專利名稱：巨噬細胞刺激蛋白質(zhì)受體(ron)的抑制及其治療方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及用于抑制人巨噬細胞-刺激蛋白質(zhì)受體(“Macrophage-Stimulating Protein Receptor,MSPR"^"R0N"(receptord'origine nantais))的方法和組合物。本發(fā) 明還提供了用于治療哺乳動物中腫瘤和其他疾病的方法，其包括施用抑制RON活化的RON 特異性抗體或抗體片段。
背景技術(shù)：
巨噬細胞-刺激蛋白質(zhì)受體在下文也稱為“R0N”，其屬于受體酪氨酸激酶的c-met 家族。RON是由細胞外α鏈和跨膜β鏈構(gòu)成的異二聚化蛋白質(zhì)。RON首先表達為單鏈前 體，然后切割為α和β鏈(1)。認為β鏈是其配體，巨噬細胞-刺激蛋白質(zhì)(“MSP”;a/ k/a HGF-樣蛋白質(zhì))與所述受體結(jié)合所必需的，MSP的2和3的三環(huán)域是R0N/MSP相互作 用必需的。參見美國專利公開No. 2003/0073656。認為RON的細胞外結(jié)構(gòu)域與c-met家族 受體的對應(yīng)結(jié)構(gòu)域幾乎沒有同源性。事實上，激活c-met家族中其他受體的肝細胞生長因 子(“HGF”)與RON受體的結(jié)合不刺激酪氨酸激酶活性(W0 02/083,047)。認為RON在腫瘤的細胞遷移、形狀改變和組織侵襲中具有作用(1)。但是，早先的 公開報道了 RON對誘導(dǎo)轉(zhuǎn)化的有限作用，但是記載了 RON活化對侵襲性生長的促進(16)。突變、缺失、基因重排和選擇性mRNA剪接可造成在沒有任何配體結(jié)合的情況下的 RON活化(1)。RON的酪氨酸激酶結(jié)構(gòu)域中的變化可能在RON的活化中起到重要作用(1)。 從多種癌細胞系中克隆RON顯示由于編碼RON的mRNA中多種缺陷導(dǎo)致的RON活化。MSP是三環(huán)域纖溶酶原-相關(guān)蛋白質(zhì)家族的成員(1)。如其名字所暗示的，MSP最 初發(fā)現(xiàn)通過多種方式激活巨噬細胞(綜述參見2，3)。例如，將MSP添加到某些RON表達巨 噬細胞，則誘導(dǎo)形狀改變、趨化作用、大胞飲、吞噬作用以及免疫介體產(chǎn)生(4，5，6)。還發(fā)現(xiàn) RON在上皮細胞中表達，例如角質(zhì)形成細胞，其中MSP顯示磷酸化RON并活化多個信號發(fā)放 通路，其引起細胞粘附/運動、抗凋亡和增殖性應(yīng)答(7，8)。在最近幾年中，已經(jīng)在多種上皮 細胞瘤和細胞系(例如，結(jié)腸(9，10，11)，肺(12)，乳腺(13))中觀察到RON過表達。在最 近的研究中，在經(jīng)改造其肺中過表達RON的轉(zhuǎn)基因小鼠中產(chǎn)生肺腫瘤(14，15)。RON在多種人癌細胞系中表達。在許多這些癌細胞系中，RON的抗體可抑制受體 (磷酸化的RON)的活化以及下游信號發(fā)放分子的活化磷酸化MAPK和磷酸化AKT。下文舉 例的抗RON抗體(R0N6和R0N8)都顯示顯著阻礙了多種癌來源細胞系(HT-29結(jié)腸，H-292 肺，BxPC3胰腺，JIMT-I乳腺)在注射到裸鼠中時形成腫瘤的能力。這證實了 RON受體酪氨 酸激酶的抑制消極地影響這些癌細胞的增殖，強調(diào)了抑制RON在例如結(jié)腸癌、肺癌、胰腺癌 和乳腺癌中的應(yīng)用。使用常規(guī)蛋白質(zhì)印跡和流式細胞術(shù)方法，RON顯示在許多來自多種癌癥的人細胞系中表達結(jié)腸(HT-29、Colo205、HCT-116、DLD-I、Sw480、Sw620)、胰腺(BXPC-3、 CAPAN-2、ASPC-I、HPAF-II、L3. 7pl#7、Hs766T)、前列腺(DU_145、PC_3)、胃(AGS、NCI_N87)、 肺(A549、H596)、肝臟(HepG2, SNU-182)以及乳腺(JIMT1，DU4475，AU565)。本領(lǐng)域中對基于包括特異性RON表位在內(nèi)的RON靶標開發(fā)多種疾病特別是癌癥的 治療有著持續(xù)的需要。

發(fā)明內(nèi)容
因此，本發(fā)明提供了抗RON抗體，相比之前可得到的抗RON抗體，已知其具有基本上更高特異性的結(jié)合?？煞蛛x和/或純化所述抗體。本發(fā)明的抗體可用于結(jié)合RON，不論 是由人群中通常存在的野生型RON等位基因編碼的，還是變體RON蛋白質(zhì)，例如具有小的變 化或突變但是保留RON活性的那些。在一個實施方案中，本發(fā)明的抗體是RON特異性的，并 且具有約IXliT9M-1或更低的Kd(即抗原與抗體解離的平衡常數(shù))。在另一些實施方案中， 本發(fā)明純化的抗體顯示約IX ICTkT1或者約IX IiT11M-1或者更低的Kd。在另一些實施方案 中，本發(fā)明的抗體或其功能性片段本質(zhì)上完全是人的。本發(fā)明提供了例如特異性結(jié)合RON蛋白質(zhì)的抗體，所述蛋白質(zhì)包含來自于一種或 多種選自下列的抗體可變結(jié)構(gòu)域的互補決定區(qū)(CDR) :R0N6 VH,R0N6 VL,R0N8 VH,R0N8 VL 及其組合，其中 R0N6 VHCDR 是 SEQ ID NO 17, SEQ ID N0:19 禾口 SEQ ID NO 21 ；R0N6 VL CDR 是 SEQ ID NO 23, SEQ ID N0:25 禾口 SEQ ID NO 27 ；R0N8 VH CDR 是 SEQ ID NO 29, SEQ ID NO 31 和 SEQ ID NO 33 ；以及 R0N8 VL CDR 是 SEQ ID NO :35，SEQ ID NO 37 和 SEQ ID N0:39。所包含的可變結(jié)構(gòu)域中的每一個可貢獻三個CDR。所述抗體可以是例如單克隆抗 體、單鏈、Fab、Fv、雙抗體(diabody)或三抗體(triabody)。在一些實施方案中，所述抗體可包含來自于選自R0N6 VH、R0N6VL、R0N8 VH、R0N8 VL及其組合的至少兩個抗體可變結(jié)構(gòu)域的⑶R。更優(yōu)選地，本發(fā)明的抗體包含來自于選自 R0N6 VH、R0N6 VL、R0N8VH、R0N8 VL及其組合的至少三種抗體可變結(jié)構(gòu)域的CDR。在一些 實施方案中，所述抗體是R0N6或R0N8。本發(fā)明還提供了編碼所述抗體的分離的核酸，以及包含有效連接一個或多個調(diào)控 序列的所述核酸的重組載體，所述調(diào)控序列允許所述核酸在所選宿主細胞中表達。還提供 了包含所述重組載體的宿主細胞。本發(fā)明還提供了產(chǎn)生本發(fā)明RON抗體的方法，其包括在允許所述抗體表達的情況 下培養(yǎng)宿主細胞，以及任選地純化所產(chǎn)生的抗體。本發(fā)明還提供了包含本發(fā)明抗體以及可藥用載體的藥物組合物。所述藥物組合物 還可包含一種或多種其他治療有效物質(zhì)。本文計劃包含本發(fā)明RON抗體的試劑盒，其中所述RON抗體單獨或者與其他物質(zhì) (例如化療劑)組合。還提供了使用本發(fā)明抗體的方法，其包括，例如治療癌癥、抑制血管發(fā)生、腫瘤生 長、表達RON的腫瘤細胞的遷移、增殖或侵襲的方法，其包括向哺乳動物施用有效量的本發(fā) 明抗體或其片段以抑制RON的活化。所述腫瘤細胞是例如來源于結(jié)腸、胰腺、前列腺、胃、 肺、肝臟、卵巢、腎、乳腺和腦或者上皮或神經(jīng)內(nèi)分泌來源的腫瘤細胞。本發(fā)明的方法還包括與抗體一起施用其他物質(zhì)，例如小有機分子，其中所述其他物質(zhì)可包括但不限于化療劑、抗血管發(fā)生物質(zhì)或者抑制RON活化的物質(zhì)。任選地，所述抗體可以與所述其他物質(zhì)綴合，例如與小有機分子。本發(fā)明抗體可以與至少一種其他抗癌治療一起施用，例如抗血管發(fā)生劑、FGFR3拮 抗劑、化療劑、放射線、抗腫瘤形成劑，小分子或其他抗體。例如，本發(fā)明抗體可以與至少一 種抑制腫瘤的另外的抗體一起施用，例如抗EGFR抗體，例如ErbitUX (Imclone Systems, Inc. NY, NY)。本發(fā)明的抗體可靶向或結(jié)合野生型RON或者變體RON。本發(fā)明的方法還包括檢測樣品中RON的方法，其包括將所述樣品與本發(fā)明的抗體 相接觸，以獲得特異性結(jié)合，以及檢測此結(jié)合。本發(fā)明還提供了在需要的哺乳動物中預(yù)防或治療炎癥的方法，其包括將有效量的 本發(fā)明抗體施用給哺乳動物。本發(fā)明還提供了在需要的哺乳動物中預(yù)防或治療疾病的方法，例如肝臟、膽道、膽 管和膽囊疾病，其包括將有效量的本發(fā)明抗體施用給哺乳動物。本發(fā)明還提供了在需要的哺乳動物中抑制R0N、MAPK和/或Akt磷酸化的方法，其 包括將有效量的本發(fā)明抗體施用給哺乳動物。關(guān)于上述方法，在一些實施方案中，本發(fā)明抗體或其片段可以約1至約10mg/kg的 劑量施用給哺乳動物。在另一些實施方案中，所述抗體或其片段可以約3至約8mg/kg的劑 量施用。附圖簡述圖 IA 顯示了 R0N6 VH 區(qū)的 DNA(SEQ ID NO 1)和翻譯的序列(SEQID N0:2)，其 CDR以單下劃線顯示。圖 IB 顯示了 R0N6 VL 區(qū)的 DNA(SEQ ID NO :3)和翻譯的序列(SEQID N0:4)，其 CDR以單下劃線顯示。圖 IC 顯示了 R0N8 VH 區(qū)的 DNA(SEQ ID NO :5)和翻譯的序列(SEQID N0:6)，其 CDR以單下劃線顯示。圖 ID 顯示了 R0N8 VL 區(qū)的 DNA(SEQ ID NO :7)和翻譯的序列(SEQID N0:8)，其 CDR以單下劃線顯示。圖2A，2B和2C，共同顯示完整的R0N6-H(人IgGl亞類I)DNA(SEQID NO :9)和氨 基酸序列(SEQ ID N0:10)。分泌信號序列f翔娘、；可變區(qū)(雙下劃線,除了 CDR結(jié)構(gòu)域
之外)；⑶R結(jié)構(gòu)域(單下劃線)；Y恒定區(qū)(未修飾)。星號Γ)表示終止密碼子。圖2D-2E共同顯示完整的R0N6-L (人κ輕鏈亞類III)，DNA (SEQ ID NO 11)和氨
基酸序列(SEQ ID N0:12)。R0N6-L分泌信號序列；可變區(qū)(雙下劃線,除了 CDR 結(jié)構(gòu)域之外):CDR(單下劃線)；κ恒定區(qū)(未修飾)。圖3A-3C共同顯示完整的R0N8-H DNA (SEQ ID NO 13)和氨基酸序列(SEQ ID NO 14)。分泌信號序列；具有CDR結(jié)構(gòu)域(單下劃線)的可變區(qū)(雙下劃線Y恒 定區(qū)(未修飾)。星號Γ)表示終止密碼子。圖 3D-3E 顯示完整的 R0N8-L DNA (SEQ ID N0:15)和氨基酸序列(SEQ ID N0:16)。 分泌信號序列可變區(qū)(雙下戈〗線,除了 CDR結(jié)構(gòu)域之外)，CDR(單下劃線)；K恒定區(qū)(來修飾)。星號Γ)表示終止密碼子。
圖4Α和4Β顯示在Η-292小鼠異種移植模型中在施用抗RON抗體R0N6 (FIG. 4A) 和R0N8(FIG. 4B)之后腫瘤大小相對于時間的圖。該圖顯示在小鼠異種移植系統(tǒng)中R0N6和 R0N8抗體抑制H-292腫瘤細胞的生長。圖4C和4D顯示在HT-29小鼠異種移植模型中腫瘤大小相對于時間的圖。該圖顯 示在小鼠異種移植系統(tǒng)中R0N6(圖4C)和R0N8(圖4C)抗體抑制HT-29腫瘤細胞的生長。圖4E顯示在BxPC3小鼠異種移植模型中使用單獨R0N8抗體、R0N8抗體加 Erbitux (ERB)，單獨Erbitux 以及Erbitux 與對照IgGOmigG抗體)的組合的腫 瘤大小相對于時間的圖。該圖顯示在小鼠異種移植系統(tǒng)中單獨的R0N8抗體(圖4E)抑制 BXPC3腫瘤細胞的生長。該圖還顯示與Erbitux 組合時，有腫瘤壓制或抑制的傾向。圖4F顯示R0N8抗體在裸鼠中抑制乳腺癌異種移植物的生長。將JIMT-I乳腺癌 細胞皮下注射到裸鼠體內(nèi)，使之生長至約250mm3。在使用對照(鹽水)、R0N8抗體(60mg/ kg, 2x/周)，或者多西他賽或者多西他賽+R0N8抗體的組合治療過程中對R0N8腫瘤體積作 圖。圖5A，5B和5C顯示蛋白質(zhì)印跡，其證實了抗RON抗體R0N6和R0N8對MSP誘導(dǎo)磷 酸化的抑制。分別證實R0N6和R0N8抗體抑制RON受體的MSP依賴性活化以及RON受體下游的 信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路的活化。對于圖5A，使NIH3T3-R0N細胞饑餓過夜，用所示抗體濃度處理2小 時，然后用IOnM MSP激活10分鐘。激活之后，裂解細胞，通過SDS-PAGE分離總細胞裂解物， 用所示抗體進行檢測。對于圖5B，使H-292細胞饑餓過夜，用所示抗體濃度處理2小時，然 后用IOnM MSP激活10分鐘。激活之后，裂解細胞，通過SDS-PAGE分離總細胞裂解物，用所 示抗體進行檢測。對于圖5C，使HT-29細胞饑餓過夜，用所示抗體濃度處理2小時，然后用 IOnM MSP激活10分鐘。激活之后，裂解細胞，通過SDS-PAGE分離總細胞裂解物，用所示抗 體進行檢測。圖6A顯示R0N8抗體的固相阻斷特征。使用ELISA來確定阻斷重組人RON蛋白質(zhì) 與固定化重組人MSP相互作用所需的R0N8抗體的IC50值。圖6B顯示R0N8抗體抑制H596肺癌細胞遷移的能力。圖6C顯示在BXPC3胰腺癌細胞中R0N8抗體對MSP誘導(dǎo)的DNA合成的抑制。圖6C⑴顯示測量DNA合成的[3H]胸苷摻入的MSP激活。圖6C(2)顯示其中在加入MSP之前用R0N8抗體將細胞預(yù)處理1小時的體系。發(fā)明詳述本發(fā)明提供了具有用途的抗RON抗體，所述用途例如在診斷目的的用于檢測RON 蛋白質(zhì)的測定中，以及在治療的目的的抑制RON活性的方法中。另外，本發(fā)明抗RON抗體可 以以治療有效量(例如有效抑制任何和所有表達RON腫瘤細胞生長、增殖、轉(zhuǎn)移活性(即遷 移和/或侵襲)的量)施用給動物，例如哺乳動物如人。本發(fā)明還提供包含所公開的抗RON 抗體或其片段的藥物組合物。另外，本發(fā)明提供了結(jié)合人RON受體酪氨酸激酶的完全人抗 體。這些抗體包括但是不局限于舉例的R0N6和R0N8以及其活性或功能性片段和衍生物。為清楚說明起見，應(yīng)理解將靶標蛋白質(zhì)稱為R0N，如上文背景技術(shù)部分所詳細提供 的，本文中舉例的優(yōu)選抗RON抗體分別稱為“R0N6”和“R0N8”。使用篩選過程，從數(shù)百個候選抗RON抗體中選擇本發(fā)明的抗RON抗體。如下文實施例中詳細描述地，相對于之前可得到的抗RON抗體，本發(fā)明的抗體顯示出出人意料地期望的RON結(jié)合特征。特別是，新型R0N6 和R0N8抗體具有比之前從噬菌體文庫系統(tǒng)中產(chǎn)生的人抗RON抗體RONl高100倍的RON受 體親和性。特別地，R0N6和R0N8分別以4. 1 X ICT11和3. 2 X IiT11M的Kd結(jié)合RON,而RONl 以7. 7X IO-9M的Kd結(jié)合RON。RONl是本領(lǐng)域已知抗體的目前名稱，其描述于國際專利申請 No. W02005120557，其通過參考并入本文。如本文所提及的，用于本發(fā)明方法的本文所公開的CDR序列信息可以“來自于”， 即基于、產(chǎn)生于或者來源于任何和所有可能的抗體可變結(jié)構(gòu)域來源的序列信息，其可包括 野生型或變體形式以及根據(jù)本領(lǐng)域技術(shù)人員熟悉的方法天然或合成產(chǎn)生的。除非另作說明，本文所指的“腫瘤”一般性旨在包括癌癥，以及惡性和非惡性疾病。 如本文所設(shè)想的，惡性腫瘤包括原發(fā)和繼發(fā)性腫瘤。原發(fā)腫瘤直接在其所發(fā)現(xiàn)的組織中出 現(xiàn)。繼發(fā)性腫瘤或者轉(zhuǎn)移是在身體中別處起源但是目前擴散到遠端器官的腫瘤。轉(zhuǎn)移的一 般途徑是直接生長進入鄰近結(jié)構(gòu)，通過血液或淋巴系統(tǒng)擴散，以及沿著組織平面和身體空 間(腹水、腦脊液等)行進?？砂ㄔ诳赡苁褂帽景l(fā)明方法治療的具體癌癥或惡性腫瘤類型(原發(fā)或繼發(fā)) 包括但不限于白血病、乳腺癌、皮膚癌、骨癌、前列腺癌、肝癌、肺癌、腦癌、喉癌、膽囊癌、胰 腺癌、直腸癌、甲狀旁腺癌、甲狀腺癌、腎上腺癌、神經(jīng)組織癌、頭頸癌、結(jié)腸癌、胃癌、支氣管 癌、腎基底細胞癌、潰瘍型和乳突型鱗狀細胞癌、轉(zhuǎn)移性皮膚癌、骨瘤、尤因肉瘤、網(wǎng)狀細胞 肉瘤、骨髓瘤、巨細胞瘤、小細胞肺癌、非小細胞肺癌、膽結(jié)石、胰島細胞瘤、原發(fā)性腦瘤、急 性和慢性淋巴細胞和粒細胞癌、毛狀細胞癌、腺瘤、增生、髓樣癌、嗜鉻細胞瘤、粘膜神經(jīng)瘤、 腸神經(jīng)節(jié)瘤、增生性角膜神經(jīng)癌、馬方樣體型腫瘤(marfanoid habitus tumor)、胚胎性癌 肉瘤(Wilm' s tumor)、精原細胞瘤、卵巢腫瘤、平滑肌瘤、子宮頸非典型增生和原位惡性腫 瘤、神經(jīng)母細胞瘤、視網(wǎng)膜母細胞瘤、軟組織軟組織肉瘤、惡性類癌瘤、局部的皮膚損傷、蕈 樣霉菌病、橫紋肌肉瘤、皮膚多發(fā)性出血性肉瘤、成骨性及其他肉瘤、惡性高血鈣癥、腎細胞 瘤、真性紅細胞增多癥、腺癌、多形性膠質(zhì)母細胞瘤、淋巴瘤、惡性黑色素瘤、表皮樣癌以及 其他惡性腫瘤和肉瘤。為清楚起見，還規(guī)定在描述中為方便起見使用單數(shù)術(shù)語不以任何方式作為這樣的 限制。因此，例如，提及“抗體”或“腫瘤”包括一個或多個這樣的抗體或腫瘤。除非另作說 明，復(fù)數(shù)術(shù)語的使用也不作為限制。本發(fā)明的RON特異性抗體或其片段中和RON受體的活化。如本文所使用的，中和 受體表示使所述受體的固有激酶活性滅活以傳導(dǎo)信號。對RON中和的可靠測定是受體磷酸 化的抑制。本發(fā)明不受到任何特定RON中和機制的限制。例如這些中和可通過抗體阻斷某些 表位與配體的接近來進行，或者通過以特定方式改變RON的構(gòu)象來進行，其中所述配體特 別是MSP即使可結(jié)合所述受體，也不能活化所述受體。USP 6，165，464列出了此類中和的多 種可能機制，包括抗體與配體本身結(jié)合，抗體下調(diào)所述受體，抗體抑制所述受體的酪氨酸激 酶活性，或者抗體引起細胞毒性應(yīng)答。在表達RON特別是過表達(包括差異表達)RON的細 胞其表面RON受體酪氨酸激酶數(shù)目降低時，可發(fā)生下調(diào)。因此，中和具有多種作用，包括抑 制、減少、滅活和/或破壞生長(增殖和分化)、血管發(fā)生(血管募集、侵入和轉(zhuǎn)移)以及細胞運動性和轉(zhuǎn)移(細胞粘附和侵入性)。通過抗RON抗體進行的RON的中和還可包括在沒有配體結(jié)合時有活性或者結(jié)合配體并且并不因此而滅活的變體RON受體酪氨酸激酶的中和。因此，RON中和可包括野生型 和/或變體R0N(點突變、缺失、選擇性剪接等)的中和。如本文使用的，術(shù)語RON的“變體”任選地包括比野生型RON短或長的RON蛋白質(zhì)， 任選地包括含有氨基酸取代的類似物。RON變體還可由選擇性mRNA剪接或者啟示和/或一 個或多個點突變產(chǎn)生?？筊ON抗體對RON中和程度的一種可用度量是所述受體酪氨酸激酶活性的抑制。 酪氨酸激酶抑制可以使用公知的方法來確定；例如，通過測定重組激酶受體的自磷酸化水 平，和/或天然或合成底物的磷酸化。因此，在本發(fā)明背景中磷酸化測定可用于測定中和 抗體。例如，可在ELISA測定中或者蛋白質(zhì)印跡中使用磷酸化酪氨酸特異性的抗體檢測磷 酸化。用于酪氨酸激酶活性的一些測定描述于Panek等人，J. Pharmacol. Exp. Thera. 283 1433-44 (1997)和 Batley 等人，Life Sci. 62 143-50 (1998)。RON中和的另一種度量是RON下游底物的磷酸化的抑制。因此，例如可測量MAPK 或Akt的磷酸化水平。天然抗體通常具有兩個相同的重鏈和兩個相同的輕鏈，每個輕鏈通過鏈間二硫鍵 與重鏈相連，多個二硫鍵進一步將兩條重鏈彼此連接。各個鏈可折疊成具有類似尺寸的結(jié) 構(gòu)域(110-125個氨基酸)和結(jié)構(gòu)，但是具有不同功能。輕鏈可包含一個可變結(jié)構(gòu)域(VL) 和/或一個恒定結(jié)構(gòu)域(CL)。重鏈也可包含一個可變結(jié)構(gòu)域(VH)和/或根據(jù)抗體的類別 或同種型，三個或四個恒定結(jié)構(gòu)域(CH1、CH2、CH3和CH4)。在人中，所述同種型是IgA、IgD、 IgE、IgG和IgM, IgA和IgG進一步又分為亞類或亞型(IgAl-2和IgG 1-4)。通常，所述可變結(jié)構(gòu)域在不同抗體之間顯示相當多的氨基酸順序可變性，特別是 在抗原結(jié)合位點處。在每個VL和VH中發(fā)現(xiàn)稱為高可變區(qū)或者互補決定區(qū)(CDR)的三個區(qū) 域，其由稱為骨架可變區(qū)的較少可變的區(qū)域所組成(support)。如示例本發(fā)明抗體包括IgG單克隆抗體。還設(shè)想根據(jù)本發(fā)明的“抗體”可包括抗 體片段或經(jīng)改造的形式。例如，這些是Fv片段，或者為了提供替代性結(jié)構(gòu)形式的新發(fā)明抗 體優(yōu)點，其中舉例抗體的CDR和/或可變結(jié)構(gòu)域改造為單鏈抗原結(jié)合蛋白，雙抗體和/或三 抗體的蛋白質(zhì)。簡言之，由VL和VH結(jié)構(gòu)域組成的抗體的部分稱為Fv(可變片段(Fragment variable))并構(gòu)成抗原結(jié)合部位。單鏈Fv(scFv或SCA)是在一個多肽鏈上含有VL結(jié)構(gòu) 域和VH結(jié)構(gòu)域的抗體片段，其中一個結(jié)構(gòu)域的N端和另一個結(jié)構(gòu)域的C端通過柔性接頭相 連(參見,例如美國專利 No. 4，946，778 (Ladner 等人，)；WO 88/09344，(Huston 等人)。WO 92/01047 (McCafferty等人)描述了 scFv片段在可溶性重組遺傳展示包裝表面上的展示， 比如噬菌體。用于產(chǎn)生單鏈抗體的肽接頭可以是柔性肽，其選擇確保VL和VH結(jié)構(gòu)域發(fā)生正確 的三維折疊。所述接頭一般為10至50個氨基酸殘基。優(yōu)選地，所述接頭為10至30個氨 基酸殘基。更優(yōu)選地，所述接頭為12至30個氨基酸殘基。最優(yōu)選的是15至25氨基酸殘 基的接頭。這些接頭肽的實例包括四個甘氨酸的重復(fù)之后是絲氨酸。單鏈抗體缺少其所來源的整個抗體的一些或所有恒定結(jié)構(gòu)域。因此，它們可避免與使用整個抗體相關(guān)的一些問題。例如，單鏈抗體傾向于沒有重鏈恒定區(qū)與其他生物分子 之間某些非預(yù)期的相互作用。另外，單鏈抗體顯著地小于整個抗體，并且可具有比整個抗體 更強的滲透性，允許單鏈抗體更有效地定位并結(jié)合到靶標抗原結(jié)合位點。此外，單鏈抗體相 對小的尺寸使得它們相比于整個抗體更不容易在接受者中引起非預(yù)期的免疫應(yīng)答。
可通過至少一個或多個肽接頭共價連接多個單鏈抗體，形成可以為單特異性或多 特異性的多價單鏈抗體，每個單鏈具有通過第一肽接頭共價連接的一個VH和一個VL結(jié)構(gòu) 域。多價單鏈抗體的每個鏈包括可變輕鏈片段和可變重鏈片段，其通過肽接頭與至少一個 其他鏈相連。肽接頭由至少十五個氨基酸殘基構(gòu)成。氨基酸殘基的最大個數(shù)約為一百。兩個單鏈抗體可以組合形成雙抗體，也稱為二價二聚體。雙抗體具有兩條鏈和兩 個結(jié)合位點，可以是單特異性或雙特異性。雙抗體的每條鏈都包括與VL結(jié)構(gòu)域相連的VH 結(jié)構(gòu)域。所述結(jié)構(gòu)域與接頭相連，所述接頭短到足以防止相同鏈上的結(jié)構(gòu)域配對，因此驅(qū)動 不同鏈上的互補結(jié)構(gòu)域之間的配對，產(chǎn)生兩個抗原結(jié)合位點。簡單地舉例來說，根據(jù)本發(fā)明 的雙抗體可以是雙特異性的，其包含R0N6和R0N8結(jié)合結(jié)構(gòu)域。三個單鏈抗體可以組合形成三抗體，也稱為三價的二聚體。使用VL或VH結(jié)構(gòu)域 的氨基端直接與VL或VH結(jié)構(gòu)域的羧基端相融合來構(gòu)建三抗體，即沒有任何接頭序列。所 述三抗體具有三個Fv頭，其多肽以環(huán)狀頭尾相連形式排列。所述三抗體的可能構(gòu)象是平面 的，其具有三個位于平面上彼此成120度角度的結(jié)合位點。三抗體可以是單特異性、雙特異 性或三特異性的。Fab (抗原結(jié)合片段(抗原結(jié)合段))指由VL、CL、VH、CH1結(jié)構(gòu)域組成的抗體片段。 在簡單地用木瓜蛋白酶消化后產(chǎn)生的這些被稱為Fab，其沒有保留重鏈絞鏈區(qū)。在用胃蛋白 酶消化后，產(chǎn)生保留重鏈鉸鏈的多個Fab。具有完整鏈間二硫鍵的片段被稱為F(ab' )2，而 在不保留二硫鍵時得到單鏈Fab'。F(ab' ) 2片段具有比單價Fab片段更高的抗體親抗原 性。Fc (結(jié)晶片段)是包含成對重鏈恒定結(jié)構(gòu)域的抗體部分或片段的名稱。在IgG抗 體中，例如，F(xiàn)c包含CH2和CH3結(jié)構(gòu)域。IgA或IgM抗體的Fc還包含CH4結(jié)構(gòu)域。Fc與Fc 受體結(jié)合、補體介導(dǎo)的細胞毒作用和抗體依賴性細胞毒作用(ADCC)的活化相關(guān)聯(lián)。對于作 為多個IgG樣蛋白質(zhì)復(fù)合物的例如IgA和IgM的抗體，復(fù)合物形成需要Fc恒定結(jié)構(gòu)域。最后，絞鏈區(qū)將抗體的Fab和Fc部分分開，提供了 Fab彼此之間以及相對于Fc的 可動性，以及包括多個二硫鍵用以兩個重鏈的共價連接。因此，RON特異性抗體包括但不限于天然抗體及其片段。這些片段包括，簡單地 舉例來說，特異性結(jié)合RON的二價片段例如(FaV) 2，單價片段例如Fab，單鏈抗體，單鏈 Fv (seFv)，單結(jié)構(gòu)域抗體。優(yōu)選地，這些片段包括本文所舉例的R0N6和/或R0N8抗體的一 個或多個CDR。根據(jù)本發(fā)明的抗體定義任選地還包括特異性結(jié)合RON的經(jīng)改造抗體，例如特 異性結(jié)合所述抗原的多價單鏈抗體、雙抗體、三抗體等。優(yōu)選地，這些多價經(jīng)改造抗體包括 本文所舉例的R0N6和/或R0N8抗體的一個或多個CDR。本發(fā)明抗體的每個結(jié)構(gòu)域可以是具有重鏈或輕鏈可變結(jié)構(gòu)域的完整抗體，或者可 以是功能上相同的或者天然結(jié)構(gòu)域的突變體或衍生物，或者構(gòu)建的合成結(jié)構(gòu)域，例如體外 使用例如WO 93/11236 (Griffiths等人)所述的技術(shù)構(gòu)建。例如，可能將缺少至少一個氨 基酸的對應(yīng)于抗體可變結(jié)構(gòu)域的結(jié)構(gòu)域連接在一起。重要特征性特點是每個結(jié)構(gòu)域與互補結(jié)構(gòu)域相關(guān)聯(lián)形成抗原結(jié)合位點的能力。因此，術(shù)語可變重鏈和輕鏈片段不應(yīng)解釋為排除不具有對特異性有作用的物質(zhì)的變體。如本文所使用的，術(shù)語“抗體”和“抗體片段”包括保留RON受體特異性的修飾。這 些修飾包括但不限于，與效應(yīng)分子比如化療劑(例如順鉬、紫杉醇(taxol)、多柔比星)或細 胞毒素(例如蛋白質(zhì)或非蛋白質(zhì)有機化療劑)綴合。所述抗體可以通過與可檢出報告物部 分綴合而修飾。還包括具有下述改變的抗體，所述改變影響了非結(jié)合特征比如半衰期(例 如與聚乙二醇聚合物綴合)。蛋白質(zhì)和非蛋白質(zhì)物質(zhì)可以通過本領(lǐng)域已知的方法與所述抗體綴合。綴合方法 包括直接連接、通過共價連接的接頭進行連接，以及特異性結(jié)合對成員(例如親和素_生 物素)。這些方法包括，例如，Greenfield 等人，Cancer Research 50，6600-6607 (1990) 所描述的針對多柔比星的綴合，以及Arnon等人，Adv. Exp. Med. Biol. 303，79-90 (1991)和 Kiseleva等人，MolBiol. (USSR) 25，508-514 (1991)所描述的針對鉬化合物的綴合。抗體“特異性”指抗體選擇性識別抗原的特定表位。術(shù)語“表位”包括能夠特異性 結(jié)合免疫球蛋白或T細胞受體或者與分子相互作用的任何蛋白質(zhì)決定簇。表位決定簇一般 由化學活性表面分子組組成，所述分子例如氨基酸或糖類或糖側(cè)鏈，其一般具有特異性三 維結(jié)構(gòu)特征以及特異性電荷特征。表位可以是“線性的”或“構(gòu)象的”。在線性表位中，所述 蛋白質(zhì)與所述相互作用分子(比如抗體)之間所有相互作用點沿著蛋白質(zhì)的一級氨基酸序 列線性出現(xiàn)。在構(gòu)象表位中，相互作用點沿著彼此分離的蛋白質(zhì)上的氨基酸殘基出現(xiàn)，即蛋 白質(zhì)的三級折疊并列的非鄰接氨基酸。鄰接氨基酸形成的表位通常保持與變性溶劑接觸， 而三級折疊形成的表位通常對變性溶劑的處理不起作用。在獨特空間構(gòu)象中表位通常包括至少3個，更通常至少5或8-10個氨基酸。可以 在簡單的免疫測定中驗證識別相同表位的抗體，其顯示一種抗體阻斷另一種抗體結(jié)合靶抗 原的能力。一旦確定了抗原上的所需表位，就可能產(chǎn)生針對該表位的抗體，例如使用本發(fā)明 所述的方法。作為替代地，在發(fā)現(xiàn)過程中，抗體的產(chǎn)生和表征可闡明與預(yù)期表位有關(guān)的信 息。從該信息出發(fā)，可能競爭性地篩選結(jié)合相同表位的抗體。實現(xiàn)此目的的一種方法是進 行交叉競爭研究，以尋找彼此競爭性結(jié)合的抗體，例如競爭結(jié)合所述抗原的抗體。表位作圖和相關(guān)技術(shù)為了篩選結(jié)合特定表位(例如阻斷IgE與其高親和力受體結(jié)合的那些)的 抗體，可進行常規(guī)的交叉阻斷測定，例如Harlow and Lane, ANTIBODIES (1990) Cold Spring Harbor Laboratory Press中所記載的。其他方法包括丙氨酸掃描突變體，肽 印跡(Reineke，2004Methods Mol Biol248 :443_63)(通過參考以整體并入本文)或 者肽切割分析。另外，可利用比如表位切除、表位提取和抗原化學修飾的方法(Tomer， 2000ProteinScience 9 :487_496，其通過引用以整體并入本文)。功能性分析修飾輔助特征分析(Modification-Assisted Profiling，MAP)，也稱為基于抗原 結(jié)構(gòu)的抗體特征分析(Antigen Structure-based AntibodyProfiling, ASAP)是根據(jù)每 種抗體對化學或酶修飾的抗原表面的結(jié)合特征相似性，對抗相同抗原的大量單克隆抗體 (mAb)進行分類的方法(美國專利公開No. 2004/0101920，其通過參考以整體并入本文)。每個類型可反映明顯不同于另一種類型所代表的表位，或者與其部分重疊的獨特表位。此技術(shù)允許快速過濾遺傳上相同的抗體，使得表征可集中于遺傳上不同的抗體。當應(yīng)用于雜 交瘤篩選時，MAP可便于鑒定產(chǎn)生具有所需特征的mAb的稀有雜交瘤克隆。MAP可用于將本 發(fā)明的R0N6和R0N8抗體分為能夠結(jié)合不同表位的抗體組。本發(fā)明的抗體或其片段可以為單特異性或雙特異性。雙特異性抗體(BsAb)是具 有兩種不同抗原結(jié)合特異性或位點的抗體(參見美國專利公開No. 2004/0259156，提交于 2004年2月13日)。在抗體具有超過一種的特異性時，所識別的表位可以與單個抗原或者 與多于一個的抗原相關(guān)聯(lián)。因此，本發(fā)明提供了結(jié)合兩種不同抗原的雙特異性抗體或其片 段，其具有至少一種對RON的特異性?？梢愿鶕?jù)親和性和/或抗體親抗原性確定抗體或其片段對RON的特異性。由抗原 與抗體解離的平衡常數(shù)(“Kd”)代表的親和性度量抗原決定簇與抗體結(jié)合位點之間的結(jié)合 強度?？贵w親抗原性是抗體和其抗原之間結(jié)合強度的度量?？贵w親抗原性涉及表位與所述 抗體上其抗原結(jié)合位點之間的親和性以及所述抗體的價態(tài)，所述價態(tài)指特定表位的抗原結(jié) 合位點的數(shù)目?？贵w通常以約10_5至約IO-11LAioI (例如KD < IOOnM)的解離常數(shù)(Kd)結(jié) 合。一般認為任何小于約IO-4LAioI的Kd表示非特異性結(jié)合。Kd的值越小，抗原決定簇與 所述抗體結(jié)合位點之間的結(jié)合強度就越強。RON可分離自多種來源，以產(chǎn)生免疫應(yīng)答，例如從表達RON的細胞中結(jié)腸、胰腺、 前列腺、胃、肺、肝、卵巢、腎、乳腺和腦，以及一般來說在上皮和神經(jīng)內(nèi)分泌細胞中。另外，可 使用市售機器以及相應(yīng)的氨基酸序列獲得合成的受體肽。另一種可選方案是可以克隆并表 達編碼RON蛋白質(zhì)的DNA例如cDNA或其片段，回收所得的多肽并用作免疫原來產(chǎn)生本發(fā)明 抗體。為了制備對抗抗體的RON蛋白質(zhì)或其片段，可以將編碼RON或其部分尤其細胞外部 分(特別是α和β部份)的核酸分子插入到已知載體，用以使用標準重組DNA方法在宿 主細胞中表達。類似地，可制備抗RON配體特別是MSP的抗體。RON及其配體MSP的序列在GenBank數(shù)據(jù)庫中可公開獲取(RON登錄號X70040，MSP 登錄號NM 020998，其兩個引用通過參考并入本文)，并且其可容易地用于抗體制備。還可 產(chǎn)生針對RON或MSP變體/突變體的抗體。對于針對變體和突變體細胞外結(jié)構(gòu)域上存在的 表位的抗體很感興趣。差別在于細胞外結(jié)構(gòu)域框內(nèi)(inframe)缺失109個氨基酸的改變的 RON受體已顯示為組成型活化(1)。例如可以產(chǎn)生抗這些改變的RON受體的抗體?？梢酝ㄟ^用RON免疫哺乳動物來制備RON特異性抗體。所述可溶性受體自身可用 作免疫原，或者與載體蛋白或其他物體比如珠即s印harose珠相連接。在所述哺乳動物產(chǎn) 生抗體之后，分離抗體產(chǎn)生細胞的混合物，例如脾細胞?？赏ㄟ^從所述混合物中分離單獨的 抗體產(chǎn)生細胞并通過例如將其與腫瘤細胞比如骨髓瘤細胞融合使之永生化來產(chǎn)生單克隆 抗體。在培養(yǎng)物中保存所得雜交瘤，表達單克隆抗體，所述抗體從培養(yǎng)基中收獲。另外，通過標準雜交瘤技術(shù)，使用產(chǎn)生人免疫球蛋白重鏈和輕鏈的轉(zhuǎn)基因小鼠獲 得本發(fā)明的抗體和抗體片段(Harlow & Lane，ed. , ANTIBODIES :A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor，211-213 (1998)，其通過參考并入本文)在一個優(yōu)選實施方案中，將產(chǎn) 生人抗體的基因組的實質(zhì)部分插入小鼠基因組，使得內(nèi)源小鼠抗體的生產(chǎn)不足?？梢允褂?完全弗氏佐劑中的RON皮下(s. c.)免疫這些小鼠。本發(fā)明的抗體可以與另外的氨基酸殘 基融合。這些氨基酸殘基可以是肽標簽，可能便于分離。還可考慮其他使得所述抗體歸巢到具體器官或組織的氨基酸殘基。
根據(jù)本發(fā)明的抗RON抗體可以從噬菌體展示文庫中分離，例如從人重鏈和輕鏈可 變區(qū)基因構(gòu)建的文庫。例如，本發(fā)明的可變結(jié)構(gòu)域可獲得自外周血淋巴細胞，其含有重排的 可變區(qū)基因。作為替代地，可變結(jié)構(gòu)域部分，例如CDR和FW區(qū)域，可獲得自不同的人序列。RON特異性抗體以優(yōu)選約1 X IO-9M-1或更低，更優(yōu)選約1 X ICTkT1或更低，最優(yōu)選 約1 X IO-11M-1或更低的Kd結(jié)合RON。RON特異性的抗體或其片段抑制所述受體的活化。抑制受體表示阻止所述受體固 有激酶活性的活化從而傳導(dǎo)信號。對RON的可靠測定是受體磷酸化的抑制。本發(fā)明不受到任何特定RON抑制機制的限制。例如這些抑制可通過抗體阻斷某 些表位與配體的接近來進行，或者通過以下述方式改變RON的構(gòu)象來進行，所述方式使得 所述配體特別是MSP即使可結(jié)合所述受體，也不能活化所述受體。USP6，165，464列出了此 類抑制的多種可能機制，包括與配體本身結(jié)合，調(diào)所述受體，抑制所述受體的酪氨酸激酶活 性，或者引起細胞毒性應(yīng)答。在表達RON特別是過表達(包括差異表達)RON的細胞其表面 RON受體酪氨酸激酶數(shù)目降低時，可發(fā)生下調(diào)。本發(fā)明的抗體還可下調(diào)在腫瘤細胞侵襲和轉(zhuǎn) 移中具有功能的基質(zhì)金屬蛋白酶。RON抑制具有多種作用，包括抑制、減少、滅活和/或破壞生長(增殖和分化)、血 管發(fā)生(血管募集、侵入和轉(zhuǎn)移)以及細胞運動性和轉(zhuǎn)移(細胞粘附和侵入性)。本發(fā)明還設(shè)想結(jié)合并滅活變體或突變體RON受體酪氨酸激酶的抗體，所述受體酪 氨酸激酶在沒有配體結(jié)合時有活性?；加蠷ON相關(guān)疾病的哺乳動物可以，例如，同時表達野 生型和變體R0N，具有不成比例的所表達變體受體量。對差別在于細胞外結(jié)構(gòu)域的變體/突 變體序列感興趣，例如具有細胞外結(jié)構(gòu)域內(nèi)缺失的那些，如Wang所公開的(1)(9)。因此， RON抑制可包括野生型和/或變體R0N(點突變、缺失、選擇性剪接等)。RON活化可通過二聚化和使用其他RTK例如c-met或EGFR的活化進行。因此，RON 抑制還可包括RON及其他受體酪氨酸激酶(RTK)例如EGFR或c-met之間的異二聚化的抑 制。這些抑制還可包括通過例如形成RON和EGF或c-met的異二聚體抑制信號發(fā)放。這些 二聚化還可以配體依賴性方式誘導(dǎo)，例如通過MSP、HGF或EGF與其受體結(jié)合并誘導(dǎo)二聚化?？筊ON抗體對RON中和程度的一種可用度量是所述受體酪氨酸激酶活性的抑制。 酪氨酸激酶抑制可以使用公知的方法來確定；例如，通過測定重組激酶受體的自磷酸化水 平和/或天然或合成底物的磷酸化。因此，在本發(fā)明背景中磷酸化測定可用于測定抑制抗 體。例如，可在ELISA測定中或者蛋白質(zhì)印跡中使用磷酸化酪氨酸特異性的抗體檢測磷 酸化。用于酪氨酸激酶活性的一些測定描述于Panek等人，J. Pharmacol. Exp. Them. 283 1433-44(1997)和 Batley 等人，Life Sd. 62 143-50 (1998) [52]。另外，可利用檢測蛋白質(zhì) 表達的方法來確定RON抑制。這些方法包括用以檢測蛋白質(zhì)表達的免疫組織化學(IHC)、用 于檢測基因擴增的熒光原位雜交(FISH)、競爭性放射性配體結(jié)合測定、固體基質(zhì)印跡方法 例如Northern和Southern印跡、逆轉(zhuǎn)錄酶聚合酶鏈式反應(yīng)(RT-PCR)和ELISA。RON抑制的另一種度量包括RON下游底物的磷酸化水平。因此，例如可測量MAPK 或Akt的磷酸化水平。在一個實施方案中，將具有本發(fā)明抗體的一個、兩個、三個、四個、五個或全部六個 互補決定區(qū)(CDR)的RON特異性抗體施用給哺乳動物。在另一個實施方案中，所施用的抗體具有本發(fā)明抗體的可變區(qū)。圖2A-2E提供了本發(fā)明抗體的序列。不受理論的限制，認為 R0N6和R0N8結(jié)合RON的β細胞外結(jié)構(gòu)域，但是此特異性也可通過結(jié)合RON的其他結(jié)構(gòu)域 或者通過結(jié)合相同結(jié)構(gòu)域中的不同表位產(chǎn)生。根據(jù)本發(fā)明分離的R0N6和R0N8抗體的CDR 包括R0N6VH CDRl GGTFSSDAIT (SEQ ID NO 17)GGA GGC ACC TTC AGC AGC GAT GCT ATC ACC (SEQ ID NO 18)CDR2 GIIPILGMANYAGGG ATC ATC CCT ATC CTT GGT ATG GCA AAC TAC GCAQKFQG(SEQ ID NO 19)CAG AAG TTC CAG GGC(SEQ ID NO 20)CDR3 VADYYGLGTGTG GCC GAT TAC TAT GGT TTG GGG ACTYYffYFDL(SEQ ID NO 21)TAC TAC TGG TAC TTC GAT CTC(SEQ ID NO 22)R0N6VLCDRl RASQSVSAGG GCC AGT CAG AGT GTT AGCSSYLA(SEQ ID NO 23)AGC AGC TAC TTA GCC(SEQ ID NO 24)CDR2 GASSffAT(SEQ ID NO 25)GGT GCA TCC AGC TGG GCC ACT(SEQ ID NO 26)CDR3 QQYGSSPLT(SEQ ID NO 27)CAG CAA TAT GGT AGC TCA CCT CTC ACT(SEQ ID NO 28)R0N8VHCDRl GFTFSSYLMT (SEQ ID NO 29)GGA TTC ACC TTT AGT AGT TAT TTA ATG ACC (SEQ ID NO 30)CDR2 NIKQDGSEKYAAC ATA AAG CAA GAT GGA AGT GAG AAA TACYVDSVKG(SEQ ID NO 31)TAT GTG GAC TCT GTG AAG GGC(SEQ ID NO 32)CDR3 DGYSSGRGAT GGC TAT AGT TCG GGG AGAHYGMDV(SEQ ID NO 33)CAC TAC GGT ATG GAC GTC(SEQ ID NO 34)R0N8VLCDRl RASQSVSAGG GCC AGT CAG AGT GTT AGCRYLA(SEQ ID NO 35)
AGA TAC TTA GCC(SEQ ID NO 36)CDR2 DASNRAT(SEQ ID NO 37)GAT GCA TCC AAC AGG GCC ACT(SEQ ID NO 38)
CDR3 QQRSNffPRT (SEQ ID NO 39)CAG CAG CGT AGC AAC TGG CCT CGG ACG (SEQ ID NO 40)RON特異性抗體和抗體片段的功能性變體還包括具有基本類似于本發(fā)明抗體可變 區(qū)或高可變區(qū)氨基酸序列的氨基酸序列的多肽。基本上相同的氨基酸序列在本文中定義 為與所比較氨基酸序列有至少70%，優(yōu)選至少約80%，更優(yōu)選至少約90%同源性，如根據(jù) Pearson 和 Lipman，Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85，2444-2448 (1988)的 FASTA 檢索方法所 確定的，包括至少約70 %，優(yōu)選至少約80 %，更優(yōu)選至少約90 %，95 %或99 %以及其中所有 子范圍相同的序列。這些抗體會具有與具有基本上相同CDR的本發(fā)明抗體相同或類似的結(jié) 合、配體阻斷和受體抑制活性。RON特異性抗體和抗體片段的變體還包括具有一個或多個保守氨基酸取代的抗 體。保守氨基酸取代定義為通過改變肽、多肽或蛋白質(zhì)或其片段的一個、兩個或更多氨基酸 對氨基酸組成的改變。所述取代是具有一般性類似性能的氨基酸(例如酸性、堿性、芳香 族、尺寸、帶正電或帶負電、極性、非極性)的取代，使得所述取代基本上不改變肽、多肽或 蛋白質(zhì)的特征(例如電荷、等電點、親和性、抗體親抗原性、構(gòu)象、溶解度)或活性。對于保 守氨基酸取代可進行的典型取代可以是如下所述氨基酸組中的甘氨酸(G)、丙氨酸(A)、 纈氨酸(V)、亮氨酸(L)和異亮氨酸(I)；天冬氨酸(D)和谷氨酸(E)；丙氨酸(A)、絲氨酸 (S)和蘇氨酸(T)；組氨酸(H)、賴氨酸(K)和精氨酸(R)；天冬酰胺(N)和谷氨酰胺(Q)；苯 丙氨酸(F)、酪氨酸(Y)和色氨酸(W)。保守的氨基酸取代可以在例如主要負責所述分子選擇性和/或特異性結(jié)合特征 的高可變區(qū)側(cè)翼區(qū)域中，以及所述分子的其他部分例如可變重鏈盒中進行?？贵w或其片段還包括通過正突變、親和性成熟方法、噬菌體展示或者鏈更替 (chain shuffling)改善結(jié)合特征的那些?？赏ㄟ^突變CDR和/或FW殘基并篩選具有所需特征的抗原結(jié)合位點來修飾或改 善親和性和特異性(參見，例如Yang等人，J. Mol. Biol.，(1995) 254 :392_403)。一種方式 是將各個殘基或殘基組合隨機化，使得在其他相同的抗原結(jié)合位點的群體中，二至二十個 氨基酸的子集存在于特定位置上。作為替代地，可以通過易錯PCR方法在殘基范圍內(nèi)誘導(dǎo) 突變(參見例如Hawkins等人，J. Mol. Biol, (1992)226:889-96)。在另一個實施例中，含 有重鏈和輕鏈可變區(qū)基因的噬菌體展示載體可以在大腸桿菌突變體菌株中擴增(參見，例 如Low等人，J. Mol. Biol.，(1996) 250 :359_68)。這些誘變方法是本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的 許多方法的示例。增加本發(fā)明抗體親和性的另一種方式是進行鏈更替，其中重鏈或輕鏈與其他重鏈 或輕鏈隨機配對，產(chǎn)生具有更高親和性的抗體。所述抗體的多個CDR也可由其他抗體中的 對應(yīng)CDR更替。另外，本發(fā)明提供了編碼本發(fā)明抗體或其片段的分離多核苷酸，以及包含與表達 序列有效連接的這些多核苷酸序列的表達載體。這些核苷酸列于

圖1A-1D，2A-2E和3A-3E。 還提供了包含一個或多個表達本發(fā)明抗體或其片段的表達載體的重組宿主細胞。還提供了產(chǎn)生抗體或其片段的方法，其包括在允許所述抗體或其片段表達的條件下培養(yǎng)這些細胞。然后，可從所述細胞或細胞培養(yǎng)基中純化所述抗體或其片段。所述核苷酸的變體列于圖1A-1D，2A_2E和3A-3E，包括編碼具有與本發(fā)明抗體相 同功能的抗體或抗體片段的那些，即阻斷或抑制RON活化。這些變體具有與野生型RON至 少約70%、優(yōu)選至少約80%，更優(yōu)選至少約90%相同。本發(fā)明還提供了抗體融合蛋白質(zhì)。 這些融合蛋白質(zhì)可以由圖1A-1D，2A-2E和3A-3E的核苷酸序列編碼，其已有效連接編碼酶、 熒光蛋白質(zhì)、多肽標簽或發(fā)光標記物和/或其組合的核苷酸序列。本發(fā)明的核苷酸序列還包括(a)圖1A-1D，2A-2E和3A-3E所示的抗體DNA序列； (b)任何(i)與(a)中所示核苷酸序列的互補序列在嚴格條件下雜交的核苷酸序列，例如在 65攝氏度下0. 5M NaHP04、7%十二烷基硫酸鈉(SDS)、lmM EDTA中的濾器結(jié)合DNA雜交，并 在 68 攝氏度下 0. lxSSC/0. SDS 中洗滌(Ausubel F. M.等人編，1989，CURRENIPR0T0C0LS IN MOLECULAR BIOLOGY，第 I 卷，Green PublishingAssociates, Inc. ， and John Wiley & sons, Inc.，New York，在第2. 10. 3頁)和(ii)編碼具有基本上相同功能的抗體或抗體片 段的核苷酸序列；以及(c)任何在較低嚴格條件下與編碼圖2A-2E和3A-3E中所示抗體序 列的DNA序列雜交的核苷酸序列，例如中度嚴格的條件下，如在42攝氏度下0. 2xSSC/0. 1 % SDS中洗滌(Ausubel等人，1989見上文)，但其仍編碼具有基本上相同功能的抗體或抗體片 段。本發(fā)明抗體的功能是阻斷RON活化。本發(fā)明還提供了含有與調(diào)控序列有效連接的編碼本發(fā)明抗體或其片段之核酸的 表達載體，以及含有此表達載體的宿主細胞。這些宿主細胞可以在允許本發(fā)明抗體或其片 段表達的特定條件下培養(yǎng)，然后可從所述宿主細胞中純化所述抗體。使用標準重組方法和已知表達載體表達本發(fā)明抗體。在細菌尤其是大腸桿菌中 表達蛋白質(zhì)的載體是已知的。這些載體包括PATH載體，其由Dieckmarm and Tzagoloff 在J. Biol. Chem. 260,1513-1520(1985)中描述。這些載體含有編碼鄰氨基苯甲酸合成 酶(TrpE)隨后是位于羧基端的多接頭的DNA序列。其他表達載體系統(tǒng)基于β半乳糖苷 酶(ρΕΧ) ； λ PL;麥芽糖結(jié)合蛋白(pMAL)；和谷胱甘肽S轉(zhuǎn)移酶(pGST)。參見Gene 67， 31(1988)和 P印tide Research 3，167 (1990)。有可用于酵母中的載體。合適的例子有2D質(zhì)粒。在哺乳動物細胞中表達的合適 載體也是已知的。這些載體包括公知的SV40衍生物、腺病毒、逆轉(zhuǎn)錄病毒來源的DNA序列， 以及來源于功能性哺乳動物載體的組合的穿梭載體，例如上文所述的那些，以及功能性質(zhì) 粒和噬菌體DNA。其他的真核表達載體是本領(lǐng)域已知的H^0nP.J.Southern*P.Berg，J.Mol Appl. Genet. 1,327-341(1982) ；S. Subramani 等人，Mol. Cell. Biol. 1,854-864(1981)； R. J. Kaufmann 禾口 P.A.Sharp, “ Amplification andExpression Of Sequences Cotransfected with A Modular DihydrofolateReductase Complementary DNA Gene，〃 J. Mol. Biol. 159，601-621 (1982) ；R. J. Kaufmann 和 P. A. Sharp，〃 Amplification and Expression OfSequences Cotransfected with A Modular Dihydrofolate ReductaseComplementary DNA Gene, “ J. Mol. Biol. 159，601-664 (1982) ;S. I. Scahill 等人’ "Expression and Characterization Of the Product Of A HumanImmune Interferon DNA Gene In Chinese Hamster Ovary Cells, " Proc. Natl. Acad. Sci. USA80，4654-4659(1983) ；G. Urlaub 和 L. A. Chasin, Proc.Natl. Acad. Sci. USA 77，4216-4220， (1980))?？捎糜诒景l(fā)明的表達載體含有至少一個表達調(diào)控序列，其與待表達的DNA序列或 片段有效連接。在所述載體中插入所述調(diào)控序列是為了調(diào)控和調(diào)節(jié)所克隆的DNA序列的表 達?？捎帽磉_調(diào)控序列的實例有Iac體系、trp體系、tac體系、trc體系、λ噬菌體的主 要操縱子和啟動子區(qū)、fd外殼蛋白的控制區(qū)域、酵母的糖酵解啟動子，例如3-磷酸甘油酯 激酶啟動子、酵母酸性磷酸酶啟動子，例如Pho5，酵母α接合因子(alphamating factor) 啟動子，以及來源于多瘤(Ployoma)、腺病毒、逆轉(zhuǎn)錄病毒和猿病毒的啟動子，例如SV40早 期和晚期啟動子，以及已知控制原核或真核細胞以及其病毒或其組合的基因表達的其他序 列?？紤]載體(重組和表達載體)用于本文所提供的用途。例如，將含有調(diào)控信號和待表達DNA的表達載體，例如編碼本發(fā)明抗體或其抗體片段的那些，插入到宿主細胞用以表 達。一些可用表達宿主細胞包括公知的原核和真核細胞。一些合適的原核宿主包括，例如 大腸桿菌，如大腸桿菌SG-936，大腸桿菌HB 101，大腸桿菌W3110，大腸桿菌X1776，大腸桿 菌X2282，大腸桿菌DHI和大腸桿菌MRCl，假單胞菌(Pseudomonas)，芽孢桿菌(Bacillus) 例如枯草芽孢桿菌(Bacillus subtilis)以及鏈霉菌(Str印tomyces)。合適的真核細胞包 括酵母及其他真菌、昆蟲、動物細胞，例如COS細胞，淋巴系統(tǒng)來源的細胞系例如淋巴瘤、骨 髓瘤(例如NS0)和CHO細胞，人細胞和組織培養(yǎng)物中的植物細胞。提供了產(chǎn)生抗體的方法。該方法包括在允許所包含多肽表達的條件下培養(yǎng)包含合 適表達載體的所述宿主細胞，其中所述表達載體包含一個或多個編碼多肽的核酸分子，所 述多肽例如此類抗體的重鏈或輕鏈，或者其片段或經(jīng)改造變體。在合適培養(yǎng)基中維持的宿 主細胞中表達后，可從所述培養(yǎng)基中分離所表達的多肽，通過本領(lǐng)域已知的方法純化。如果 所述多肽或肽不是分泌進培養(yǎng)基的話，則在分離和純化前先裂解所述宿主細胞。純化的抗 體是已經(jīng)鑒定并從其天然環(huán)境組成中分離和/或回收的抗體。其天然環(huán)境的雜質(zhì)組分是干 擾所述抗體診斷或治療用途的物質(zhì)，可包括酶、激素以及其他蛋白質(zhì)或非蛋白質(zhì)溶質(zhì)，一般 已經(jīng)被除去。因此，例如，根據(jù)本發(fā)明的單克隆抗體由通過常規(guī)免疫球蛋白純化步驟分離 或純化自培養(yǎng)基或腹水的亞克隆分泌，所述步驟例如A蛋白-S印harose、羥基磷灰石 (hydrolyapatite)層析法、凝膠電泳、透析或親和層析。在另一個實施方案中，本發(fā)明的RON特異性抗體通過表達一種或多種編碼輕鏈和 /或重鏈的核酸來產(chǎn)生，或者通過在轉(zhuǎn)基因動物中包含所述抗體使得抗體表達并可回收的 類似方式產(chǎn)生。例如，所述抗體可以有助于回收和純化的組織特異性方式表達。在一個這樣 的實施方案中，本發(fā)明的抗體在乳腺中表達，從而在泌乳時分泌。轉(zhuǎn)基因動物包括但不限于 小鼠、山羊和兔。也可使用任何其他本領(lǐng)域已知的轉(zhuǎn)基因體系，例如在鳥類卵(例如雞蛋) 的卵清中表達。本發(fā)明提供了包含本發(fā)明抗RON抗體的藥物組合物。在一個實施方案中，所述組 合物可包含一種或多種本文舉例的R0N6和/或R0N8抗RON抗體。應(yīng)理解本發(fā)明的抗RON 抗體在以預(yù)防或治療目的用于哺乳動物時以另外包含可藥用載體的組合物的形式施用。合 適的可藥用載體包括例如下列一種或多種水、鹽水、磷酸鹽緩沖鹽水、葡萄糖、甘油、乙醇等等以及其組合?？伤幱幂d體還可包含少量的輔助物質(zhì)例如潤濕劑或乳化劑、防腐劑或緩沖 齊IJ，其提高了結(jié)合蛋白質(zhì)的保存期限或有效性。注射用組合物可以如本領(lǐng)域中所公知的配 制成在施用到哺乳動物后提供活性成分的快速、持續(xù)或延遲釋放。本文使用的“載體”包括可藥用載體、賦形劑或穩(wěn)定劑，其在所使用的劑量和濃度 下對暴露于其的細胞或哺乳動物是無毒的。通常生理可接受載體是水性PH緩沖溶液。生 理可接受載體的實例包括緩沖液例如磷酸鹽、檸檬酸鹽和其他有機酸；抗氧化劑包括維生 素C;低分子量(小于約10個殘基)多肽；蛋白質(zhì)例如血清白蛋白、明膠或免疫球蛋白；親 水聚合物例如聚乙烯吡咯烷酮；氨基酸例如甘氨酸、谷氨酰胺、天冬酰胺、精氨酸或賴氨酸； 單糖、二糖及其他糖類包括葡萄糖、甘露糖或糊精；螯合劑例如EDTA ；糖醇例如甘露醇或山 梨醇；成鹽平衡離子例如鈉；和/或非離子型表面活性劑例如吐溫，聚乙二醇(PEG)和普羅 尼克。所述活性成分還可裝入制備的微膠囊中，例如通過界面聚合制備，如羥甲基纖維素或明膠微膠囊以及聚(甲基丙烯酸甲酯)微膠囊，分別在膠體藥物遞送體系(例如脂質(zhì) 體、白蛋白微球體、微乳劑、納米顆粒和納米膠囊)或者在大乳劑中。用于體內(nèi)施用的制劑 必須是無菌的。這易于通過濾過除菌膜的過濾來實現(xiàn)。也可制備持續(xù)釋放制劑。持續(xù)釋放制劑的合適例子包括含有所述抗體的固體疏水 聚合物半透性基質(zhì)，所述基質(zhì)是成型制品的形式，例如膜或微膠囊。持續(xù)釋放基質(zhì)的實例包 括聚酯、水凝膠(例如聚(2-羥乙基-甲基丙烯酸)，或聚(乙烯醇))，聚交酯(美國專利 No. 3，773，919)、L-谷氨酸和L-谷氨酸、乙酯的共聚物，非降解乙烯-醋酸乙烯酯，可降 解乳酸-乙醇酸共聚物例如IAJPRON DEPOT (由乳酸-乙醇酸共聚物和醋酸亮丙 瑞林構(gòu)成的可注射微球)，以及聚-D- (-) -3"羥基丁酸。例如乙烯-醋酸乙烯酯和乳酸乙醇 酸的聚合物實現(xiàn)超過100天的分子釋放，而某些水凝膠以更長的時期釋放蛋白質(zhì)。當包裝的抗體在體內(nèi)長時間保持時，它們可能由于在37攝氏度下暴露于潮濕而 變性或聚集，導(dǎo)致生物活性損失以及免疫原性可能發(fā)生變化?？梢愿鶕?jù)所涉及機制來設(shè)計 合理的策略使其穩(wěn)定。例如，如果發(fā)現(xiàn)聚集機制在分子間的話。通過巰基-二硫互換形成S-S鍵，可通過修飾巰基殘基、從酸性溶液凍干、控制含 水量、使用合適添加劑以及開發(fā)特定的聚合物基質(zhì)組合物來實現(xiàn)穩(wěn)定。本發(fā)明提供了治療方法，包括將有效量的RON特異性抗體或其片段作為單獨治療 或者與其他治療選擇組合地施用給所需哺乳動物。在一個實施方案中，所述哺乳動物是人。 這些抗體可包括由多種方法獲得的嵌合、人源化、鼠、兔和人抗體。在另一個實施方案中，所 施用的抗體是人抗體。在另一個實施方案中，所述抗體包括R0N6或R0N8的至少單個CDR 序列。可使用這些方法的疾病包括表達RON的腫瘤、炎癥疾病、增生疾病以及肝臟、膽道、膽 管、膽囊和相關(guān)肝膽系統(tǒng)的疾病。如本文所討論的，設(shè)想本發(fā)明抗RON抗體可用于作為單獨治療和/或與其他治療 劑聯(lián)合治療任何病理狀況，包括但不限于腫瘤或非腫瘤病癥。還設(shè)想，在針對某些病癥的治 療中，例如癌癥，所述抗體可作為第一線治療策略(例如作為在新診斷的癌癥患者中的第 一階段治療)或者作為第二線治療策略(例如治療之前已經(jīng)使用其他物質(zhì)進行了治療但是 沒有對所述第一物質(zhì)產(chǎn)生反應(yīng)或者已對其產(chǎn)生抗性的癌癥患者)單獨或聯(lián)合其他治療劑 一起使用。
治療意為任何對哺乳動物中疾病的治療，包括(1)在傾向于發(fā)生但未發(fā)生或顯 示所述疾病癥狀的哺乳動物中預(yù)防疾病發(fā)生；例如預(yù)防臨床癥狀的發(fā)作；(2)抑制所述疾 病，例如停止其發(fā)展；或者(3)減輕所述疾病，例如造成所述疾病癥狀的減輕。在本發(fā)明的方法中，將治療有效量的本發(fā)明抗體施用給所需哺乳動物。如本文所 使用的術(shù)語“施用”意為通過可實現(xiàn)所要結(jié)果的任何方法將本發(fā)明抗體遞送至哺乳動物。它 們可以例如靜脈內(nèi)或肌內(nèi)注射施用。盡管本發(fā)明的人抗體特別可用于施用給人，但是它們 也可施用給其他哺乳動物。本文使用的術(shù)語“哺乳動物”旨在包括但不限于人、實驗動物、 家庭寵物和家畜?！爸委熡行Я俊敝冈谑┯媒o哺乳動物時有效產(chǎn)生所需治療作用例如抑制激 酶活性或抑制腫瘤生長的本發(fā)明抗體的量。 本發(fā)明抗RON抗體可以足以防止、抑制或減少腫瘤或病癥狀況發(fā)展的量施用以治 療患有腫瘤或血管發(fā)生相關(guān)病理狀況的患者。發(fā)展包括，例如腫瘤或病理狀況的生長、侵 襲、轉(zhuǎn)移和/或復(fù)發(fā)。足以實現(xiàn)此的量被稱為治療有效劑量。對于該用途有效的量取決于 所述疾病的嚴重程度以及患者自身免疫系統(tǒng)的綜合狀態(tài)。劑量時間表也會隨著疾病狀態(tài)和 病人狀況的變化而變化，通常的范圍為從單劑快速濃注或連續(xù)輸注到每天多次施用(例如 每4-6小時)，或者由治療的醫(yī)生和患者狀況所指示。但是，應(yīng)指出本發(fā)明不限于任何特定 的劑量。本發(fā)明抗體的合適劑量可以根據(jù)本發(fā)明顯示的體內(nèi)數(shù)據(jù)來確定。體內(nèi)實驗使用約 每隔兩天lmg/20g的劑量。平均小鼠為約0. 02Kg，其體積為約0. 008m2。平均人為約70Kg，其 體積為約1. 85m2。約200mg/m2的劑量對應(yīng)于約40mg/Kg進入小鼠，在人中大致為約2. 6mg/ Kg。為了顯示該劑量，以每周一劑施用另一種抗體ErbitUX ，約250mg/m2，其在人中為約 6. 5mg/Kg。根據(jù)這些計算和實驗，施用給人的劑量為優(yōu)選約1至約10mg/Kg，更優(yōu)選約3至 8mg/Kg (每周一劑)。所述劑量可以類似于Erbitux ,例如約6至約7mg/Kg。本發(fā)明的一個實施方案設(shè)想使用本發(fā)明抗體對RON的體內(nèi)抑制腫瘤生長。如圖4D 所示，RON抗體抑制裸鼠皮下生長的HT-29細胞。在多個實施方案中，腫瘤生長抑制至少約 20%或者至少約40%。圖4D顯示在40天的時間段中HT-29腫瘤生長減少50-60%。根據(jù)本發(fā)明的抗RON抗體可在多個實施方案中阻斷至少約60 %、約80 %或約 100% 的 MSP 誘導(dǎo)的 RON、MAPK 和 AKT 的磷酸化(例如 HT-29，Colo205, AGS 和 DU145)。在 圖5A中，泳道1和3的條帶幾乎相同，顯示這些完全的磷酸化阻斷。MAPK和AKT的磷酸化 被認為對于細胞增殖(細胞個數(shù)隨時間增加)、遷移(細胞朝向物質(zhì)，特別是MSP，的運動， 即化學_吸引)、侵襲(穿過新組織移動的能力)以及存活來說非常重要。在RON抗體和 10%血清存在下可以抑制約20%至約30%或者約25%的貼壁HT-29和Colo205細胞的增 殖。另外，當HT-29和Colo205在RON抗體和10%血清存在下在軟瓊脂中生長時，可以抑 制對于HT-29約60%至約80%更常見為約75%的集落形成，對于Colo205為約50%至約 70 %更常見約60 %的集落形成。本發(fā)明基于下列觀測結(jié)果RON特異性抗體可抑制軟瓊脂中癌細胞的生長，并且 抑制在細胞培養(yǎng)條件下作為貼壁細胞生長時的增殖。RON抗體可顯著地阻礙癌細胞系在注 射到裸鼠中時形成腫瘤的能力，其證明RON受體酪氨酸激酶的抑制消極影響結(jié)腸癌細胞的增殖。使用常規(guī)蛋白質(zhì)印跡和流式細胞術(shù)方法，已經(jīng)發(fā)現(xiàn)RON在許多人腫瘤細胞系中表達結(jié)腸(HT-29、Colo205、HCT-116、DLD-I、Sw480、Sw620)、胰腺(BXPC-3、CAPAN_2、ASPC_I、 HPAF-II、L3. 7pl#7、Hs766T)、前列腺(DU-145、PC-3)、胃(AGS、NCI-N87)、肺(A549、H596)、 肝臟0fepG2、SNU-182)和乳腺(JIMT1、DU4475、AU565)。因此，來源于多種細胞類型的腫瘤 是RON抗體的治療靶標。 待治療的腫瘤包括原發(fā)腫瘤和轉(zhuǎn)移腫瘤，以及難治腫瘤。難治腫瘤包括對使用單 獨的化療劑、單獨的抗體、單獨的放射或其組合的治療沒有反應(yīng)或者有抗性的腫瘤。難治腫 瘤還涵蓋了使用這些物質(zhì)的治療似乎對其抑制但是停止治療后至多五年，有時至多十年或 更長時間復(fù)發(fā)的腫瘤。可治療的腫瘤包括非血管化或者基本上尚未血管化以及血管化的腫瘤。可治療的 實體腫瘤的實例包括乳腺癌、肺癌、結(jié)腸直腸癌、胰腺癌、神經(jīng)膠質(zhì)瘤和淋巴瘤。這些腫瘤 的一些實例包括表皮樣腫瘤、鱗狀腫瘤，例如頭頸癌、結(jié)腸直腸癌、前列腺癌、乳腺癌、肺癌 包括小細胞和非小細胞肺癌、胰腺癌、甲狀腺癌、卵巢癌和肝癌。其他實例包括卡波西肉瘤 (Kaposi' s sarcoma)、CNS腫瘤、神經(jīng)母細胞瘤、毛細管成血管細胞瘤、腦脊膜瘤和腦轉(zhuǎn)移、 黑素瘤、胃腸和腎癌及肉瘤、橫紋肌肉瘤、惡性膠質(zhì)瘤，優(yōu)選多形性成膠質(zhì)細胞瘤和平滑肌 肉瘤。特定治療關(guān)注的有結(jié)腸、胰腺、前列腺、胃、肺和肝癌，但是本文設(shè)想任何和所有在 其中施用本發(fā)明抗體可得到治療益處的病理狀況形式，包括腫瘤和非腫瘤疾病，都包括在 本發(fā)明的范圍內(nèi)。所述病理狀況可容易地由本領(lǐng)域技術(shù)人員在本文提供的教導(dǎo)下確定。因此，人抗RON抗體可以有效治療患有血管化腫瘤或贅生物或者血管發(fā)生疾病的 對象。這些腫瘤和贅生物包括，例如，惡性腫瘤和贅生物，比如胚細胞瘤、癌或肉瘤，以及高 度血管化的腫瘤和贅生物。可通過本發(fā)明方法治療的癌癥包括，例如，膀胱、腎上腺、睪丸、 CNS和外周神經(jīng)系統(tǒng)、腦、泌尿生殖道、淋巴系統(tǒng)、胃、腎系統(tǒng)、結(jié)腸、喉、肺和骨的癌癥。這些 腫瘤的非限制性實例包括表皮樣腫瘤、鱗狀腫瘤，例如頭頸癌、結(jié)腸直腸癌、前列腺癌、乳腺 癌、肺癌包括肺腺癌和小細胞和非小細胞肺癌、胰腺癌、甲狀腺癌、卵巢癌和肝癌。所述方法 還可用于治療血管化皮膚癌，包括鱗狀細胞癌、基底細胞癌和可通過抑制惡性角質(zhì)形成細 胞(例如人惡性角質(zhì)形成細胞)生長來治療的皮膚癌。其他可治療的癌癥包括上皮細胞 間充質(zhì)轉(zhuǎn)化(epithelial-mesenchymal transformation, EMT)、卡波西肉瘤、CNS 月中瘤(神 經(jīng)母細胞瘤、毛細管成血管細胞瘤、腦脊膜瘤和腦轉(zhuǎn)移)、黑素瘤、胃腸和腎癌包括腎乳頭狀 癌，及肉瘤、橫紋肌肉瘤、惡性膠質(zhì)瘤包括多形性成膠質(zhì)細胞瘤和平滑肌肉瘤。在本發(fā)明的另一個方面中，所述抗RON抗體抑制腫瘤相關(guān)的血管發(fā)生。受體酪氨 酸激酶對血管內(nèi)皮細胞的刺激與腫瘤血管化相關(guān)。通常，以旁分泌形式刺激血管內(nèi)皮。施用抗RON抗體包括單一治療。在其他一些考慮的實施方案中，可包括組合治療， 其中所述抗RON抗體與抗腫瘤劑或其他對抗給定病理狀況的活性物質(zhì)組合施用?？鼓[瘤劑可以與RON抗體分開施用或者作為綴合物施用。目前在本領(lǐng)域中已知或 者正在評價的所述抗腫瘤劑可分為多個類型，包括例如有絲分裂抑制劑、烷化劑、抗代謝 齊U、嵌入型抗生素、生長因子抑制劑、細胞周期抑制劑、酶、拓撲異構(gòu)酶抑制劑、抗存活劑、生 體應(yīng)答修飾物質(zhì)、抗激素劑和抗血管發(fā)生劑。根據(jù)本發(fā)明的“小有機分子”定義為常規(guī)抗腫瘤劑，例如不是相對大的生物分子， 例如抗體或核酸。例如，許多已知的抗腫瘤劑是小有機分子，比如所述拓撲異構(gòu)酶抑制劑等等。因此，本發(fā)明的實施方案任選地包括其中拓撲異構(gòu)酶抑制劑與結(jié)合RON的抗體聯(lián)合施用的方法。所述抑制劑可以是拓撲異構(gòu)酶I或拓撲異構(gòu)酶II的抑制劑。拓撲異構(gòu)酶I抑 制劑包括伊立替康(CPT-II)、氨基喜樹堿、喜樹堿、DX-8951f、拓撲替康。拓撲異構(gòu)酶II抑 制劑包括依托泊苷(VP-16)和替尼泊苷(VM-26)。其他物質(zhì)目前正在評價作為抗腫瘤劑的 拓撲異構(gòu)酶抑制活性和有效性。任選地與本發(fā)明抗體共施用的其他小有機分子抗腫瘤劑或 化療劑，可以是烷化劑或抗代謝劑。烷化劑的實例包括但不限于順鉬、環(huán)磷酰胺、美法侖和 達卡巴嗪。另外的小有機分子包括細胞毒劑和/或化療劑比如紫杉醇、多柔比星、放線菌 素D、甲氨蝶呤、吉西他濱、奧鉬(oxyplatin)、氟尿嘧啶(5-FU)、leucourin (LU)、順鉬、伊立 替康(CPT-II)、紫杉酚(paclitaxel)、多西他賽、長春堿、埃博霉素、順鉬/卡鉬和聚乙二 醇化的阿霉素。小有機分子可以組合施用，比如(CPT-II ；5-FU ；LU)；(紫杉酚；5-FU)；和 (CPT-II ；5-FU ；LU)。所述抗腫瘤劑也包括放射線。當所述抗腫瘤劑是放射線時，所述放射線的來源可 以是在待治療患者的外部(外粒子束放射療法(external beamradiation therapy-EBRT)) 或者內(nèi)部(近距離放射治療(brachytherapy-BT))。所施用的抗腫瘤劑的劑量取決于多個 因素，包括例如藥劑類型、待治療腫瘤類型和嚴重程度以及所述藥劑的施用途徑。然而應(yīng)強 調(diào)本發(fā)明不限于任何特定的劑量。放射線可以與其他抗腫瘤劑聯(lián)用。在本發(fā)明的另一個方面中，抗RON抗體或抗體片段可以與抗腫瘤劑或可檢出信號 產(chǎn)生物質(zhì)化學地或生物合成地相連，特別是在所述抗體被內(nèi)化時。與抗體相連的抗腫瘤劑 包括任何破壞或損傷所述抗體已結(jié)合或者在所述抗體已結(jié)合的細胞環(huán)境中的腫瘤的藥劑。 例如，抗腫瘤劑是毒劑，比如化療劑或放射性同位素。合適的化療劑是本領(lǐng)域技術(shù)人員已 知的，包括蒽環(huán)類(例如道諾霉素和多柔比星)、甲氨蝶呤、長春地辛、新制癌菌素、順鉬、苯 丁酸氮芥、阿糖胞苷、5-氟尿苷、美法侖、篦麻毒素和卡奇霉素(calicheamicin)。所述化 療劑使用常規(guī)方法與所述抗體綴合(參見例如，Hermentin and Seller, Behring Inst. Mitt. 82 197-215(1988))οRON抗體還可與放射性同位素一起施用給癌癥患者。用作抗腫瘤劑的合適放射性 同位素也是本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的。例如，可使用1311或21IAt。這些同位素使用常規(guī)方 法與所述抗體連接(參見例如Pedley等人，Br. J. Cancer 68，69_73 (1993))。作為替代地， 與所述抗體相連的抗腫瘤劑是酶，其活化前藥，這樣一旦施用所述抗體復(fù)合物，施用的前藥 保持非活性形式直至它到達腫瘤部位，在那里它轉(zhuǎn)變?yōu)榧毎拘孕问?。實踐中，將抗體-酶 綴合物施用給患者，使之定位于待治療組織的區(qū)域。然后，將前藥物施用給患者，使得在待 治療組織的區(qū)域轉(zhuǎn)變?yōu)榧毎拘运幬?。作為替代地，與所述抗體綴合的所述抗腫瘤劑是細 胞因子例如白細胞介素_2 (IL-2)、白細胞介素-4 (IL-4)或者腫瘤壞死因子α (TNF- α )。所 述抗體使得細胞因子靶向到所述腫瘤，以致所述細胞因子介導(dǎo)所述腫瘤的損傷或破壞，而 不影響其他組織。使用常規(guī)重組DNA方法將所述細胞因子在DNA水平上與所述抗體融合。 也可使用干擾素。本發(fā)明還提供了在哺乳動物中治療非癌癥增生性疾病的方法，其包括向所述哺乳 動物施用有效量的本發(fā)明抗體。如本文所公開的，“增生性疾病”定義為由表達RON家族受 體成員的非癌癥細胞過度長大引起的病癥。由增生性疾病產(chǎn)生的過量細胞表達正常水平的 RON,或者它們可過表達RON。
可根據(jù)本發(fā)明治療的增生性疾病的類型為任何由RON配體或此類配體突變體激 活的增生性疾病。增生性疾病的實例包括銀屑病、光化性角化病和皮脂溢角化病、疣、瘢痕 和濕疹。還包括由病毒感染例如乳頭狀瘤病毒感染造成的增生性疾病。例如，銀屑病有許 多不同的變化和不同的嚴重程度。不同類型的銀屑病顯示例如膿樣水泡(膿皰性銀屑病)、 嚴重皮膚掉皮(紅皮病型銀屑病)、滴樣斑點(滴型銀屑病)以及平滑炎癥病變(反向銀屑 病)。本發(fā)明設(shè)想治療所有類型的銀屑病(例如尋常銀屑病、膿皰型銀屑病、紅皮病型銀屑 病、關(guān)節(jié)病性銀屑病、類銀屑病、掌跖膿皰病)。 對于增生性疾病的治療，如上所述的本發(fā)明抗體的施用可與任何常規(guī)治療劑的施 用組合。例如，當所述增生性疾病是銀屑病時，有多種常規(guī)全身性和局部藥劑可用。銀屑病 的全身性藥劑包括甲氨蝶呤和口服類視黃醇例如阿維A、阿維A酯和異維A酸。銀屑病的 其他全身性治療包括羥基脲、NSAIDS、柳氮磺吡啶和6-巰基鳥嘌呤?？股睾涂咕鷦┛捎?于治療或預(yù)防可造成銀屑病爆發(fā)和惡化的感染。銀屑病的局部性藥劑包括地蒽酚、卡泊三 醇、煤焦油、皮質(zhì)留類、類視黃醇、溶角蛋白劑和他扎羅汀。局部類固醇是為輕度至中度銀 屑病開出處方的最常見療法。局部類固醇應(yīng)用于皮膚表面，但是一些是注射到銀屑病病變 (lesion)內(nèi)。增生性疾病治療還包括施用與光照療法聯(lián)合的抗RON抗體。光照療法包括施用減 少增生性疾病癥狀的任何波長的光以及化療劑的光活化(光化療)。有關(guān)增生性疾病治療 的其他討論，參見WO 02/11677 (Teufel等人，描述了使用表皮生長因子受體拮抗劑治療增 生性疾病)。在本發(fā)明中，可使用任何合適的方法或途徑來施用本發(fā)明的抗RON抗體，任選地 與其他物質(zhì)共施用，例如抗腫瘤劑和/或其他受體拮抗劑。根據(jù)本發(fā)明使用的所述抗腫瘤 劑方案包括任何被認為最適合于治療患者腫瘤病癥的任何方案。不同惡性腫瘤可需要使用 特異性抗腫瘤抗體和特異性抗腫瘤劑，其取決于患者。施用途徑包括例如注射、胃腸外、輸 注、經(jīng)口、靜脈內(nèi)、腹膜內(nèi)、皮下或肌內(nèi)施用。所施用拮抗劑的劑量取決于多個因素，包括例 如拮抗劑類型、待治療腫瘤的類型和嚴重程度以及拮抗劑的施用途徑。但是，應(yīng)強調(diào)本發(fā)明 不限于任何特定的方法或給藥途徑。抗RON抗體，特別是為治療癌癥的，還可與抑制參與腫瘤生長或腫瘤相關(guān)血管發(fā) 生的RTK或其相關(guān)下游信號元件活性的細胞內(nèi)RTK拮抗劑一起施用。細胞內(nèi)RTK拮抗劑優(yōu) 選是小分子。小分子的一些實例包括有機化合物、有機金屬化合物、有機化合物和有機金屬 化合物的鹽，以及無機化合物。小分子中的原子通過共價鍵和離子鍵相連；對于小有機化 合物例如小分子酪氨酸激酶抑制劑通常為前者，對于小無機化合物通常為后者。小有機分 子中原子的排列可表示為鏈，例如碳_碳鏈或碳_雜原子鏈或者可表示為含碳原子的環(huán)，例 如苯或多環(huán)體系，或者碳原子和雜原子的組合，即雜環(huán)例如嘧啶或喹唑啉。盡管小分子可具 有任何分子量，但是它們一般包括除非被認為是生物分子的分子，分子量不大于650D的除 夕卜。小分子包括天然存在的化合物以及合成制備的化合物，所述天然存在的化合物例如激 素、神經(jīng)遞質(zhì)、核苷酸、氨基酸、糖、脂類及其衍生物，所述合成制備的化合物是通過傳統(tǒng)有 機合成、生物介導(dǎo)的合成或其組合制備的。參見例如Ganesan，Drug Discov. Today 7(1) 47-55(2002 年 1 月)；Lou，DrugDiscov. Today, 6(24) 1288-1294(2001 年 12 月)。在一個實施方案中，根據(jù)本發(fā)明用作細胞內(nèi)RTK拮抗劑的小分子是細胞內(nèi)RON拮抗劑，其與ATP競爭結(jié)合具有激酶結(jié)構(gòu)域的EGFR細胞內(nèi)結(jié)合區(qū)域，或者結(jié)合參與EGFR活化的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路的蛋白質(zhì)。這些信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路的實例包括ras-絲裂原活化蛋白激酶 (MAPK)通路，磷脂酰肌醇_3激酶(P13K)-Akt通路，脅迫活化蛋白激酶(SAPK)通路以及轉(zhuǎn) 錄的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)子和活化子(STAT)通路。涉及這些通路的蛋白質(zhì)的非限制性實例(根據(jù)本 發(fā)明的小分子RON拮抗劑可與之結(jié)合的)包括GRB-2、S0S、Ras、Raf、MEK、MAPK和基質(zhì)金屬 蛋白酶(MMP)。本文所述的治療方法，特別是針對癌癥的，也可與其他抗體的施用聯(lián)用。例如， 也可施用抗egfr的抗體，例如Erbitux (西妥昔單抗)，特別是在治療結(jié)腸癌時。 Erbitux(S)mab是重組人/小鼠嵌合單克隆抗體，其特異性結(jié)合人egfr的細胞外結(jié)構(gòu)域。 Erbitux 是egfr拮抗劑，其阻斷egfr的配體結(jié)合，防止受體活化，抑制表達egfr的腫瘤 細胞生長。Erbitux 已經(jīng)被批準聯(lián)用伊立替康或者不聯(lián)用伊立替康地用于治療患有難治 性的或者無法容許基于伊立替康的化學治療的表達表皮生長因子的轉(zhuǎn)移性結(jié)腸直腸癌的 患者。i^bitux 還顯示有效治療銀屑病。除了Erbitux 之夕卜，可使用其他抗體，例如 vegfr抗體，igf-ir抗體、pdgfr α抗體和pdgfr β抗體。組合使用的其他抗體包括赫賽汀(曲妥珠單抗)(抗表達HER2的乳腺癌細胞，或 者其他癌細胞上表達的HER2)以及阿瓦斯汀 (貝伐單抗)(抑制血管發(fā)生的抗體)。聯(lián)用 的其他抗體有特異性結(jié)合人胰島素樣生長因子-1 (IGFR)的抗體，包括抗體2F8和Α12，例 如2005年2月24目提交的公開的國際專利申請W02005/016970所述(參見例如18頁，表 1)，其具有下列⑶r序列重鏈(2F8/A12)CDRlSYAIS (SEQ ID NO 41)；CDR2GIIPIFGTANYAQKFQG(SEQ ID NO 42)；CDR3APLRFLEffSTQDHYYYYYMDV(SEQ ID NO 43)；輕鏈(2F8)CDRlQGDSLRSYYAS(SEQ ID NO 44)；CDR2GKNNRPS(SEQ ID NO 45)；CDR3NSRDNSDNRLI(SEQ ID NO 46)；輕鏈(Al2)CDRlQGDSLRSYYAT(SEQ ID NO 47)；CDR2GENKRPS(SEQ ID NO 48)；cdr3ksrdgsgohlv (seq id ν0:49)._本文所述的治療方法也可與其他肽的施用聯(lián)用。例如，在MSP變體結(jié)合RON但 是不活化RON或者至少競爭性抑制MSP時，可施用MSP變體。參見例如，美國專利公開 No.2003/0073656。RON抗體與其他抗體和/或小有機分子的施用可同時或者分別通過相同或不同的 途徑進行。本發(fā)明的抗RON抗體可以與RON拮抗劑和/或其他RTK的拮抗劑一起施用，例如 阻斷RTK配體或者以其他方式抑制RTK的抗體。其他此類RTK的實例包括EGFR、c-met和VEGFR0 在本發(fā)明的一個實施方案中，抗RON抗體與VEGFR拮抗劑聯(lián)合使用。例如，VEGFR 拮抗劑 IMC-18F1，如 Wu 等人，Clin Cancer Res ； 12 (21) 6573-6584 (2006)所述。在本發(fā)明 的一個實施方案中，抗RON抗體與特異性結(jié)合VEGFR-2/KDR受體的受體拮抗劑聯(lián)用(PCT/ US92/01300，1992 年 2 月 20 日提交，Terman 等人，Oncogene 6 :1677_1683 (1991))。在另一 個實施方案中，抗RON抗體與特異性結(jié)合VEGFR-I/Fit-Ι受體的受體拮抗劑聯(lián)用(Shibuya M.等人，Oncogene 5，519-524 (1990))。特別優(yōu)選的是結(jié)合VEGFRl或VEGFR2細胞外結(jié)構(gòu)域 并阻斷配體(VEGF或P1GF)結(jié)合，和/或抑制VEGF誘導(dǎo)或PlGF誘導(dǎo)的活化的抗原結(jié)合蛋 白。例如，Mab IMC-1121結(jié)合可溶性的細胞表面表達的KDR。Mab IMC-1121包含獲得自人 Fab噬菌體展示文庫的VH和VL結(jié)構(gòu)域。(參見WO 03/075840)。在另一個實施例中，ScFv 6. 12結(jié)合可溶性的細胞表面表達的Fit-I。ScFv6. 12包含小鼠單克隆抗體MAb 6. 12的VH 和VL結(jié)構(gòu)域。產(chǎn)生MAb 6. 12的雜交瘤細胞系是已知的并已經(jīng)由Wang等人Blood 104(9)， 2893-2902(2004)報道。這些RTK的另一個實例是胰島素樣生長因子受體(IGFR)。在某些腫瘤細胞中，RTK 功能的抑制可以由其他生長因子受體信號通路的上調(diào)補償，特別地由RON激活補償。另外， IGFR信號的抑制導(dǎo)致腫瘤細胞對某些治療劑的敏感性增加。RON或IGFR的激活導(dǎo)致普遍 的下游轉(zhuǎn)導(dǎo)分子磷酸化，包括Akt和P44/42，盡管程度不同。因此，在本發(fā)明的一個實施方 案中，IGFR拮抗劑(例如結(jié)合IGF或IGFR并抑制所述受體的抗體)與本發(fā)明的抗體共施 用，由此阻斷第二輸入進入普遍下游信號發(fā)放通路(例如抑制Akt和/或p44/42的活化)。 IGFR特異性人抗體的一個實例是IMC-A12 (參見WO 2005/016970)?？膳cRON組合靶向的另一個受體是EGFR。EGFR可以由如上所述例如ErbitUX 的抗體或者小有機分子靶向。小分子RTK拮抗劑的一個實例是IRESS A (ZD 1939)，其是用 作ATP模擬物抑制EGFR的喹唑啉衍生物。參見美國專利No. 5，616，582 (Zeneca Limited)； WO 96/33980 (ZenecaLimited)，第4頁；也參見Rowinsky等人，在ASCO的第37屆年會上發(fā) 布的摘要5，San Francisco, CA, 2001年5月12-15日；Anido等人，在ASCO的第37屆年會 上發(fā)布的摘要1712，San Francisco，CA，2001年5月12-15日。小分子EGFR拮抗劑的另一 個實例是TARCEVA (0SI-774)，其為4-(取代的苯基氨基)喹唑啉衍生物[6，7_雙(2 甲 氧基-乙氧基)_喹唑啉-4-基]-(3-乙炔基-苯基)胺鹽酸化物]EGFR抑制劑。參見WO 96/30347 (Pfizer Inc.)，例如在第2頁第12行至第4頁第34行，以及第19頁14-17頁。 另外參見 Moyer 等人，Cancer Res. ,57 4838-48 (1997) ；Pollack 等人，J. Pharmacol, 291 739-48 (1999)。TARCEVA 可通過抑制EGFR及其下游P13/Akt和MAP (絲裂原活化蛋白質(zhì)) 激酶信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路的磷酸化作用發(fā)揮功能，導(dǎo)致P27-介導(dǎo)的細胞周期停滯。參見Hidalgo 等人，ASCO的第37屆年會發(fā)布的摘要281，San Francisco, CA, 2001年5月12-15日。上 述小有機分子還可抑制RON。涉及腫瘤發(fā)生的生長因子受體的其他例子有血小板來源生長因子(PDGF)、神經(jīng)生 長因子(NGF)和成纖維細胞生長因子(FGF)的受體。這些受體可以與RON聯(lián)合靶向。在另一個實施方案中，所述抗RON抗體可以與一種或多種合適的佐劑聯(lián)合施用， 例如細胞因子(如IL-10和IL-13)或者其他免疫激活物，例如但不限于趨化因子、腫瘤相 關(guān)抗原和肽。
在組合治療中，所述抗RON抗體在另一種藥劑治療之前、期間、基本上同時或者之 后施用，以及其組合，即開始所述抗腫瘤藥劑治療的之前和期間，之前和之后，期間和之后， 或者之前、期間和之后。例如，所述抗RON抗體可以在開始放射治療之前1-30天，或者3-20 天，或者5-12天施用。在本發(fā)明的一個實施方案中，化學治療與抗體治療同時或在其之后 施用。本發(fā)明還設(shè)想與靶標或報告物部分相連的本發(fā)明的RON抗體或抗體片段。靶標部 分是結(jié)合對的第一成員。例如，抗腫瘤劑與此對的第二成員綴合，由此引導(dǎo)至所述抗原結(jié)合 蛋白質(zhì)結(jié)合的部位。此類結(jié)合對的常見例子是親和素和生物素。在一個優(yōu)選實施方案中，生 物素與本發(fā)明的抗原結(jié)合蛋白質(zhì)綴合，由此提供了與親和素或鏈霉親和素綴合的抗腫瘤劑 或其他部分的靶標。作為替代地，生物素或另一種此類部分與本發(fā)明的抗原結(jié)合蛋白質(zhì)相 連，并用作報告物，例如在可檢出信號產(chǎn)生物質(zhì)與親和素或鏈霉親和素綴合的診斷系統(tǒng)中。可檢出信號產(chǎn)生物質(zhì)可在體內(nèi)和體外用于診斷目的。所述信號產(chǎn)生物質(zhì)產(chǎn)生可通 過外部手段檢出的可測量信號，通常測量電磁輻射。多半的情況，所述信號產(chǎn)生物質(zhì)是酶或 生色團，或者通過熒光、磷光或化學發(fā)光發(fā)射光線。生色團包括吸收紫外線或可見光譜區(qū)的 光，可以是酶催化反應(yīng)的底物或降解產(chǎn)物。此外，本發(fā)明范圍內(nèi)包括本發(fā)明抗體在體內(nèi)和體外用于研究或診斷方法的用途， 其在本領(lǐng)域中是公知的。所述診斷方法包括試劑盒(kit)，其含有本發(fā)明抗體。此類試劑 盒可能可用于通過檢測個體細胞上RON的過表達鑒定處于某種類型癌癥風險中的個體。此 夕卜，由于其鑒定RON的能力，本發(fā)明的抗體可用于實驗室研究。本發(fā)明還包括藥盒(kit)，例如抑制腫瘤生長和/或腫瘤相關(guān)血管發(fā)生的藥盒，其 包含治療有效量的人抗EGFR抗體。所述藥盒還可含有任何例如涉及腫瘤發(fā)生或血管發(fā)生 的另一種生長因子受體(例如 VEGFR-l/Flt-1、VEGFR-2、PDGFR、IGFR、NGFR、EGFR、FGFR 等 等，如上所述)的合適拮抗劑。作為替代地或者另外地，本發(fā)明的藥盒還可包含抗腫瘤劑。 本發(fā)明背景中的合適抗腫瘤劑的實例在本文已有描述。本發(fā)明的藥盒還可包含佐劑；其實 例也已在上文有描述。本發(fā)明還提供了鑒定和分離具有與R0N6或R0N8或其片段相同功能的抗體的方 法，其中對文庫的篩選包括提供與固定支持物結(jié)合的具有含RON配體結(jié)合功能的親和基 質(zhì)，將所述親和基質(zhì)與抗體片段文庫相接觸，以及將所述親和基質(zhì)結(jié)合的抗體片段與不結(jié) 合所述親和基質(zhì)的抗體片段分離。固體支持物意為RON可附著于其上的非水性基質(zhì)。本文涵蓋的固相的實例包括部 分或全部由玻璃(例如受控有孔玻璃)、多糖(例如瓊脂糖)、聚丙烯酰胺、聚苯乙烯、聚乙 烯醇和硅氧烷形成的那些。在某些實施方案中，根據(jù)上下文，所述固相可包含測定板的孔； 在另一些實施方案中，它是純化柱(例如親和層析柱)。該術(shù)語還包括離散微粒的不連續(xù)固 相，例如美國專利No. 4，275，149中所描述的那些。本發(fā)明還提供了在使用本發(fā)明所提供之外的RON抗體時的治療方法。 本文詳細描述本發(fā)明的具體實施 方案。當連帶這些具體實施方案描述本發(fā)明時， 應(yīng)理解不打算將本發(fā)明限于這些具體實施方案。相反地，旨在覆蓋如所附權(quán)利要求定義的 本發(fā)明的精神和范圍內(nèi)包含的替代方案、修飾和等同方案。在接下來的描述中，闡述了許多 具體細節(jié)，以提供對本發(fā)明的徹底了解。本發(fā)明可以在沒有這些細節(jié)中一些或全部的情況下實施。在另一些情況下，沒有詳細描述公知的過程操作，從而不使本發(fā)明不必要地變得模糊。在本說明書中提到的所有上述美國專利、美國專利申請公開、美國專利申請以及 外國專利、外國專利申請通過引用以整體并入本文。本說明書中引用的所有出版物表現(xiàn)出本發(fā)明所屬技術(shù)領(lǐng)域中技術(shù)人員的技術(shù)水平。所有這些出版物通過引用以整體并入本文，其程度為各個出版物明確地且單獨地指明 通過引用并入。
實施例僅僅為說明目的提供下列實施例，不意為以任何方式對本發(fā)明的范圍進行限制。 所述實施例不包括常規(guī)方法的詳細說明，例如構(gòu)建載體和質(zhì)粒，將編碼多肽的基因插入此 類載體和質(zhì)粒或者將質(zhì)粒引入宿主細胞中利用的那些方法。此類方法是本領(lǐng)域技術(shù)人員公 知的，并且在許多出版物中有述，包括Sambrook, J.，F(xiàn)ritsch, E. F.和Maniatis, T. (1989) Molecular CloninR :A laboratory Manual,第 2 版，Cold Spring Harbor Laboratory Press。材料和方法兩種抗RON抗體R0N6和R0N8的開發(fā)和表征。實施例1 抗RON抗體的產(chǎn)生通過標準雜交瘤技術(shù)產(chǎn)生人抗RON單克隆抗體(本文稱為R0N6和R0N8) (Harlow & Lane 編，Antibodies :A Laboratory Manual, ColdSpring Harbor, 211-213 (1998),其通 過引用并入本文)，其使用HuMAb小鼠(Medarex，San Jose, Calif.)，該小鼠產(chǎn)生人免疫球 蛋白、重鏈和κ輕鏈。用完全弗氏佐劑中RON細胞外結(jié)構(gòu)域片段，過表達人RON受體的 RE7細胞和MDCK細胞皮下(s. c.)免疫HuMAb小鼠。在融合之前，用弗氏不完全佐劑中的相 同RON蛋白質(zhì)對動物腹膜內(nèi)(i.p.)加強三次。在動物接受最后的磷酸鹽緩沖液(PBS)中 25微克RON蛋白質(zhì)的腹膜內(nèi)加強之前，使其休息一個月。四天后，從免疫的小鼠收獲脾細 胞，使用聚乙二醇(PEG，MW :1450KD)將其與P3_X63_Ag8. 653Bcl_2轉(zhuǎn)染子漿細胞瘤細胞融 合。融合后，在添加了 10%胎牛血清(FBS)的HAT(次黃嘌呤，氨基蝶呤，胸苷)培養(yǎng)基中重 懸細胞，以200微升/孔的密度分配到96孔板，以建立雜交瘤細胞。在融合后第6天，吸出 100微升培養(yǎng)基，替換為100微升新鮮培養(yǎng)基。應(yīng)注意，從一個融合鑒定到180個雜交瘤克隆為產(chǎn)生具有rhu-RON蛋白質(zhì)反應(yīng)性 之抗體的陽性克隆。180個結(jié)合陽性中，僅有5個克隆鑒定為具有阻斷活性。在這五個中， 根據(jù)其優(yōu)秀的結(jié)合特異性，僅選擇2個，R0N6和R0N8，進行進一步的開發(fā)。這些證明了阻斷活性的雜交瘤克隆進行三次亞克隆，以建立產(chǎn)生抗RON的mAb的 單克隆雜交瘤細胞系。進一步驗證具有阻斷活性的克隆，以選擇較強的阻斷活性。命名為R0N6和R0N8 的克隆具有較強的阻斷活性，如ELISA所測得的，具有2-3nM的IC50，并具有高親和力(KD 值分別為45和23pM)。選擇這兩個克隆進行進一步開發(fā)。R0N6和R0N8抗體是IgG抗體，已經(jīng)對其各個重鏈和輕鏈進行了測序。如下所示， 每個抗體的結(jié)構(gòu)易于從所提供的圖和相應(yīng)序列中得知。
R0N6 的結(jié)構(gòu)R0N6抗體包括兩條重鏈，其每個如圖2A、2B和2C中所示，合起來如SEQ ID NO :10， 其由SEQ ID NO 9的DNA序列編碼。應(yīng)注意，圖2A的前19個殘基/密碼三聯(lián)子代表分泌 信號序列，不在成熟抗體鏈中存在。R0N6抗體還包括兩條輕鏈，其由圖2D-2E所示，合起來如SEQ IDNO :12，其由SEQ ID NO 11的DNA序列編碼。應(yīng)注意，圖2D的前19個殘基/密碼三聯(lián)子代表分泌信號序列， 不在成熟抗體鏈中存在。
R0N8 的結(jié)構(gòu)R0N8抗體包括兩條重鏈，其每個如圖3A、3B和3C中所示，合起來如SEQ ID NO: 14，其由SEQ ID NO: 13的DNA序列編碼。應(yīng)注意，圖3A的前19個殘基/密碼三聯(lián)子代表 分泌信號序列，不在成熟抗體鏈中存在。R0N8抗體還包括兩條輕鏈，其由圖3D-3E所示，合起來如SEQ IDNO :16，其由SEQ ID NO 15的DNA序列編碼。應(yīng)注意，圖3D的前19個殘基/密碼三聯(lián)子代表分泌信號序列， 不在成熟抗體鏈中存在。實施例2 來自實施例1的抗RON抗體結(jié)合RON并抑制RON與其配體(MSP)的結(jié)
合結(jié)合ELISA 在融合后第10_12天，篩選雜交瘤的抗體產(chǎn)生以及在基于ELISA 的結(jié)合和阻斷測定中篩選培養(yǎng)物上清與rhRON蛋白質(zhì)的特異性結(jié)合活性。用(lyg/ ml X 100 μ DrhRON蛋白質(zhì)(R&D系統(tǒng))在室溫下包被Maxi_sorp96孔微量滴定板(Nunc)L 5 小時。洗滌孔后，用3% PBS/牛奶對它們進行封閉。然后，將來源于雜交瘤上清的抗RON 抗體添加到包被孔并使之在室溫下孵育1.5小時。洗滌數(shù)次后，將1 1000稀釋的抗人 IgG-HRP綴合抗體添加到所述板，在室溫下保持1. 5小時，以檢測陽性結(jié)合。通過有限稀釋 培養(yǎng)物將陽性雜交瘤亞克隆三次，以建立單克隆雜交瘤。檢測阻斷MSP/R0N 相互作用的抗體的 ELISA 用(1 μ r/πιΙ X 100 μ 1) MSP (R&D Systems)在室溫下包被Maxi-sorp 96-孔微滴定板(Nunc) 1. 5小時。洗滌孔后，用3% PBS/牛奶對它們進行封閉。首先，將來源于雜交瘤上清的抗RON抗體與rhRON在室溫下孵 育1小時，然后將其添加到MSP-包被的孔。在室溫下孵育1. 5小時，之后洗滌數(shù)次，然后將 1 1000稀釋的抗人IgG-HRP綴合抗體添加到所述板，在室溫下保持1.5小時，以檢測哪個 抗RON可阻斷MSP/R0N相互作用。檢測R0N8阻斷MSP與RON結(jié)合的ELISA 在搖床上用IOOng/孔的無載體MSP (R&D Systems)在4攝氏度下過夜包被ELISA平板。用0. 2% PBS/T洗滌平板一次，在37攝氏度 下用150 μ 1/孔的3%牛奶封閉2小時。制備15μ g/ml稀釋的R0N8，連續(xù)稀釋到另一個 ELISA平板。向R0N8添加IOOng/孔重組人MSPR (R&D Systems)。在搖床上室溫下使R0N8/ rhMSPR復(fù)合物形成2小時。接下來，用0. 2% PBS/T洗滌MSP包被的ELISA平板一次，向 每個孔添加100 μ 1的R0N8/rhMSra復(fù)合物。在室溫下孵育1. 5小時候，用0. 2% PBS/T將 所述平板洗滌5次，在室溫下與1 2000稀釋的抗His-標簽HRP抗體(Sigma) —起孵育 1小時，所述抗His-標簽HRP抗體識別重組人MSra蛋白質(zhì)上的His標簽。用0. 2% PBS/T 洗滌所述平板5次，每孔添加100-AL底物直至出現(xiàn)黃色。使用50 μ IlN H2SO4停止反應(yīng)，使 用標準平板讀數(shù)器測定450nm的吸光度。圖6A顯示的結(jié)果描述了 R0N8的固相阻斷特征。ELISA數(shù)據(jù)確定阻斷重組人RON蛋白質(zhì)與固定化重組人MSP相互作用所需的R0N8IC50值。細胞遷移。為了確定R0N8是否可阻斷MSP誘導(dǎo)的H596肺癌細胞(ATCC，Manassas，VA)的遷移，我們使用24孔細胞培養(yǎng)小室(cell cultureinsert)，其含有多孔半透明聚對 苯二甲酸乙二酉享酉旨徑跡蝕刻膜(polyethylene terephthalate track etched membrane, 8. OAm孔徑；Becton Dickinson Falcon)。在進行測定之前，通過將所述多孔膜置入充滿700 微升 Vitrogen-IOO 純化的膠原溶液(25 μ g/mL ;Cohesion，Palo Alto, CA)的 24 孔 Falcon 平板用膠原包被所述多孔膜的底面。在4攝氏度下將所述插入物留置1小時，然后將其放 入新的24孔板。接下來，用PBS將已經(jīng)血清饑餓24小時的6X IO5活細胞漂洗一次，然后 將其接種于300 μ L無血清培養(yǎng)基中的細胞培養(yǎng)小室的上室。將MSP添加到700微升無血 清培養(yǎng)基中的下室，在37攝氏度下保持24小時，以誘導(dǎo)細胞穿過膠原包被的多孔膜遷移。 使用0%的血清作為陰性對照，使用10%的血清作為細胞遷移的陽性對照。在添加MSP之 前，將R0N8添加到上室中的一些，保持1小時，以確定它是否可抑制MSP誘導(dǎo)的Η596細胞遷 移。在測定結(jié)束時，用 Hoechst 染料(2 μ g/ml ；Invitrogen-Molecular Probes, Carlsbad, CA)對附著于膠原包被膜的底面的遷移細胞染色，以IOOx的倍率由熒光顯微鏡拍照，使用 Image-Pro Plus軟件進行計數(shù)。圖6B顯示R0N8抑制H596肺癌細胞遷移的能力。在體外傷口愈合測定中R0N8抑制遷移的能力。在H292肺癌細胞單層中制備刮傷。 添加R0N8，以確定它是否可抑制MSP誘導(dǎo)細胞遷移填充該傷口的能力。將H292肺癌細胞 以2. 5 X IO5細胞/孔接種于BectonDickinson Falcon 6孔細胞培養(yǎng)板，使之過夜生長至 匯合。使細胞血清饑餓48小時。在添加MSP之前，產(chǎn)生傷口前用R0N8抗體對一些孔進行 預(yù)孵育1小時。在開始測定時，用200 μ 1塑料槍頭產(chǎn)生小的傷口。接下來，在有和沒有無 血清培養(yǎng)基中MSP+R0N8抗體存在下將細胞孵育24小時。使用0%的血清作為陰性對照，使 用10%的血清作為細胞遷移到傷口中的陽性對照。孵育24小時候，通過亮場顯微鏡以40χ 的倍率對細胞進行拍照。觀察到IOOnM的R0N8抑制細胞遷移填充傷口，由此顯示R0N8在 體外模型中抑制細胞遷移的能力。R0N8抑制增殖的能力。圖6C顯示在BXPC3胰腺癌細胞中R0N8抑制MSP誘導(dǎo)的 DNA合成。圖6C(1)顯示度量DNA合成的[3H]-胸苷摻入的MSP刺激。將腫瘤細胞(10000/ 孔)鋪板于96孔組織培養(yǎng)板并使之靜息。用MSP將細胞刺激20小時。[將[3H]胸苷 (0.25mCi)添加到各孔，再孵育4小時。使用閃爍計數(shù)器測定DNA摻入的放射性。點，一式 兩份樣品的平均值；條，SD。圖6C(2)顯示下述體系細胞預(yù)先用R0N8處理1小時，然后加 入 MSP。BIAcore 分析。通過使用 BIAC0RE 3000 (BIAcore，Piscataway，NJ)測定所述抗 體與RON蛋白質(zhì)的結(jié)合動力學。將重組RON-Fc固定于傳感器芯片上，以多種濃度注射抗 體。獲得傳感圖，使用BIA Evaluation 2. O軟件進行評價，確定速率常數(shù)。從速率常數(shù)的 比K。ff/K。n計算親和常數(shù)KD。相互作用的速率〃 K^M—.S—1"和“K。ff，S—1”用于確定抗體/ 受體相互作用的親和性(Kd，Μ)。R0N6的速率Kd，1( 和1(。 為4. le_ll，2. 2e6和8. 6e_5。 對于 R0N8，它們是3. 2e-ll，6. Ie6 和 2. 0e_4。RON細胞表面表達的流式細胞術(shù)分析。在4攝氏度下，將來自貼壁癌細胞系的 一百萬個細胞在PBS+5% FCS中與5微克R0N8 —起孵育30分鐘。在PBS+5% FCS中洗滌 后，在4攝氏度下將細胞與抗人IgG藻紅蛋白綴合的二抗(Jackson Immuno Research) —起孵育30分鐘。用PBS+5% FCS洗滌后，通過流式細胞術(shù)使用FACSvantage SE流式細胞計 (BectonDickinson)分析細胞。蛋白質(zhì)印跡和免疫沉淀。將細胞鋪板于IOcm或6孔培養(yǎng)皿，培養(yǎng)至70-80%匯合。在PBS洗滌單層兩次，在無血清培養(yǎng)基中培養(yǎng)過夜。然后，添加抗體，在37攝氏度下孵育 60-120分鐘。用MSP配體刺激細胞10分鐘，然后將其置于冰上，用冰冷的PBS洗滌。在冰 上 50mM Tris-HCl (pH7. 4) U50mM NaClU % Triton X-IOOUmM EDTA、ImM 苯甲基磺酰氟、 0. 5mM Na3VO4Uu g/ml亮抑酶肽、1 μ g/ml抑胃酶肽和1 μ g/ml抑蛋白酶肽中裂解細胞10 分鐘。通過4攝氏度下離心澄清所述裂解液。然后，將溶液化的RON從裂解液中免疫沉淀 下來。在 4 攝氏度下，將抗體 RON，克隆 C-20 (Santa Cruz Biotechnology, Santa Cruz, CA) 或R0N6和R0N8與400微升4微克/毫升的裂解液一起孵育過夜。通過添加A蛋白-瓊脂 糖珠使得免疫復(fù)合物沉淀，在4攝氏度下保持2小時，沉淀，用裂解緩沖液洗滌三次。將與A 蛋白-瓊脂糖珠結(jié)合的免疫沉淀浸入變性凝膠樣品緩沖液中。對裂解液或免疫沉淀進行變 性凝膠電泳，在4-12%的丙烯酰胺凝膠上進行，并通過蛋白質(zhì)印跡轉(zhuǎn)印至硝酸纖維素膜。使 用抗磷酸化RON抗體(Biosource)和抗小鼠辣根過氧化物酶二抗在印跡上檢測酪氨酸-磷 酸化的蛋白質(zhì)。使用單克隆抗體RON C-20 (Santa Cruz Biotechnology)檢測RON。磷酸 化-Akt 和總 Akt 抗體獲得自 PharMingen (BD Biosciences, SanDiego, CA)。對于 MAPK 磷 酸化，磷酸化-P44/42和總p44/42抗體購自CellSignaling Technology。使用增強化學發(fā) jfei式齊[J (Amersham PharmaciaBiotech) ^t X 身寸_月交>t (Eastman Kodak, Rochester, NY) ± 使條帶顯影。用于測定IC50和ED50倌的ELISA使用ELISA測定抗RON抗體、R0N6和R0N8結(jié)合重組人RON受體并阻斷MSP/R0N相 互作用的能力。使用固定于ELISA板的受體，R0N6和R0N8結(jié)合RON的ED50值分別為4. 2pM 和2.1pM。使用相同的ELISA形式，檢測兩種抗體阻斷MSP/R0N相互作用的能力。測得的 IC50 值為 R0N6 :46pM 和 R0N8 :62pM。人月中瘤異禾中移植模胡。通過各MatriRel (Collaborative ResearchBiochemicals, Bedford, ΜΑ)中混合的5 X IO6個細胞皮下注射到5_6周齡雌性無胸腺(nu/nu)小鼠 (Charles River Laboratories，Wilmington，ΜΑ)建立腫瘤異種移植體。使腫瘤達到 150-300mm3的大小，然后將小鼠隨機分到各有12個動物的組。通過每三天腹膜內(nèi)注射對照 抗體(人IgG)或R0N6和R0N8抗體處理小鼠。在研究進行過程中持續(xù)對動物進行處理。每 周使用游標卡尺測量腫瘤兩次，通過下列公式計算腫瘤體積(η /6(wlx w2xw2))，其中wl 表示最大腫瘤直徑，《2表示最小腫瘤直徑。使用Marm-Whitney U檢驗分析腫瘤體積，使用 SigmaStat (2. 03 版 JandelScientific, San Rafeal, CA)中的統(tǒng)計包進行計算。實施例3 在人腫瘤異種移植模型中證實腫瘤抑制。在四種不同腫瘤細胞中通過使用上文實施例2中所述小鼠異種移植方法證實 R0N6和R0N8抗體抑制腫瘤生長的體內(nèi)有效性。腫瘤細胞如下。H-292細胞，來源于肺腫瘤， 獲得自美國典型培養(yǎng)物保藏中心(AmericanType Culture Collection) (Manassas，VA)。 HT-29細胞，來源于結(jié)腸腫瘤，獲得自美國典型培養(yǎng)物保藏中心(Manassas，VA)。BxPC3細 胞，來源于胰腺腫瘤，獲得自美國典型培養(yǎng)物保藏中心(Manassas，VA)。JIMT細胞，來源于 乳腺癌，獲得自美國典型培養(yǎng)物保藏中心(Manassas，VA)。
使用上文所述異種移植方法，將H-292細胞注射到總共24只小鼠。用60mg/kg的 R0N6抗體處理12只小鼠，用鹽水處理12只作為對照。如圖4A所示，相對于對照，觀察到 腫瘤體積的顯著抑制。另外用40只小鼠進行了實驗，分為四組，分別用鹽水以及60mg/kg、 20mg/kg和2mg/kg的R0N8抗體進行處理。如圖4B所示，相對于對照，觀察到腫瘤體積的顯 著抑制。如圖4B所見的，該實驗也證實了應(yīng)答隨著抗體劑量增加而增加。使用上文所述異種移植方法，將HT-29細胞注射到總共24只小鼠。用60mg/kg的 R0N6抗體處理12只小鼠，用鹽水處理12只。如圖4C所示，相對于對照，觀察到腫瘤體積的 顯著抑制。另外用另一組40只小鼠進行了相同的實驗，分為四組，分別用鹽水或者60mg/ kg、20mg/kg或2mg/kg的R0N8抗體進行處理。如圖4D所示，相對于對照，觀察到腫瘤體積 的顯著抑制。如圖4D所見的，該實驗也證實了應(yīng)答隨著抗體劑量增加而增加。使用上述異種移植方法，將BxPC3細胞注射進總共60只小鼠。小鼠分為五組(12/ 組)，處理如下鹽水，60mg/kg 的 R0N8，60mg/kg 的ErbitUX (獲得自 ImClone Systems, Inc.)，60mg/kg 的 R0N8 和 60mg/kg 的ErbitllX ，以及 60mg/kg 的ErbitUX 和 60mg/kg 的 hulgG(對照IgG獲得自MeridianLife Sciences)。結(jié)果如圖4E所示，證實了 R0N-8在胰 腺BxPC-3模型中增加了西妥昔單抗(cetuximab)的抗腫瘤作用(使用單側(cè)重復(fù)測量ANOVA 的P值為0. 06)。使用上述異種移植方法，將JIMT-I乳腺癌細胞皮下注射進裸鼠，使 之生長到約 250mm3。在使用對照(鹽水)、R0N8 (60mg/kg, 2x/周)、多西他賽或者多西他賽+R0N8的組 合的處理過程中對腫瘤體積作圖。對平均值+/-SEM作圖。圖4F所示的結(jié)果證實了在乳腺 JIMT-I模型中R0N-8抑制裸鼠中乳腺癌異種移植物的生長。參考文獻Dffang, M. H. ， Kurtz, A. L. ， Chen, Y. (2000b). Identification of a novel splicing product of the RONreceptor tyrosine kinase in human colorectal carcinomacells. Carcinogenesis 21,1507—1512.2)Leonard, E.J.，Danilkovitch, A. (2000). Macrophagestimulating protein. Adv. Cancer Res. 77,139-167.3)Skeel, A. , Leonard, E. J. (1994). Action and target cellspecificity of human macrophage-stimulating protein(MSP). J. Immunol. 152,4618-4623.4) Leonard, E.J·, Skeel, A. (1976). A serum protein thatstimulates macrophage movement, chemotaxis and spreading. Exp. Cell Res. 102,434-438.5) Iwama, A. , Wang, Μ. H. , Yamaguchi, N. , Ohno, N. , Okano, K. , Sudo, Τ. , Takeya, Μ. , Gervais, F. , Morissette, C. , Leonard, E. J. (1995). Terminal differentiation of murineresident peritoneal macrophages is characterized byexpression of the STK protein tyrosine kinase,a receptorfor macrophage-stimulating protein. Blood 86, 3394-3403.6) Wang, Μ. H. , Cox, G. W. , Yoshimura, Τ. , SheffIer, L. A. , Skeel, A. , Leonard, E. J. (1994a). Macrophage-stimulatingprotein inhibits induction of nitric oxide production byendotoxin-or cytokine-stimulated mouse macrophages. J. Biol. Chem. 269，14027-14031.
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權(quán)利要求
特異性結(jié)合RON蛋白質(zhì)的抗體或其片段，其包含選自下列的CDRSEQ ID NO17、SEQ ID NO19、SEQ ID NO21、SEQ ID NO23、SEQ IDNO25、SEQ ID NO27、SEQ ID NO29、SEQ ID NO31、SEQ ID NO33、SEQ ID NO35、SEQ ID NO37和SEQ ID NO39。
2.根據(jù)權(quán)利要求1的抗體或其片段，其中所述抗體或其片段包含SEQIDN0:29、SEQ ID NO 31 禾口 SEQ ID NO :33。
3.根據(jù)權(quán)利要求1的抗體或其片段，其中所述抗體或其片段包含SEQIDNO35,SEQ ID NO 37 禾口 SEQ ID NO :39。
4.根據(jù)權(quán)利要求1的抗體或其片段，其中所述抗體或其片段包含SEQIDN029,SEQ ID NO :31、SEQ ID NO 33 ；SEQ ID NO :35、SEQ ID NO 37 和 SEQ ID NO :39。
5.根據(jù)權(quán)利要求2的抗體或其片段，其中所述抗體或其片段包含與SEQID N0:6有至 少75%相同的可變區(qū)。
6.根據(jù)權(quán)利要求3的抗體或其片段，其中所述抗體或其片段包含與SEQID N0:8有至 少75%相同的可變區(qū)。
7.根據(jù)權(quán)利要求4的抗體或其片段，其中所述抗體或其片段包含SEQIDNO :6和SEQ ID NO :8。
8.根據(jù)權(quán)利要求1的抗體或其片段，其中所述抗體或其片段包含SEQIDN0:17、SEQ ID NO 19 禾口 SEQ ID NO :21。
9.根據(jù)權(quán)利要求1的抗體或其片段，其中所述抗體或其片段包含SEQIDN023,SEQ ID NO 25 禾口 SEQ ID NO :27。
10.根據(jù)權(quán)利要求1的抗體或其片段，其中所述抗體或其片段包含SEQID N0 17, SEQ ID NO 19 和 SEQ ID NO 21 ；SEQ ID NO :23、SEQID NO 25 和 SEQ ID NO :27。
11.根據(jù)權(quán)利要求9的抗體或其片段，其中所述抗體或其片段包含與SEQID N0:2有 至少75%相同的可變區(qū)。
12.根據(jù)權(quán)利要求10的抗體或其片段，其中所述抗體或其片段包含與SEQID N0:4有 至少75%相同的可變區(qū)。
13.根據(jù)權(quán)利要求11的抗體或其片段，其中所述抗體或其片段包含SEQID NO :2和SEQ ID NO :4。
14.根據(jù)權(quán)利要求1的抗體或其片段，其中所述抗體或其片段是RON特異性的，其Kd為 約IX icnr1或更低。
15.根據(jù)權(quán)利要求1的抗體或其片段，其中所述抗體或其片段是RON特異性的，其Kd為 約IXlO-10M-1或更低。
16.根據(jù)權(quán)利要求1的抗體或其片段，其中所述抗體或其片段是RON特異性的，其Kd為 約IXlO-11M-1或更低。
17.根據(jù)權(quán)利要求1的抗體或其片段，其中所述抗體或其片段包含選自下列的結(jié)構(gòu)單 克隆抗體、單鏈、Fab、Fv、雙抗體和三抗體。
18.根據(jù)權(quán)利要求1的抗體或其片段，其中所述抗體或其片段包含來源于至少兩個抗 體可變結(jié)構(gòu)域的CDR，所述抗體可變結(jié)構(gòu)域選自R0N6VH、R0N6VL、R0N8VH、R0N8VL及其組口 O
19.根據(jù)權(quán)利要求1的抗體或其片段，其中所述抗體或其片段包含來源于至少三個抗體可變結(jié)構(gòu)域的CDR，所述抗體可變結(jié)構(gòu)域選自R0N6VH、R0N6VL、R0N8VH、R0N8VL及其組
20.根據(jù)權(quán)利要求2的抗體或其片段，其中所述抗體或其片段包含IgG結(jié)構(gòu)。
21.根據(jù)權(quán)利要求20的抗體或其片段，其中所述抗體或其片段包含RON6或RON8。
22.編碼權(quán)利要求1的抗體或其片段的分離核酸。
23.包含權(quán)利要求22的所述分離核酸的重組載體。
24.根據(jù)權(quán)利要求23的重組載體，其中所述核酸有效連接允許所述核酸表達的調(diào)控序列。
25.包含權(quán)利要求24的重組載體的宿主細胞。
26.產(chǎn)生RON抗體的方法，其包括在允許所述抗體表達的條件下培養(yǎng)權(quán)利要求25的宿 主細胞。
27.根據(jù)權(quán)利要求26的方法，其中所述方法還包括純化所述抗體。
28.包含可藥用載體和權(quán)利要求1的抗體或其片段的藥物組合物。
29.根據(jù)權(quán)利要求28的藥物組合物，其還包括另一種治療有效化合物。
30.包含權(quán)利要求1抗體或其片段以及化療劑的藥盒。
31.根據(jù)權(quán)利要求30的藥盒，其中所述化療劑選自紫杉酚、多柔比星、放線菌素D、甲 氨蝶呤、伊立替康(CPT-II)、吉西他濱、奧鉬、氟尿嘧啶(5-FU)、leuCOurin(LU)、順鉬、紫杉 酚、多西他賽、長春堿、埃博霉素、順鉬/卡鉬和聚乙二醇化的阿霉素。
32.在哺乳動物中抑制血管發(fā)生、腫瘤生長、腫瘤細胞增殖、腫瘤細胞遷移、腫瘤細胞侵 襲、RON活化或者RON、MAPK和/或Akt磷酸化的方法，其包括向所需哺乳動物施用有效量 的權(quán)利要求1抗體或其片段。
33.在哺乳動物中治療癌癥的方法，其包括向所述哺乳動物施用有效量的權(quán)利要求1 抗體或其片段。
34.根據(jù)權(quán)利要求33的方法，其還包括將另一種抗癌治療施用給所述哺乳動物。
35.根據(jù)權(quán)利要求34的方法，其中所述抗癌治療選自抗血管發(fā)生劑、另一種FGFR-3 拮抗劑、化療劑、放射、另一種抗體、抗腫瘤劑和小分子。
36.根據(jù)權(quán)利要求35的方法，其中所述抗癌治療是化療劑。
37.根據(jù)權(quán)利要求36的方法，其中所述化療劑選自紫杉醇、多柔比星、放線菌素D、甲 氨蝶呤、伊立替康(CPT-II)、吉西他濱、奧鉬、氟尿嘧啶(5-FU)、leuCOurin(LU)、順鉬、紫杉 酚、多西他賽、長春堿、埃博霉素、順鉬/卡鉬和聚乙二醇化的阿霉素。
38.根據(jù)權(quán)利要求35的方法，其中所述抗癌治療是放射。
39.根據(jù)權(quán)利要求35的方法，其中所述抗癌治療是另一種抗體。
40.根據(jù)權(quán)利要求39的方法，其中所述抗體選自EGFR抗體、VEGFR抗體、IGFIR抗體、 PDGFR α抗體和PDGFR β抗體。
41.根據(jù)權(quán)利要求39的方法，其中所述抗體與另一個分子綴合。
42.根據(jù)權(quán)利要求33的方法，其中所述癌癥選自起源于結(jié)腸、胰腺、前列腺、胃、肺、肝 臟、卵巢、腎、乳腺和腦的腫瘤細胞。
43.根據(jù)權(quán)利要求42的方法，其中所述腫瘤細胞來自結(jié)腸。
44.根據(jù)權(quán)利要求32的方法，其中所述腫瘤細胞是上皮或神經(jīng)內(nèi)分泌來源的。
45.根據(jù)權(quán)利要求32的方法，其中所述RON是野生型RON或變體RON。
46.根據(jù)權(quán)利要求32的方法，其中所述RON是變體。
47.檢測樣品中RON的方法，其包括將所述樣品與權(quán)利要求1的抗體或其片段相接觸， 以獲得特異性結(jié)合，以及檢測此結(jié)合。
48.在哺乳動物中預(yù)防或治療炎癥的方法，其包括向所需哺乳動物施用有效量的權(quán)利 要求1的抗體或其片段。
49.在哺乳動物中預(yù)防或治療選自肝臟、膽道、膽管和膽囊疾病的病癥的方法，其包括 向所需哺乳動物施用有效量的權(quán)利要求1的抗體或其片段。
50.根據(jù)權(quán)利要求32的方法，其中所述抗體或其片段通過注射、輸注、經(jīng)口、胃腸外、皮 下、肌內(nèi)或靜脈內(nèi)施用。
51.根據(jù)權(quán)利要求32的方法，其中所述抗體或其片段以約1至約10mg/kg的劑量施用 給哺乳動物。
52.根據(jù)權(quán)利要求51的方法，其中所述抗體或其片段以約3至約8mg/kg的劑量施用。
全文摘要
本發(fā)明提供了巨噬細胞刺激蛋白受體(MSP-R或RON)特異性的抗體(包括人抗體)或其片段，其抑制RON活化。本發(fā)明還提供了抑制RON的方法，特別是使用RON抗體以治療諸如癌癥的疾病。
文檔編號A61P35/00GK101868478SQ200880117231
公開日2010年10月20日 申請日期2008年11月21日 優(yōu)先權(quán)日2007年11月21日
發(fā)明者D·佩雷拉, J·奧圖爾 申請人:伊姆克羅尼責任有限公司