器18向任意的井16流入流出。
或者，側(cè)壁20也可以同樣地由濾器18形成。通過在該側(cè)壁上形成的濾器18，在鄰接的井16、16之間可以移動(dòng)上述各種溶液。這種情況下，形成底壁22的濾器和形成側(cè)壁20的濾器可以相互用相同材質(zhì)連續(xù)地形成，也可以分別用不同材質(zhì)的濾器構(gòu)成的復(fù)合濾器。
容器12和芯片10，如圖12的(a)、(b)所示，可以將兩者用相同材料一體形成；或者也可以通過連接并固定兩者，在容器12內(nèi)部使芯片10和容器12一體化。
或者，如圖13的(a)、(b)所示，生物芯片試劑盒14也可以分別由獨(dú)立的容器12和芯片10的二者構(gòu)成，并將芯片10收容于容器12的內(nèi)部。這種情況下，容器12不需要在各種操作中都完全一致，可以根據(jù)其單位操作變更其容器以及溶液收容容器。
在上述構(gòu)成的生物芯片試劑盒14中，收容于各井16中的探針載體微粒根據(jù)其井的位置指定探針的內(nèi)容，可以將多個(gè)探針不被污染而收容在芯片上。
收容于上述生物芯片中的探針載體微粒溶液和具有分析物、各種緩沖液、清洗液、分離劑、標(biāo)記試劑、二次抗體、感光劑、蛋白質(zhì)分解酶、離子化劑等的溶液，可以在收容了探針載體微粒的井16、16…之間自由地移動(dòng)。通過適當(dāng)選擇芯片10的構(gòu)造或上述溶液的攪拌條件，可以使上述溶液向全部的井16、16…循環(huán)，從而給予上述溶液和多種微粒承載的探針接觸或反應(yīng)的機(jī)會(huì)。
全部的井16、16…優(yōu)選通過形成有底壁22或側(cè)壁20的濾器，直接鄰接在由芯片10和容器12的間隙構(gòu)成的溶液收容室26。
該溶液收容室26是，例如圖12的(a)、(b)所示，由芯片10的底部下表面和容器12的底部上表面之間的間隙構(gòu)成的之外；還可以如圖13的(a)、(b)所示，由分別獨(dú)立的芯片10和容器12之間的間隙構(gòu)成。
根據(jù)上述構(gòu)成，通過攪拌和根據(jù)需要進(jìn)行加減壓，使上述溶液從將其共通地收容的溶液收容室26通過一層濾器18，并列地到達(dá)分別收容了承載有不同種類探針的微粒的多個(gè)井16、16…，從而進(jìn)行并列地接觸、反應(yīng)。
而且，在特定的井16內(nèi)沒有進(jìn)行反應(yīng)的未反應(yīng)分析物，再通過攪拌或加減壓到達(dá)其他的井16內(nèi)并嘗試接觸、反應(yīng)。這樣在各井16、16…之間，逐次地嘗試使未反應(yīng)的上述溶液和探針載體微粒接觸、反應(yīng)。
然后，由于溶液收容室26和各井16、16…只通過一層濾器18而鄰接，壓力損失最小。而且，由于到達(dá)溶液收容室26時(shí)，與各井16中的探針載體微粒的反應(yīng)并列地進(jìn)行，從而可以使接觸、反應(yīng)時(shí)間最短。
而且，通過以適當(dāng)?shù)臈l件設(shè)定其濾器18的細(xì)孔孔徑和其深度，可以將壓力損失降到很低。由于恰好在沒有濾器18的空間移動(dòng)，上述溶液可以在收容有探針載體微粒的全部井16、16…和由上述溶液的共通室構(gòu)成的溶液收容室26之間自由地移動(dòng)。
或者，可以形成這樣的構(gòu)造第一濾器被設(shè)置在底部的同時(shí)，在第一濾器的相反側(cè)設(shè)置第二濾器，以夾住井。該例如圖14的(a)所示。如同圖所示，在該生物芯片的上部，作為第二濾器設(shè)置上側(cè)濾器18’。該上側(cè)濾器18’是將探針載體微粒收容在井16中之后而安裝的。作為其安裝方法可以使用上述連接劑、磁力、機(jī)械嵌合、平滑面的結(jié)合、機(jī)械加壓等。而且如圖14的(b)所示，預(yù)先在上容器81和下容器82上分別安裝濾器18’和具有底面濾器18的井16中的任意一個(gè)，連接上容器81和下容器82之后，也可以使用連接劑、磁體、夾緊等機(jī)械加壓安裝方法。在本方法中，根據(jù)機(jī)械壓力的設(shè)置/重新設(shè)置，可以將上側(cè)濾器18’和底面濾器18任意地切離。或者，如圖14的(c)所示，在上容器81設(shè)置具有底面濾器18的井16，將其和下容器82上上下相反地安裝，并將上容器81和下容器82的井16通過上述方法中的任意一種結(jié)合。
而且，如圖16的(a)所示，層疊具有與井的外圓周部形狀相同的貫通孔的、平滑的板87a和具有孔徑比其小的貫通孔的板87b，在孔的級(jí)差部分插入芯片，而且用具有液體出入孔的透明板94覆蓋試劑盒，以關(guān)閉板87的孔。這種情況下，例如板87a、87b是由硅晶片形成，而且透明板94是由研磨石英玻璃形成，由此通過利用了平滑性的表面結(jié)合，不使用連接劑也能形成試劑盒。
<生物芯片試劑盒的操作方法>
在本發(fā)明的生物芯片試劑盒的操作方法中，使收容在生物芯片的井中的分散有探針載體微粒的溶液和；收容在容器內(nèi)的例如具有分析物、各種緩沖液、清洗液、分離劑、標(biāo)記試劑、二次抗體、感光劑、蛋白質(zhì)分解酶、離子化劑等的各種溶液處在可能接觸的狀態(tài)，通過使井內(nèi)的溶液和容器內(nèi)的溶液循環(huán)，從而可以使兩溶液高效率地混合、擴(kuò)散、反應(yīng)、清洗或分離。
作為使上述兩溶液處于可能接觸狀態(tài)的方法，可以是使生物芯片在容器中上下移動(dòng)而使其與容器內(nèi)溶液接觸的方法(圖20(a-1)→(a-3)、圖20(c-1)→(c-3))；將容器內(nèi)的溶液通過注口86的加壓/減壓或、通過從外部注入排出溶液等方法，使液面上下移動(dòng)，從而使其移動(dòng)到井內(nèi)并與井內(nèi)的溶液接觸的方法(圖20(b-1)→(b-2)、圖20(d-1)→(d-2))。
這樣通過加壓/減壓或、通過從外部注入排出溶液等方法使容器內(nèi)的溶液增減，而使容器內(nèi)溶液的液面上下移動(dòng)，在使帶有探針的微粒殘留在生物芯片內(nèi)的狀態(tài)下，使井內(nèi)的溶液與容器內(nèi)的溶液合成一體，可以使井內(nèi)的溶液向井內(nèi)外移動(dòng)。通過反復(fù)操作該方法，可以使容器內(nèi)的溶液和井內(nèi)的溶液高效率地混合、擴(kuò)散、反應(yīng)、清洗或分離。
或者，如圖20(e-1)～(e-5)所示，連接安裝有濾器18’的上容器81和、安裝有在底部具有濾器18的井16的下容器82，并設(shè)置對(duì)上容器81和下容器82加減壓以及進(jìn)行投入排出溶液的注口83、84(圖20(e-1))。通過注口83進(jìn)行加減壓，根據(jù)該加壓力或減壓力使上容器81內(nèi)的溶液與井16內(nèi)的溶液接觸，且使上容器81的溶液與井16內(nèi)的溶液混合(圖20(e-2))，再使其移動(dòng)至下容器82(圖20(e-3)。再通過注口84進(jìn)行加減壓，將溶液排出到容器外(圖20(e-4))。而且，可以向井內(nèi)填充其他溶液85(圖20(e-5))。
這種情況下，使上容器81和下容器82的容積相等，優(yōu)選投入溶液的量比上下各容器的容積大，因此向下容器82移動(dòng)溶液時(shí)，上容器81還有溶液殘留，使空氣不能進(jìn)入到濾器內(nèi)，從而可以使加減壓力最小。
而且在上下移動(dòng)上述井、和移動(dòng)溶液時(shí)，移動(dòng)不是連續(xù)進(jìn)行的，優(yōu)選在移動(dòng)過程中按規(guī)定時(shí)間停止，間歇地移動(dòng)?；蛘撸瑑?yōu)選在正方向移動(dòng)過程中，穿插短時(shí)間的負(fù)方向移動(dòng)。根據(jù)該方法，井內(nèi)的微粒不粘附在濾器，通過移動(dòng)停止或負(fù)方向移動(dòng)在井內(nèi)循環(huán)，可以使生物芯片內(nèi)的溶液和微粒接觸率最大。
<分析物的投入方法>
可以向生物芯片的各井投入相同或不同的分析物。向各井投入相同的分析物時(shí)，可以從各井上部通過點(diǎn)樣將相同的分析物投入各井中，或?qū)⑷萜鲀?nèi)的溶液作為分析物，通過上述方法使其與井內(nèi)溶液接觸，可以使其與井內(nèi)溶液循環(huán)、混合、擴(kuò)散、反應(yīng)。
芯片的井?dāng)?shù)量多時(shí)，優(yōu)選使用容器內(nèi)的分析物的方法。根據(jù)點(diǎn)樣，逐次點(diǎn)樣需要大量點(diǎn)樣時(shí)間，則需要多個(gè)點(diǎn)樣器的并列點(diǎn)樣。
而且，向各井分別投入不同的分析物時(shí)，從各井上部用點(diǎn)樣器等將不同的分析物點(diǎn)樣投入各井中，或?qū)?yīng)每個(gè)井在獨(dú)立的容器分別收容不同的分析物，并通過上述方法使其與井內(nèi)溶液接觸，可以使其與井內(nèi)溶液循環(huán)、混合、擴(kuò)散、反應(yīng)。
這里作為所使用的分析物可以是各種培養(yǎng)液、組織、菌、病毒、細(xì)胞、淋巴球、脂質(zhì)、糖鏈、核酸、尿、血液、血清、血球、人/鼠細(xì)胞因子、絲氨酸/蘇氨酸、激酶、分子量50～100萬的蛋白質(zhì)即合成縮氨酸、膜蛋白質(zhì)、酶、信號(hào)轉(zhuǎn)換蛋白、轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白、磷酸化蛋白質(zhì)等各種蛋白質(zhì)、細(xì)胞因子、淋巴因子、IgA以及IgE等抗體、各種抗原、轉(zhuǎn)錄因子、分子量50～100萬的低分子先導(dǎo)化合物、基質(zhì)、補(bǔ)酶、調(diào)節(jié)因子、血凝素、激素、神經(jīng)傳遞素、反義寡核苷酸、核糖酶、適配子等配體、各種醫(yī)藥候補(bǔ)物質(zhì)、具有生理活性的或可能具有生理活性的各種化學(xué)物質(zhì)等，但并不限定于上述物質(zhì)。
而且，當(dāng)使用競(jìng)爭(zhēng)性雜交或競(jìng)爭(zhēng)性免疫測(cè)定反應(yīng)時(shí)，同時(shí)使用含有靶物質(zhì)的分析物和含有標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)的標(biāo)記分析物。
而且，除分析物之外，還可以通過上述方法投入對(duì)應(yīng)于各井的不同材料，例如各種緩沖液、清洗液、標(biāo)記試劑、二次抗體、感光劑等。
<分析物中的靶物質(zhì)和探針的反應(yīng)方法>
在使用了本發(fā)明的生物芯片試劑盒的分析物中的靶物質(zhì)和探針的反應(yīng)方法中，通過以下(1)～(3)的步驟進(jìn)行反應(yīng)。
(1)通過上述任何一種方法將特定的微粒收容于生物芯片的井中。并且，該步驟也可以預(yù)先在制造芯片時(shí)由芯片制造商調(diào)整。
(2)向生物芯片的井內(nèi)投入含有分析物的溶液，根據(jù)上述操作方法，使該分析物和全部井內(nèi)的上述微粒處于可能接觸的狀態(tài)。在該步驟中，例如通過使井在容器內(nèi)溶液中上下移動(dòng)、或使容器內(nèi)溶液的液面移動(dòng)，使容器內(nèi)溶液和井內(nèi)溶液合成一體，進(jìn)行分析物中的靶物質(zhì)和探針的擴(kuò)散(以及反應(yīng))。
(3)在收容于生物芯片的容器中的上述溶液中，通過使井上下移動(dòng)、或使收容于生物芯片的容器中的上述溶液的液面上下移動(dòng)，進(jìn)行分析物中的靶物質(zhì)和探針反應(yīng)。在該步驟中，根據(jù)上述操作方法，進(jìn)行分析物和探針的反應(yīng)。
<B/F分離方法>
使用本發(fā)明的生物芯片試劑盒的B/F分離方法通過上述反應(yīng)方法中的(1)～(3)步驟和以下的(4)、(5)步驟進(jìn)行。
(4)降低上述溶液的液面高度至未達(dá)到井底部的濾器下表面，將未與上述微粒承載的探針反應(yīng)的分析物從各井內(nèi)除去。
(5)將清洗液投入生物芯片的井中，通過上述容器使清洗液循環(huán)到生物芯片的井中，使清洗液在該生物芯片的井內(nèi)外出入，通過向井外排出清洗液，從而清洗除去探針結(jié)合靶物質(zhì)以外的物質(zhì)。
<分離分級(jí)方法>
使用了本發(fā)明的生物芯片的分析物中的靶物質(zhì)的分離分級(jí)方法通過上述反應(yīng)方法中的(1)～(3)步驟和以下的(4)～(6)步驟進(jìn)行。
(4)降低上述溶液的液面高度至未達(dá)到井底部的濾器下表面，將未與上述微粒承載的探針反應(yīng)的分析物從各井內(nèi)除去。
(5)將清洗液投入生物芯片的井中，通過上述容器使清洗液循環(huán)到生物芯片的井中，通過使清洗液在該生物芯片的井內(nèi)外出入，從而清洗除去探針結(jié)合靶物質(zhì)以外的非靶物質(zhì)。
(6)與設(shè)置于上述生物芯片的井側(cè)部下端的凹部、凸部或平滑部相對(duì)應(yīng)，在上端設(shè)置凸部、凹部或平滑部，使具有上述部分的容器嵌合，然后將分離劑溶液投入生物芯片的井中，因此從上述微粒分離分析物中的靶物質(zhì)，并移動(dòng)到上述容器的井。
以下，對(duì)于本發(fā)明的分析物的分離分級(jí)方法的一個(gè)示例，根據(jù)圖21～23具體說明。最初，每個(gè)生物芯片的各井16分別收容不同種類的承載有探針的微粒。
然后，如圖21的(a)、(b)所示，向生物芯片10的容器12內(nèi)投入含有被檢測(cè)物質(zhì)25的分析物溶液，使分析物和全部井16內(nèi)的探針載體微粒24處在可能接觸的狀態(tài)。這時(shí)，井16內(nèi)溶液液面高度必須不大于側(cè)壁20的高度。
作為這樣按規(guī)定液面高度投入含有分析物的溶液的方法，例如可以是如下方法。第一方法，如圖13所示的生物芯片試劑盒14，獨(dú)立使用芯片10和容器12，預(yù)先向容器12放入分析物溶液，在此處使芯片10向下移動(dòng)并浸漬，通過濾器18使分析物溶液進(jìn)入各井16內(nèi)的方法。這時(shí)，存在濾器18壓力損失的情況下，使芯片10和容器12相互連接的部分形成薄片，向?yàn)V器18施加加壓力或減壓力，可以使分析物溶液通過濾器18，而導(dǎo)入各井16內(nèi)。
第二方法，如圖12所示的生物芯片試劑盒14，使用預(yù)先使容器12的底面和濾器18具有一定距離的芯片，從形成在容器12的低壁或側(cè)壁的導(dǎo)入口通過溶液收容室26，投入分析物溶液的方法。
分析物溶液也可以從井的開口部17投入，這種情況下，優(yōu)選用點(diǎn)樣器等向每個(gè)井16投入等量的溶液。而且，將分析物溶液，例如通過圖21中的導(dǎo)入口42而投入時(shí)，可以使用從該導(dǎo)入口加壓送入分析物溶液、或在溶液收容室26一側(cè)減壓而送入分析物溶液的方法中的任意一種。
根據(jù)上述方法，可以使分析物和全部井16內(nèi)的探針載體微粒24接觸(圖21的(a))。作為使井16內(nèi)的探針載體微粒與被檢測(cè)溶液混合、擴(kuò)散、反應(yīng)的方法，在例如圖12的(b)以及圖13的(b)所示的側(cè)壁20由濾器18構(gòu)成、且鄰接的各井被濾器18分割的情況下，通過攪拌分析物溶液，可以替換各井16內(nèi)的溶液。作為該攪拌方法，可以使用帶有攪拌槳葉的攪拌機(jī)、由聲波或超聲波產(chǎn)生的振動(dòng)、通過空氣或常磁性體的移動(dòng)而攪拌等，根據(jù)現(xiàn)有的方法進(jìn)行攪拌。其中優(yōu)選使用由聲波或超聲波產(chǎn)生的振動(dòng)，可以使用使容器12或芯片10振動(dòng)、或?qū)⒄褡臃湃胄酒?0內(nèi)的分析物溶液中的方法中的任意一種。這種情況下，振動(dòng)的適用頻率可以根據(jù)探針或分析物的種類適宜地調(diào)節(jié)，可以使用100Hz～1GHz，優(yōu)選1kHz～300MHz。在該范圍的頻率中，阻抗很低，可以將對(duì)象物的損傷降到最小。適用頻率小于100Hz時(shí)，攪拌能力低；適用頻率大于1GHz時(shí)，可能損傷分析物或探針。而且如圖13所示的容器12和芯片10為獨(dú)立的情況下，將芯片10從容器12內(nèi)的溶液液面提起之后，將容器12內(nèi)的該溶液使用上述方法中的任意一種進(jìn)行攪拌，然后將芯片10再次浸漬在容器12的溶液內(nèi)的方法、或者通過在水平面上旋轉(zhuǎn)或上下移動(dòng)芯片10使容器12和芯片10相對(duì)移動(dòng)的方法，通過上述方法可以替換各井16內(nèi)的溶液。在井16被不是濾器18的側(cè)壁分割時(shí)，將底壁22的來自濾器18的溶液導(dǎo)入溶液收容室26，然后通過濾器18將溶液導(dǎo)入其它的井16中，由此進(jìn)行溶液的替換。
或者，圖12、13中的任何一種芯片，可以從導(dǎo)入孔42導(dǎo)入加壓空氣，通過提高在容器12內(nèi)的分析物溶液的液面，向井16導(dǎo)入分析物溶液。
然后，如圖22的(a)所示，降低分析物溶液的液面高度至未達(dá)到井16的底壁22的下表面，將未與上述探針載體微粒24承載的探針反應(yīng)的非靶物質(zhì)除去。這里，作為使溶液液面高度降到濾器18的底面以下的方法可以使用，降分析物溶液，通過底壁22的濾器18由泵或加減壓等方式從排出口44向容器12外、或向溶液收容室26移動(dòng)的方法。而且，容器12和芯片10為獨(dú)立的情況下，可以使用使容器12和芯片10相對(duì)移動(dòng)而使濾器18上下移動(dòng)的方法、或?qū)⑿酒?0移動(dòng)到與生物芯片10鄰接的容器或獨(dú)立的其它容器的方法。
在上述中，在使用一側(cè)開放的井，且具有圖14所示的相互面對(duì)的濾器的芯片的情況下，不必?fù)?dān)心從井泄漏微粒，液體表面可以超過井的高度任意移動(dòng)。
而且，在進(jìn)行本操作之前或之后，根據(jù)需要，也可以投入各種清洗劑和各種緩沖液、或二次抗體等化學(xué)試劑。這些投入方法可以與分析物的投入方法相同。
然后，如圖23所示，準(zhǔn)備具有對(duì)應(yīng)于各井16的多個(gè)收容井52的容器54。從上部的開口17向各井16投入分離劑溶液，從與分析物的靶物質(zhì)反應(yīng)的探針載體微粒分離該靶物質(zhì)，并使靶物質(zhì)移動(dòng)到容器54。
該容器54可以是，如圖24所示，在井52的底面設(shè)置有細(xì)微的貫通孔53的容器。通過設(shè)置這樣的貫通孔，可以使芯片的井16和容器的井52之間產(chǎn)生壓差，可以使一并芯片的井16內(nèi)的液體下流。通過注口進(jìn)行與井的數(shù)量相同的次數(shù)的、從各芯片的井向容器的井的液體移動(dòng)的方法，與該方法相比根據(jù)上述一并下流，可以用更少的移動(dòng)次數(shù)，同時(shí)還可以防止由注口等引起的污染或分析物物質(zhì)由于附著在注口而引起的損耗。
在該容器底面形成的貫通孔的直徑根據(jù)孔的高度，優(yōu)選100～500μm，更優(yōu)選150～300μm。孔徑大于500μm時(shí)，液體可能從底面流出；孔徑小于100μm時(shí)，加減壓時(shí)的阻力變大。
分離劑溶液可以使用點(diǎn)樣器等從井開口17，向每個(gè)井16分別地或向各井16一次性投入。
使分離了靶物質(zhì)的溶液移動(dòng)的容器54沒有特別限定為設(shè)置有與各井16分別對(duì)應(yīng)的多個(gè)靶物質(zhì)收容井52、52…的容器54。例如，可以將設(shè)置有具有與井16、16…大致相同大小的靶物質(zhì)收容井52、52…的容器54，定位于芯片10的正下方，將分離劑溶液從井開口17投入而將靶物質(zhì)從該井16內(nèi)的探針載體微粒分離，并收容進(jìn)定位于其正下方的靶物質(zhì)收容井52。
在井底部和上部存在濾器的圖14的(a)、(b)、(c)所示情況下，也可以根據(jù)上述方法的步驟操作。例如圖14的(b)所示的芯片的情況下，如圖20(e-2)、(e-3)所示，通過注口83、84進(jìn)行輸入輸出加減壓空氣，使上容器81內(nèi)的溶液與井16內(nèi)的溶液合成一體，逐漸地移動(dòng)到上容器81、下容器82。
根據(jù)上述方法被分離分級(jí)的分析物是作為以下反應(yīng)步驟的起始物質(zhì)或試驗(yàn)的精制體使用。特別地向質(zhì)量分析計(jì)、拉曼分析計(jì)、表面等離子分析計(jì)、X射線分析計(jì)、電化學(xué)檢測(cè)裝置、石英微量天秤等各檢測(cè)裝置投入被分離分級(jí)的分析物，根據(jù)不需要標(biāo)記試劑的分析方法，分析·鑒定分析物的內(nèi)容。
根據(jù)這些手段分析時(shí)，通過改變溫度等反應(yīng)條件或、通過進(jìn)行多次實(shí)時(shí)檢測(cè)，可以進(jìn)行動(dòng)力學(xué)(Kinetic)分析。而且，不僅要分析是否存在單獨(dú)地與分析物的內(nèi)容、探針反應(yīng)的配體，還要分析每個(gè)井16內(nèi)的各微粒的內(nèi)容，由此可以求出含有分析物的靶物質(zhì)的濃度或量。
<分析物的檢測(cè)方法>
在本發(fā)明的分析物中的靶物質(zhì)的光學(xué)檢測(cè)·鑒定方法中，進(jìn)行與上述分析物中的靶物質(zhì)和探針的反應(yīng)方法，或與B/F分離方法相同的步驟之后，進(jìn)行以下(1)～(3)步驟。
(1)投入標(biāo)記試劑，使標(biāo)記試劑與探針和靶物質(zhì)結(jié)合，之后清洗除去未結(jié)合的標(biāo)記試劑。
(2)將井內(nèi)的溶液通過底部的濾器從井內(nèi)向井外排出，將井內(nèi)的微粒定位于濾器的細(xì)孔。
(3)檢測(cè)被承載于微粒的探針和分析物中的靶物質(zhì)之間的反應(yīng)或相互作用。
且，在所謂同源試驗(yàn)方法中，可以省略B/F分離步驟。
作為步驟(1)中的標(biāo)記試劑可以使用，例如放射性同位素、有機(jī)熒光體、稀土類等交聯(lián)系熒光體、熒光蛋白、磷光體、利用量子效果的發(fā)光毫微粒、化學(xué)發(fā)光劑、酶發(fā)光劑、金或銀的毫微粒等。
而且還可以使用結(jié)合了這些失蹤劑的二次抗體等二次探針、或用于分子標(biāo)記方法的熒光分子/消光分子、用于FRET(FluorescentResonance Energy Transfer)法的原料物質(zhì)和受體分子等。
在步驟(3)中，可以檢測(cè)出對(duì)于每個(gè)微粒，微粒的探針識(shí)別信息和；被微粒承載的探針和分析物中的靶物質(zhì)之間的反應(yīng)或相互作用的信息。而且，對(duì)于每個(gè)井的微粒，識(shí)別被承載于微粒的探針的識(shí)別信息，然后計(jì)算測(cè)量探針和分析物中的靶物質(zhì)相互作用的相關(guān)狀態(tài)，根據(jù)個(gè)微粒中所得的相互作用的狀態(tài)信息，可以計(jì)算出以井為單位的相互作用信息。
以下，關(guān)于本發(fā)明的分析物的檢測(cè)方法的一示例進(jìn)行具體說明。首先，每個(gè)井分別收容不同種類的承載探針的微粒。將本發(fā)明的生物芯片用于檢測(cè)分析物時(shí)，每個(gè)井中的各探針的微粒數(shù)優(yōu)選1～1000各，更優(yōu)選1～500個(gè)，最優(yōu)選1～200個(gè)。
然后，向生物芯片10的容器12內(nèi)投入含有分析物的溶液，使該分析物與各井16內(nèi)的探針載體微粒接觸(圖21的(a)、(b))。
然后，降低分析物溶液的液面高度至未達(dá)到井16的濾器18的下表面，將未與上述探針載體微粒24承載的探針反應(yīng)的分析物除去(圖22的(a))。
這些步驟根據(jù)上述分析物的分離分級(jí)方法中的操作實(shí)施。且，在除去未反應(yīng)的分析物的步驟中，如圖22的(b)所示，導(dǎo)入清洗液進(jìn)行微粒清洗，根據(jù)需要反復(fù)進(jìn)行清洗液的導(dǎo)入、攪拌、排出，從探針載體微粒中除去未反應(yīng)的分析物。
然后，如圖25所示，將生物芯片內(nèi)的溶液通過底面濾器排出，將井16內(nèi)的微粒定位于底面濾器18的孔部之后，檢測(cè)每個(gè)井16中探針載體微粒和分析物之間的反應(yīng)或相互作用。且，用電子顯微鏡照片表示將探針載體微粒定位于濾器孔上的實(shí)際情況，如圖28所示。
在現(xiàn)有技術(shù)中，檢測(cè)溶液中探針載體微粒和分析物的反應(yīng)時(shí)，將進(jìn)行反應(yīng)的微粒的一部分或全部作為一個(gè)分析物而進(jìn)行檢測(cè)·鑒定，這樣降低分析物溶液的液面高度至未達(dá)到井16的濾器18的下表面，根據(jù)在將帶有探針的微粒定位于濾器孔上的狀態(tài)下進(jìn)行檢測(cè)，可以將全部進(jìn)行反應(yīng)的微粒作為逐個(gè)檢測(cè)·鑒定的對(duì)象，從而達(dá)到提高檢測(cè)敏感度的企圖。圖28是將探針載體微粒定位于濾器孔上的電子顯微鏡照片。
作為分析物的檢測(cè)方法可以使用通常使用的各種方法，例如放射性同位素檢測(cè)、熒光檢測(cè)、化學(xué)發(fā)光檢測(cè)、酶發(fā)光檢測(cè)、拉曼檢測(cè)等，但不限于上述方法。
根據(jù)上述檢測(cè)方法進(jìn)行檢測(cè)時(shí)，通過改變溫度等反應(yīng)條件或、通過進(jìn)行多次實(shí)時(shí)檢測(cè)，可以進(jìn)行動(dòng)力學(xué)(Kinetic)分析。而且，不僅要分析是否存在單獨(dú)地與分析物的內(nèi)容、探針反應(yīng)的配體，還要分析每個(gè)井內(nèi)的各微粒的內(nèi)容，由此可以求出含有分析物的靶物質(zhì)的濃度或量。
而且，對(duì)于熒光發(fā)光、化學(xué)發(fā)光檢測(cè)等所謂化學(xué)檢測(cè)，從收容由井構(gòu)成的芯片的容器中取出該芯片，優(yōu)選單獨(dú)對(duì)芯片進(jìn)行激勵(lì)光的照射、檢測(cè)光的檢測(cè)。將芯片從容器中取出時(shí)，激勵(lì)光可以從芯片的上表面、下表面的任意一個(gè)進(jìn)行照射。而且，檢測(cè)光也可以從芯片的上表面、下表面的任意一個(gè)進(jìn)行照射。
通過從容器中取出芯片，排除容器的變形和來自容器自身的熒光的影響，而且由于與物體的距離變近，可以使光學(xué)檢測(cè)時(shí)的開口數(shù)NA(Numerical Aparture)變大。
而且，如圖16所示通過將容器做成透明的，不必從容器取出芯片就可以將激勵(lì)光、檢測(cè)光中的任意一個(gè)從芯片的上下取出。這種情況下，使圖16中的透明板94的厚度和板87b的厚度盡可能地薄，由此可以使NA變大。
而且，在圖14的(b)或(c)所示的芯片中，為用于反應(yīng)后檢測(cè)，將帶有上濾器的上容器81取出，對(duì)于在下濾器上排列有微粒的帶有下濾器的下容器82，可以從上側(cè)開放面進(jìn)行光照射而進(jìn)行檢測(cè)。
在上述檢測(cè)步驟中，對(duì)每個(gè)井計(jì)算測(cè)量探針和分析物中的靶物質(zhì)相互作用的相關(guān)狀態(tài)，根據(jù)各微粒中所得的相互作用的狀態(tài)信息，可以計(jì)算出以井為單位的相互作用信息，對(duì)上述情況進(jìn)行說明。首先，計(jì)算測(cè)量每個(gè)收容于各井中的探針載體微粒中，探針和分析物之間的相互作用相關(guān)的信息。作為進(jìn)行該測(cè)量的手段，可以使用上述記載的各種方法。例如，使用熒光檢測(cè)時(shí)，照射用于檢測(cè)排列在同一井內(nèi)的各微粒的UV光或可見光等激勵(lì)光，其結(jié)果用CCD照相機(jī)、熒光管等檢測(cè)得到的檢測(cè)光等信號(hào)。將該方法對(duì)每個(gè)微粒分別實(shí)施，而且對(duì)其它井內(nèi)的微粒也同樣地逐次進(jìn)行該檢測(cè)操作。然后，將這些得到的數(shù)據(jù)對(duì)于每個(gè)井分別累積處理，對(duì)于井內(nèi)的微粒數(shù)N的數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)標(biāo)準(zhǔn)化處理。而且根據(jù)需要，參考比較現(xiàn)存的各種數(shù)據(jù)庫的數(shù)據(jù)，對(duì)該數(shù)據(jù)進(jìn)行修正或判斷處理。
根據(jù)該方法，例如在現(xiàn)有技術(shù)的生物芯片中的對(duì)井或單元的光學(xué)檢測(cè)方法，與測(cè)定一個(gè)井或單元發(fā)出的熒光強(qiáng)度、熒光光譜的方法相比，由于能得到每個(gè)井內(nèi)的微粒探針個(gè)數(shù)N的信息，所以信息量變多而提高了敏感度；或可以通過統(tǒng)計(jì)處理N個(gè)微粒探針的信息分布，而進(jìn)行定量的檢測(cè)·鑒定。
而且，通過改變溫度等反應(yīng)條件或進(jìn)行多次實(shí)時(shí)檢測(cè)，在所謂行動(dòng)力學(xué)(Kinetic)分析中，對(duì)于每個(gè)井內(nèi)微粒或微粒的檢測(cè)模式通過實(shí)時(shí)追蹤，可以得到很多參數(shù)N的高可靠性分析數(shù)據(jù)。
在本發(fā)明的生物芯片中，除了將核酸作為其探針由微粒承載的DNA芯片以外，還包括將抗原以及抗體等蛋白或與這些蛋白反應(yīng)的化學(xué)物質(zhì)由微粒承載蛋白芯片；阻擋與承載低分子化合物的蛋白等相互作用的芯片；將糖鏈由微粒承載的糖鏈芯片；將細(xì)胞由微粒承載的細(xì)胞芯片。
根據(jù)固定在載體上的各種探針，這些DNA芯片、蛋白芯片、糖鏈芯片以及細(xì)胞芯片可以應(yīng)用于基因功能分析；基因表達(dá)分析；功能蛋白組學(xué)或結(jié)構(gòu)蛋白組學(xué)；用于確認(rèn)功能塞絡(luò)姆(selloum)、結(jié)構(gòu)塞絡(luò)姆、疾病分析、各種感染癥等疾病的患者情況的臨床檢查；基因多型檢測(cè)；被稱為對(duì)癥治療的、對(duì)于患者的基因序列治療醫(yī)藥的選定；核酸、蛋白質(zhì)、細(xì)胞或糖鏈與化學(xué)物質(zhì)相互作用的研究、孤立受體配體的研究；稱為藥理基因組學(xué)的、用于醫(yī)藥品開發(fā)的藥學(xué)篩選或化學(xué)物質(zhì)安全性以及毒性篩選；其它各種篩選等。而且，通過組合使用特異性分析物和特異性探針，組合進(jìn)行免疫試驗(yàn)、蛋白質(zhì)-DNA、蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì)等的相互作用試驗(yàn)、蛋白、糖鏈、細(xì)胞-配體試驗(yàn)、受體-配體試驗(yàn)、激酶等酶試驗(yàn)等各種試驗(yàn)。
以下，根據(jù)實(shí)施例對(duì)本發(fā)明進(jìn)行說明，本發(fā)明并不限定于這些實(shí)施例。
通過電鑄制造濾器和肋1.濾器的制造在不銹鋼基板(SUS304，尺寸120mm×120mm×厚度1mm)上，用旋轉(zhuǎn)涂布機(jī)(Pin Coater)以膜厚為5μm涂布抗蝕劑THB-110N(商品名，JSR株式會(huì)社制)，在加熱板上進(jìn)行120℃、5分鐘的預(yù)烘。預(yù)烘后，使用掩模對(duì)準(zhǔn)器M-3LDF(商品名，Mikasa株式會(huì)社制)以400mJ/cm2的曝光量燒結(jié)規(guī)定的圖案使未電鍍部分殘留。顯像液使用PD523(商品名，JSR株式會(huì)社制)進(jìn)行顯像后，在加熱板上進(jìn)行90℃、5分鐘的堅(jiān)膜。
然后，向確保pH值為4.0至4.5、維持浴溫在50℃的氨基磺酸鎳浴(浴組成700g/l、60％的氨基磺酸鎳溶液，5g/l的溴化鎳，35g/l的硼酸，1.5g/l的應(yīng)力調(diào)節(jié)劑，2.5ml/l的凹陷防止劑)中，投入用抗蝕劑THB-110N制膜的SUS基板，將電壓電流控制在電壓7V、電流密度1A/dm2，施加直流電30分鐘，制得的厚度5μm、最小孔徑3μm、最小孔間距7μm鎳膜。
電鍍后，通過將電鑄樣品在抗蝕劑剝離器THB-S1(商品名，JSR株式會(huì)社制)中浸漬攪拌30分鐘，得到全部剝離了抗蝕劑的濾器。
2.肋的制造在根據(jù)電鑄法得到的鎳濾器上，使用與上述相同的步驟通過層疊肋而制得帶有肋的濾器。裝置以及電鑄條件與上述制造條件大致相同，但對(duì)于厚度5μm的濾器要得到厚度50μm的肋，使用旋轉(zhuǎn)涂布機(jī)涂布THB-220N(商品名，JSR株式會(huì)社制)的抗蝕劑，以650mJ/cm2的曝光量進(jìn)行曝光。而且，為得到厚度為50μm的鎳電鍍膜，進(jìn)行5小時(shí)的鎳電鍍。
通過蝕刻帶有氧化膜的硅晶片制造濾器和肋1.濾器的制造使用旋涂器(CLEAN TRACK MARK8(商標(biāo))，東京Electron社制)將抗蝕劑IX1170G(商品名，JSR株式會(huì)社)在帶有6英寸氧化膜的硅晶片(厚度2μm)上，以3300rpm旋轉(zhuǎn)涂布30秒，然后在加熱板(CLEAN TRACK MARK8(商標(biāo))，東京Electron社制)上以90℃干燥60秒，從而得到膜厚0.86μm的保護(hù)膜。向該保護(hù)膜使用縮小投影曝光裝置NSR-2205i12D(商品名，理光社制，NA＝0.57，δ＝0.60)以0.4umC/H 1000msec、0.8C/H 580msec的曝光量進(jìn)行曝光后，使用顯像液PD523AD(商品名，JSR株式會(huì)社制)以23℃進(jìn)行1分鐘PADDLE顯像。然后水洗20秒，干燥后得到保護(hù)膜圖案。
向經(jīng)過制膜后的帶有厚度為2μm氧化膜的硅晶片上，使用等離子蝕刻裝置將CF4等離子用RIE模式照射后，用O2等離子除去抗蝕劑而得到形成在氧化膜上濾器，該濾器具有濾器孔直徑和孔隙為0.4/0.8μm、0.8/0.8、2.8/1.0、2.8/2.0、2.8/2.8、2.8/4.0、4.0/1.0、4.0/2.0、4.0/4.0、4.0/6.0、4.0/8.0、8.0/2.0、8.0/4.0、8.0/6.0μm，高度為2μm的孔。
2.肋的制造在與進(jìn)行濾器加工的面相反的面上，將抗蝕劑(THB-151N)使用旋涂器(旋轉(zhuǎn)涂布機(jī)1H-DX2(商品名)，Mikasa株式會(huì)社制)以1700rpm旋轉(zhuǎn)涂布20秒，用加熱板以120℃干燥5分鐘而得到膜厚為40μm的保護(hù)膜。向該保護(hù)膜使用等倍投影曝光裝置MA-150CC(商品名，SUSS MicroTec社制)進(jìn)行曝光后，使用顯像液PD523AD(商品名，JSR株式會(huì)社制)以23℃進(jìn)行90秒PADDLE顯像。然后水洗30秒，干燥后得到保護(hù)膜圖案。
向經(jīng)過制膜后的帶有厚度為440μm氧化膜的硅晶片上，使用等離子蝕刻裝置將SF6等離子用RIE模式照射后，用O2等離子除去抗蝕劑而得到具有井的硅晶片，該井上形成有在硅上高度為440μm、直徑為500μm的孔。用鉆石輪劃片機(jī)切斷上述制得物，制成在10mm見方具有28個(gè)井的芯片。
準(zhǔn)備用PBS(Phosphate Buffered Saline)將牛血清稀釋10倍的溶液。使用實(shí)施例2中得到的濾器孔徑為4.0μm、孔間隔為2.0μm的芯片，在圖16的(b)所示容器中設(shè)置芯片，在上蓋設(shè)置管，在管的另一端連接用于輸入牛血清稀釋液的槽，將槽的高度設(shè)置成具有4gf/cm2和18gf/cm2的壓差，使牛血清稀釋液流入芯片容器的一部分濾器中，然后從下容器的下蓋排出牛血清稀釋液。各時(shí)段合計(jì)的排出量和排出時(shí)間的關(guān)系如圖30所示。
如同一附圖所示，從濾器的排出量大致恒定，在評(píng)估時(shí)段中沒有產(chǎn)生堵塞或破壞。
對(duì)于實(shí)施例3中芯片的孔徑和孔間隔不同的8種組合，以18gf/cm2的壓差進(jìn)行與實(shí)施例3相同的試驗(yàn)。其結(jié)果如圖31所示。并且，在同一附圖中，a/r表示濾器的開口面積比。試驗(yàn)結(jié)果為在同一附圖的區(qū)域A(開口面積比小于10％)中，濾器容易堵塞；在區(qū)域B(開口面積比大于60％)中，濾器被破壞。因此，開口面積比為10％～60％時(shí)，不容易發(fā)生堵塞和破壞。
權(quán)利要求
1.一種生物芯片，其特征是，具有底部設(shè)置有濾器的井，所述濾器包括按均等孔間隔排列的具有均等孔徑的直細(xì)孔。
2.如權(quán)利要求1所述的生物芯片，其特征是，上述濾器的厚度為1～10μm。
3.如權(quán)利要求1或2所述的生物芯片，其特征是，上述濾器的開口面積比為15～60％。
4.如權(quán)利要求1～3中任意一項(xiàng)所述的生物芯片，其特征是，上述濾器的表面材質(zhì)為二氧化硅、二氧化鈦或氧化鋁。
5.如權(quán)利要求1～4中任意一項(xiàng)所述的生物芯片，其特征是，具有彼此整體形成的多個(gè)上述井。
6.如權(quán)利要求1～4中任意一項(xiàng)所述的生物芯片，其特征是，具有單個(gè)的上述井。
7.如權(quán)利要求1～6中任意一項(xiàng)所述的生物芯片，其特征是，在上述井中的濾器的上側(cè)或下側(cè)，設(shè)置有補(bǔ)強(qiáng)用肋部。
8.如權(quán)利要求7所述的生物芯片，其特征是，上述補(bǔ)強(qiáng)用肋部呈形成有多個(gè)貫通孔的一體形狀。
9.如權(quán)利要求7或8所述的生物芯片，其特征是，上述補(bǔ)強(qiáng)用肋部直接與上述濾器結(jié)合。
10.如權(quán)利要求7或8所述的生物芯片，其特征是，上述補(bǔ)強(qiáng)用肋部是與上述濾器用相同的材料連續(xù)延伸形成的。
11.如權(quán)利要求1～10中任意一項(xiàng)所述的生物芯片，其特征是，在上述井的底部，在距其圓周邊緣規(guī)定寬度內(nèi)，設(shè)置未形成濾器細(xì)孔的無孔部。
12.如權(quán)利要求1～11中任意一項(xiàng)所述的生物芯片，其特征是，在底部設(shè)置第一濾器的同時(shí)，以把井夾在中間的方式，在第一濾器的相反一側(cè)設(shè)置第二濾器。
13.如權(quán)利要求1～12中任意一項(xiàng)所述的生物芯片，其特征是，在上述井中收容具有分散了探針載體微粒的分散液。
14.如權(quán)利要求13所述的生物芯片，其特征是，上述微粒的粒徑與濾器的孔徑的比率為粒徑/孔徑＝1.1～2.5，并且粒徑＜孔間隔＜粒徑×10。
15.如權(quán)利要求13所述的生物芯片，其特征是，上述微粒的粒徑、濾器的孔徑以及孔間隔滿足粒徑＞孔徑+孔間隔/2的關(guān)系。
16.如權(quán)利要求13所述的生物芯片，其特征是，在上述井中收容具有分散了探針載體微粒的分散液，該探針載體微粒具有用于提供探針識(shí)別信息的至少一種識(shí)別手段。
17.如權(quán)利要求16所述的生物芯片，其特征是，上述識(shí)別手段為從探針載體微粒的顏色、形狀、粒徑以及基因序列中選擇的至少一種。
18.如權(quán)利要求16或17所述的生物芯片，其特征是，在全部上述識(shí)別手段的探針識(shí)別信息相同的多個(gè)探針載體微粒被收容在同一井中，并且對(duì)于收納于各井中的多個(gè)探針載體微粒的上述探針識(shí)別信息相同。
19.如權(quán)利要求16或17所述的生物芯片，其特征是，在全部上述識(shí)別手段的探針識(shí)別信息相同的多個(gè)探針載體微粒被收容在同一井中，并且對(duì)于收納于各井中的多個(gè)探針載體微粒的上述探針識(shí)別信息不同。
20.如權(quán)利要求16或17所述的生物芯片，其特征是，在至少一種上述識(shí)別手段的探針識(shí)別信息不同的多個(gè)探針載體微粒被收納在同一井中，并且對(duì)于收納于各井中的多個(gè)探針載體微粒，在其全部識(shí)別手段的上述探針識(shí)別信息的構(gòu)成相同。
21.如權(quán)利要求16或17所述的生物芯片，其特征是，在至少一種上述識(shí)別手段的探針識(shí)別信息不同的多個(gè)探針載體微粒被收容在同一井中，并且對(duì)于收納于各井中的多個(gè)探針載體微粒，在其全部識(shí)別手段的上述探針識(shí)別信息的構(gòu)成不同。
22.一種生物芯片試劑盒，其特征是，具有容器，該容器或者收容權(quán)利要求1～21中任意一項(xiàng)所述的生物芯片中彼此整體形成的多個(gè)井或單個(gè)井，或者與上述井連接。
23.如權(quán)利要求22所述的生物芯片試劑盒，其特征是，上述容器與上述井形成為一體。
24.如權(quán)利要求22所述的生物芯片試劑盒，其特征是，上述容器與上述井獨(dú)立地形成。
25.如權(quán)利要求22～24任意一項(xiàng)所述的生物芯片試劑盒，其特征是，上述容器具有與上述生物芯片的井相對(duì)應(yīng)的井。
26.如權(quán)利要求25所述的生物芯片試劑盒，其特征是，在上述容器的井底部形成貫通孔。
27.如權(quán)利要求25或26所述的生物芯片試劑盒，其特征是，將上述生物芯片與上述容器連接，以使對(duì)應(yīng)的井相互聯(lián)結(jié)。
28.如權(quán)利要求22～27任意一項(xiàng)所述的生物芯片試劑盒，其特征是，上述容器是使用形成有貫通孔的板和未形成貫通孔的板中的至少一種，通過層疊多個(gè)上述板而形成的。
29.一種生物芯片試劑盒，其特征是，將權(quán)利要求1～21任意一項(xiàng)所述的多個(gè)生物芯片彼此之間相連接，以使對(duì)應(yīng)的井相互聯(lián)結(jié)。
30.如權(quán)利要求22～29任意一項(xiàng)所述的生物芯片試劑盒，其特征是，將設(shè)置在上述生物芯片的井側(cè)部下端的平坦部和設(shè)置在分離的上述容器或上述生物芯片的井側(cè)部的上端的平坦部直接連接，使井相互聯(lián)結(jié)。
31.如權(quán)利要求22～29任意一項(xiàng)所述的生物芯片試劑盒，其特征是，在上述生物芯片的井側(cè)部下端設(shè)置有，與分離的上述容器或上述生物芯片的井側(cè)部上端所設(shè)凸部相嵌合的定位用的凹部；或與分離的上述容器或上述生物芯片的井側(cè)部上端所設(shè)凹部相嵌合的定位用的凸部。
32.一種生物芯片的制造方法，其特征是，在制造權(quán)利要求1～21任意一項(xiàng)所述的生物芯片時(shí)，對(duì)于用不同組分的材質(zhì)形成的至少由兩層構(gòu)成的板，通過蝕刻圖案進(jìn)行蝕刻，從一側(cè)蝕刻到二層的邊界而形成井孔，同時(shí)通過蝕刻圖案進(jìn)行蝕刻，從另一側(cè)蝕刻到二層的邊界而形成濾器孔，由此得到井和濾器結(jié)合的生物芯片。
33.一種生物芯片的制造方法，其特征是，在制造權(quán)利要求1～21任意一項(xiàng)所述的生物芯片時(shí)，通過蝕刻硅晶片而分別制造濾器、肋以及井，然后將其層疊。
34.一種生物芯片試劑盒的操作方法，其特征是，在收容在容器與生物芯片的井獨(dú)立地形成的權(quán)利要求22～31任意一項(xiàng)所述的生物芯片試劑盒的該容器的溶液內(nèi)，通過使生物芯片的井上下移動(dòng)，使該容器內(nèi)的溶液與井內(nèi)的探針載體微粒和/或溶液相接觸。
35.一種生物芯片試劑盒的操作方法，其特征是，通過使收容在權(quán)利要求22～31任意一項(xiàng)所述的生物芯片試劑盒的容器中的溶液的界面上下移動(dòng)，使該容器內(nèi)的溶液與井內(nèi)的探針載體微粒和/或溶液相接觸。
36.一種生物芯片試劑盒的操作方法，其特征是，使權(quán)利要求22～31任意一項(xiàng)所述的生物芯片試劑盒所具有用于連接生物芯片的容器和芯片之間、或在該芯片中的井相互之間產(chǎn)生壓差，由此產(chǎn)生井內(nèi)的液體和探針載體微粒的接觸、液體在井之間的移動(dòng)，或二者同時(shí)產(chǎn)生。
37.一種生物芯片試劑盒的操作方法，其特征是，使權(quán)利要求22～31任意一項(xiàng)所述的生物芯片試劑盒所具有用于連接生物芯片的容器和芯片之間、或該芯片中的井相互之間產(chǎn)生壓差，由此產(chǎn)生井內(nèi)的液體和探針載體微粒的接觸、液體在井之間的移動(dòng)，或二者同時(shí)產(chǎn)生。
38.如權(quán)利要求34～37任意一項(xiàng)所述的生物芯片試劑盒的操作方法，其特征是，通過使上述容器內(nèi)的溶液和井內(nèi)的探針載體微粒和/或溶液接觸，對(duì)生物芯片內(nèi)的內(nèi)容物進(jìn)行混合、擴(kuò)散、反應(yīng)、分離或清洗。
39.如權(quán)利要求34～38任意一項(xiàng)所述的生物芯片試劑盒的操作方法，其特征是，向上述生物芯片的各井中投入相同的分析物。
40.如權(quán)利要求34～38任意一項(xiàng)所述的生物芯片試劑盒的操作方法，其特征是，向上述生物芯片的各井中投入彼此不同的分析物。
41.一種分析物中的靶物質(zhì)和探針的反應(yīng)方法，其特征是，包括以下步驟將特定的微粒放置在權(quán)利要求22～31任意一項(xiàng)所述的試劑盒中的生物芯片的井內(nèi)，形成權(quán)利要求18～21任意一項(xiàng)所述的芯片；向上述生物芯片的井內(nèi)，投入含有分析物的溶液，使該分析物和所有井內(nèi)的上述微粒形成可能接觸的狀態(tài)；以及在生物芯片容器所收容的上述溶液中使井上下移動(dòng)、或使收容在生物芯片容器中的上述溶液的界面上下移動(dòng)，或者通過施加壓差使井內(nèi)外的溶液循環(huán)，從而使分析物中的靶物質(zhì)和探針進(jìn)行反應(yīng)。
42.一種從分析物中B/F分離靶物質(zhì)的方法，其特征是，包括以下步驟將特定微粒放置在權(quán)利要求22～31任意一項(xiàng)所述的試劑盒的生物芯片的井中，形成權(quán)利要求18～21任意一項(xiàng)所述的芯片；向上述生物芯片的井內(nèi)，投入含有分析物的溶液，使該分析物和所有井內(nèi)的上述微粒形成可能接觸的狀態(tài)；使上述溶液的界面高度降低到低于井底部的濾器的下表面，從而將未與上述微粒所承載的探針反應(yīng)的分析物從各井內(nèi)除去；以及向生物芯片的井中投入清洗液，通過上述容器使清洗液在該生物芯片的井中循環(huán)，向該生物芯片的井內(nèi)外輸入排出清洗液，并從井中排出清洗液，從而清洗去除探針結(jié)合的靶物質(zhì)以外的物質(zhì)。
43.一種分析物中靶物質(zhì)的分離分級(jí)方法，其特征是，包括以下步驟將特定微粒放置在權(quán)利要求30或31所述的試劑盒中的生物芯片的井中，形成權(quán)利要求18～21任意一項(xiàng)所述的芯片；向上述生物芯片的井內(nèi)，投入含有分析物的溶液，使該分析物和所有井內(nèi)的上述微粒形成可能接觸的狀態(tài)；使上述溶液的界面高度降低到低于井底部的濾器的下表面，將未與上述微粒所承載的探針反應(yīng)的分析物從各井內(nèi)除去；向生物芯片的井中投入清洗液，使清洗液通過上述容器在該生物芯片的井中循環(huán)，向該生物芯片的井內(nèi)外輸入排出清洗液，并從井中排出清洗液，從而清洗去除探針結(jié)合的靶物質(zhì)以外的物質(zhì)；以及使在上述生物芯片的井側(cè)部下端設(shè)置的凹部、凸部或平滑部與在容器上端具有的與其對(duì)應(yīng)的凸部、凹部或平滑部嵌合，然后向生物芯片的井中投入分離劑溶液，由此從上述微粒中分離分析物中的靶物質(zhì)，并移動(dòng)到上述容器的井中。
44.一種分析物中的靶物質(zhì)和探針相互作用的檢測(cè)·鑒定方法，其特征是，包括以下步驟將特定微粒放置在權(quán)利要求22～31任意一項(xiàng)所述的試劑盒中的生物芯片的井內(nèi)，形成權(quán)利要求18～21任意一項(xiàng)所述的芯片；向上述生物芯片的井內(nèi)，投入含有分析物的溶液，使該分析物和所有井內(nèi)的上述微粒形成可能接觸的狀態(tài)；使上述溶液的界面高度降低到低于井底部的濾器的下表面，將未與上述微粒所承載的探針反應(yīng)的分析物從各井內(nèi)除去；向生物芯片的井中投入清洗液，使清洗液通過上述容器在該生物芯片的井中循環(huán)，向該生物芯片的井內(nèi)外輸入排出清洗液，并從井中排出清洗液，從而清洗去除探針結(jié)合的靶物質(zhì)以外的物質(zhì)；使井內(nèi)的微粒定位于濾器的細(xì)孔內(nèi)；以及檢測(cè)·鑒定上述微粒所承載的探針和分析物的靶物質(zhì)之間的反應(yīng)或相互作用。
45.如權(quán)利要求44所述的分析物中的靶物質(zhì)和探針相互作用的檢測(cè)·鑒定方法，其特征是，對(duì)于每個(gè)微粒檢測(cè)兩方面信息，即微粒的探針識(shí)別信息，以及上述微粒所承載的探針與分析物的靶物質(zhì)之間的反應(yīng)或相互作用的信息。
46.如權(quán)利要求44所述的分析物中的靶物質(zhì)和探針相互作用的檢測(cè)·鑒定方法，其特征是，對(duì)于各井中的微粒，識(shí)別上述微粒所承載的探針識(shí)別信息，然后計(jì)測(cè)有關(guān)探針和分析物中的靶物質(zhì)的相互作用的狀態(tài)，以基于各微粒的相互作用的狀態(tài)信息，計(jì)算出以井為單位的相互作用信息。
全文摘要
本發(fā)明提供生物芯片和生物芯片試劑盒及其制造方法和使用方法，可以高效率短時(shí)間地使分析物中的靶物質(zhì)和探針反應(yīng)，還可以進(jìn)行以高B/F分離效率、高敏感度的定量檢測(cè)；使用了該生物芯片試劑盒的、分析物中的靶物質(zhì)和探針之間的反應(yīng)方法；分析物中的靶物質(zhì)的分離分級(jí)方法以及檢測(cè)·鑒定方法等。本發(fā)明的生物芯片具有底部設(shè)置有濾器的井，所述濾器包括按均等孔間隔排列的具有均等孔徑的直細(xì)孔。在該井中，收容了分散有探針載體微粒的分散液，向井投入分析物使其與探針載體微粒反應(yīng)。分析物溶液等溶液可以通過濾器被導(dǎo)入井中，或從井中排出。
文檔編號(hào)G01N37/00GK1781020SQ20048001117
公開日2006年5月31日 申請(qǐng)日期2004年4月23日 優(yōu)先權(quán)日2003年4月25日
發(fā)明者奧村勝彌, 三原誠(chéng), 吉岡睦彥 申請(qǐng)人:捷時(shí)雅株式會(huì)社, 奧克泰克株式會(huì)社