專利名稱：鑒定和設(shè)計(jì)細(xì)胞表面受體抑制劑的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及鑒定和設(shè)計(jì)細(xì)胞表面受體抑制劑的方法，特別是整聯(lián)蛋白抑制劑。
關(guān)于政府資助研究的申明本研究得到國家衛(wèi)生部(NIDDK和NHLBI)授予的基金號DK48549和HL70219的資助。
背景技術(shù)：
整聯(lián)蛋白是在形態(tài)形成、組織重建和修復(fù)過程中，介導(dǎo)重要的雙向信號的粘附受體(在參考文獻(xiàn)2中綜述)。整聯(lián)蛋白是由α亞基和β亞基通過非共價(jià)結(jié)合形成的異二聚體，α亞基和β亞基都是具有大細(xì)胞外片段的I型膜蛋白。在哺乳動物中，18種α亞基和8種β亞基組裝成24種不同的受體。整聯(lián)蛋白借助于二價(jià)陽離子結(jié)合到其細(xì)胞外的配體上。雖然這些配體在結(jié)構(gòu)上是不同的，但是在整聯(lián)蛋白識別過程中，它們都能夠利用酸性殘基。然后可以通過額外地與整聯(lián)蛋白接觸，確定對特定配體的特異性。整聯(lián)蛋白對配體的高親合性結(jié)合通常不是組成型的，但是在對細(xì)胞“活化”信號(所謂的由“內(nèi)-外”地發(fā)送信號)反應(yīng)時(shí)被激發(fā)，使整聯(lián)蛋白配體有反應(yīng)能力(making the integrin ligand-competent)，這些活化信號改變細(xì)胞外區(qū)域的三級和四級結(jié)構(gòu)。接著，配體結(jié)合在整聯(lián)蛋白中引起結(jié)構(gòu)重排，導(dǎo)致由“外-內(nèi)”地發(fā)送信號(在參考文獻(xiàn)4中綜述)。
根據(jù)是否存在約180個氨基酸的A型結(jié)構(gòu)域(αA或者I結(jié)構(gòu)域；參見參考文獻(xiàn)18)，可以將整聯(lián)蛋白分成兩類。在含有9個βA的整聯(lián)蛋白(βA-整聯(lián)蛋白)中，βA是主要的配體結(jié)合位點(diǎn)。因此，分離的βA以二價(jià)陽離子依賴的方式直接結(jié)合生理性配體，具有與各個配體-感受態(tài)的異二聚體(ligand-component heterodimer)相同的親合性。18處于“配體化的(liganded)”(高親合性)和“未配體化的(unliganded)”(低親合性)構(gòu)象中的分離αA結(jié)構(gòu)域的結(jié)構(gòu)已經(jīng)顯示該結(jié)構(gòu)域是如何與配體相互作用。19，30通過保守的5個氨基酸基序，即金屬離子依賴的附著位點(diǎn)(MIDAS)，金屬離子被配位在βA的配體結(jié)合界面上，金屬配位是通過配體上的谷氨酸鹽來實(shí)現(xiàn)的，在缺乏谷氨酸鹽時(shí)，通過水分子來實(shí)現(xiàn)。19，20，29本發(fā)明人認(rèn)為，在缺乏βA的整聯(lián)蛋白中，配體識別是通過存在于所有整聯(lián)蛋白β亞基中的αA樣結(jié)構(gòu)域(αA)來維持的。19α亞基也被認(rèn)為參與配體識別；最近，本發(fā)明人確定了原型配體(prototypical ligand)RGD的結(jié)合位點(diǎn)。23發(fā)明概述本發(fā)明特征在于用于鑒定結(jié)合和調(diào)節(jié)整聯(lián)蛋白的化合物的方法。通過本發(fā)明鑒定的化合物能夠以在此稱作為“死拴抑制”(deadbolt inhibition)的方式抑制整聯(lián)蛋白。參與死栓抑制的區(qū)域包括βA結(jié)構(gòu)域鏈-F/α7環(huán)，其與未配體化的整聯(lián)蛋白(unliganded integrin)(例如，αVβ3)的β尾部結(jié)構(gòu)域(βTD)的CD環(huán)接觸。βA結(jié)構(gòu)域和βTD之間的接觸區(qū)域作為可調(diào)節(jié)的死栓，通過防止與α1螺旋的活化起始向內(nèi)移動相關(guān)的鏈-F/α7環(huán)的移動，將βA結(jié)構(gòu)域鎖定在失活狀態(tài)。通過βTD和雜合結(jié)構(gòu)域之間的同一側(cè)面上的其它接觸，以及通過ADMIDAS陽離子的離子鍵，將死栓接觸穩(wěn)定在適當(dāng)位置上，將鏈-F/α7環(huán)連接到βA的α1螺旋上。本發(fā)明的方法所鑒定的化合物(例如，該環(huán)的模擬物、ADMIDAS陽離子模擬物或者βTD/βA接觸模擬物)起穩(wěn)定CD環(huán)的作用，將整聯(lián)蛋白鎖定在被滅活的狀態(tài)。
本發(fā)明的特征在于評價(jià)一種化合物的潛力的方法，該化合物與包含整聯(lián)蛋白βA結(jié)構(gòu)域的非配體結(jié)合位點(diǎn)的分子或分子復(fù)合物結(jié)合，該方法包括(a)采用計(jì)算方法進(jìn)行化合物與未配體化的整聯(lián)蛋白(例如，αVβ3)的鏈β-F/α7環(huán)的尾部結(jié)構(gòu)域(βTD)的接觸區(qū)之間的擬合操作(fitting operation)；和(b)分析擬合操作的結(jié)果，量化所述的結(jié)合潛力。在一些實(shí)施方案，化合物模擬肽與整聯(lián)蛋白的βA結(jié)構(gòu)域的鏈-F/α7環(huán)的相互作用，該肽包含氨基酸序列C663VVRFQYYE671D672S673S674G675KSILYVVEEPEC687或其片段，或者K618KFDREPYMTENTCNR633YCRD或其片段。
在另一個方面，本發(fā)明的特征在于用于鑒定整聯(lián)蛋白的活性的候選的選擇性調(diào)節(jié)物(selective modulator)的方法，該方法包括(a)用整聯(lián)蛋白的βA結(jié)構(gòu)域的原子結(jié)構(gòu)模型對檢測化合物建模，該化合物從空間上并且優(yōu)先擬合到感興趣的整聯(lián)蛋白的βA結(jié)構(gòu)域的非配體結(jié)合位點(diǎn)上，其中分子結(jié)構(gòu)模型是用包含C663VVRFQYYE671D672S673S674G675KSILYVVEEPEC687或其片段，或者K618KFDREPYMTENTCNR633YCRD或其片段的氨基酸序列來生成；(b)在整聯(lián)蛋白活化的生物分析中篩選測試化合物，特征在于將測試化合物結(jié)合到整聯(lián)蛋白的βA結(jié)構(gòu)域的非配體結(jié)合位點(diǎn)上；和(c)鑒定選擇性地調(diào)節(jié)整聯(lián)蛋白的活性的測試化合物，和可選擇地，(d)在生物分析中，篩選所鑒定的測試化合物通過所鑒定的測試化合物結(jié)合到整聯(lián)蛋白的βA結(jié)構(gòu)域的非配體結(jié)合位點(diǎn)上阻止βA結(jié)構(gòu)域與βTD結(jié)構(gòu)域的相互作用的能力，和(e)從測試化合物的組中，鑒定所篩選的測試化合物為能夠可選擇地調(diào)節(jié)整聯(lián)蛋白活性的化合物。在各種實(shí)施方案中調(diào)節(jié)包括抑制整聯(lián)蛋白的活性，調(diào)節(jié)包括抑制配體結(jié)合到整聯(lián)蛋白上。
在另一個方面，本發(fā)明的特征在于鑒定整聯(lián)蛋白活性的候選抑制劑的方法，該方法包括(a)將定義整聯(lián)蛋白的βA結(jié)構(gòu)域的非配體結(jié)合位點(diǎn)的信息輸入到合適的計(jì)算機(jī)程序中，該信息包括由表1和表2中基于坐標(biāo)系的原子(coordinate atoms)定義的構(gòu)象，其中該程序展示該構(gòu)象的三維結(jié)構(gòu)；(b)在計(jì)算機(jī)程序中建立測試化合物的三維結(jié)構(gòu)；(c)將測試化合物的模型疊加到整聯(lián)蛋白的βA結(jié)構(gòu)域的非配體結(jié)合位點(diǎn)的模型上；和(c)評價(jià)測試化合物的模型是否在空間上與非配體結(jié)合位點(diǎn)吻合。在一個實(shí)施方案中，這些原子包括表3和表4中的那些原子。
在另一個實(shí)施方案中，本發(fā)明的特征在于鑒定候選的整聯(lián)蛋白調(diào)節(jié)化合物的方法，該方法包括(a)生成非配體結(jié)合的整聯(lián)蛋白的βA結(jié)構(gòu)域的鏈-F/α7環(huán)的βTD接觸區(qū)的三維結(jié)構(gòu)；(b)將三維結(jié)構(gòu)應(yīng)用于設(shè)計(jì)或者選擇候選的整聯(lián)蛋白調(diào)節(jié)化合物，和(c)通過從步驟(a)和(b)中獲得的數(shù)據(jù)，鑒定所述候選的整聯(lián)蛋白調(diào)節(jié)化合物。在一個實(shí)施方案中，該方法還包括(d)合成整聯(lián)蛋白調(diào)節(jié)化合物；和(e)通過將調(diào)節(jié)化合物與整聯(lián)蛋白接觸，確定整聯(lián)蛋白抑制劑結(jié)合整聯(lián)蛋白的能力。
在另一個實(shí)施方案中，本發(fā)明的特征在于鑒定候選的整聯(lián)蛋白調(diào)節(jié)化合物的方法，該方法包括(a)表達(dá)含有βA結(jié)構(gòu)域和βTD結(jié)構(gòu)域的重組整聯(lián)蛋白片段和(b)在篩選分析中，利用這兩個結(jié)構(gòu)域的蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì)相互作用來鑒定βA結(jié)構(gòu)域和βTD結(jié)構(gòu)域相互作用的調(diào)節(jié)物。該方法還可以包括(c)合成整聯(lián)蛋白調(diào)節(jié)化合物；(d)通過測量調(diào)節(jié)化合物與整聯(lián)蛋白的相互作用，確定整聯(lián)蛋白調(diào)節(jié)物結(jié)合整聯(lián)蛋白的能力；和(e)將調(diào)節(jié)化合物作為藥物設(shè)計(jì)的基礎(chǔ)。
本發(fā)明的特征還在于一種抑制整聯(lián)蛋白活化的方法，該方法包括將化合物與整聯(lián)蛋白接觸，從而將整聯(lián)蛋白的βA結(jié)構(gòu)域結(jié)構(gòu)鎖定為不可活化的形式。在各種實(shí)施方案中，在與整聯(lián)蛋白相互作用中，該化合物模擬一種鏈內(nèi)配體，該鏈內(nèi)配體包含SEQ ID No1或其片段，或者SEQ ID No.2或其片段的序列；并且鏈內(nèi)配體是抑制素家族的成員。
在另一個方面，本發(fā)明的特征在于鑒定整聯(lián)蛋白調(diào)節(jié)物的方法，包括(a)用表1和表2的三維結(jié)構(gòu)坐標(biāo)進(jìn)行合理的藥物設(shè)計(jì)，篩選可能的抑制劑，其中篩選是結(jié)合計(jì)算機(jī)建模來進(jìn)行的；(b)將可能的抑制劑與整聯(lián)蛋白結(jié)構(gòu)域接觸；和(c)檢測可能的抑制劑抑制整聯(lián)蛋白的能力。在各種實(shí)施方案中，在步驟(c)中，采用配體結(jié)合分析來檢測可能的抑制劑抑制整聯(lián)蛋白的能力；在步驟(c)中，采用細(xì)胞分析來檢測可能的抑制劑抑制整聯(lián)蛋白的能力；而且該方法還包括(d)培育輔助晶體(supplemental crystal)，該輔助晶體包含由整聯(lián)蛋白結(jié)構(gòu)域與來自步驟(a)的第一種可能的抑制劑之間形成的復(fù)合物，以超過4.0A的分辨率，有效地X射線衍射復(fù)合物的原子坐標(biāo)；(e)確定輔助晶體的三維結(jié)構(gòu)；(f)用確定的輔助晶體的三維結(jié)構(gòu)進(jìn)行合理藥物設(shè)計(jì)，選擇第二種可能的抑制劑，其中篩選是結(jié)合計(jì)算機(jī)建模來進(jìn)行的；(g)將第二種可能的抑制劑與整聯(lián)蛋白的結(jié)構(gòu)域接觸；和(h)檢測第二種可能的抑制劑抑制整聯(lián)蛋白的能力。
在本發(fā)明中還有通過本發(fā)明的方法鑒定的化合物，只要該化合物不是洛伐他汀(lovastatin)，和包含這種化合物和藥學(xué)上可接受的載體的藥物組合物。
本發(fā)明的特征還在于調(diào)節(jié)、抑制或者刺激配體或者相關(guān)蛋白質(zhì)結(jié)合到整聯(lián)蛋白上的方法，通過改變整聯(lián)蛋白βA結(jié)構(gòu)域結(jié)構(gòu)(βA)與β尾部結(jié)構(gòu)域(βTD)的相互作用。在一些實(shí)施方案中，整聯(lián)蛋白選自如下αVβ1，αVβ3，αVβ5，αVβ6，αVβ8，α3β1，α4β1，α5β1，α6β1，α6β4，α7β1，α9β1，α4β7，gp3b3a，α1β1，α2β1，α10β1，α11β1，LFA-1，MAC-1，或者α150β95；用計(jì)算機(jī)技術(shù)或者生物化學(xué)方法或者生物物理學(xué)方法，研究βA與βTD的相互作用；βA、βTD或者兩者作為計(jì)算機(jī)方法或者生物化學(xué)方法或者生物物理學(xué)方法的結(jié)構(gòu)基礎(chǔ)。
本發(fā)明的特征還在于發(fā)現(xiàn)藥學(xué)上的相關(guān)物質(zhì)的方法，這些物質(zhì)包括抗體、小分子、多肽、肽和肽模擬物，它們能夠擾亂或者刺激整聯(lián)蛋白的βA結(jié)構(gòu)域結(jié)構(gòu)(βA)與β尾部結(jié)構(gòu)域(βTD)的相互作用。在一些實(shí)施方案中，藥學(xué)上相關(guān)的物質(zhì)調(diào)節(jié)(例如，抑制)天然的整聯(lián)蛋白與其配體或者輔助因子的相互作用。
定義如在此所用，“整聯(lián)蛋白”和“整聯(lián)蛋白受體”可以互換使用?！罢?lián)蛋白”和“整聯(lián)蛋白受體”是指許多細(xì)胞表面受體蛋白的任何一種，也被稱作為粘附受體，其結(jié)合到細(xì)胞外基質(zhì)配體或者其它細(xì)胞粘附蛋白配體上，從而介導(dǎo)細(xì)胞-細(xì)胞以及細(xì)胞-基質(zhì)的粘附過程。整聯(lián)蛋白由屬于基因超家族的基因編碼，通常由含有α亞基和β亞基的異二聚跨膜糖蛋白組成。整聯(lián)蛋白亞家族含有與不同α亞基結(jié)合的β亞基，形成具有不同特異性的粘附蛋白受體。整聯(lián)蛋白分成兩類，含有αA結(jié)構(gòu)域的和不含αA結(jié)構(gòu)域的。這兩類都含有βA結(jié)構(gòu)域。
“ 化合物”是指一種化學(xué)實(shí)體，包括肽或多肽，包括抗體、噬菌體展示抗體及其生物學(xué)活性片段，小分子(例如，化學(xué)合成的或者天然來源的)，或者合成的肽或多肽(例如非天然存在的多肽，例如類肽(peptoid)或者肽模擬物(peptidomimetic))?；衔锬軌蚪Y(jié)合到整聯(lián)蛋白的βA結(jié)構(gòu)域的非配體結(jié)合位點(diǎn)上?！罢?lián)蛋白的βA結(jié)構(gòu)域的非配體結(jié)合位點(diǎn)”包括β亞基的尾部結(jié)構(gòu)域β(βTD)的CD環(huán)用以結(jié)合到未結(jié)合配體的整聯(lián)蛋白的β亞基的βA結(jié)構(gòu)域中的鏈-F/α7環(huán)上的位點(diǎn)。如此，配體是指結(jié)合整聯(lián)蛋白實(shí)現(xiàn)其生理功能的天然存在的配體。所述位點(diǎn)區(qū)別于配體結(jié)合位點(diǎn)。化合物包括β尾部結(jié)構(gòu)域(βTD)的CD環(huán)或者CD環(huán)的片段的合成的以及天然存在的模擬物，βTD接觸未結(jié)合配體的整聯(lián)蛋白的βA結(jié)構(gòu)域中的鏈-F/α7環(huán)，接觸α1/鏈-A環(huán)或者該環(huán)的片段(其與未結(jié)合配體的整聯(lián)蛋白的雜交結(jié)構(gòu)域接觸)，以及接觸未結(jié)合配體的整聯(lián)蛋白的βA結(jié)構(gòu)域中的ADMIDAS配位位點(diǎn)(coordinate site)。“模擬物”與其所模擬的實(shí)體具有結(jié)構(gòu)相似性或者具有類似的結(jié)合特性?；衔锇ɑ蛘哂赡M物組成。按照本發(fā)明，“化合物”優(yōu)選是指如上所述的化學(xué)實(shí)體，選自a)天然存在的多肽，優(yōu)選小于160kDa的天然存在的多肽，特別地小于100kDa，但是優(yōu)選大于32kDa；b)合成多肽，優(yōu)選小于160kDa的合成多肽，特別地小于80kDa，但是優(yōu)選大于32kDa；c)小分子，優(yōu)選如下描述的小分子；d)抗體，優(yōu)選選自單克隆抗體、多克隆抗體、嵌合抗體、抗體融合物等的抗體；e)抗體片段，優(yōu)選d)中給出的抗體的抗體片段；和f)非肽的有機(jī)分子，優(yōu)選具有大于150g/mol的分子量(formula weight)，和優(yōu)選小于1500g/mol，更加優(yōu)選大于250g/mol和優(yōu)選小于800g/mol。
“調(diào)節(jié)”是指調(diào)節(jié)或者改變整聯(lián)蛋白的活化或者配體結(jié)合。例如。一種調(diào)節(jié)物能夠抑制或者促進(jìn)整聯(lián)蛋白的活化或者能夠阻止或者促進(jìn)對整聯(lián)蛋白的配體結(jié)合。
“肽模擬物”是指多肽或者肽的化學(xué)變體，其中多肽或者肽的側(cè)鏈實(shí)質(zhì)上在受體中維持，而在至少一個肽鍵中，肽模擬物的化學(xué)骨架相對于多肽或者肽被改變。
“類肽”是N取代的甘氨酸的寡核苷酸。類肽可以從大量不同的N-烷基化甘氨酸中合成得到，N-烷基化甘氨酸具有與氨基酸側(cè)鏈相似的側(cè)鏈(例如，如Simon等人，(1992)PNAS899367-9371所描述)?？梢宰鳛橹苽湫路肿拥幕瘜W(xué)多樣化的文庫的基序。作為天然多聚物的替代，這是可以大量合成單體的模系統(tǒng)。這些單體在寡聚骨架的側(cè)鏈具有大量功能基團(tuán)，該連接化學(xué)是高產(chǎn)量的并且適合于自動化。類肽中的連接對水解酶如蛋白酶具有抗性。另一個優(yōu)點(diǎn)是該單體是非手性的。
“小分子”是具有小于32kDa的分子，例如，0.5kDa、1kDa、5kDa、10kDa、15kDa、20kDa、25kDa、30kDa或者32kDa。
除非另外說明，所有在此所用的科學(xué)技術(shù)術(shù)語具有與本發(fā)明所屬領(lǐng)域的技術(shù)人員通常所理解的相同意義。雖然與在此所描述的那些類似或者相當(dāng)?shù)姆椒ê筒牧?，可以被用于?shí)施或檢測本發(fā)明，下文描述了合適的方法和材料。所有的出版物、專利申請、專利和其它在此提及的參考文獻(xiàn)完全引入作為參考。在相互矛盾的情況下，包括定義的說明書將起決定作用。此外，材料、方法和實(shí)施例僅是說明性的，而不是起限制作用。
本發(fā)明的一個或多個實(shí)施方案的詳細(xì)內(nèi)容將在附隨的附圖和下文的說明書中闡述。根據(jù)說明書和附圖，以及根據(jù)權(quán)利要求書，本發(fā)明的其它特征、目標(biāo)和優(yōu)點(diǎn)是顯然的。
附圖簡介附

圖1A是細(xì)胞外活性形式的αVβ3的晶體結(jié)構(gòu)，具有12個結(jié)構(gòu)域4個在α亞基，而8個在β亞基。附圖1B是在膝節(jié)(genu)上計(jì)算伸直的αVβ3的結(jié)構(gòu)(135°彎曲和120°旋轉(zhuǎn))，與整聯(lián)蛋白的十分常見的水母樣的早期EM圖像相似。
附圖2是結(jié)合到原型(prototypical)Arg-Gly-Asp(RGD)配體上的細(xì)胞外αVβ3的結(jié)構(gòu)，該結(jié)構(gòu)在環(huán)RGDf[N-Me]V分散到存在Mn2+23時(shí)形成的已有αVβ3晶體中后被確定。RGD序列占據(jù)螺旋樣推進(jìn)器(propeller)與βA結(jié)構(gòu)域之間的淺裂縫(附圖2A)，螺旋樣推進(jìn)器與βA結(jié)構(gòu)域分別專一地接觸Arg和Asp殘基。附圖2B是在配體化結(jié)構(gòu)中觀察到的三級和四級變化的球形和棒狀的示意圖。四級變化主要限制在βA，使得配體Asp通過第二個金屬離子直接與βA接觸。附圖2C顯示系統(tǒng)化的(schematized)較小的四級變化，在未配體化和配體化的結(jié)構(gòu)在其αβ足片(leg section)(calf-1/2和βTD結(jié)構(gòu)域)上疊加時(shí)，觀察到這些變化在螺旋樣推進(jìn)器/股節(jié)界面(propeller/thigh interface)上，螺旋樣推進(jìn)器發(fā)生小的旋轉(zhuǎn)，接著為βA和雜交結(jié)構(gòu)域協(xié)作發(fā)生小旋轉(zhuǎn)。此外，螺旋樣推進(jìn)器和βA結(jié)構(gòu)域在肽結(jié)合位點(diǎn)上更緊密地鄰近。在“鄰近”結(jié)構(gòu)中，一個水分子實(shí)現(xiàn)將金屬離子(附圖2D)與環(huán)2的蘇氨酸和環(huán)3的天冬酰胺配位，分別與金屬離子形成間接和直接的化學(xué)鍵。在開放的構(gòu)象中(附圖2E)，金屬離子移動約2A，在其配位中產(chǎn)生微妙的變化蘇氨酸直接與之接觸，而天冬氨酸是通過水分子與之接觸。在第6個金屬配位點(diǎn)上，配體Glu(在附圖2E以金色表示)替代水分子19，20 29；因此，αA的這一面被稱作為金屬離子依賴的附著位點(diǎn)(MIDAS)19。
附圖3A是顯示金屬離子位置和配位改變與環(huán)1移向環(huán)22A相關(guān)的示意圖。附圖3B是顯示在關(guān)閉和開放形式的αA中，在與金屬配位中的四級變化相關(guān)的兩個轉(zhuǎn)換區(qū)(switch region)中，大的三級變化分別與存在于無活性和活性狀態(tài)的G蛋白中的那些變化十分相似。當(dāng)βA被配體化，其顯示出明顯的四級改變，在配體結(jié)合位點(diǎn)周圍改變環(huán)的形狀(reshape)。在數(shù)量和方向上，這些改變與由封閉轉(zhuǎn)換到開放αA中所見到的那些改變類似，同樣是由α1螺旋的相似運(yùn)動觸發(fā)(比較附圖3A和3C)。附圖3D是顯示，當(dāng)用TOP對這些結(jié)構(gòu)進(jìn)行重疊時(shí)，在未配體化的αA中，C末端α7螺旋相對于中心β-片層的高度和位置更加緊密地與開放α1的高度和位置匹配的示意圖。
附圖4顯示在配體化的αVβ3上建模的α5β1-FN復(fù)合物的結(jié)構(gòu)示意圖，這得到在αVβ3結(jié)合肽23和FN61中，觀察到RGD的晶體結(jié)構(gòu)幾乎相同的結(jié)果的支持。
附圖5是顯示在一個正好位于αA的α7螺旋后面的保守基序中，將αA連接到螺旋樣推進(jìn)器上的彈性14-17殘基的C末端接頭(C-接頭)含有一個恒定的谷氨酸(CD11中的Glu320)，由于該螺旋樣推進(jìn)器向下運(yùn)動10A，該恒定的谷氨酸可能在βA中以配體-模擬物方式，直接接觸MIDAS陽離子，在αA和βA之間形成界面中心，將αA鎖定在開放狀態(tài)67。
附圖6A是顯示整聯(lián)蛋白活化可以從其頭部或者尾部被激發(fā)的示意圖，而從尾部激發(fā)與足部和腿部的分離相關(guān)。附圖6B是顯示在未配體化的αVβ3中，βCD的彈性CD環(huán)與鏈-F/α7環(huán)(前者的Ser674與βA的Val332接觸)接觸的示意圖，在RGD結(jié)合時(shí)，鏈-F/α7環(huán)是βA中發(fā)生最顯著變化的區(qū)域(見附圖3C)。
附圖7A是顯示在未結(jié)合配體的結(jié)構(gòu)中，雜交結(jié)構(gòu)域(hybrid domain)的D/D′環(huán)(C374LNNE；SEQ ID NO3)和D″/E(M387GLKIGD；SEQ ID NO4)環(huán)接觸βCD的α1-鏈/A環(huán)的示意圖。附圖7B顯示在未配體化的結(jié)構(gòu)中，ADMIDAS陽離子的配位(鄰近于金屬離子依賴的附著位點(diǎn))。
附圖8是顯示αMβ2整聯(lián)蛋白的配體結(jié)合的圖形。x軸表示在存在1mMMg2+時(shí)，逐漸升高的鈣濃度，而y軸表示常規(guī)的iC3b檢測配體結(jié)合的百分比。突變的膜結(jié)合整聯(lián)蛋白(D141D142/A141A142)與生理性配體結(jié)合增加了1.5-2倍。在αVβ3的類似突變中，也獲得了相似的結(jié)果。
附圖9是αVβ3氨基酸的原子坐標(biāo)(atomic coordinates)表。
附圖10是αVβ3氨基酸的原子坐標(biāo)表。
發(fā)明詳述本發(fā)明部分地基于確定了整聯(lián)蛋白的“死栓抑制”的機(jī)制，其特征在于鑒定結(jié)合整聯(lián)蛋白(例如αVβ3)的化合物的方法，特別是抑制整聯(lián)蛋白活化和抑制配體結(jié)合到整聯(lián)蛋白上從而產(chǎn)生死栓抑制的化合物。附圖9和10中的結(jié)構(gòu)信息可以被用于鑒定整聯(lián)蛋白(αVβ3)活性和配體結(jié)合的各種抑制劑。在整聯(lián)蛋白(例如，αVβ3)的一個或多個體外或體內(nèi)生物學(xué)分析中，用本發(fā)明的方法鑒定的優(yōu)選模擬物和拮抗劑起滅活整聯(lián)蛋白的作用。
本發(fā)明的方法能夠鑒定具有特定結(jié)構(gòu)的化合物(例如，小分子天然存在的多肽和非天然存在的肽或者多肽(例如，類肽，肽模擬物，抗體等)。該方法依賴于使用來源于x射線晶體學(xué)試驗(yàn)的精確的結(jié)構(gòu)信息，包括整聯(lián)蛋白(αVβ3)的βA結(jié)構(gòu)域。這些晶體學(xué)數(shù)據(jù)可以鑒定化合物(例如，天然存在的和非天然存在的多肽、小分子等)中的原子，對于整聯(lián)蛋白結(jié)合和整聯(lián)蛋白調(diào)節(jié)(例如，抑制)來說，該原子是重要的。更加重要地，這些數(shù)據(jù)詳細(xì)說明了重要的接觸原子的三維結(jié)構(gòu)排列。其它分子包括原子與那些接觸原子的一些或全部具有類似三維排列的部分，可能能夠結(jié)合整聯(lián)蛋白并且作為整聯(lián)蛋白的調(diào)節(jié)物(例如抑制劑)。該方法還可以以分離的結(jié)構(gòu)域或者融合配偶體(例如，具有免疫球蛋白的Fc結(jié)構(gòu)域)，利用分離的整聯(lián)蛋白的βA結(jié)構(gòu)，并使用基于βTD結(jié)構(gòu)域與βA結(jié)構(gòu)域的相互作用的抑制或刺激的常規(guī)抑制劑篩選，所述分離的整聯(lián)蛋白的βA結(jié)構(gòu)域是根據(jù)結(jié)構(gòu)域的X射線晶體學(xué)數(shù)據(jù)或高分辯分子結(jié)構(gòu)數(shù)據(jù)(例如，通過溶液NMR)，或者根據(jù)與整聯(lián)蛋白αVβ3的結(jié)構(gòu)同源性確定的。
一項(xiàng)最新的所述研究基于對溶液中的細(xì)胞外整聯(lián)蛋白的負(fù)染EM(電子顯微照片)圖像的分析，發(fā)現(xiàn)Mn2+和RGD(Arg-Gly-Asp)在整聯(lián)蛋白中引發(fā)整體的變化，使得整聯(lián)蛋白由彎曲變?yōu)橄ブ毙问?knee-straightened form)，而無論其腿部是否被化學(xué)束縛。24一般認(rèn)為，在膝部伸直是由于雜交結(jié)構(gòu)域相對于βA向外旋轉(zhuǎn)，是由βA的C末端的α7螺旋下滑驅(qū)動。由于彎曲形式的細(xì)胞外或者膜結(jié)合的αVβ3(均通過基于αVβ3的原子結(jié)構(gòu)導(dǎo)入二硫鍵將頭部鎖定在腿部產(chǎn)生)是無活性的，但是可以通過化學(xué)還原二硫鍵來激活，一般認(rèn)為，這種“彈簧式”模型表明整聯(lián)蛋白活化。雖然吸引人，但是這種模型不能夠解釋大量觀察結(jié)果。第一，內(nèi)-外活化十分迅速(＜1秒)并且是可逆的。彈簧式模型不能夠解釋該伸展的結(jié)構(gòu)如何在數(shù)秒鐘內(nèi)折疊，特別是在細(xì)胞外基質(zhì)的擁擠范圍內(nèi)。第二，僅僅是膝部的移動不足以伸展20成為天然無活性的αIβ3的cryoEM結(jié)構(gòu)45。第三，對活性的和無活性的天然αIIbβ3的mAb表位圖譜的分析表明，它們都可以是緊湊(彎曲)的形式82。第四，活化和擴(kuò)張可以是分開的腿部被束縛的細(xì)胞外α5β1被解開時(shí)，會呈現(xiàn)出一種直的構(gòu)象，但仍是無活性的。此外，由于整聯(lián)蛋白的三級和四級變化是必須的，期望通過人工的二硫化物將該結(jié)構(gòu)固定在其彎曲的未配體化狀態(tài)，使其未配體化，并且這甚至發(fā)生在蛋白質(zhì)晶格中，以使RGD配體結(jié)合(參見上文)。因此，膝部的彎曲/伸展是活化的結(jié)果，而不是活化的原因，這會引起配體結(jié)合后的事件。
在未配體化的αVβ3中，βTD的彈性CD環(huán)與鏈-F/α7環(huán)接觸(前者的Ser674與βA中的Val332接觸)(表1)(附圖6B)，這是βA中在RGD結(jié)合時(shí)發(fā)生最顯著變化的區(qū)域(附圖3C)；在配體化結(jié)構(gòu)(liganded structure)中不存在這種接觸。該接觸在未配體化的αVβ3中覆蓋了非常小的表面積，而βTD環(huán)具有高溫因子。因此，這種接觸可能不會在結(jié)晶結(jié)構(gòu)中產(chǎn)生大量穩(wěn)定能量。βTD的同側(cè)(α1-鏈-A環(huán))與雜交結(jié)構(gòu)域的接觸面積更大(表2)。α和β亞基和/或其結(jié)構(gòu)域界面在膜結(jié)合結(jié)構(gòu)中發(fā)生較小重排后，βTD和βA結(jié)構(gòu)域緊密鄰近，產(chǎn)生了更實(shí)質(zhì)性的接觸。βTD-βA接觸可以作為一種可調(diào)節(jié)或者可調(diào)控的“死栓”(deadblot)，通過防止與α1螺旋向內(nèi)移動起始的活化相關(guān)的鏈-F/α7環(huán)的移動，將βA鎖定在無活性的狀態(tài)。分離整聯(lián)蛋白的足部41，44，將會通過膜包埋螺旋發(fā)生活塞樣的、see-saw41或者轉(zhuǎn)動83的運(yùn)動，引起腿部分離。這些運(yùn)動能夠解開βTD的“死栓”，游離βA，行使蛋白質(zhì)在被配體化狀態(tài)下觀察到的運(yùn)動，因而提供一種快速而可逆地內(nèi)-外活化整聯(lián)蛋白的途經(jīng)?；谠撛?，不要期望在活性整聯(lián)蛋白中觀察到廣泛的接觸，因?yàn)樗浪ㄔ谠摻Y(jié)構(gòu)中不參與。這正好是βTD的TD環(huán)具有高溫因子(high temperaturefactors)的原因一定程度的活動性可能有助于其使βA結(jié)構(gòu)域重新參與滅活(將死栓滑到該位置上)。在該推理的另一個支持中，洛伐他汀(lovastatin)結(jié)合到來自CD11a的αA結(jié)構(gòu)域中的鏈-F/α7界面上，將整聯(lián)蛋白鎖定在無活性狀態(tài)84。值得注意的是，ADMIDAS(鄰近于金屬離子依賴的附著位點(diǎn))陽離子將活化敏感的βA的α1螺旋結(jié)合到同一結(jié)構(gòu)域的鏈-F/α7螺旋上，該陽離子鄰近于死栓位點(diǎn)，并且當(dāng)鏈-F/α7環(huán)翻轉(zhuǎn)時(shí)，通過未鎖定的α1參與活化過程。內(nèi)-外活化(inside-out activation)中的死栓的一個特別吸引人的特點(diǎn)在于，其可以通過兩個結(jié)構(gòu)域之間的直接界面，相對容易地將變化由最接近膜的βTD結(jié)構(gòu)域呈遞到遠(yuǎn)離膜的βA結(jié)構(gòu)域。這表明了在晶體和溶液中觀察到的αVβ3的彎曲構(gòu)象的主要作用，并且可以解釋PSI/EGF/βTD結(jié)構(gòu)域以及鄰近的calf-2結(jié)構(gòu)域中的突變和/或活化依賴的變化的活化作用(參考16)，示例說明這可能改變βTD相對于βA的位置。
最近，在闡明未被配體化的和RGD配體化的狀態(tài)下的整聯(lián)蛋白的外結(jié)構(gòu)域(ectodomain)的晶體結(jié)構(gòu)，以及其細(xì)胞質(zhì)尾“足”的NMR結(jié)構(gòu)22，23，44方面取得了顯著進(jìn)展。該配體化的結(jié)構(gòu)有助于說明陽離子依賴的配體結(jié)合特異性的基礎(chǔ)，并且有助于開發(fā)整聯(lián)蛋白與更加復(fù)雜的配體相互作用模型。未被配體化的結(jié)構(gòu)與被配體化的結(jié)構(gòu)之間的比較闡明了引起配體結(jié)合的三級結(jié)構(gòu)變化，提供了對相關(guān)的四級結(jié)構(gòu)變化的最低限度的觀點(diǎn)。該信息產(chǎn)生了新的內(nèi)-外活化的“死栓抑制”模型。由于失控的整聯(lián)蛋白功能引起或加劇的疾病的廣譜性，該結(jié)構(gòu)信息給合理開發(fā)靶向這些受體的特定治療性藥物提供了豐富來源。
αVβ3結(jié)構(gòu)與洛伐他汀結(jié)合位點(diǎn)具有驚奇的相似性。由于β3鏈嚴(yán)重折疊，在接近洛伐他汀接觸CD11a處的位置上，βTD的接近的膜的環(huán)與βA結(jié)構(gòu)域的遠(yuǎn)離膜的F7折疊接觸。在結(jié)合RGD配體時(shí)，在βA結(jié)構(gòu)域中的0.3nm的允許移動中，這種接觸被破壞掉。RGD配體能夠活化整聯(lián)蛋白。可能這種鏈內(nèi)接觸因此解決了非αA結(jié)構(gòu)域的整聯(lián)蛋白的活化問題，解釋了細(xì)胞內(nèi)信號如何能夠經(jīng)由5個結(jié)構(gòu)域與沿著鏈向23nm之外的配體結(jié)合位點(diǎn)傳遞信息。
這種機(jī)制表明，F(xiàn)1-F7螺旋形成的縫隙以及非αA結(jié)構(gòu)域的F7褶是常用的新靶點(diǎn)，可以作為合理設(shè)計(jì)的藥物的新分類。這些藥物將會通過將βA結(jié)構(gòu)域結(jié)構(gòu)鎖定為不可活化形式，防止整聯(lián)蛋白活化。這些藥物必須是完全不同的，并且通過完全不同的機(jī)制在配體結(jié)合位點(diǎn)上起作用，同樣，由于它們是一種鏈內(nèi)配體的模擬物，不同于對整聯(lián)蛋白的α鏈的細(xì)胞外催化劑起作用的洛伐他汀抑制。由于A結(jié)構(gòu)域作為獨(dú)立的結(jié)構(gòu)域被成功地結(jié)晶，可以快速地闡明來自還未表征的整聯(lián)蛋白的這些結(jié)構(gòu)域的結(jié)構(gòu)(即，以重組蛋白生產(chǎn)βA結(jié)構(gòu)域，確定其晶體結(jié)構(gòu))，以進(jìn)行合理藥物設(shè)計(jì)。
合理藥物設(shè)計(jì)的起始點(diǎn)包括1)β3中的βTD環(huán)的氨基酸序列(C663VVRFQYYE671D672S673S674G675KSILYVVEEPEC687SEQ ID No.1，特別是中心氨基酸671-675；和K618KFDREPYMTENTCNR633YCRDSEQ ID NO.2，特別是Arg633)，2)其它相關(guān)整聯(lián)蛋白β鏈的同源環(huán)，3)完整存在于全長的整聯(lián)蛋白中或者作為含有βA結(jié)構(gòu)域的鏈片段的βA結(jié)構(gòu)域的高溶解性NMR或者X射線結(jié)晶結(jié)構(gòu)，和所述鏈的可變片段和可以快速結(jié)晶的其它合適融合配偶體的可變片段，以及4)藥物的抑制素家族的結(jié)構(gòu)同源物。在高通量篩選藥物候選物中，可以采用如下步驟1)基于配體結(jié)合到整聯(lián)蛋白上或者重組的配體結(jié)合的整聯(lián)蛋白的片段上的分析(例如玻連蛋白，纖維蛋白原或者血小板反應(yīng)蛋白結(jié)合分析以及βA結(jié)構(gòu)域/βTD結(jié)構(gòu)域結(jié)合分析)，2)NMR信號的干擾，3)對分離的整聯(lián)蛋白受體或者含有βA結(jié)構(gòu)域的受體片段的干擾，或者4)通過細(xì)胞水平上的連接。
計(jì)算機(jī)建模本發(fā)明的方法采用計(jì)算機(jī)方法來鑒定具有期望結(jié)構(gòu)的化合物。這些計(jì)算機(jī)方法分為兩個大類數(shù)據(jù)庫方法和從頭進(jìn)行的(de novo)設(shè)計(jì)方法。數(shù)據(jù)庫方法分為兩種主要類型，基于化合物(即僅僅是結(jié)合位點(diǎn)的配體)的方法或者基于結(jié)合位點(diǎn)的三維結(jié)構(gòu)的方法。在前一種方法中，將感興趣的化合物與存在于化學(xué)結(jié)構(gòu)數(shù)據(jù)庫中的所有化合物比較，鑒定在某種程度上結(jié)構(gòu)與感興趣的化合物類似的化合物。在后一種方法中，通過適當(dāng)?shù)挠?jì)算機(jī)軟件，將數(shù)據(jù)庫中所有化合物放入結(jié)合位點(diǎn)，評價(jià)并排列它們的擬合程度。數(shù)據(jù)庫中的結(jié)構(gòu)是基于通過NMR或者X射線結(jié)晶學(xué)產(chǎn)生的試驗(yàn)數(shù)據(jù)建立，或者根據(jù)二維的蛋白質(zhì)或者DNA序列數(shù)據(jù)建模的三維結(jié)構(gòu)來建立。在從頭設(shè)計(jì)方法中，結(jié)構(gòu)在某種程度上與感興趣的化合物相似的化合物的模型通過計(jì)算機(jī)程序使用來源于已知結(jié)構(gòu)的信息(例如，由X射線結(jié)晶學(xué)和/或合理規(guī)則產(chǎn)生數(shù)據(jù))生成。這種設(shè)計(jì)方法可以以原子-原子方式或者通過組裝存儲的小分子片段，建立具有期望結(jié)構(gòu)的化合物。
數(shù)據(jù)庫方法和從頭設(shè)計(jì)方法是否能夠成功地鑒定具有與感興趣的化合物類似活性的化合物，依賴于鑒定感興趣的化合物中的功能相關(guān)部分。對于藥物來說，功能相關(guān)部分是指一種藥效團(tuán)。而藥效團(tuán)是對生物學(xué)活性來說重要的結(jié)構(gòu)特性和功能基團(tuán)的排列。
并非所有所鑒定的具有期望藥效團(tuán)的化合物都可以作為整聯(lián)蛋白的調(diào)節(jié)物。真正的活性僅通過在相關(guān)的生物學(xué)分析中測定化合物的活性來最終確定。但是，本發(fā)明的方法是非常有價(jià)值的，可以被用于極大地減少需要被檢測以鑒定真正的模擬物的化合物的數(shù)量。
適合從二維數(shù)據(jù)中生成預(yù)測的三維結(jié)構(gòu)的程序包括Concord(TriposAssociated，St.Louis，MO)，3-D Builder(Chemical Design Ltd.，Oxford，U.K.)，Catalyst(Bio-CAD Corp.，Mountain View，CA)，Daylight(Abbott Laboratories，Abbott Park，IL)。
適合搜索三維數(shù)據(jù)庫來鑒定具有期望藥效團(tuán)的分子的程序包括MACCS-3D and ISIS/3D(Molecular Design Ltd.，San Leandro，CA)，ChemDBS-3D(Chemical Design Ltd.，Oxford，U.K.)，Sybyl/3DB Unity(TriposAssociates，St.Louis，MO)。適合藥效團(tuán)選擇和設(shè)計(jì)的程序包括DISCO(Abbott Laboratories，Abbott Park，IL)，Catalyst(Bio-CAD Corp.，MountainView，CA)以及ChemDBS-3D(Chemical Design Ltd.，Oxford，U.K.)。
化學(xué)結(jié)構(gòu)的數(shù)據(jù)庫可以從Cambridge Crystallographic Data Centre(Cambridge，U.K.)以及Chemical Abstracts Service(Columbus，OH)獲得。
從頭設(shè)計(jì)程序包括Ludi(Biosym Technologies Inc.，San Diego，CA)以及Aladdin(Daylight Chemical Information Systems，Irvine CA)，LEGEND(Nishibata，Y.，Itai，A.，Tetrahedron，47，8985(1991))(MolecularSimultations，Burlington，MA)和LeapFrog(可從Tripos associates，St.Louis，MO獲得)。
在確定整聯(lián)蛋白的三維結(jié)構(gòu)時(shí)，可以單獨(dú)或者組合使用多種方法中的任何一種，評價(jià)可能的調(diào)節(jié)物。這種評價(jià)可以基于在此描述的晶體的X射線坐標(biāo)，在計(jì)算機(jī)屏幕上視察整聯(lián)蛋白上的結(jié)合位點(diǎn)的三維結(jié)構(gòu)示意圖?？梢允褂帽绢I(lǐng)域技術(shù)人員知曉的計(jì)算機(jī)建模技術(shù)、硬件和軟件，實(shí)現(xiàn)評價(jià)或者建模。這還包括模型建立、模型對接(model docking)或者使用軟件對蛋白質(zhì)-配體相互作用的其它分析，使用的軟件包括，例如QSC，GOLD(Jones等人，J.Mol.Biol.，245，43-53，1995)，F(xiàn)lexX(Lengauer，Rarey，1996)，Autodock(Morris等人，1998)，GLIDE，Modeler，或者Sybyl，接著用標(biāo)準(zhǔn)的分子力學(xué)力場進(jìn)行能量最小化和分子動力學(xué)，包括，例如CHARMM和AMBER。未配體化的整聯(lián)蛋白的三維結(jié)構(gòu)信息(例如，βTD結(jié)構(gòu)域的CD環(huán)與未配體化的整聯(lián)蛋白中的βA結(jié)構(gòu)域的鏈-F/α7環(huán)接觸)也可以與計(jì)算機(jī)建模結(jié)合利用，生成其它未配體化的整聯(lián)蛋白的計(jì)算機(jī)模型。還可以用常規(guī)方法和本領(lǐng)域的熟練人員熟知的技術(shù)，包括在此描述的軟件包，建立未配體化的整聯(lián)蛋白的結(jié)構(gòu)域的計(jì)算機(jī)模型。
一旦確定包含未被配體化的整聯(lián)蛋白的晶體的三維結(jié)構(gòu)，或者通過NMR測定的溶液結(jié)構(gòu)，通過采用對接(docking)程序，例如QSC、GOLD、FlexX或Autodock的計(jì)算機(jī)建模方法，鑒定可能的非配體位點(diǎn)結(jié)合物(例如模擬βA的鏈-F/α7環(huán)的βTD結(jié)合的結(jié)合物)，確定可能的配體的形狀和化學(xué)結(jié)構(gòu)與結(jié)合位點(diǎn)相互作用的效果如何。還可以用計(jì)算機(jī)程序估計(jì)兩個結(jié)合配偶體(即，非配體結(jié)合位點(diǎn)與調(diào)節(jié)結(jié)合物)之間的吸引、排斥和空間位阻。通常，可能配體與變構(gòu)結(jié)合位點(diǎn)之間較為緊密地?cái)M合、較低的位阻以及較大的吸引力與它們之間較高的結(jié)合常數(shù)是一致的。此外，在可能的藥物設(shè)計(jì)中，特異性越高，該藥物與其它蛋白質(zhì)相互作用的可能性越低。這可以使由于與其它蛋白質(zhì)之間的不期望的相互作用產(chǎn)生的潛在副作用最小化。
本領(lǐng)域技術(shù)人員可以獲得各種方法，來評價(jià)和實(shí)際上篩選適合與一種蛋白質(zhì)，特別是整聯(lián)蛋白相結(jié)合的分子或化學(xué)片段。這種結(jié)合可以是各種形式的，包括，例如空間相互作用、范德華力相互作用、靜電相互作用、溶劑化相互作用、電荷相互作用、共價(jià)結(jié)合相互作用、非共價(jià)結(jié)合相互作用(例如氫鍵相互作用)、熵或焓有利的相互作用等。
眾多計(jì)算機(jī)程序是可獲得的，并且適合于合理藥物設(shè)計(jì)，以及在此描述的方法中，對可能的調(diào)節(jié)化合物進(jìn)行計(jì)算機(jī)建模、模型建立和計(jì)算化鑒定、篩選和評價(jià)處理。這些計(jì)算機(jī)程序包括，例如QSC(WO 01/98457)、FlexX、Autodock、Glide、Accelrys′Discovery Studio或Sybyl。使用軟件包如QSC(WO01/98457)、Accelrys′Discovery Studio、Sybyl、ISIS、ChemDraw或Daylight，計(jì)算機(jī)“從頭”設(shè)計(jì)可能的抑制劑。化合物的變形能和靜電排斥可以用程序例如GAUSSIAN92、AMBER、QUANTA/CHARMM、ANDINSIGHT II/DISCOVER來評估。
有大量方法來選擇填充各個結(jié)合口袋的成分。這些方法包括QUANTA[Molecular Simulations，Inc.，Burlington，Mass.，1992]、SYBYL[MolecularModeling Software，Tripos Associates，Inc.，St.Louis，Mo.，1992]、AMBER[S.J.Weiner，P.A.Kollman，D.A.Case，U.C.Singh，C.Ghio，G.Alagona和P.Weiner，J.Am.Chem.Soc.，106，765-784(1984)]或者CHARMM[B.R.Brooks，R.E.Bruccoleri，B.D.Olafson，D.J.States，S Swaminathan和M.Karplus，J.Comp.Chem.4，187-217(1983)]。在這種模擬步驟之后，用標(biāo)準(zhǔn)的分子力學(xué)力場(molecular mechanics forcefields)如CHARMM和AMBER來使能量最小化。此外，還有許多更加專業(yè)的計(jì)算機(jī)程序來在選擇本發(fā)明的結(jié)合成分的過程中起輔助作用。這些程序包括1.)GRID(Goodford，P.J.A Computational Procedure for DeterminingEnergetically Favorable Binding Sites on Biologically ImportantMacromolecules.J.Med.Chem.，28，849-857(1985))。GRID可以從OxfordUniversity，Oxford，UK獲得。
2.)MCSS(Miranker，A.；Karplus，M.Functionality Maps of Binding SitesA Multiple Copy Simultaneous Search Method.ProteinsStructure，F(xiàn)unction andGenetics，11，29-34(1991))。MCSS可以從Molecular Simulations，Burlington，Mass獲得。
3.)AUTODOCK(Goodsell，D.S.；Olsen，A.J.Automated Docking ofSubstrates to Proteins by Simmulated Annealing.PROTEINSStructure，F(xiàn)unction and Genetics，8，195-202(1990))。AUTODOCK從Scripps ResearchInstitute，La Jolla，Calif獲得。
4.)DOCK(Kuntz，I.D.；Blaney，J.M.；Oatley，S.J.；Langridge，R.；Ferrin，T.E.A Geometric Approach to Macromolecule-Ligand Interactions.J.Mol.Biol.，161，269-288(1982))。DOCK從University of California，San Francisco，Calif獲得。
5.)GOLD(Jones等人，J.Mol.Biol.，245，43-53，1995)。GOLD從Cambridge Crystallography Data Centre，Camdridge，UK獲得。
6.)FlexX(T.Lengauer和M.Rarey，Computational Methods forBiomolecular Docking，Current Opinion in Structural Biology，6，402-406，1996)。FlexX從Tripos Associated，St.Louis，MO獲得。
這些計(jì)算機(jī)評價(jià)與建模技術(shù)可以用任何合適的硬件來實(shí)施，包括例如，可以從Silicon Graphics、Sun Microsystems等處獲得的工作臺。這些技術(shù)、方法、硬件和軟件包是示例性的，不是作為廣泛的列舉。本領(lǐng)域知曉的其它建模技術(shù)也可以被用于本發(fā)明。參見，例如QSC(WO01/98457)、FlexX、Autodock、Glide、Accelrys′Discovery Studio或者Sybyl以及在各個互聯(lián)網(wǎng)上確定的軟件(例如，netsci.org/Resources/Software/Modeling/CADD/ch.cam.ac.uk/SGTL/software.htmlcmm.info.nih.gov/modeling/universal_software.htmldasher.wustl.edu/tinker/zeus.polsl.gliwice.pl/～nikodem//linux4chemistry.htmlnyu.edu/pages/matbmol/software.html
msi.umn.edu/usersupport/software/MolecularModeling.htmlus.expasy.org/sisweb.com/software/model.htm)。
用三維結(jié)構(gòu)(或者結(jié)構(gòu))進(jìn)行合理藥物設(shè)計(jì)，選擇可能的整聯(lián)蛋白調(diào)節(jié)物，該三維結(jié)構(gòu)是為在此描述的βA結(jié)構(gòu)域上βTD所接觸的位點(diǎn)而確定的，結(jié)合或者僅通過計(jì)算機(jī)建模和上述方法。然后，可能的調(diào)節(jié)物可以購買得到或者用標(biāo)準(zhǔn)的合成技術(shù)和本領(lǐng)域知曉的方法學(xué)由容易獲得的起始原料合成。然后，分析該可能的抑制劑，確定其調(diào)節(jié)靶點(diǎn)(例如，整聯(lián)蛋白，例如αVβ3)和/或整聯(lián)蛋白路徑的能力。
還可以通過篩選化合物文庫(例如，組合文庫，例如質(zhì)量編碼(mass-coded)的組合文庫)來選擇可能的抑制劑。可以通過親合篩選對化合物文庫進(jìn)行篩選，選擇在新的非配體結(jié)合位點(diǎn)上與特定整聯(lián)蛋白具有最大親和力的成員。
一旦選擇了合適的結(jié)合成分，可以將它們組裝成單一的調(diào)節(jié)結(jié)合物。可以將各種成分連接到中心骨架上來實(shí)現(xiàn)這種組裝。例如，可以通過視覺觀察，接著進(jìn)行手工建模，再使用軟件如Quanta或者Sybyl，來進(jìn)行該組裝過程。大量其它程序也可以被用于輔助選擇連接各種成分的方式。這些程序包括CAVEAT(Bartlett，P.A.；Shea，G.T.；Telfer，S.J.；Waterman，S.CAVEATA Program to Facilitate the Structure-Derived Design of BiologicallyActive Molecules.In″Molecular Recognition in Chemical and BiologicalProblems，″Special Pub.，Royal Chem.Soc.，78，182-196(1989))(可從Universityof Califomia，Berkeley，CA獲得)、3D數(shù)據(jù)庫系統(tǒng)例如MACCS-3D(MDLInformation Systems，San Leandro，CA(綜述見Martin(Martin，Y.C.3DDatabase Searching in Drug Design.J.Med.Chem.，35，2145-2154(1992)))以及HOOK(可從Molecular Simulations，Burlington，MA獲得)。
大量通常用于建立藥物模型的技術(shù)也可以被使用(綜述見Cohen，N.C.；Blaney，J.M.；Humblet，C.；Gund，P.；Barry，D.C.，″Molecular Modeling Softwareand Methods for Medicinal Chemistry″，J.Med.Chem.，33，883-894(1990))。同樣，在用于特定藥物設(shè)計(jì)方案的技術(shù)的化學(xué)文獻(xiàn)中還有許多例子(綜述參見Navia，M.A.和Murcko，M.A.，″The Use of Structural Information in DrugDesign″，Current Opinions in Structural Biology，2，202-210(1992))。這種特定應(yīng)用的部分例子包括Baldwin，J.J.等人，″Thienothiopyran-2-sulfonamidesNovel Topically Active Carbonic Anhydrase Inhibitors for the Treatment ofGlaucoma″，J.Med.Chem.，32，2510-2513(1989)；Appelt，K.等人，″Design ofEnzyme Inhibitors Using IteratiVe Protein Crystallographic Analysis″，J.Med.Chem.，34，1925-1934(1991)；以及Ealick，S.E.等人，″Application ofCrystallographic and Modeling Methods in the Design of Purine NucleotidePhosphorylase Inhibitors″Proc.Nat.Acad.Sci USA，88，11540-11544(1991)。
多種常規(guī)技術(shù)也可以被用于各個上述的評價(jià)以及在篩選整聯(lián)蛋白的調(diào)節(jié)(例如抑制)中的候選化合物中所需的評價(jià)。通常，這些技術(shù)包括特定成分的位置和結(jié)合鄰近性，結(jié)合調(diào)節(jié)物(例如抑制劑)所占據(jù)的空間，特定化合物的結(jié)合的變形能以及電相互作用能量?？捎糜谏鲜鲈u價(jià)的常規(guī)技術(shù)的例子包括量子力學(xué)、分子力學(xué)、分子動力學(xué)、Monte Carlo采樣、系統(tǒng)研究和距離幾何方法(G.R.Marshall，Ann.Ref.Pharmacol.Toxicol.，27，193(1987))。已經(jīng)開發(fā)出用于實(shí)現(xiàn)這些方法的特定計(jì)算機(jī)軟件。被設(shè)計(jì)用于這種用途的程序的例子包括Gaussian92，修訂版本E.2(M.J.Frisch，Gaussian，Inc.，Pittsburgh，PA1993)；AMBER，版本4.0(P.A.Kollman，University ofCalifornia at San Francisco，1993)；QUANTA/CHARMM[MolecularSimulations，Inc.，Burlington，Mass.1992]；and Insight II/Discover(BiosysmTechnologies Inc.，San Diego，Calif.1992)。可以用例如Silicon GraphicsIndigo2工作臺或者IBM RISC/6000工作臺型號550來執(zhí)行這些程序。其它硬件和軟件包是本領(lǐng)域技術(shù)人員知曉的，并且是可以應(yīng)用的。
常規(guī)篩選本發(fā)明表明，除了計(jì)算機(jī)技術(shù)外，βTD與βA結(jié)構(gòu)域結(jié)合相互作用可以被用于常規(guī)的藥物文庫篩選中，直接鑒定能夠調(diào)節(jié)這兩個結(jié)構(gòu)域之間的相互作用的化合物。
這些分析可能基于結(jié)合與相互作用分析，其中一個配偶體被標(biāo)記(例如，用生物素或者熒光標(biāo)記)，而另一個配偶體被固定(例如，固定在96孔的ELISA平板上)。對化合物文庫進(jìn)行篩選，對化合物增強(qiáng)或者阻斷固定的配偶體與添加的生物素化配偶體或者熒光配偶體之間的相互作用的能力進(jìn)行篩選。通過抗生物素抗體或者與下文用于αVβ3-玻連蛋白結(jié)合分析中詳細(xì)描述的方法類似的熒光光譜測定法，測量結(jié)合相互作用。許多其它標(biāo)記技術(shù)可用于這種方法中(例如放射性標(biāo)記、鄰近分析)。
可替代地，在酵母的雙-雜交系統(tǒng)中，用βA結(jié)構(gòu)域(或者含有該結(jié)構(gòu)域的更大的蛋白質(zhì)片段)作為誘餌(bait)，用βTD結(jié)構(gòu)域(或者含有該結(jié)構(gòu)域的更大的蛋白質(zhì)片段)作為捕獲器(prey)，能夠產(chǎn)生結(jié)構(gòu)域之間的相互作用。檢測化合物文庫干擾Gal4啟動子下的合適的標(biāo)記基因的轉(zhuǎn)錄的能力。
化合物合成用于合成在此描述的調(diào)節(jié)化合物的合成化學(xué)轉(zhuǎn)化和保護(hù)基方法(保護(hù)與去保護(hù))是本領(lǐng)域已知的，包括例如，在R.Larock，Comprehensive OrganicTransformations，VCH Publishers(1989)；T.W.Greene和P.G.M.Wuts，Protective Groups in Organic Synthesis，2nd ed.，John Wiley and Sons(1991)；L.Fieser和M.Fieser，F(xiàn)ieser and Fieser′s Reagents for Organic Synthesis，JohnWiley and Sons(1994)以及L.Paquette，編輯，Encyclopedia of Reagents forOrganic Synthesis，John Wiley and Sons(1995)，以及它們的后續(xù)版本中描述的那些方法。
在此描述的調(diào)節(jié)化合物可以含有一個或多個不對稱中心，從而形成消旋體和外消旋混合物、單一的對映異構(gòu)體、單獨(dú)的非對映異構(gòu)體以及非對映異構(gòu)體混合物。這些化合物所有同分異構(gòu)體形式都清楚地包括在本發(fā)明中。在此描述的調(diào)節(jié)性化合物還可以表現(xiàn)為多種互變異構(gòu)體形式，它們都被包括在本發(fā)明中。調(diào)節(jié)化合物還可以順式或反式或者E-或Z-雙鍵同分異構(gòu)體形式出現(xiàn)。所有這些同分異構(gòu)形式的這種調(diào)節(jié)化合物都清楚地包括在本發(fā)明中。
保守氨基酸取代多肽模擬化合物具有與SEQ ID No.1或SEQ ID No.2的多肽不同的氨基酸含量，并且作為有用的模擬物。取代突變體包括作為保守或者非保守改變的氨基酸殘基(或者，其中一個以上氨基酸被改變，可能是兩個)?！氨Ｊ亍比〈且粋€氨基酸殘基被另一個具有類似側(cè)鏈的氨基酸替代的取代。在本領(lǐng)域中，已經(jīng)定義了包括具有類似側(cè)鏈的氨基酸殘基的家族。這些家族包括具有堿基側(cè)鏈的氨基酸(例如，賴氨酸、精氨酸、組氨酸)、具有酸性側(cè)鏈的氨基酸(例如天冬氨酸、谷氨酸)、具有無電荷極性側(cè)鏈的氨基酸(例如甘氨酸、天冬酰胺、谷氨酰胺、絲氨酸、蘇氨酸、酪氨酸、半胱氨酸)、具有非極性側(cè)鏈的氨基酸(例如，丙氨酸、纈氨酸、亮氨酸、異亮氨酸、脯氨酸、苯丙氨酸、甲硫氨酸、色氨酸)、具有β-分支側(cè)鏈的氨基酸(例如蘇氨酸、纈氨酸、異亮氨酸)以及具有芳香側(cè)鏈的氨基酸(例如酪氨酸、苯丙氨酸、色氨酸、組氨酸)。本發(fā)明包括包含一個、兩個、三個、五個或者更多個保守氨基酸取代的多肽，其中生成的突變多肽結(jié)合整聯(lián)蛋白βA結(jié)構(gòu)域的非配體結(jié)合位點(diǎn)(例如，未配體化的αVβ3的βA結(jié)構(gòu)域中的鏈-F/α7環(huán))。
可以通過本領(lǐng)域熟知的突變技術(shù)來制備片段或者其它突變核酸，包括那些被用于多核苷酸、細(xì)胞或者生物體的突變技術(shù)(例如，通過飽和突變，在編碼SEQ ID No.1的多肽的核酸的整體或者部分上隨機(jī)引入突變)，對生成的蛋白質(zhì)抑制整聯(lián)蛋白活化的能力進(jìn)行篩選，如下面一個或多個的分析中所示。
整聯(lián)蛋白抑制分析通過在下文詳細(xì)描述的或者在美國專利6,489,333純化αVβ3(人胎盤)中進(jìn)一步描述的如下分析，如玻連蛋白ELISA、αVβ3-玻連蛋白結(jié)合分析、人大動脈平滑肌細(xì)胞遷移分析、體內(nèi)血管生成模型、豬再狹窄模型、小鼠視網(wǎng)膜病模型中的一種或多種進(jìn)行檢測，可以評價(jià)鑒定化合物的方法的效用和本發(fā)明的化合物的效用。假設(shè)這些分析是為了適合感興趣的整聯(lián)蛋白而進(jìn)行的，并且如下不是限定，而僅僅是作為實(shí)施例。如果在αVβ3-玻連蛋白結(jié)合分析的抑制中，通過本發(fā)明鑒定的化合物具有小于約10μM的IC50或Ki值，則被認(rèn)為是有活性的，化合物優(yōu)選具有小于約1μM的Ki值。在αVβ3-玻連蛋白結(jié)合分析以及在αVβ3受體介導(dǎo)的整聯(lián)蛋白附著細(xì)胞分析中，本發(fā)明的被檢測化合物是有活性的。通常，可以挑選更加適用于感興趣的特定整聯(lián)蛋白的分析。例如，使用適當(dāng)?shù)呐潴w(例如，含有RGD的配體，例如纖維蛋白原、玻連蛋白、纖連蛋白、血小板反應(yīng)蛋白、層粘連蛋白、膠原蛋白、VCAM-1、ICAM-1、ICAM-2、因子X、骨橋蛋白、骨涎蛋白或者vWF)，使用適當(dāng)?shù)募?xì)胞類型，和使用適當(dāng)?shù)臈l件，這都是本領(lǐng)域技術(shù)人員容易獲知的知識。下面的分析可用于檢測αVβ3的抑制或調(diào)節(jié)，也可以直接用于其它整聯(lián)蛋白的檢測，或者被最低限度地修改以適當(dāng)用于其它整聯(lián)蛋白。
純化的αVβ3(人胎盤)-玻連蛋白ELISA可以從人胎盤提取物中分離αVβ3受體，用辛基葡萄糖甙制備人胎盤提取物。該提取物經(jīng)過親合層析柱，柱中裝有加到Affigel上的抗αVβ3單克隆抗體(LM609)。隨后，在pH7和pH4.5的大范圍內(nèi)洗滌該柱，接著在pH3洗脫。通過麥胚凝集素(wheat germ agglutinin)層析濃縮生成的樣本，并且通過SDS凝膠上存在兩個條帶來鑒定，和通過western印跡被確定為αVβ3。還可以用所述的桿狀病毒表達(dá)以可溶的重組形式來制備該受體。
可以在不同水平上稀釋親合純化的蛋白質(zhì)，并且裝到96孔平板上?？梢杂霉潭舛鹊纳锼鼗＿B蛋白(約80nM/孔)進(jìn)行ELISA。通過凝膠(αVβ3)以及通過在ELISA中檢測阻斷αVβ3或αVβ5抗體的作用，確認(rèn)該受體制備物中含有αVβ3，而無可檢測含量的αVβ5。
根據(jù)固定濃度受體與不同濃度的生物素化玻連蛋白的濃度反應(yīng)曲線，可以選擇接近生物素化玻連蛋白的最大濃度的濃度。
αVβ3-玻連蛋白結(jié)合分析可以如先前所描述，測量整聯(lián)蛋白-配體結(jié)合相互作用21。用包被緩沖液(20mM Tris HCl，150mM NaCl，1.0mM CaCl2，1.0mMMgCl26H2O，10.0M MnCl2.4H2O)稀釋純化的受體，并覆蓋(100μL/孔)到Costar(3590)大容量結(jié)合平板上，4℃過夜。棄去包被溶液，用封閉/結(jié)合緩沖液(B/B緩沖液，50mM Tris HCl，100mM NaCl，1.0mM CaCl2，1.0mMMgCl26H2O，10.0MMnCl2.4H2O)洗滌平板一次。然后在室溫，用溶于B/B緩沖液的3.5％BSA(200μL/孔)封閉受體2小時(shí)。用溶于B/B緩沖液的1.0％BSA洗滌一次，每個孔中加入生物素化的玻連蛋白(100μL)以及抑制劑r(11μL)或者B/B緩沖液w/1.0％BSA(11μL)。在室溫溫育平板2小時(shí)。用B/B緩沖液洗滌平板兩次，并且在室溫，用溶于含有1.0％BSA的B/B緩沖液中的抗生物素堿性磷酸酶(100μL/孔)溫育1小時(shí)。用B/B緩沖液洗滌平板兩次，加入堿性磷酸酶底物(100μL)。在室溫顯色。加入2N NaOH(25μL/孔)以阻斷顯色，在405nm讀取吸收值。IC50是阻斷50％玻連蛋白結(jié)合到受體上所需的檢測底物的濃度。在αVβ3-玻連蛋白結(jié)合分析中，如果化合物具有小于或者等于約10μM的IC50值時(shí)，該化合物被認(rèn)為是有活性的。具有小于100nM的抑制玻連蛋白的IC50值的化合物是期望的。采用上述方法，可以發(fā)現(xiàn)大量的本發(fā)明的化合物具有小于或者等于約10μM的IC50值，從而確認(rèn)本發(fā)明的化合物可以用作有效的αVβ3整聯(lián)蛋白抑制劑。
βTD-βA結(jié)構(gòu)域結(jié)合分析將作為Fc-融合蛋白的純化βTD固定，如上用于整聯(lián)蛋白αVβ3-玻連蛋白結(jié)合相互作用所述，測量βTD與生物素化的βA結(jié)構(gòu)域的相互作用。IC50是阻斷50％βTD結(jié)合到受體上所需的檢測底物的濃度。在βTD-βA結(jié)構(gòu)域結(jié)合分析中，如果化合物具有小于或者等于約10μM的IC50值時(shí)，該化合物被認(rèn)為是有活性的。具有小于100nM的抑制βTD-βA相互作用的IC50值的化合物是期望的。
整聯(lián)蛋白細(xì)胞粘附分析在該粘附分析中，用被檢測的整聯(lián)蛋白的適當(dāng)配體(例如纖維蛋白原、玻連蛋白、纖連蛋白、血小板反應(yīng)蛋白、層粘連蛋白、膠原蛋白、VCAM-1、ICAM-1、ICAM-2、因子X、骨橋蛋白、骨涎蛋白或者vWF)包被96孔平板，在4℃溫育過夜。第二天，收集細(xì)胞，洗滌，加入熒光染料。一同加入化合物和細(xì)胞，然后立即加到包被的平板中。溫育后，從平板上去除松散的細(xì)胞，然后平板(具有附著細(xì)胞)在熒光計(jì)中計(jì)數(shù)。檢測化合物抑制50％細(xì)胞附著的能力表示為IC50值，表示對整聯(lián)蛋白介導(dǎo)的結(jié)合的抑制能力的測定值。用特異于感興趣的整聯(lián)蛋白的整聯(lián)蛋白相互作用分析檢測化合物阻斷細(xì)胞附著的能力。
血小板凝集分析從麻醉的雜種狗中采集靜脈血，或者從在采集血液前至少兩周不服用藥物和阿司匹林的健康人供體中采集靜脈血。將血液收集到檸檬酸鹽Vacutainer試管中。室溫，以150×g(在具有H-1000 B轉(zhuǎn)子的Sorvall RT6000臺式離心機(jī)為850RPM)離心血液15分鐘，去除富含血小板的血漿(PRP)。在室溫，以1500×g(26，780RPM)離心剩余血液15分鐘，去除貧含血小板的血漿(PRP)。在PAP-4血小板凝集擴(kuò)增儀中分析樣本，將PPP用作空白(100％透光率)。將200μL of PRP(5×108血小板/mL)加入各個微型試管中，將透光率設(shè)定為0％。將20μL ADP(10μM)加到各個試管中，繪制凝集曲線(％透光率比時(shí)間)。在加入血小板激動劑之前，加入不同濃度的檢測試劑(20μL)。結(jié)果表示為對激動劑誘導(dǎo)的血小板凝集的抑制的百分?jǐn)?shù)(％)。
人大動脈平滑肌細(xì)胞遷移分析用于評價(jià)αVβ3-介導(dǎo)的平滑肌細(xì)胞遷移的方法以及抑制αVβ3-介導(dǎo)的平滑肌細(xì)胞遷移的試劑在Liaw等人，J.Clin.Invest.(1995)95713-724)中描述。
體內(nèi)血管生成模型用于評價(jià)血管生成的定量方法和抗血管生成試劑在Passaniti等人，Laboratory Investigation(1992)67519-528中描述。
豬再狹窄模型用于評價(jià)再狹窄的方法和抑制再狹窄的試劑在Schwartz等人，J.Am.College of Cardiology(1992)19267-274中描述。
小鼠視網(wǎng)膜病模型用于評價(jià)視網(wǎng)膜病以及抑制視網(wǎng)膜病的試劑在Smith等人，Invest.Ophthal.&Visual Science(1994)35101-111中描述。
“死栓”的接觸點(diǎn)下面的表1列舉了βTD和βA結(jié)構(gòu)域之間的接觸點(diǎn)。下文的表2列舉了雜交結(jié)構(gòu)域與βTD之間的更廣泛的接觸點(diǎn)。在各個表的來源欄中列舉的氨基酸表示接觸點(diǎn)，一種調(diào)節(jié)物將被設(shè)計(jì)來結(jié)合該接觸點(diǎn)。通過在此描述的方法鑒定的調(diào)節(jié)物通常模擬列舉在靶點(diǎn)欄中的肽C663VVRFQYYE671D672S673S674G675KSILYVVEEPEC687(SEQ ID No.1)以及K618KFDREPYMTENTCNRYCRD(SEQ ID NO.2)的相互作用，特別是列舉在表1中的那些肽，以及其它列舉在表2中的那些。整聯(lián)蛋白調(diào)節(jié)物將結(jié)合的重要氨基酸接觸點(diǎn)包括如表1中的Ser673。如表2中所示，整聯(lián)蛋白調(diào)節(jié)物將結(jié)合的重要氨基酸接觸點(diǎn)包括(α1/鏈A環(huán)的)Arg633、Thr630、Glu628和Arg636。在未配體化的αVβ3中，βTD的彈性CD環(huán)接觸鏈-F/α7環(huán)(前者的Ser674接觸βA中的Val332)(表1)(附圖6B)，鏈-F/α7環(huán)是在RGD結(jié)合時(shí)，βA中發(fā)生最顯著變化的區(qū)域(附圖3C)；在配體化結(jié)構(gòu)中，失去這種接觸。在未配體化的αVβ3中，該接觸覆蓋非常小的表面積，βTD環(huán)具有高溫因子。因此，在晶體結(jié)構(gòu)中，該接觸可能不產(chǎn)生很多穩(wěn)定能量。βTD的同側(cè)也與雜交結(jié)構(gòu)域發(fā)生較大的接觸(表2)。在膜結(jié)合結(jié)構(gòu)中，在α亞基與β亞基和/或它們的結(jié)構(gòu)域界面較小重排后，βTD與βA結(jié)構(gòu)域緊密接近可能產(chǎn)生更加實(shí)質(zhì)性的接觸。βTD-βA接觸能夠作為可調(diào)節(jié)的或者可調(diào)控的“死栓”，通過防止與活化起始的α1螺旋向內(nèi)移動相關(guān)的鏈-F/α7環(huán)的移動，將βA鎖定在無活性的狀態(tài)。
有意思的是，已經(jīng)發(fā)現(xiàn)D126D127/A126A127突變滅活A(yù)DMIDAS。生成的膜結(jié)合整聯(lián)蛋白與生理配體的結(jié)合增加了1.5-2倍(附圖8)。如附圖4所示，假設(shè)ADMIDAS的位置與死栓相關(guān)，可能將ADMIDAS穩(wěn)定(用本發(fā)明的整聯(lián)蛋白調(diào)節(jié)物)在未配體化的狀態(tài)也會將死栓穩(wěn)定在被鎖定的狀態(tài)。該區(qū)域包括殘基Y122SMKDD(來自α1)以及S334MDSS(來自鏈-F/α7環(huán))。
表2.在4.0下，βA.pdb和βTD.pdb之間的接觸列表。

表3.在4.0下，雜合體.pdb和βTD.pdb之間的接觸列表。

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權(quán)利要求
1.一種用于評價(jià)化合物與分子或分子復(fù)合物結(jié)合的能力的方法，該分子或分子復(fù)合物包含整聯(lián)蛋白βA結(jié)構(gòu)域的非配體結(jié)合位點(diǎn)，該方法包含(a)使用計(jì)算機(jī)手段進(jìn)行化合物與未配體化的整聯(lián)蛋白(例如，αVβ3)的鏈-F/α7環(huán)上的β尾部結(jié)構(gòu)域(βTD)接觸區(qū)之間的擬合操作；和(b)分析擬合操作的結(jié)果，量化所述結(jié)合能力。
2.權(quán)利要求1的方法，其中化合物模擬一種肽與整聯(lián)蛋白的βA結(jié)構(gòu)域的鏈-F/α7環(huán)的相互作用，該肽包含氨基酸序列C663VVRFQYYE671D672S673S674G675KSILYVVEEPEC687或其片段，或者包含K618KFDREPYMTENTCNR633YCRD或其片段。
3.用于鑒定候選的針對整聯(lián)蛋白活性的選擇性調(diào)節(jié)物的方法，該方法包含(a)用整聯(lián)蛋白的βA結(jié)構(gòu)域的原子結(jié)構(gòu)模型對測試化合物建模，該化合物在空間上優(yōu)先地?cái)M合到感興趣的整聯(lián)蛋白βA結(jié)構(gòu)域非配體結(jié)合位點(diǎn)中，其中所述原子結(jié)構(gòu)模型是用包含C663VVRFQYYE671D672S673S674G675KSILYVVEEPEC687或其片段，或者包含K618KFDREPYMTENTCNR633YCRD或其片段的氨基酸序列生成的，(b)在生物學(xué)分析中篩選所述測試化合物對整聯(lián)蛋白的活化作用，該活化作用的特征在于所述測試化合物結(jié)合到整聯(lián)蛋白的βA結(jié)構(gòu)域非配體結(jié)合位點(diǎn)上；和(c)鑒定可選擇地調(diào)節(jié)整聯(lián)蛋白的活性的測試化合物，和可選擇地，(d)在生物學(xué)分析中，通過被鑒定的測試化合物結(jié)合到整聯(lián)蛋白的βA結(jié)構(gòu)域非配體結(jié)合位點(diǎn)上，阻止βA結(jié)構(gòu)域與βTD結(jié)構(gòu)域的相互作用的能力，對被鑒定的測試化合物進(jìn)行篩選，和(e)從測試化合物集合中，鑒定被篩選出來的測試化合物為能夠可選擇地調(diào)節(jié)整聯(lián)蛋白活性的化合物，在各種實(shí)施方案中所述調(diào)節(jié)包含抑制整聯(lián)蛋白的活化，以及所述調(diào)節(jié)包含抑制配體結(jié)合到整聯(lián)蛋白上。
4.鑒定整聯(lián)蛋白活性的候選抑制劑的方法，該方法包含(a)將定義整聯(lián)蛋白βA結(jié)構(gòu)域的非配體結(jié)合位點(diǎn)的信息導(dǎo)入計(jì)算機(jī)程序中，該信息包含由表1或者表2的給出坐標(biāo)的原子限定的或者如附圖9和10中定義的構(gòu)象，其中該程序顯示其三維結(jié)構(gòu)；(b)在計(jì)算機(jī)程序中建立測試化合物的三維結(jié)構(gòu)；(c)將測試化合物的模型疊加到整聯(lián)蛋白βA結(jié)構(gòu)域的非配體結(jié)合位點(diǎn)的模型上；和(d)評價(jià)測試化合物模型是否在空間上與非配體結(jié)合位點(diǎn)擬合。
5.權(quán)利要求4的方法，其中原子選自表1和表2中的那些原子。
6.用于鑒定候選整聯(lián)蛋白調(diào)節(jié)化合物的方法，該方法包含(a)生成非配體結(jié)合整聯(lián)蛋白的βA結(jié)構(gòu)域的鏈-F/α7環(huán)的βTD接觸區(qū)的三維結(jié)構(gòu)；(b)使用三維結(jié)構(gòu)來設(shè)計(jì)或者選擇候選整聯(lián)蛋白調(diào)節(jié)化合物，和(c)通過步驟(a)和(b)獲得的數(shù)據(jù)，鑒定所述候選整聯(lián)蛋白調(diào)節(jié)化合物。
7.權(quán)利要求6的方法，還包含(d)提供整聯(lián)蛋白調(diào)節(jié)化合物；和(e)通過將調(diào)節(jié)化合物與整聯(lián)蛋白接觸，確定整聯(lián)蛋白抑制劑結(jié)合整聯(lián)蛋白的能力。
8.用于鑒定候選整聯(lián)蛋白調(diào)節(jié)化合物的方法，該方法包含(a)表達(dá)含有βA結(jié)構(gòu)域和βTD結(jié)構(gòu)域的重組整聯(lián)蛋白片段；和(b)在篩選分析中，使用這兩種結(jié)構(gòu)域的蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì)相互作用來鑒定βA結(jié)構(gòu)域與βTD結(jié)構(gòu)域相互作用的調(diào)節(jié)物。
9.權(quán)利要求8的方法，還包含(c)提供整聯(lián)蛋白調(diào)節(jié)化合物；和(d)通過測量調(diào)節(jié)化合物與整聯(lián)蛋白的相互作用，確定整聯(lián)蛋白調(diào)節(jié)物結(jié)合整聯(lián)蛋白的能力；和(e)將調(diào)節(jié)化合物用作藥物設(shè)計(jì)的基礎(chǔ)。
10.抑制整聯(lián)蛋白活化的方法，該方法包含將一種化合物與整聯(lián)蛋白接觸，從而將整聯(lián)蛋白的βA結(jié)構(gòu)域結(jié)構(gòu)鎖定在不可活化的形式中。
11.權(quán)利要求10的方法，其中在與整聯(lián)蛋白相互作用中，所述化合物模擬鏈內(nèi)配體。
12.權(quán)利要求10的方法，其中鏈內(nèi)配體包含SEQ ID No1或其片段或者SEQ ID No.2或其片段的序列。
13.權(quán)利要求10的方法，其中鏈內(nèi)配體是抑制素家族成員。
14.鑒定整聯(lián)蛋白調(diào)節(jié)物的方法，包含(a)用表1或表2的或者如附圖9和10所定義的三維結(jié)構(gòu)坐標(biāo)，進(jìn)行合理藥物設(shè)計(jì)來選擇可能的抑制劑，其中結(jié)合計(jì)算機(jī)建模來進(jìn)行所述選擇；(b)將可能的抑制劑與整聯(lián)蛋白結(jié)構(gòu)域接觸；和(c)檢測可能的抑制物抑制整聯(lián)蛋白的能力。
15.權(quán)利要求14的方法。其中步驟(c)用配體結(jié)合分析來進(jìn)行。
16.權(quán)利要求14的方法。其中步驟(c)用基于細(xì)胞的分析來進(jìn)行。
17.權(quán)利要求16的方法，還包含(d)生成包含一種復(fù)合物的輔助晶體，該復(fù)合物由整聯(lián)蛋白結(jié)構(gòu)域與來自步驟(a)的第一種可能抑制劑形成，所述輔助晶體以大于4.0的分辨率有效地X-射線衍射復(fù)合物的原子坐標(biāo)；(e)確定所述輔助晶體的三維結(jié)構(gòu)；(f)用所述輔助晶體確定的三維結(jié)構(gòu)進(jìn)行合理藥物設(shè)計(jì)，選擇第二種可能的抑制劑，其中所述選擇結(jié)合計(jì)算機(jī)建模進(jìn)行；(g)將第二種可能的抑制劑與整聯(lián)蛋白結(jié)構(gòu)域接觸；和(h)檢測第二種可能抑制劑抑制整聯(lián)蛋白的能力。
18.通過權(quán)利要求3的方法鑒定的化合物，條件是該化合物不是洛伐他汀。
19.包含這種化合物和藥學(xué)上可接受的載體的藥物組合物。
20.用于調(diào)節(jié)、抑制或者刺激配體或者相關(guān)蛋白質(zhì)結(jié)合到整聯(lián)蛋白上的方法，通過改變整聯(lián)蛋白βA結(jié)構(gòu)域(βA)與β尾部結(jié)構(gòu)域(βTD)的相互作用。
21.權(quán)利要求20的方法，其中整聯(lián)蛋白選自αVβ1，αVβ3，αVβ5，αVβ6，αVβ8，α3β1，α4β1，α5β1，α6β1，α6β4，α7β1，α9β1，α4β7，gp3b3a，α1β1，α2β1，α10β1，α11β1，LFA-1，MAC-1，或者α150β95。
22.權(quán)利要求20的方法，其中βA與βTD的相互作用利用計(jì)算機(jī)方法或者生物化學(xué)方法或者生物物理學(xué)方法來研究。
23.權(quán)利要求20的方法，其中βA、βTD或者兩者都作為計(jì)算機(jī)方法或者生物化學(xué)方法或者生物物理學(xué)方法的結(jié)構(gòu)基礎(chǔ)。
24.用于評價(jià)化合物與分子或者分子復(fù)合物結(jié)合的能力的方法，所述分子或分子復(fù)合物包含整聯(lián)蛋白βA結(jié)構(gòu)域的非配體結(jié)合位點(diǎn)，該方法包含(a)構(gòu)建由結(jié)構(gòu)坐標(biāo)定義的結(jié)合位點(diǎn)的計(jì)算機(jī)模型，其中按照附圖9和10，表1或表2的氨基酸的結(jié)構(gòu)坐標(biāo)之間的均方根差不超過約4.0；(b)通過選自下組的方法，選擇將被評價(jià)的化合物(i)將分子片段組裝成化合物，(ii)從小分子數(shù)據(jù)庫中選擇一種化合物，(iii)從頭進(jìn)行配體設(shè)計(jì)的化合物，或(iv)改變蛋白質(zhì)激酶的一種已知抑制劑或其部分；(c)使用計(jì)算機(jī)手段，進(jìn)行將被評價(jià)的化合物的計(jì)算機(jī)模型與結(jié)合位點(diǎn)之間的擬合程序操作，以提供在結(jié)合位點(diǎn)上的化合物的能量最小化構(gòu)象；和(d)評價(jià)所述擬合操作的結(jié)果以量化所述化合物與所述結(jié)合位點(diǎn)之間的結(jié)合，從而評價(jià)所述化合物與所述結(jié)合位點(diǎn)的結(jié)合能力。
25.按照權(quán)利要求24的方法，其中結(jié)合位點(diǎn)進(jìn)一步通過按照附圖9和10確定的SEQ ID NO1-4中一個或多個氨基酸的結(jié)構(gòu)坐標(biāo)來定義。
26.按照權(quán)利要求24的方法，其中所述分子或者分子復(fù)合物通過按照附圖9和10的SEQ ID NO1-4的氨基酸的結(jié)構(gòu)坐標(biāo)設(shè)定來定義。
27.權(quán)利要求24的方法，其中均方根差不超過3.0。
28.權(quán)利要求24的方法，其中均方根差不超過2.5。
29.權(quán)利要求24的方法，其中均方根差不超過2.0。
30權(quán)利要求24的方法，其中均方根差不超過1.5。
31.用于鑒定整聯(lián)蛋白βA結(jié)構(gòu)域的非配體結(jié)合位點(diǎn)的活化劑或抑制劑的方法，該方法包含(a)構(gòu)建由結(jié)構(gòu)坐標(biāo)定義的結(jié)合位點(diǎn)的計(jì)算機(jī)模型，其中按照附圖9和10，表1或表2的氨基酸的結(jié)構(gòu)坐標(biāo)之間的均方根差不超過約4.0；(b)通過選自下組的方法，選擇作為可能的活化劑或者抑制劑的將被評價(jià)的化合物(i)將分子片段組裝成化合物，(ii)從小分子數(shù)據(jù)庫中選擇一種化合物，(iii)從頭進(jìn)行配體設(shè)計(jì)的化合物，或(iv)改變整聯(lián)蛋白的一種已知抑制劑或其部分；(c)使用計(jì)算機(jī)手段，進(jìn)行將被評價(jià)的化合物的計(jì)算機(jī)模型與結(jié)合位點(diǎn)之間的擬合程序操作，以提供在結(jié)合位點(diǎn)上的化合物的能量最小化構(gòu)象；(d)評價(jià)所述擬合操作的結(jié)果以量化所述化合物與所述結(jié)合位點(diǎn)之間的結(jié)合，從而評價(jià)所述化合物與所述結(jié)合位點(diǎn)的結(jié)合能力；(e)提供化合物；和(f)將所述化合物與所述分子接觸，確定該化合物活化或者抑制所述分子的能力。
32.按照權(quán)利要求31的方法，其中結(jié)合位點(diǎn)進(jìn)一步通過按照附圖9和10確定的SEQ ID NO1-4中一個或多個氨基酸的結(jié)構(gòu)坐標(biāo)來定義。
33.按照權(quán)利要求31的方法，其中所述分子或者分子復(fù)合物通過按照附圖9和10確定的SEQ ID NO1-4的氨基酸的結(jié)構(gòu)坐標(biāo)設(shè)定來定義。
34.權(quán)利要求31的方法，其中均方根差不超過3.0。
35.權(quán)利要求31的方法，其中均方根差不超過2.5。
36.權(quán)利要求24的方法，其中均方根差不超過2.0。
37.權(quán)利要求24的方法，其中均方根差不超過1.5。
全文摘要
在此描述的方法提供調(diào)節(jié)尤其是抑制整聯(lián)蛋白活化的途經(jīng)。該方法包括鑒定結(jié)合到整聯(lián)蛋白的βA結(jié)構(gòu)域上從而模擬CD環(huán)與βA結(jié)構(gòu)域之間的接觸的化合物，例如天然存在的和非天然存在的多肽和小分子。以這種方式接觸βA結(jié)構(gòu)域鎖定了整聯(lián)蛋白，使得整聯(lián)蛋白不能被激活。
文檔編號G01N33/48GK101084509SQ200480008570
公開日2007年12月5日 申請日期2004年1月30日 優(yōu)先權(quán)日2003年1月30日
發(fā)明者M·阿明·阿內(nèi)奧特, 西洛·斯特爾, 西蒙·戈德曼 申請人:通用醫(yī)療公司, 默克專利有限責(zé)任公司