專利名稱：用于進(jìn)行現(xiàn)場(chǎng)測(cè)試的膜條生物傳感器系統(tǒng)的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種用于進(jìn)行現(xiàn)場(chǎng)測(cè)試(Point-of-care Testing，POCT)的生物傳感器，通過將一種用于信號(hào)生成的免疫反應(yīng)和其它反應(yīng)的連續(xù)交叉流動(dòng)步驟(successive cross-flow procedure)引入到膜條色譜法檢測(cè)系統(tǒng)中可顯著地提高所述生物傳感器的分析性能。
背景技術(shù)：
對(duì)體液中低濃度的疾病標(biāo)記物(代謝物、蛋白、細(xì)胞等)的測(cè)定通常是通過采用生物學(xué)反應(yīng)例如酶反應(yīng)和抗原-抗體結(jié)合而實(shí)現(xiàn)的。因?yàn)槊负涂贵w具有非常高的選擇性識(shí)別它們的反應(yīng)配體的反應(yīng)特異性以及具有高的反應(yīng)效率，所以測(cè)定復(fù)雜介質(zhì)中的分析物成為可能。尋求發(fā)展基于這些反應(yīng)特性的診斷系統(tǒng)以便對(duì)疾病進(jìn)行早期診斷和在疾病早期對(duì)疾病進(jìn)行充分治療是非常重要的。但是，因?yàn)榻^大多數(shù)的診斷系統(tǒng)都需要操縱試劑和設(shè)備，所以它們的應(yīng)用被限定于實(shí)驗(yàn)室，并且需要具有更多的專業(yè)知識(shí)才能進(jìn)行測(cè)定。
最近，作為一種免疫檢測(cè)法，對(duì)在家里的自我診斷以及在現(xiàn)場(chǎng)例如醫(yī)生辦公室或急診室測(cè)定可以代表疾病的癥狀和進(jìn)展的標(biāo)記物例如激素、蛋白和微生物的需求正在快速地增長(參考文獻(xiàn)C.P.Price等，Principles and Practice of Immunoassay，1997，page 579-603，MacmillanReference Ltd.，London)。為此，發(fā)展不需要任何專業(yè)知識(shí)和復(fù)雜步驟，并且使用簡(jiǎn)單以及提供快速應(yīng)答的免疫檢測(cè)系統(tǒng)是必需的?？梢酝ㄟ^采用用于固定結(jié)合蛋白(例如抗原或抗體)的微孔膜的免疫色譜法完成這樣的診斷操作(參考文獻(xiàn)R.Chen等，1987，Clin.Chem.Vol.33，Page1521-1525；M.P.A.Laitinen，1996，Biosens，Bioelectron.，Vol.11.1207-1214；S.C.Lou等，1993，Clin.Chem.，Vol.39，619-624；S.H.Paek等，1999，Anal.Lett.，Vol.32.335-360)。在這種分析形式中，當(dāng)從膜條的底部末端吸收含分析物的標(biāo)本時(shí)，通過毛細(xì)管作用經(jīng)膜孔將分析物轉(zhuǎn)運(yùn)到固定有結(jié)合蛋白的層。在固體的表面發(fā)生抗原和抗體之間的結(jié)合反應(yīng)，接著通過介質(zhì)流動(dòng)分離未結(jié)合的分子。因?yàn)榻橘|(zhì)的側(cè)向流動(dòng)(lateralflow)加速了試劑的轉(zhuǎn)運(yùn)，所以基于上述原理的膜條免疫色譜法提供了對(duì)分析物的快速分析以及一步檢測(cè)的便利，其中在單次加樣后就可以完成分析。
受孕和排卵的診斷試劑盒市場(chǎng)的快速增長已經(jīng)很好地反映了對(duì)這些一步診斷系統(tǒng)的需求，并且由于預(yù)計(jì)不久可能建立的基于因特網(wǎng)的電話診斷和處方系統(tǒng)，因此就要求將對(duì)例如要求定期檢查的成人疾病的疾病家庭監(jiān)測(cè)系統(tǒng)作為衛(wèi)生保健的關(guān)鍵環(huán)節(jié)。但是，現(xiàn)有的家庭版的診斷試劑幾乎都是處于實(shí)施簡(jiǎn)單的免疫色譜檢測(cè)和用肉眼識(shí)別顏色信號(hào)的定性結(jié)果的水平，因此它們不適用于分析需要測(cè)定其濃度的指示劑物質(zhì)(蛋白標(biāo)記物等)。作為能被用于定量分析的傳統(tǒng)方法，利用傳統(tǒng)的光度測(cè)定轉(zhuǎn)換方法可將從作為示蹤劑的膠體金中生成的顏色信號(hào)轉(zhuǎn)化為吸光度(參考文獻(xiàn)M.P.A.Laitinen，1996，Biosens.Bioelectron.，Vol.11，1207-1214)，它仍有缺點(diǎn)，即與在實(shí)驗(yàn)室中所廣泛使用的酶聯(lián)免疫吸附檢測(cè)法的檢測(cè)敏感度比較，它的檢測(cè)敏感度低。
通過使用具有高敏感度的信號(hào)生成劑例如熒光物質(zhì)或放射性同位素可以克服現(xiàn)場(chǎng)測(cè)試設(shè)備的低敏感度的缺點(diǎn)。事實(shí)上，已經(jīng)發(fā)展出免疫檢測(cè)系統(tǒng)，其中用熒光物質(zhì)標(biāo)記的檢測(cè)抗體進(jìn)行免疫色譜檢測(cè)以及用熒光檢測(cè)儀測(cè)定檢測(cè)結(jié)果(參考文獻(xiàn)美國專利5753517)。因?yàn)檫@個(gè)技術(shù)提供了高敏感度以及無有害作用，它最近已經(jīng)被應(yīng)用于可在急診室使用的現(xiàn)場(chǎng)免疫診斷設(shè)備中(參考文獻(xiàn)美國專利6271040 B1)。但是，因?yàn)闊晒鈾z測(cè)儀是相當(dāng)昂貴的并且它難以被縮小到可攜帶的尺寸，所以這個(gè)系統(tǒng)被限制地用于醫(yī)院的臨床實(shí)驗(yàn)室或研究實(shí)驗(yàn)室，以及當(dāng)與實(shí)驗(yàn)室版的酶聯(lián)免疫吸附檢測(cè)法比較時(shí)，除了快速檢測(cè)之外，它不具有其它的特殊的優(yōu)點(diǎn)。
另一方面，實(shí)驗(yàn)室版的酶聯(lián)免疫吸附檢測(cè)法基本上都需要用于在相應(yīng)的免疫檢測(cè)過程中分離免疫復(fù)合物和未反應(yīng)物的洗滌步驟，并且還要分開進(jìn)行用于信號(hào)生成的酶反應(yīng)。因此，對(duì)于現(xiàn)場(chǎng)測(cè)試，使用這些復(fù)雜的、多步驟的方法顯然是困難的。
本發(fā)明的目的是提供一種膜條生物傳感器技術(shù)，通過將具有相當(dāng)廉價(jià)的和高敏感度優(yōu)點(diǎn)的實(shí)驗(yàn)室版的酶聯(lián)免疫吸附檢測(cè)法的原理應(yīng)用到現(xiàn)場(chǎng)測(cè)試中，它不僅使得能夠進(jìn)行現(xiàn)場(chǎng)測(cè)試所需的快速和簡(jiǎn)單的檢測(cè)，還滿足了對(duì)標(biāo)本中的分析物的高敏感度測(cè)定的臨床需要。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明涉及一種膜條生物傳感器系統(tǒng)，包括(a)用于加樣的膜墊片(10)，(b)用于釋放檢測(cè)結(jié)合成分的膜墊片(20)，其中膜墊片(20)含有干燥狀態(tài)的用于檢測(cè)的與標(biāo)記物相連接的結(jié)合成分，(c)具有用于捕獲的固定的結(jié)合成分的信號(hào)生成膜墊片(30)，(d)用于吸收縱向流動(dòng)介質(zhì)的膜墊片(40)，(e)用于給酶供應(yīng)底物溶液的膜墊片(50)，(f)用于吸收橫向流動(dòng)介質(zhì)的膜墊片(60)以及(g)底物溶液，其中所述系統(tǒng)具有兩組交叉排列的膜墊片，(I)一組縱向排列的墊片，其中墊片(10)在長度方向上被部分地疊加于墊片(20)的末端并固定，而墊片(20)和墊片(40)在長度方向上分別被部分疊加于信號(hào)生成膜墊片(30)的兩個(gè)末端并固定；和(II)另一組橫向排列的墊片，其中墊片(50)和墊片(60)在信號(hào)生成時(shí)分別被部分疊加于信號(hào)生成膜墊片(30)的兩個(gè)側(cè)邊并固定。
上述的縱向排列的膜墊片通常是在傳統(tǒng)的免疫色譜法中所使用的膜墊片，附加的橫向排列的膜墊片是唯一不同的。這樣排列的膜墊片使得我們能在膜條生物傳感器系統(tǒng)中連續(xù)進(jìn)行利用縱向流動(dòng)的反應(yīng)例如免疫反應(yīng)和利用橫向流動(dòng)的其它反應(yīng)例如酶反應(yīng)。
在本發(fā)明的膜條生物傳感器系統(tǒng)中，橫向排列的墊片(50)和(60)或是在一開始就固定到組合有縱向排列的墊片的信號(hào)生成膜墊片(30)上或是最初保持分離狀態(tài)并在完成縱向流動(dòng)反應(yīng)(例如免疫反應(yīng))之后再固定到信號(hào)生成墊片上，它們被用于進(jìn)行橫向流動(dòng)反應(yīng)(例如酶反應(yīng))。
如上述的，對(duì)于分別制備縱向排列的墊片和橫向排列的墊片的情況，通過將縱向排列的墊片(10)、(20)、(30)和(40)固定到一單個(gè)板上以及將橫向排列的墊片(50)和(60)固定到另一個(gè)板上，然后將任何一個(gè)板移動(dòng)到另一個(gè)板上使之成為十字形，就可以進(jìn)行兩組墊片的連接。
具體地，可以以如下的形式制備本發(fā)明的膜條生物傳感器系統(tǒng)將縱向排列的墊片(10)、(20)、(30)和(40)固定在具有信號(hào)檢測(cè)窗(78)和底物溶液容器穿透針頭(75)的系統(tǒng)的容器(holder)(例如塑料容器)的底部(72)內(nèi)側(cè)，以及將橫向排列的墊片(50)和(60)固定于安置在具有加樣孔的容器的頂部?jī)?nèi)側(cè)的橫向排列的墊片固定支架(74)上，其中支架(74)與頂部外面的流動(dòng)轉(zhuǎn)換按鈕(73)和含有底物溶液并最終將底物加到底物供應(yīng)膜墊片(50)上的底物溶液容器(76)相連接(圖7)。
所述的膜墊片生物傳感器系統(tǒng)的操縱原理如下當(dāng)在完成縱向流動(dòng)反應(yīng)之后通過自動(dòng)地或手動(dòng)地操縱流動(dòng)轉(zhuǎn)換按鈕(73)將橫向排列的墊片以交叉的位置連接到縱向排列的墊片上時(shí)，用置于容器底部(72)的底物溶液容器穿透針頭(75)穿透底物溶液容器(76)，這樣就自動(dòng)進(jìn)行橫向流動(dòng)反應(yīng)。
更具體地，所述的膜條生物傳感器系統(tǒng)的操縱步驟如下首先，當(dāng)經(jīng)加樣孔(77)加入含有分析物的標(biāo)本時(shí)，在該位點(diǎn)通過經(jīng)縱向排列的墊片的毛細(xì)管孔的側(cè)向流動(dòng)用固定的捕獲抗體進(jìn)行免疫反應(yīng)，同時(shí)經(jīng)流動(dòng)轉(zhuǎn)換按鈕(73)被固定于頂部的橫向排列的墊片保持不與縱向排列的墊片接觸的狀態(tài)(圖7C)。在免疫反應(yīng)之后，當(dāng)自動(dòng)地或手動(dòng)地操縱流動(dòng)轉(zhuǎn)換按鈕(73)時(shí)，橫向排列的墊片固定部分(74)垂直下降，據(jù)此橫向排列的墊片(50)和(60)分別被固定于縱向排列的墊片中的信號(hào)生成膜墊片(30)的左側(cè)和右側(cè)，同時(shí)底物溶液容器穿透針頭(75)在底物溶液容器(76)的底物打了個(gè)孔，自動(dòng)地將酶的底物供應(yīng)給墊片(50)(圖7D)。然后底物形成橫向流動(dòng)并扮演了洗滌未反應(yīng)成分以及使得生成來自與捕獲抗體所形成免疫復(fù)合物中所含的酶的顏色信號(hào)的作用。可以通過信號(hào)檢測(cè)窗(78)用肉眼觀察和用基于比色法或其它檢測(cè)方法例如發(fā)光法和電化學(xué)法的檢測(cè)設(shè)備定量檢測(cè)酶反應(yīng)所生成的信號(hào)。
可以以用于電化學(xué)測(cè)定的模式構(gòu)建本發(fā)明的膜條生物傳感器系統(tǒng)，此外，一個(gè)電極可以被直接地安裝于信號(hào)生成膜墊片(30)上或分別制造并在信號(hào)檢測(cè)時(shí)將其與墊片結(jié)合。
在膜條生物傳感器系統(tǒng)中，為了有助于在酶反應(yīng)時(shí)自動(dòng)地將底物供應(yīng)到膜墊片(50)上，在固定于系統(tǒng)的容器頂部的預(yù)定位置上的容器中制備底物溶液。對(duì)于底物溶液的手工供應(yīng)，也可以在不同于分析系統(tǒng)的容器中制備底物溶液。
對(duì)于所述墊片的可用材料，任何人都可以使用，只要它適用于每種墊片的目的。作為一個(gè)經(jīng)典的實(shí)例，玻璃纖維膜可被用作為用于加樣的膜墊片(10)、用于綴合物釋放的膜墊片(20)(在本發(fā)明中“綴合物”被用作為同義于“標(biāo)記的結(jié)合成分”)和用于底物溶液供應(yīng)的膜墊片(50)；硝化纖維素膜可被用作為信號(hào)生成膜墊片(30)；以及纖維素膜可被用作為吸收膜墊片(40)和(60)。
如上述的，用于綴合物釋放的膜墊片(20)至少包括一種用于檢測(cè)的結(jié)合成分以及一種用于信號(hào)生成的標(biāo)記(這表示“信號(hào)生成劑”或“示蹤劑”，例如酶、熒光素和放射性同位素)。
膜墊片(20)中所含有的干燥狀態(tài)的用于檢測(cè)的與標(biāo)記物相連接的結(jié)合成分包括(i)標(biāo)記物與用于檢測(cè)的結(jié)合成分的綴合物，或(ii)用于檢測(cè)的結(jié)合成分和標(biāo)記物與第二結(jié)合成分的綴合物，所述第二結(jié)合成分特異于用于檢測(cè)的結(jié)合成分。
用于檢測(cè)的結(jié)合成分是一種與分析物例如抗體、酶、受體、DNA等特異性反應(yīng)的物質(zhì)。另外，用于捕獲的結(jié)合成分是一種與分析物和抗體、酶、受體或DNA等特異性反應(yīng)的物質(zhì)，可被列舉作為成分。因此，本發(fā)明的分析原理以及基于此的生物傳感器系統(tǒng)可以被用于構(gòu)建采用酶的信號(hào)生成的免疫傳感器、酶?jìng)鞲衅骱虳NA傳感器。
作為信號(hào)生成劑，可舉出酶，如辣根過氧化物酶、堿性磷酸酶、β-半乳糖苷酶或Arthromyces ramosus過氧化物酶、葡萄糖氧化酶、尿素酶、青霉素氧化酶、或膽固醇氧化酶；膠體金顆粒；金屬離子，例如Co2+、Cu2+、Mg2+、Fe2+、或它們的化合物。所述底物溶液包括顯色成分、光生成成分、電化學(xué)信號(hào)生成成分、或銀化合物；并進(jìn)行產(chǎn)生以顏色、顏色改變、光發(fā)射、傳導(dǎo)性改變、電流改變、或電壓改變作為信號(hào)的作用。
如下可以解釋根據(jù)選擇信號(hào)生成劑和底物溶液應(yīng)用本發(fā)明的膜條生物傳感器系統(tǒng)。
對(duì)于顏色檢測(cè)型光度測(cè)定生物傳感器，可以將辣根過氧化物酶、堿性磷酸酶、β-半乳糖苷酶或Arthromyces ramosus過氧化物酶作為信號(hào)生成劑，以及底物溶液包括一種特異于相應(yīng)的酶的顯色底物成分，并且酶-底物反應(yīng)生成了可被肉眼所檢測(cè)到的信號(hào)例如顏色或顏色變化。另外，作為一種對(duì)酶-底物反應(yīng)的替代，可以采用化學(xué)反應(yīng)，作為一個(gè)經(jīng)典的實(shí)例，通過用膠體金作為示蹤劑和銀化合物例如乙酸銀作為底物溶液，金和銀中間的催化反應(yīng)可生成如上面所提及的信號(hào)。
對(duì)于光檢測(cè)型光度測(cè)定生物傳感器，可以將辣根過氧化物酶或Arthromyces ramosus過氧化物酶作為示蹤劑，以及底物溶液包括特異于相應(yīng)的酶的光生成底物成分例如魯米諾，并且在信號(hào)生成時(shí)，酶-底物反應(yīng)生成了可被肉眼所檢測(cè)到的光信號(hào)。另外，作為一種對(duì)上述提及的酶的替代示蹤劑，可以使用金屬離子例如Co2+、Cu2+、Mg2+、Fe2+、或它們的化合物。
對(duì)于電化學(xué)的生物傳感器，可以將葡萄糖氧化酶、尿素酶、青霉素氧化酶、或膽固醇氧化酶用作為信號(hào)生成劑，以及底物溶液包括特異于酶的電化學(xué)信號(hào)生成底物成分，并且酶-底物反應(yīng)生成了作為信號(hào)的傳導(dǎo)性變化、電流變化或電壓變化。
如下可以更詳細(xì)地解釋本發(fā)明的膜條生物傳感器系統(tǒng)的免疫檢測(cè)。結(jié)合圖1中所示的實(shí)施例，基于介質(zhì)的連續(xù)交叉流動(dòng)的膜條生物傳感器系統(tǒng)是由左側(cè)的分別以橫向方向排列的功能性膜墊片和右側(cè)的四個(gè)在縱向方向彼此連接的不同的膜墊片構(gòu)成。在縱向排列中，在底部放置了用于加樣的玻璃纖維膜墊片(10)，在更上方的位置，放置了干燥狀態(tài)的含有檢測(cè)抗體(22)-酶(21)綴合物的玻璃纖維膜墊片(20)。當(dāng)以干燥狀態(tài)存在時(shí)，綴合物具有固定性，但是一旦與水性介質(zhì)接觸后，它馬上被溶解并參與液相中的抗原-抗體反應(yīng)。在更上方的位置，安置了其中捕獲抗體(31)和特異于檢測(cè)抗體的第二抗體(32)分別被固定于預(yù)定位點(diǎn)上的硝化纖維素膜墊片(30)，最終在相應(yīng)的位點(diǎn)上分別生成與分析物濃度成比例的信號(hào)以及作為對(duì)照的與分析物濃度無關(guān)的恒定信號(hào)。在頂部位置上，放置了作為吸收物的纖維素膜墊片(40)以保持經(jīng)上面所羅列的膜墊片中的微孔的毛細(xì)管作用所造成的側(cè)向流動(dòng)。每個(gè)膜墊片都是彼此部分疊加的，排列在塑料薄膜上，并用雙面帶固定以制備功能性免疫條。另外，與免疫條分開的是，制備將最終定位于硝化纖維素膜墊片(30)左側(cè)的用于給作為示蹤劑的酶供應(yīng)底物或供應(yīng)用于信號(hào)擴(kuò)增的水性介質(zhì)的玻璃纖維膜墊片(50)以及將位于其右側(cè)的用于吸收底物溶液以保持經(jīng)毛細(xì)管作用的底物溶液流動(dòng)的纖維素膜墊片(60)。這些橫向排列的墊片最初不與免疫條的主體接觸，因此免疫反應(yīng)首先通過免疫條沿縱向方向單獨(dú)進(jìn)行，以及隨后的左側(cè)和右側(cè)墊片的連接將容許在橫向方向單獨(dú)進(jìn)行酶反應(yīng)。
膜條生物傳感器系統(tǒng)的分析概念在圖2中顯示了如上所述的用膜條生物傳感器系統(tǒng)所進(jìn)行的由四個(gè)步驟所構(gòu)成的分析過程。首先，當(dāng)免疫條的底部末端被浸泡于含分析物的標(biāo)本(例如血清、血漿、全血)時(shí)，標(biāo)本通過加樣墊片被吸收到系統(tǒng)內(nèi)，并且經(jīng)毛細(xì)管作用在縱向方向沿著條轉(zhuǎn)移介質(zhì)(圖2A)。當(dāng)介質(zhì)到達(dá)蓄積有干燥狀態(tài)的抗體綴合物的玻璃膜墊片時(shí)，綴合物即刻被溶解并且經(jīng)抗原(即分析物)-抗體反應(yīng)形成了液態(tài)的第一免疫復(fù)合物。當(dāng)該免疫復(fù)合物被轉(zhuǎn)移到更上方位置上的信號(hào)生成墊片時(shí)，通過與固定的捕獲抗體的反應(yīng)將其捕獲于固體表面形成三明治型的免疫復(fù)合物，用介質(zhì)流動(dòng)分離未結(jié)合物。其次，將免疫條與橫向排列的墊片連接(圖2B)。通過利用墊片固定支架移動(dòng)縱向排列的墊片或橫向排列的墊片可以實(shí)現(xiàn)這一點(diǎn)。第三步，將酶底物溶液自動(dòng)地或手動(dòng)地加入到底物溶液供應(yīng)墊片上，并啟動(dòng)橫向流動(dòng)，該流動(dòng)容許溶液經(jīng)信號(hào)生成墊片被吸附到底物溶液吸附墊片上(圖2C)。第四步，將底物供應(yīng)給在與固定于硝化纖維素膜上的捕獲抗體所形成的三明治免疫復(fù)合物中所含的酶(示蹤劑)，因此通過催化反應(yīng)分別生成與分析物濃度成比例的信號(hào)和對(duì)照信號(hào)(圖2D)。根據(jù)所選擇的信號(hào)生成劑的類型，用合適的檢測(cè)儀(例如顏色檢測(cè)儀、光檢測(cè)儀或電化學(xué)檢測(cè)儀)定量信號(hào)以測(cè)定分析物濃度。
本發(fā)明所設(shè)計(jì)的“基于縱向-橫向交叉流動(dòng)的膜條生物傳感器系統(tǒng)”的主要目的是結(jié)合利用催化劑例如酶作為示蹤劑的信號(hào)生成技術(shù)和免疫色譜檢測(cè)法例如可以高敏感度實(shí)施的現(xiàn)場(chǎng)測(cè)試。在一個(gè)利用微孔作為固體介質(zhì)的普通的酶聯(lián)免疫吸附檢測(cè)中，在抗原-抗體反應(yīng)之后從免疫復(fù)合物中分離未反應(yīng)的成分，然后加入復(fù)合物中所含的酶標(biāo)記的底物進(jìn)行催化反應(yīng)以生成信號(hào)。但是，在傳統(tǒng)的僅依賴于縱向流動(dòng)的免疫色譜檢測(cè)系統(tǒng)中，難以實(shí)現(xiàn)這樣的免疫復(fù)合物的分離與信號(hào)生成。如果在完全分離免疫復(fù)合物之前提前存在或加入酶底物，那么就生成了與分析物濃度無關(guān)的非特異信號(hào)。因此，這兩個(gè)操作即免疫復(fù)合物的分離和信號(hào)生成應(yīng)當(dāng)是被一步一步地、完全連續(xù)地實(shí)施的。通過引入在本發(fā)明中所發(fā)展出的交叉流動(dòng)概念滿足了這樣的需要，這種使得能夠進(jìn)行緊接著的在免疫條上縱向流動(dòng)單獨(dú)所不可能完成的底物供應(yīng)是創(chuàng)造性的。在這個(gè)新的檢測(cè)形式中，檢測(cè)過程的自動(dòng)化是可能的，這樣可以去除單獨(dú)的洗滌步驟或試劑操作，并且可以在加樣后的短期內(nèi)(例如15分鐘)完成分析，還可以得到精確的檢測(cè)結(jié)果，因?yàn)樗褂昧俗鳛槊舾械男盘?hào)生成劑的酶。
在圖3中顯示了各種用于供應(yīng)酶底物溶液的流動(dòng)途徑。除了通過免疫條上的信號(hào)生成墊片的橫向流動(dòng)以外(圖3A)，通過底物溶液供應(yīng)墊片和吸收墊片的適當(dāng)排列也可以誘導(dǎo)出橫向的、對(duì)角流動(dòng)(圖3B)。另外，在進(jìn)行免疫反應(yīng)并去除了除信號(hào)生成墊片以外的免疫條的成分之后，沿長度方向排列底物溶液供應(yīng)墊片和吸收墊片，據(jù)此可以以各種縱向流動(dòng)(圖3C、D和E)供應(yīng)底物溶液。在這些不同的流動(dòng)途徑中，在設(shè)計(jì)新的分析系統(tǒng)時(shí)要考慮到多個(gè)信號(hào)生成和效率，通過橫向流動(dòng)供應(yīng)酶底物溶液是優(yōu)選的。
與其它傳統(tǒng)的系統(tǒng)相比較，本發(fā)明所發(fā)展的用于現(xiàn)場(chǎng)測(cè)試的膜條生物傳感器系統(tǒng)的優(yōu)點(diǎn)如下。首先，當(dāng)酶示蹤劑與其它的比色信號(hào)生成劑例如膠體金和乳膠顆粒比較時(shí)，酶通過催化反應(yīng)生成信號(hào)，因此提供了擴(kuò)增效應(yīng)。所以，采用新的生物傳感器對(duì)分析物的檢測(cè)與利用熒光物質(zhì)作為信號(hào)生成劑的生物傳感器是同樣高度敏感的。其次，如果采用了合適的酶-底物反應(yīng)，與熒光檢測(cè)儀比較，用于測(cè)定反應(yīng)所生成的信號(hào)的檢測(cè)儀是相當(dāng)便宜的并且可以被縮小到可攜帶的尺寸。第三，在分析中可將各種酶作為示蹤劑，因此如上面所解釋的，可以生成不同的信號(hào)例如在顏色、光度、電流、電壓和傳導(dǎo)度上的變化。這就提供了靈活性，即根據(jù)可獲得的信號(hào)檢測(cè)設(shè)備和技術(shù)可以選擇作為示蹤劑的酶。
顏色檢測(cè)型光度測(cè)定生物傳感器作為相同的分析概念的應(yīng)用，如上所解釋的膜條生物傳感器系統(tǒng)可被用于構(gòu)建顏色信號(hào)檢測(cè)型光度測(cè)定生物傳感器。和使用微孔作為用于蛋白固定的固體介質(zhì)的酶聯(lián)免疫吸附檢測(cè)(ELISA)一樣，這樣的生物傳感器可以在膜條上獨(dú)立地完成用于信號(hào)生成的酶反應(yīng)，據(jù)此提供了可以從兩種檢測(cè)系統(tǒng)中所能得到的優(yōu)點(diǎn)，即ELISA中的高敏感度和普通免疫色譜檢測(cè)中的快速應(yīng)答。在顏色檢測(cè)型傳感器中，根據(jù)反射光度可以測(cè)定出與標(biāo)本中的分析物濃度成比例的膜上所生成的可感知到的顏色信號(hào)的強(qiáng)度。因此，當(dāng)與定量所常用到的熒光檢測(cè)型系統(tǒng)比較時(shí)，保持有可與之相比的分析性能的顏色檢測(cè)型傳感器是相當(dāng)廉價(jià)的并使用小尺寸的信號(hào)檢測(cè)儀，因此可被用于現(xiàn)場(chǎng)測(cè)試。
在圖4中詳細(xì)地描述了顏色檢測(cè)型生物傳感器的分析原理。當(dāng)如上面所解釋的經(jīng)縱向流動(dòng)從免疫條的底物末端吸收含分析物的標(biāo)本(例如血液)時(shí)，分析物與檢測(cè)抗體-酶綴合物反應(yīng)，固定于信號(hào)墊片上的捕獲抗體捕獲第一免疫復(fù)合物，然后用介質(zhì)流動(dòng)分離未反應(yīng)成分(圖4A)。所捕獲的檢測(cè)抗體-酶綴合物的量與分析物濃度成正比，因此最終生成了與之成比例的信號(hào)。在相同的條的上方區(qū)域中所固定的第二抗體捕獲了縱向流動(dòng)所分離的過量的綴合物。不論分析物的濃度如何，在該位點(diǎn)上的信號(hào)保持恒定，并且它可被用作為對(duì)照信號(hào)。對(duì)于來自酶綴合物的信號(hào)生成，如上述的通過橫向流動(dòng)供應(yīng)酶底物，然后去除除了固定抗體所捕獲的免疫復(fù)合物以外的其它所有成分，同時(shí)在所捕獲的免疫復(fù)合物中所包含的酶生成了信號(hào)(圖4B)。利用分光光度計(jì)(例如，光電二極管、電荷耦合器件等)通過供給具有恒定波長的光并測(cè)定其的減少與顏色強(qiáng)度成比例的反射光測(cè)定出膜條上所生成的顏色信號(hào)的強(qiáng)度(圖4C)。
作為可用于生成顏色信號(hào)的酶，可以列舉在ELISA中廣泛使用的辣根過氧化物酶(HRP)、堿性磷酸酶、β-半乳糖苷酶和Arthromyces ramosus過氧化物酶(ARP)。作為催化反應(yīng)的結(jié)果，這些酶生成顏色信號(hào)，對(duì)于這樣的目的，可被用作為每種酶的底物是不同的。例如，對(duì)于使用HRP的情況，四甲基聯(lián)苯胺(TMB)、二氨基聯(lián)苯(DAB)和4-氯-1-奈酚(4ClN)可被用作為在存在有過氧化氫時(shí)的可溶性的顯色底物。相應(yīng)的底物要求不同的光反應(yīng)條件，因此通過考慮它的分析特征和生物傳感器的要求可以選擇出合適的底物。
作為酶的標(biāo)記方法，除了如上面所提及的用檢測(cè)抗體直接綴合酶的方法外，可以列舉使用特異于檢測(cè)抗體的第二抗體的間接方法。在該情況中，在免疫條的綴合物墊片上的不同空間分別蓄積檢測(cè)抗體和第二抗體-酶綴合物以構(gòu)建檢測(cè)系統(tǒng)。在檢測(cè)時(shí)，酶綴合物特異地與檢測(cè)抗體與分析物之間的第一免疫復(fù)合物反應(yīng)，然后被固定于信號(hào)生成墊片的指定位置上的捕獲抗體所捕獲。這個(gè)方法可以解決對(duì)于不同的分析物每次都需要進(jìn)行檢測(cè)抗體和酶之間的綴合的不便。另外，也可以通過與膠體金的綴合使用檢測(cè)抗體，因此可以在免疫條的綴合墊片上的不同位置上蓄積檢測(cè)抗體-金綴合物和第二抗體-酶綴合物。對(duì)于應(yīng)用該方法到膜條生物傳感器系統(tǒng)的情況，在檢測(cè)后從膠體金生成了與隨后在縱向流動(dòng)期間通過結(jié)合于固定抗體而被捕獲的分析物和金綴合物之間的第一免疫復(fù)合物的濃度成比例的紅色信號(hào)，因此，可以肉眼隨訪檢測(cè)的進(jìn)展。另外，對(duì)于一個(gè)或多個(gè)檢測(cè)抗體分子被結(jié)合于膠體金表面的情況，可以結(jié)合與檢測(cè)抗體分子成比例的第二抗體-酶綴合物，因此提供了信號(hào)擴(kuò)增效應(yīng)。
作為另一種用于信號(hào)生成的方法，可以采用抗生物素鏈菌素和生物素之間的結(jié)合反應(yīng)，并且抗生物素鏈菌素通常被綴合于檢測(cè)抗體以及生物素被結(jié)合于酶。因?yàn)榭股锼劓溇睾蜕锼刂g的反應(yīng)具有至今為止所有已知的生物學(xué)反應(yīng)中的最高的親和力，所以與使用第二抗體的方法比較，它提供了一個(gè)優(yōu)點(diǎn)即信號(hào)擴(kuò)增效應(yīng)。當(dāng)構(gòu)建檢測(cè)系統(tǒng)時(shí)，根據(jù)檢測(cè)系統(tǒng)的需要例如分析物的更低的檢測(cè)限度、動(dòng)態(tài)范圍、分析時(shí)間和費(fèi)用選擇上面所提及的信號(hào)生成方法。
在顏色檢測(cè)型生物傳感器的另一個(gè)形式中，對(duì)于信號(hào)生成，可以采用化學(xué)反應(yīng)例如金和銀之間的催化反應(yīng)作為對(duì)酶反應(yīng)的一種取代，并且可以列舉膠體金和乙酸銀作為常用的試劑(參考文獻(xiàn)Patel N等，1992，Ann.Clin.Biochem.Vol.29，Page 282-286，Rocks.BF等，1991，Ann.Clin.Biochem.Vol.28，Page 155-159)。在傳統(tǒng)的免疫色譜法中，通過用檢測(cè)抗體-膠體金綴合物作為信號(hào)生成劑制備免疫條，以及通過第一縱向流動(dòng)從金中生成與分析物濃度成比例的顏色信號(hào)。當(dāng)根據(jù)交叉流動(dòng)概念通過第二橫向流動(dòng)提供乙酸銀時(shí)，經(jīng)催化反應(yīng)將銀蓄積到結(jié)合于捕獲抗體位點(diǎn)的膠體金的表面上，因此顯著地?cái)U(kuò)增了顏色信號(hào)。這樣的結(jié)果是等同于使用酶作為信號(hào)生成劑的檢測(cè)系統(tǒng)的結(jié)果，通過之后供應(yīng)基于交叉流動(dòng)方法的不使用酶、生物學(xué)材料就能擴(kuò)增金顏色信號(hào)的化學(xué)物質(zhì)例如乙酸銀可以容易地構(gòu)建具有高敏感度的檢測(cè)系統(tǒng)。這樣一種方法的引入提供了顯著的優(yōu)點(diǎn)即對(duì)痕量濃度的分析物的測(cè)定成為可能，而用對(duì)金顏色的肉眼識(shí)別的方法不能達(dá)到這一點(diǎn)。和使用酶的情況一樣，用反射光測(cè)法可以測(cè)定所擴(kuò)增的顏色信號(hào)。
光檢測(cè)型光度測(cè)定生物傳感器作為在本發(fā)明中所發(fā)展的另一種膜條生物傳感器系統(tǒng)的形式，它可被用于構(gòu)建光檢測(cè)型光度測(cè)定生物傳感器。當(dāng)與上面所提及的顏色檢測(cè)型生物傳感器比較時(shí)，這樣的傳感器采用本身能生成光信號(hào)的示蹤劑。因此，這種形式的生物傳感器不需要光源，它使得檢測(cè)儀更為簡(jiǎn)單和廉價(jià)。檢測(cè)系統(tǒng)的檢測(cè)原理和變異性等同于上面所解釋的顏色檢測(cè)型生物傳感器，對(duì)合適信號(hào)生成劑的選擇仍是必要的，使得可以生成與分析物濃度成比例的光信號(hào)。如在圖5中所特別顯示的那樣，可以將一種酶Arthromyces ramosus過氧化物酶(ARP)用作為信號(hào)生成劑，這種酶與魯米諾的反應(yīng)生成了可在427nm的最大吸光率所測(cè)定的光信號(hào)(參考文獻(xiàn)Kim，Pisarev，and Egorov，1991，Anal.Biochem.Vol.199，Page 1-6)。與通常用于顏色生成的HRP比較，光信號(hào)的強(qiáng)度在敏感度上比它高約500倍。作為對(duì)酶的取代，可以使用金屬離子(Co2+、Cu2+、Mg2+、Fe2+等)，它們是廉價(jià)的并比酶生成更敏感的光信號(hào)(參考文獻(xiàn)D.Junsaek，U.Spohn，1999，Biosensors & Bioelectronics，Vol.14，Page 123-129)。
可以將使用酶或金屬離子作為示蹤劑的光信號(hào)生成方法應(yīng)用到本發(fā)明的交叉流動(dòng)系統(tǒng)中。在進(jìn)行用于抗原-抗體反應(yīng)的縱向流動(dòng)之后，接著進(jìn)行用于供應(yīng)底物溶液的橫向流動(dòng)(圖5A)。同時(shí)，沖洗除了結(jié)合到固定在膜上的抗體的免疫復(fù)合物之外的未結(jié)合成分，并且同時(shí)從包含于所捕獲的免疫復(fù)合物中的示蹤劑生成光信號(hào)。對(duì)于APR用作為示蹤劑的情況，可以采用被調(diào)整到最優(yōu)化酸度的含有魯米諾和過氧化氫的底物溶液。在噪音最小化的暗條件下，用在鄰近信號(hào)生成墊片上所帶有的檢測(cè)工具例如光電二極管測(cè)定所生成的信號(hào)(圖5B)。在用光度測(cè)定檢測(cè)儀檢測(cè)信號(hào)并將其轉(zhuǎn)化為電信號(hào)之后，根據(jù)顯示信號(hào)變化對(duì)分析物濃度的標(biāo)準(zhǔn)曲線測(cè)定出標(biāo)本中的分析物濃度。
對(duì)于構(gòu)建光檢測(cè)型生物傳感器的情況，抗體分子上的示蹤劑的標(biāo)記方法和分析成分的排列都等同于上面所詳細(xì)解釋的用于構(gòu)建顏色檢測(cè)型生物傳感器。
電化學(xué)生物傳感器作為另一種應(yīng)用，在本發(fā)明中所發(fā)展的膜條生物傳感器系統(tǒng)的概念也可被用于電化學(xué)生物傳感器的組裝。這些生物傳感器用酶作為信號(hào)生成劑，它經(jīng)對(duì)底物的酶轉(zhuǎn)化誘導(dǎo)了離子濃度、電荷密度或電化學(xué)能的變化并生成了作為信號(hào)的電化學(xué)變化(參考文獻(xiàn)M.M Castillo-Ortega等，2002，Sensors and Actuators B.Vol 85，page 19-25；Andrea Pizzariello等，2001，Talanta，Vol 54，Page 763-772)。對(duì)于這些信號(hào)的電化學(xué)檢測(cè)儀是使用相當(dāng)簡(jiǎn)單的、廉價(jià)的和小尺寸的，但是作為額外的需要，用于電化學(xué)測(cè)定的電極應(yīng)當(dāng)被直接地安裝到免疫條上或分別制備在信號(hào)檢測(cè)的同時(shí)與免疫條結(jié)合(參考文獻(xiàn)J.H.Kim，S.H.Paek，2000，Biosensors &Bioelectronics，Vol.14，Page 907-915)。檢測(cè)系統(tǒng)的分析原理等同于上面所解釋的光度測(cè)定生物傳感器，但是對(duì)于生成與分析物濃度成比例的電化學(xué)信號(hào)，需要選擇合適的信號(hào)生成劑。
根據(jù)電化學(xué)檢測(cè)的方法，可用作為示蹤劑的酶可以不同。例如，為了誘導(dǎo)作為信號(hào)的傳導(dǎo)性變化，可以使用尿素酶。這個(gè)酶通過將作為底物的尿素降解為銨離子和碳鎓離子增加了離子濃度，據(jù)此生成了作為信號(hào)的與分析物濃度成比例的傳導(dǎo)性變化(圖6)。作為另一個(gè)實(shí)例，為了生成作為信號(hào)的電流的變化，可以將氧化或還原它的底物的酶例如葡萄糖氧化酶和膽固醇氧化酶用作為示蹤劑，利用電極測(cè)定經(jīng)酶反應(yīng)的電子密度的變化作為電流變化。作為另一個(gè)實(shí)例，可以生成作為信號(hào)的電化學(xué)能變化以及它的通常應(yīng)用是用作為示蹤劑的酶(葡萄糖氧化酶、尿素酶、青霉素氧化酶調(diào)控氫離子濃度即酸度)并用pH電極測(cè)定酶反應(yīng)的結(jié)果(參考文獻(xiàn)Andrea Pizzariello等，2001，Talanta，Vol.54，page 763-772)。另一方面，對(duì)于使用尿素酶作為示蹤劑的情況，將對(duì)于在這個(gè)酶反應(yīng)中尿素的降解所生成的銨離子或碳鎓離子的選擇性膜安裝于電極表面，據(jù)此可以檢測(cè)作為電信號(hào)的化學(xué)能變化。
如圖6所描述的那樣，電化學(xué)生物傳感器的分析原理等同于上面所解釋的光度測(cè)定生物傳感器。當(dāng)將含分析物的標(biāo)本應(yīng)用到免疫條的底物末端時(shí)，分析物和從綴合物墊片中所釋放出的抗體-酶綴合物形成第一免疫復(fù)合物，然后該復(fù)合物與固定在信號(hào)生成墊片上的捕獲抗體形成三明治型免疫復(fù)合物。當(dāng)用于抗原-抗體反應(yīng)的縱向流動(dòng)停止并轉(zhuǎn)換為橫向流動(dòng)時(shí)，去除了除捕獲免疫復(fù)合物以外的其它成分，并且同時(shí)通過捕獲免疫復(fù)合物中所存在的酶和它的底物之間的反應(yīng)生成了電化學(xué)信號(hào)(圖6A)。為了檢測(cè)這些電化學(xué)信號(hào)，采用了已經(jīng)被安置于膜或分別制備的合適的電極(圖6B)使得信噪比最大化(圖6C)。另外，對(duì)于電化學(xué)分析，雖然關(guān)于電極的分析條件例如材料、形狀和尺寸影響生物傳感器的檢測(cè)性能，但是為了信噪比應(yīng)當(dāng)最優(yōu)化傳感器的物理化學(xué)因素。
根據(jù)對(duì)作為示蹤劑的酶的適當(dāng)選擇，如上所述的在本發(fā)明中所構(gòu)想的基于交叉流動(dòng)的膜條生物傳感器系統(tǒng)導(dǎo)致了各種生物傳感器的構(gòu)建。在過去，使用膜條的檢測(cè)系統(tǒng)無法提供從作為示蹤劑的酶的酶反應(yīng)生成信號(hào)所必需的成分，因此構(gòu)建有效的生物傳感器是困難的。通過使用在本發(fā)明中所發(fā)展的交叉流動(dòng)概念可以解決這個(gè)問題。也就是說，根據(jù)酶示蹤劑以及酶的底物溶液的便利的、自動(dòng)的供應(yīng)，交叉流動(dòng)方法可以構(gòu)建出各種生物傳感器。因此盡管具有高敏感度但是因?yàn)閺?fù)雜的檢測(cè)步驟和長的檢測(cè)時(shí)間而不能被普通人所常規(guī)操縱的酶聯(lián)免疫吸附檢測(cè)(ELISA)可以被在膜條上便利地完成。另外，根據(jù)本發(fā)明將各種酶用作為信號(hào)生成劑以取代以往的需要昂貴檢測(cè)儀的熒光示蹤劑是有可能的，據(jù)此可采用廉價(jià)的和小尺寸的檢測(cè)儀。


圖1顯示了本發(fā)明所構(gòu)想的膜條生物傳感器系統(tǒng)的成分和排列。
圖2顯示了膜條生物傳感器系統(tǒng)的交叉流動(dòng)色譜檢測(cè)方法、本發(fā)明的關(guān)鍵點(diǎn)和它的基于此的分析原理。在這個(gè)圖中，A描述了介質(zhì)的縱向流動(dòng)所誘導(dǎo)的標(biāo)本的吸收和抗原-抗體反應(yīng)。B描述了免疫條與縱向排列的墊片的連接；C描述了在免疫檢測(cè)中用作為標(biāo)記的酶的底物溶液的供應(yīng)；和D描述了酶所生成的信號(hào)。
圖3顯示了用于給酶供應(yīng)底物溶液的各種流動(dòng)途徑，這在基于雙流動(dòng)的色譜法的分析中是有用的。
圖4顯示了基于組合于交叉流動(dòng)色譜法的酶聯(lián)免疫吸附檢測(cè)法的本發(fā)明的顏色檢測(cè)型光度測(cè)定生物傳感器的分析原理。在此，A描述了縱向流動(dòng)的加樣和免疫復(fù)合物的形成，B是底物溶液的橫向流動(dòng)的用于信號(hào)生成的酶反應(yīng)，和C是基于反射光測(cè)法的顏色信號(hào)檢測(cè)。
圖5顯示了本發(fā)明的光檢測(cè)型光度測(cè)定生物傳感器的分析原理，它是基于與圖4中所描述的相同的概念，只是信號(hào)生成方式不同。在此，A描述了橫向流動(dòng)的用于信號(hào)生成的酶反應(yīng)，和B是發(fā)光信號(hào)檢測(cè)。
圖6描述了本發(fā)明的電化學(xué)生物傳感器的分析原理，它利用了與圖4中所描述的相同的原理，只是信號(hào)生成方式不同。在此，A描述了用于信號(hào)生成的酶反應(yīng)，B是電極附著步驟，C是電化學(xué)信號(hào)(例如傳導(dǎo)性變化)檢測(cè)。
圖7顯示了一個(gè)用于交叉流動(dòng)膜條色譜檢測(cè)的分析成分的容器，它被設(shè)計(jì)用于以自動(dòng)或手工模式進(jìn)行連續(xù)操縱，即免疫反應(yīng)和酶反應(yīng)。在此，A和B描述了容器的所有構(gòu)成，C和D描述了具有被組合的容器的頂面和底面的容器的橫截面。C部分描述了在進(jìn)行用于免疫反應(yīng)的縱向流動(dòng)期間的橫向和縱向排列的墊片的相對(duì)位置，和D描述了在進(jìn)行用于酶反應(yīng)的橫向流動(dòng)期間的兩種排列的墊片的相對(duì)位置。
圖8描述了根據(jù)本發(fā)明的顏色檢測(cè)型光度測(cè)定生物傳感器(實(shí)施例6)對(duì)分析物(B型肝炎病毒表面抗原，HBsAg)濃度的應(yīng)答。A顯示了用膠體金作為標(biāo)記的試驗(yàn)結(jié)果，B是用酶HRP作為標(biāo)記的結(jié)果，和C是吸光度的顏色信號(hào)所表達(dá)的劑量-應(yīng)答曲線。
圖9顯示了對(duì)標(biāo)準(zhǔn)濃度的分析物肌鈣蛋白I的金顏色信號(hào)和ARP光信號(hào)的比較。利用在實(shí)施例7中所制備的光檢測(cè)型膜條生物傳感器測(cè)定光信號(hào)。
圖10顯示了利用在實(shí)施例9中所制備的電導(dǎo)分析的膜條生物傳感器所測(cè)定的對(duì)標(biāo)準(zhǔn)濃度的人血清白蛋白的傳導(dǎo)性信號(hào)的變化，以證實(shí)概念在電化學(xué)生物傳感器中的應(yīng)用。
圖11顯示了直接酶標(biāo)法和間接方法所測(cè)定的對(duì)HBsAg的劑量應(yīng)答的比較。A和B分別是根據(jù)直接和間接方法從基于交叉流動(dòng)概念的膜條生物傳感器系統(tǒng)中所生成的顏色信號(hào)的結(jié)果，和C顯示了從酶聯(lián)免疫吸附法(ELISA)生成并在450nm的吸光率上所測(cè)定的顏色信號(hào)的結(jié)果。
<附圖標(biāo)記的解釋>
1分析物10用于加樣的膜墊片20用于釋放與標(biāo)記物相連接的檢測(cè)結(jié)合成分的膜墊片21信號(hào)生成劑(或示蹤劑)22檢測(cè)抗體30用于信號(hào)生成的膜墊片31捕獲抗體32特異于檢測(cè)抗體的第二抗體33光源34光度測(cè)定檢測(cè)儀35用于電化學(xué)信號(hào)檢測(cè)的電極40用于吸收縱向流動(dòng)介質(zhì)的膜墊片50用于供應(yīng)底物溶液的膜墊片60用于吸收橫向流動(dòng)介質(zhì)的膜墊片71容器的頂部72容去的底部73流動(dòng)轉(zhuǎn)換按鈕74橫向排列的墊片固定板75底物溶液容器穿透針頭76底物溶液容器77加樣孔78信號(hào)檢測(cè)窗實(shí)現(xiàn)發(fā)明的最佳模式以下實(shí)施例更具體地支持本發(fā)明的內(nèi)容并通過說明具體的應(yīng)用顯示出它的用途，但是它們從不限制本發(fā)明的范圍。
實(shí)施例中所用的材料實(shí)施例中所用的材料和它們的來源如下B型肝炎病毒表面抗原(HBsAg)、抗HBsAg的多克隆抗體(兔來源)和單克隆抗體(鼠來源)、抗人血清白蛋白的多克隆抗體(山羊來源)都購自Enzyme International(美國)。心臟肌鈣蛋白I(cTnI)和特異于它的抗體即多克隆抗體(山羊來源)和單克隆抗體(鼠來源)都購自Spectral(美國)。膠體金(直徑40nm，0.01％)、葡聚糖凝膠、酪蛋白(鈉鹽型，牛奶中提取)、牛血清白蛋白(BSA，經(jīng)熱休克法純化，V級(jí))、Tween20、Triton X-100、人血清白蛋白(HAS)是由Sigma(美國)提供。硝化纖維素膜(孔徑12mm)和玻璃纖維膜、及纖維素膜(3MM，色譜級(jí))分別購自Millipore(美國)和Whatman(美國)?？股锼劓溇?SA)、N-琥珀?；?3-[2-聯(lián)硫基吡啶]丙酸酯(N-succinimidyl-3-[2-pyridyldithio]propionate，SPDP)、琥珀酰4-[N-馬來酰亞胺甲基]環(huán)己胺-1-羧酸酯(succinimidyl4-[N-maleimidomethyl]cyclohexane-1-carboxylate，SMCC)、二硫蘇糖醇(DTT)、和N-羥基琥珀酰亞胺(NHS)-LC-LC-生物素都來自Pierce(美國)。酶即辣根過氧化物酶(HRP)、Arthromyces ramosus過氧化物酶(ARP)和尿素酶都購自Calbiochem(美國)。每種酶的底物即四甲基聯(lián)苯胺(TMB)和魯米諾、尿素分別購自Moss(美國)和Sigma(美國)。其它所用的試劑都是分析級(jí)的。
實(shí)施例1抗體-膠體金綴合物的合成根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)方案測(cè)定了各種反應(yīng)溶液的酸度和抗體濃度，然后找出在最優(yōu)化的條件下合成綴合物(參考文獻(xiàn)S.H.Paek等，1999，Anal.Lett.，Vol.32，335-360)。
簡(jiǎn)單地，將中性pH緩沖液中的透析了的特異于HBsAg的抗體溶液(100mg/ml，0.8ml)加入到金溶液(8ml)中，調(diào)整pH為9.0，并反應(yīng)30分鐘。然后，往該溶液中加入1ml 5％通過將酪蛋白溶解于10mM磷酸緩沖液(pH7.4，PB)所制成的酪蛋白溶液(酪蛋白-PB)并反應(yīng)30分鐘。在15,000rpm離心反應(yīng)溶液45分鐘后，去除上清液。往剩下的金沉淀物中加入酪蛋白-PB并調(diào)整綴合物的終體積為0.2ml，儲(chǔ)存于4℃直到使用。
實(shí)施例2抗體-酶綴合物的合成通過利用交聯(lián)劑的化學(xué)反應(yīng)進(jìn)行特異于分析物的抗體和酶之間的綴合。在抗體與20倍過量摩爾濃度的SMCC在4℃下反應(yīng)4小時(shí)之后，用Sephadex G-15凝膠色譜去除過量的SMCC，然后如下所述用活化的酶直接將抗體綴合化。對(duì)于酶的活化，將蛋白溶液在5mM含EDTA的PB中并與20倍過量摩爾濃度的SPDP在室溫下反應(yīng)1小時(shí)。為了引入分子上的巰基，將DTT(終濃度10mM)加入到反應(yīng)混和物中并在37℃再反應(yīng)2小時(shí)。在Sephadex G-15凝膠柱中去除過量的試劑。將摩爾比為1∶10的兩種活化試劑即抗體和酶混和并在4℃反應(yīng)過夜。用一填充滿SephadexG-100凝膠的柱(1×20cm)進(jìn)行這些所合成的抗體-酶綴合物的純化。將反應(yīng)混和物(1ml)注射到柱中并用PBS洗脫。用Bradford檢測(cè)法監(jiān)測(cè)每個(gè)洗脫部分中的蛋白，并在非還原條件下最后用SDS-PAGE(7％凝膠)確認(rèn)綴合物的純度。
實(shí)施例3具有固定抗體的信號(hào)生成墊片將針對(duì)遷移效率和孔徑的硝化纖維素(NC)膜的最優(yōu)化產(chǎn)品用作為信號(hào)生成墊片。將NC膜(孔徑12mm，Millipore)用于抗體的固定?？梢詫⑽锢砦胶突瘜W(xué)方法用作為固定方法，并根據(jù)試驗(yàn)的結(jié)果通過考慮方法的便利性和可重復(fù)性最終選擇出合適的方法。用物理吸附將抗體固定在NC膜條(7×25mm)的預(yù)定位置上。用微分配器將用含有140mMNaCl的PB所稀釋的1mg/ml抗體(1.5ml)點(diǎn)在膜的一個(gè)位置(距離底部10mm處)上，然后在室溫下反應(yīng)1小時(shí)。將具有固定抗體的條在溶解于100mM Tris緩沖液的0.5％酪蛋白(pH7.6，酪蛋白-Tris)中浸泡1小時(shí)以阻斷殘余的表面，隨后用含有0.1％Triton X-100的Tris緩沖液洗滌3次，并在空氣中晾干。
實(shí)施例4信號(hào)生成墊片(具有固定的抗生物素鏈菌素)將用于固定取代抗體的抗生物素鏈菌素(SA)的如在實(shí)施例3中所解釋的相同的NC膜用作為信號(hào)生成墊片。作為固定方法，因?yàn)樵陬A(yù)試驗(yàn)中SA的物理吸附顯示出低的固定產(chǎn)率，所以采用了化學(xué)方法。將NC膜(7×25mm)浸泡在0.5％戊二醛溶液中并反應(yīng)1小時(shí)，然后用PBS洗滌3次。用微分配器將10mg/ml SA(1mL)加入到距離底部末端1cm的位置上，在保持100％濕度的孵育箱中孵育并在室溫下反應(yīng)1小時(shí)。剩下的步驟與在實(shí)施例3中所示的抗體固定的步驟一致。
實(shí)施例5顏色檢測(cè)型分析系統(tǒng)的構(gòu)建5-1.免疫條的構(gòu)建用在實(shí)施例6-1中所用的檢測(cè)抗體-膠體金綴合物或與第二抗體-HRP綴合物(實(shí)施例6-2中所用的)結(jié)合的金綴合物作為信號(hào)生成劑構(gòu)建免疫色譜檢測(cè)系統(tǒng)，其中用肉眼識(shí)別或吸光度檢測(cè)測(cè)定出依賴于分析物(HBsAg)濃度的信號(hào)。免疫條(圖1)包括(從底部)用0.1％(v/v)TritonX100處理的玻璃纖維膜(7×20mm)、具有標(biāo)記綴合物的玻璃纖維膜(7×5mm)、具有固定抗體的NC膜(7×25mm)、和作為吸附墊片的纖維素膜(7×15mm)。每個(gè)連續(xù)的膜墊片都是部分疊加的并用雙面帶固定于塑料薄膜上。
5-2.橫向排列的墊片的構(gòu)建為了在抗體-HRP綴合物的應(yīng)用中的從HRP生成顏色信號(hào)，為了誘導(dǎo)交叉流動(dòng)，利用供應(yīng)含有過氧化氫和TMB的酶底物的玻璃纖維膜(10×20mm)和作為吸附墊片的纖維素膜(15×20mm)構(gòu)建橫向排列的墊片。墊片與上面所解釋的免疫條是空間分離的，以這樣的之后橫向墊片被容許分別與NC膜的兩個(gè)側(cè)邊接觸以誘導(dǎo)酶反應(yīng)的方式設(shè)計(jì)分析系統(tǒng)(圖2)。
實(shí)施例6顏色檢測(cè)型光度測(cè)定生物傳感器的劑量應(yīng)答6-1.以膠體金作為示蹤劑用掃描反射光測(cè)法測(cè)定在實(shí)施例5中所制備的分析系統(tǒng)的金顏色信號(hào)對(duì)HBsAg標(biāo)準(zhǔn)物的劑量應(yīng)答。將每個(gè)HBsAg的標(biāo)準(zhǔn)溶液(150ml)放到不同的微孔中，將免疫條以直立位放置到每個(gè)微孔中15分鐘以吸附水溶液到條中。用掃描儀(HP ScanJet 6100C，Hewlett-Packard，Palo Alto，CA，USA)掃描在固定抗體區(qū)域所顯示的信號(hào)。通過使用圖像分析程序(Multianalyst version 1.1，Bio-Rad Laboratories，Hercules，CA，USA)選擇出所捕獲圖像中的染色區(qū)域(圖8A)使得可以覆蓋所有的染色區(qū)域，然后將其轉(zhuǎn)化為與顏色強(qiáng)度成比例的吸光度(圖8C，金信號(hào))。
根據(jù)結(jié)果，所測(cè)定的吸光度和用肉眼所驗(yàn)證的顏色強(qiáng)度都與分析物濃度成比例。對(duì)于金顏色信號(hào)，檢測(cè)敏感度為約100ng/ml。
6-2.以HRP作為示蹤劑用與金顏色信號(hào)測(cè)定相同的方法測(cè)定在如實(shí)施例5-1中所構(gòu)建的檢測(cè)系統(tǒng)中的HRP信號(hào)對(duì)HBsAg的劑量應(yīng)答。分析方法基本上等同于生成金信號(hào)的方法，除了如所提及的第二抗體-HRP綴合物的額外應(yīng)用。對(duì)于HRP信號(hào)生成，橫向排列的底物供應(yīng)墊片和吸附墊片分別位于信號(hào)墊片的右側(cè)和左側(cè)，供應(yīng)HRP的底物溶液以容許進(jìn)行橫向流動(dòng)3分鐘。去除除了被NC膜上的捕獲抗體所捕獲的免疫復(fù)合物以外的剩余成分，并同時(shí)從所捕獲的免疫復(fù)合物所包含的HRP中生成藍(lán)色信號(hào)(圖8B)。
用與金信號(hào)相同的方法將顏色信號(hào)定量為吸光度(圖8C，HRP信號(hào))。
從所得到的結(jié)果發(fā)現(xiàn)，作為信號(hào)的吸光度與肉眼所驗(yàn)證的顏色強(qiáng)度成比例以及也與分析物濃度成比例。對(duì)于以酶作為示蹤劑，檢測(cè)敏感度為約1ng/ml，這比金顏色信號(hào)約強(qiáng)100倍(圖8C)。
實(shí)施例7光檢測(cè)型分析系統(tǒng)的構(gòu)建7-1.免疫條的構(gòu)建將急性心肌梗死的特異性標(biāo)記物肌鈣蛋白I用作為模型分析物。用捕獲抗體-生物素綴合物、檢測(cè)抗體-膠體金綴合物或檢測(cè)抗體-ARP綴合物和具有在實(shí)施例4中所制備的固定SA的膜條制備免疫色譜檢測(cè)系統(tǒng)。免疫條(圖1)包括(從底部)用0.1％(v/v)Triton X100處理的玻璃纖維膜(7×20mm)、具有綴合物的玻璃纖維膜(7×5mm)、具有固定SA的NC膜(7×25mm)、和作為吸附墊片的纖維素膜(7×15mm)。每個(gè)連續(xù)的膜墊片都是部分疊加的并用雙面帶固定于塑料薄膜上。
7-2.橫向排列的墊片的構(gòu)建為了從條中所有的ARP中生成光信號(hào)，利用供應(yīng)含有魯米諾和過氧化氫的酶底物的玻璃纖維膜(10×20mm)和作為吸附墊片的纖維素膜(15×20mm)構(gòu)建橫向排列的墊片。在實(shí)施例5-2中已經(jīng)提及橫向排列的墊片的作用，并且也顯示于圖2中。
實(shí)施例8光檢測(cè)型生物傳感器的劑量應(yīng)答8-1.以膠體金作為示蹤劑用掃描反射光測(cè)法測(cè)定在實(shí)施例7中所制備的分析系統(tǒng)的金顏色信號(hào)對(duì)cTnI標(biāo)準(zhǔn)物的劑量應(yīng)答。將每個(gè)cTnI的標(biāo)準(zhǔn)溶液(150ml)放到不同的微孔中，將免疫條以直立位放置到每個(gè)微孔中。下面的分析方法與在實(shí)施例6-1對(duì)HBsAg的方法相同，如所說明的將所生成的顏色信號(hào)轉(zhuǎn)化為吸光度(圖9，金顏色信號(hào))。
根據(jù)結(jié)果觀察到吸光度與用肉眼所驗(yàn)證的顏色強(qiáng)度成比例，也與分析物濃度成比例。對(duì)于金顏色信號(hào)，檢測(cè)敏感度為約1ng/ml。
8-2.以ARP作為示蹤劑從與在實(shí)施例8-1中所描述的金顏色檢測(cè)型免疫條相同構(gòu)建的檢測(cè)系統(tǒng)中測(cè)定出ARP光信號(hào)對(duì)cTnI的劑量應(yīng)答，除了用檢測(cè)抗體-ARP取代檢測(cè)抗體-膠體金綴合物，以及也將交叉流動(dòng)用作為用于本發(fā)明的從酶中生成信號(hào)的關(guān)鍵方法。在縱向流動(dòng)模式中的用于免疫反應(yīng)的方法是等同于用膠體金作為示蹤劑的實(shí)施例8-1中的方法。在完成縱向流動(dòng)后，底物供應(yīng)墊片和橫向排列的吸附墊片分別位于信號(hào)墊片的右側(cè)和左側(cè)，供應(yīng)ARP的底物溶液(0.2M碳酸緩沖液，pH9.0，含有過氧化氫和魯米諾)以容許進(jìn)行橫向流動(dòng)3分鐘。去除除了膜上所捕獲的免疫復(fù)合物以外的剩余成分并同時(shí)從所捕獲的免疫復(fù)合物中所含有的ARP中生成藍(lán)色光信號(hào)。用安裝于個(gè)人計(jì)算機(jī)中的光電二極管(Hamamatsu，日本)和模擬數(shù)字轉(zhuǎn)換設(shè)備(ADCM板，韓國制造)定量光信號(hào)。
根據(jù)結(jié)果觀察到從光信號(hào)所轉(zhuǎn)化的點(diǎn)信號(hào)(電壓)與分析物濃度成比例(圖9，ARP光信號(hào))。檢測(cè)敏感度為約0.1ng/ml，這比用膠體金作為示蹤劑的敏感度高出約10倍。
實(shí)施例9電化學(xué)檢測(cè)型分析系統(tǒng)的構(gòu)建根據(jù)與實(shí)施例5和7中所顯示的方法基本相同的方法構(gòu)建生成針對(duì)分析物濃度的電化學(xué)信號(hào)的免疫色譜檢測(cè)系統(tǒng)。但是電化學(xué)檢測(cè)系統(tǒng)還需要如圖6所示的電極以指示電化學(xué)測(cè)定，下面解釋了傳導(dǎo)性檢測(cè)系統(tǒng)。
9-1.免疫條的構(gòu)建采用用作為糖尿病并發(fā)癥所引起的腎病的早期診斷的標(biāo)記物的人血清白蛋白(HAS)為模型分析物。用檢測(cè)抗體-尿素酶綴合物和具有固定捕獲抗體的NC膜條構(gòu)建免疫色譜檢測(cè)系統(tǒng)。用與實(shí)施例5-1中所描述的相同的方式構(gòu)建免疫條系統(tǒng)(圖1)。
9-2.橫向排列的墊片的構(gòu)建為了從條中所有的尿素酶中生成傳導(dǎo)性信號(hào)，利用供應(yīng)含有尿素的酶底物溶液的玻璃纖維膜(10×20mm)和作為吸附墊片的纖維素膜(15×20mm)構(gòu)建橫向排列的墊片。
實(shí)施例10電化學(xué)檢測(cè)型生物傳感器的劑量應(yīng)答用電化學(xué)檢測(cè)設(shè)備(傳導(dǎo)性計(jì))得到在實(shí)施例9中所制備的檢測(cè)系統(tǒng)的HAS的劑量應(yīng)答。采用與實(shí)施例6-2中所描述的相同的分析方法。在應(yīng)用橫向流動(dòng)3分鐘后，去除除了膜上所捕獲的免疫復(fù)合物以外的剩余成分，并同時(shí)在免疫復(fù)合物中所含有的尿素酶將尿素降解為銨離子和碳鎓離子。因此，與分析物濃度成比例的傳導(dǎo)性的變化作為信號(hào)(圖10)。然后用數(shù)字萬用表(HITASI，日本)測(cè)定在具有固定捕獲抗體的區(qū)域上所生成的電流所表達(dá)的傳導(dǎo)性信號(hào)。
根據(jù)結(jié)果證實(shí)傳導(dǎo)性依賴性電流與分析物濃度成比例，以及檢測(cè)敏感度符合約1ng/ml。
實(shí)施例11酶標(biāo)記方法在酶聯(lián)免疫吸附檢測(cè)法(ELISA)中有兩種標(biāo)記方法，即直接法，其中通過將酶直接連接到與分析物特異反應(yīng)的檢測(cè)抗體上生成信號(hào)，和間接法，其中完全用檢測(cè)抗體結(jié)合分析物以及將酶連接到特異性識(shí)別檢測(cè)抗體的第二抗體上用于信號(hào)生成。
通過使用采用了將如ELISA中的基于酶的信號(hào)擴(kuò)增技術(shù)引入到膜條分析系統(tǒng)中的交叉流動(dòng)系統(tǒng)，比較了兩種標(biāo)記方法。通過將HRP直接連接到檢測(cè)抗體上應(yīng)用直接標(biāo)記法，檢測(cè)抗體為從鼠中生成的特異于HBsAg(分析物)的單克隆抗體，以及通過將HRP連接到第二抗體上測(cè)定間接標(biāo)記法，第二抗體為從山羊中生成的識(shí)別特異于分析物的檢測(cè)抗體的多克隆抗體?；旧希苯臃赡芤竺笜?biāo)記應(yīng)當(dāng)倍連接到不同的分析物的每種檢測(cè)抗體上。另一方面，間接法在便利性和信號(hào)擴(kuò)增上是有優(yōu)勢(shì)的，即甚至可以使用不同分析物的酶綴合物，因?yàn)槭褂酶郊涌贵w可以實(shí)現(xiàn)信號(hào)擴(kuò)增。在這個(gè)實(shí)施例中，用兩種方法比較了它們的分析性能。
與實(shí)施例6-2中的方法一樣進(jìn)行采用間接標(biāo)記法的分析，如實(shí)施例6-1所描述的那樣實(shí)行利用直接法的檢測(cè)除了用HRp取代金連接到特異于HBsAg的檢測(cè)抗體上。如上面所解釋的，用掃描光度測(cè)定法測(cè)定膜條檢測(cè)系統(tǒng)所生成的顏色信號(hào)對(duì)HBsAg的劑量應(yīng)答(圖11A和B)。
分別從直接和間接法的結(jié)果中證實(shí)間接法的檢測(cè)敏感度比直接法高出約10倍。從ELISA中也得到了相同的比較結(jié)果(圖11C)。但是，根據(jù)分析的目的和要求，優(yōu)選的方法可以是不同的。
工業(yè)實(shí)用性本發(fā)明提供了一種膜條生物傳感器技術(shù)，它不僅能進(jìn)行現(xiàn)場(chǎng)測(cè)試所需的快速和簡(jiǎn)單的檢測(cè)，還滿足了對(duì)標(biāo)本中的分析物的高度敏感的檢測(cè)的臨床需要。通過將實(shí)驗(yàn)室版酶聯(lián)免疫吸附檢測(cè)法的原理應(yīng)用到現(xiàn)場(chǎng)測(cè)試的設(shè)備上實(shí)現(xiàn)了這一點(diǎn)，它具有廉價(jià)和對(duì)分析物的敏感定量的優(yōu)點(diǎn)。
權(quán)利要求
1.一種膜條生物傳感器系統(tǒng)，其包括(a)用于加樣的膜墊片(10)，(b)用于釋放檢測(cè)結(jié)合成分的膜墊片(20)，其中所述膜墊片(20)含有干燥狀態(tài)的用于檢測(cè)的與標(biāo)記物相連接的結(jié)合成分，(c)具有用于捕獲的固定的結(jié)合成分的信號(hào)生成膜墊片(30)，(d)用于吸收縱向流動(dòng)介質(zhì)的膜墊片(40)，(e)用于給酶供應(yīng)底物溶液的膜墊片(50)，(f)用于吸收橫向流動(dòng)介質(zhì)的膜墊片(60)以及(g)底物溶液，其中所述系統(tǒng)具有兩組交叉排列的膜墊片，(I)一組縱向排列的墊片，其中墊片(10)在長度方向上被部分地疊加于墊片(20)的末端并固定，且墊片(20)和墊片(40)在長度方向上分別被部分疊加于信號(hào)生成膜墊片(30)的兩個(gè)末端并固定；和(II)另一組橫向排列的墊片，其中墊片(50)和墊片(60)在信號(hào)生成時(shí)分別被部分疊加于信號(hào)生成膜墊片(30)的兩個(gè)側(cè)邊并固定。
2.權(quán)利要求1的膜條生物傳感器系統(tǒng)，其中橫向排列的墊片(50)和(60)(i)固定在屬于縱向排列的墊片的信號(hào)生成膜墊片(30)的兩個(gè)側(cè)邊；或是(ii)最初保持分離狀態(tài)，然后在完成縱向流動(dòng)反應(yīng)之后固定到信號(hào)生成墊片上。
3.權(quán)利要求1的膜條生物傳感器系統(tǒng)，其中與橫向排列的墊片分開制備縱向排列的墊片，并通過將任何一個(gè)板移到另一個(gè)板上而將固定在分開的板上的兩組墊片以交叉的位置相結(jié)合成十字形。
4.權(quán)利要求1的膜條生物傳感器系統(tǒng)，其中為進(jìn)行電化學(xué)測(cè)定，將一電極直接安放在信號(hào)生成膜(30)上或是分開制造并在進(jìn)行信號(hào)檢測(cè)時(shí)與墊片結(jié)合。
5.權(quán)利要求1的膜條生物傳感器系統(tǒng)，其中或是在用于促進(jìn)酶反應(yīng)時(shí)的底物溶液供應(yīng)的膜墊片(50)上方的預(yù)定位置上所放置的容器中制備底物溶液或是在與分析系統(tǒng)分開的容器中制備底物溶液。
6.權(quán)利要求1的膜條生物傳感器系統(tǒng)，其中用于加樣的膜墊片(10)、用于釋放檢測(cè)結(jié)合成分的膜墊片(20)、和用于供應(yīng)底物溶液的膜墊片(50)是玻璃纖維膜，信號(hào)生成膜墊片(30)是硝化纖維素膜，而用于吸附的膜墊片(40)和(60)是纖維素膜。
7.權(quán)利要求1的膜條生物傳感器系統(tǒng)，其中用于檢測(cè)的與標(biāo)記物相連接的結(jié)合成分包括i)示蹤劑與用于檢測(cè)的結(jié)合成分的綴合物，或ii)用于檢測(cè)的結(jié)合成分和示蹤劑與第二結(jié)合成分的綴合物，所述第二結(jié)合成分特異于用于檢測(cè)的結(jié)合成分。
8.權(quán)利要求7的膜條生物傳感器系統(tǒng)，其中用于檢測(cè)的結(jié)合成分是與分析物特異性反應(yīng)的抗體、酶、受體或DNA。
9.權(quán)利要求7的膜條生物傳感器系統(tǒng)，其中示蹤劑是辣根過氧化物酶、堿性磷酸酶、β-半乳糖苷酶、或Arthromyces ramosus過氧化物酶，且底物溶液包括特異于酶的顯色底物成分，以及在信號(hào)生成時(shí)，將酶-底物反應(yīng)的信號(hào)顯示為肉眼可檢測(cè)到的顏色變化。
10.權(quán)利要求7的膜條生物傳感器系統(tǒng)，其中示蹤劑是膠體金，且底物溶液包括銀化合物，以及在信號(hào)生成時(shí)，將化學(xué)催化反應(yīng)的信號(hào)顯示為肉眼可檢測(cè)到的顏色變化。
11.權(quán)利要求7的膜條生物傳感器系統(tǒng)，其中示蹤劑是辣根過氧化物酶或Arthromyces ramosus過氧化物酶，且底物溶液包括魯米諾或其它特異于酶的發(fā)光底物成分，以及在信號(hào)生成時(shí)，測(cè)定光信號(hào)作為酶-底物反應(yīng)的信號(hào)。
12.權(quán)利要求7的膜條生物傳感器系統(tǒng)，其中示蹤劑是Co2+、Cu2+、Mg2+、Fe2+、或其化合物，且底物溶液包括魯米諾或其它發(fā)光底物成分，以及在信號(hào)生成時(shí)，測(cè)定光信號(hào)作為化學(xué)催化反應(yīng)的信號(hào)。
13.權(quán)利要求7的膜條生物傳感器系統(tǒng)，其中示蹤劑是葡萄糖氧化酶、尿素酶、青霉素氧化酶、或膽固醇氧化酶，且底物溶液包括特異于酶的電化學(xué)信號(hào)生成成分，以及在信號(hào)生成時(shí)，測(cè)定傳導(dǎo)性變化、電流變化或電壓變化作為酶-底物反應(yīng)的信號(hào)。
14.權(quán)利要求1的膜條生物傳感器系統(tǒng)，其中用于捕獲的結(jié)合成分是與分析物特異性反應(yīng)或與結(jié)合成分和分析物之間所形成的復(fù)合物中的另一部分特異性反應(yīng)的抗體、酶、受體或DNA。
15.權(quán)利要求1的膜條生物傳感器系統(tǒng)，其中系統(tǒng)按照如下排列而構(gòu)建縱向排列的墊片(10)、(20)、(30)和(40)被固定在系統(tǒng)的容器的底部(72)內(nèi)側(cè)，所述系統(tǒng)的容器具有信號(hào)檢測(cè)窗(78)和底物溶液容器穿透針頭(75)，橫向排列的墊片(50)和(60)被固定于橫向排列的墊片固定支架(74)上，所述支架(74)位于具有加樣孔的容器的頂部(71)內(nèi)側(cè)，其中支架(74)與位于頂部(71)外側(cè)的流動(dòng)轉(zhuǎn)換按鈕(73)相連接，且含有底物溶液的底物溶液容器(76)被置于膜墊片(50)上以供應(yīng)底物溶液。
16.權(quán)利要求15的膜條生物傳感器系統(tǒng)，其中當(dāng)在完成縱向流動(dòng)反應(yīng)之后通過自動(dòng)地或手動(dòng)地操縱流動(dòng)轉(zhuǎn)換按鈕(73)將橫向排列的墊片以交叉的位置固定于縱向排列的墊片上時(shí)，立即用安置于容器的底部(72)的底物溶液容器穿透針頭(75)穿透底物溶液容器(76)，由此自動(dòng)進(jìn)行橫向流動(dòng)反應(yīng)。
全文摘要
本發(fā)明涉及一種用于現(xiàn)場(chǎng)測(cè)試(POCT)的生物傳感器，通過將一種用于免疫反應(yīng)和酶反應(yīng)的連續(xù)交叉流動(dòng)步驟引入到膜條色譜檢測(cè)系統(tǒng)中顯著地提高了檢測(cè)敏感度。本發(fā)明涉及一種膜條生物傳感器系統(tǒng)，它包括(a)用于加樣的膜墊片(10)，(b)用于釋放檢測(cè)結(jié)合成分的膜墊片(20)，其中膜墊片(20)含有干燥狀態(tài)的用于檢測(cè)的與標(biāo)記物相連接的結(jié)合成分，(c)具有用于捕獲的固定的結(jié)合成分的信號(hào)生成膜墊片(30)，(d)用于吸收縱向流動(dòng)介質(zhì)的膜墊片(40)，(e)用于給酶供應(yīng)底物溶液的膜墊片(50)，(f)用于吸收橫向流動(dòng)介質(zhì)的膜墊片(60)以及(g)底物溶液。
文檔編號(hào)G01N33/53GK1781022SQ200480011159
公開日2006年5月31日 申請(qǐng)日期2004年4月21日 優(yōu)先權(quán)日2003年4月25日
發(fā)明者白世煥, 趙貞煥, 金奭廈 申請(qǐng)人:拜奧迪吉特實(shí)驗(yàn)室技術(shù)公司