專利名稱：用于細(xì)胞胞外動(dòng)作電位測(cè)量的單細(xì)胞傳感器的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本實(shí)用新型涉及一種用于細(xì)胞胞外動(dòng)作電位測(cè)量的單細(xì)胞傳感器。
背景技術(shù)：
1992年美國分子器件公司首次提出將活細(xì)胞與EIS(電解質(zhì)/絕緣層/硅)結(jié)構(gòu)的光尋址電位傳感器相結(jié)合，構(gòu)成敏感測(cè)試儀器，檢測(cè)胞外微環(huán)境酸堿度的變化，在此基礎(chǔ)上，又有研究人員改進(jìn)傳感器結(jié)構(gòu)和數(shù)據(jù)處理方法，使該類傳感器可以同時(shí)檢測(cè)幾種離子的變化。但是，這些細(xì)胞傳感器檢測(cè)的都是細(xì)胞群的代謝產(chǎn)物，所以很難確定藥物對(duì)單個(gè)細(xì)胞的作用機(jī)理，同時(shí)，也難以將測(cè)量精確定位到離子通道，無法確定藥物對(duì)細(xì)胞的作用靶點(diǎn)，對(duì)于實(shí)現(xiàn)藥物篩選的定量化是個(gè)不可回避的難點(diǎn)。

發(fā)明內(nèi)容
本實(shí)用新型的目的在于提供一種用于細(xì)胞動(dòng)作電位檢測(cè)及藥物分析測(cè)量的單細(xì)胞傳感器，能夠?qū)蝹€(gè)細(xì)胞外動(dòng)作電位進(jìn)行定性和定量檢測(cè)。
為了達(dá)到上述目的，本實(shí)用新型采用的技術(shù)方案如下在鋁板上固定敷銅板，敷銅板上粘附具有SiO2層的打磨的Si片，聚二甲基硅氧烷作的微型測(cè)量腔固定在SiO2層上，微型測(cè)量腔上覆蓋一層生物兼容性膠，與下表面鍍金膜參考電極的光學(xué)玻璃粘接，玻璃上兩個(gè)開口處分別接通藥物和培養(yǎng)液的進(jìn)液乳膠管和出液乳膠管，敷銅板上引出工作電極，對(duì)電極與金膜參考電極相連。
所說的微型測(cè)量腔為1～2個(gè)。
本實(shí)用新型具有的優(yōu)點(diǎn)是該單細(xì)胞傳感器提高了精度和穩(wěn)定度，細(xì)胞貼附生長狀況良好，將測(cè)量定位于單個(gè)細(xì)胞，可以準(zhǔn)確測(cè)量藥物刺激下，單細(xì)胞的胞外動(dòng)作電位變化。本實(shí)用新型改善了光源設(shè)計(jì)，提高了精度和穩(wěn)定度，可以將測(cè)量定位于單個(gè)細(xì)胞甚至單個(gè)離子通道，從而將精確測(cè)量藥物對(duì)單個(gè)細(xì)胞的作用及作用靶點(diǎn)。這種單細(xì)胞傳感器，可以實(shí)現(xiàn)神經(jīng)細(xì)胞外動(dòng)作電位的快速、實(shí)時(shí)監(jiān)測(cè)，定性分析不同濃度不同藥物對(duì)細(xì)胞的興奮和抑制作用，主要應(yīng)用于藥物篩選、分析和評(píng)價(jià)。
以下結(jié)合附圖和實(shí)施例對(duì)本實(shí)用新型作進(jìn)一步的說明。


圖1是單細(xì)胞傳感器沿圖2的I-I方向剖面結(jié)構(gòu)圖；圖2是單細(xì)胞傳感器俯視圖；圖3是采用涂敷法提高器件的靈敏度；圖4是單細(xì)胞傳感器檢測(cè)實(shí)例系統(tǒng)示意圖；圖5是n型硅襯底LAPS的特性曲線示意圖；圖6是無藥物刺激時(shí)，單細(xì)胞傳感器的基線；圖7是低濃度乙酰膽堿刺激時(shí)單細(xì)胞傳感器的響應(yīng)；圖8是中濃度乙酰膽堿刺激時(shí)單細(xì)胞傳感器的響應(yīng)；圖9是高濃度乙酰膽堿刺激時(shí)單細(xì)胞傳感器的響應(yīng)。
圖中，1.鋁板，2.敷銅板，3.光可尋址電位傳感器，3.1.打磨薄后的Si片，3.2。SiO2層，4.光學(xué)玻璃，5.金膜參考電極，6.紅光激光器，7.聚二甲基硅氧烷微型腔，8.生物兼容性膠，9.多聚鳥胺酸與層粘素層，10.工作電極，11.對(duì)電極，12.進(jìn)液乳膠管，13.出液乳膠管。
具體實(shí)施方式
1、傳感器的檢測(cè)結(jié)構(gòu)如圖1、圖2所示，本實(shí)用新型在鋁板1上固定敷銅板2，敷銅板2上粘附具有SiO2層3.2的打磨薄的Si片3.1，聚二甲基硅氧烷作的微型測(cè)量腔7固定在SiO2層3.2上，聚二甲基硅氧烷微型測(cè)量腔7上覆蓋一層生物兼容性膠8，與下表面鍍金膜參考電極5的光學(xué)玻璃4粘接，微型測(cè)量腔7內(nèi)涂敷一層多聚鳥胺酸與層粘素層9，玻璃上兩個(gè)開口處分別接通藥物和培養(yǎng)液的進(jìn)液乳膠管12和出液乳膠管13，敷銅板上引出工作電極10，對(duì)電極11與金膜參考電極5相連。測(cè)量時(shí)，微型測(cè)量腔上面粘光學(xué)玻璃為上蓋，形成密封測(cè)量腔。紅光激光器6選擇照射某一細(xì)胞正上方，進(jìn)液乳膠管與蠕動(dòng)泵連接，通過泵的通斷控制藥物刺激，工作電極、參考電極、對(duì)電極與恒電位/電流儀相連，恒電位/電流儀通過鎖相放大器與數(shù)字補(bǔ)償電路相連，接入計(jì)算機(jī)，與計(jì)算機(jī)實(shí)現(xiàn)雙向通訊，控制溫度并實(shí)現(xiàn)數(shù)據(jù)采集處理，計(jì)算機(jī)與數(shù)字/模擬轉(zhuǎn)換器相連，控制蠕動(dòng)泵通斷，檢測(cè)系統(tǒng)框圖如圖4所示。
2、傳感器的制備(1)光尋址電位傳感器的制備選用<100>n型單晶硅片作為LAPS的襯底。硅片經(jīng)拋光清洗后，放入1000℃高溫爐中進(jìn)行熱氧化20分鐘，使硅片正面生長一層厚度約為30nm的SiO2薄膜，利用打磨技術(shù)從背面將硅片的厚度打磨至100μm，然后用導(dǎo)電膠將硅片粘在敷銅板上，160℃高溫固化2小時(shí)，通過歐姆從敷銅板上接觸引出工作電極。
(2)硅器件表面處理本實(shí)用新型設(shè)計(jì)了兩種細(xì)胞固定的方案一，涂敷法，即在芯片表面做增強(qiáng)貼附性的涂層；二，通過改變芯片表面的粗糙度，做誘導(dǎo)細(xì)胞生長的圖形。
涂敷法過程如下將100μg/ml多聚鳥氨酸的磷酸鹽緩沖液和8μg/ml層粘素的磷酸鹽緩沖液按1∶1混合，用0.22μm的微孔濾膜濾菌，將器件浸入該混合溶液(PLOL)中，37℃，5％CO2環(huán)境下，浸泡24小時(shí)，再用雙蒸水沖洗兩次，冷凍備用。實(shí)驗(yàn)結(jié)果證明做了表面處理后的單細(xì)胞傳感器，斜率明顯增大，因此器件敏感性提高，從而提高了測(cè)量的靈敏度，如圖3所示，而且，細(xì)胞形態(tài)正常，突觸明顯，生長情況良好。
改變芯片表面的粗糙度的過程如下用光刻技術(shù)在LAPS表面做2×2mm2的微腔圖形，改變硅片的表面粗糙度，然后再進(jìn)行涂層的處理。
(3)參考電極制備熱丙酮清洗增透光學(xué)玻璃，80℃烘干。在玻璃表面，用坐標(biāo)紙做掩模，采用磁控濺射技術(shù)在玻璃表面按掩模形狀鍍金，用導(dǎo)電膠將導(dǎo)線與金膜粘接，引出參考電極。
(4)微型測(cè)量腔設(shè)計(jì)用聚二甲基硅氧烷制備一0.2×5×5cm3的薄膜結(jié)構(gòu)，用模具在上刻出與參考金電極類似的兩個(gè)測(cè)量腔，腔的尺寸為0.2×1.4×0.5cm3。用生物兼容性膠將此結(jié)構(gòu)粘著于LAPS傳感器表面，在此腔中培養(yǎng)細(xì)胞，測(cè)量時(shí)，上面粘光學(xué)玻璃為上蓋，形成密封測(cè)量腔。
傳感器的原理由于要測(cè)量的是細(xì)胞外液體環(huán)境的生理參數(shù)，所以采用的是具有EIS結(jié)構(gòu)的LAPS系統(tǒng)。它的基本原理是半導(dǎo)體的內(nèi)光電效應(yīng)，即當(dāng)半導(dǎo)體受到一定波長的光照射時(shí)，半導(dǎo)體吸收光子，發(fā)生禁帶到導(dǎo)帶的躍遷，即產(chǎn)生電子空穴對(duì)。在一般情況下，電子空穴對(duì)很快復(fù)合，在外電路中是測(cè)不到電流的。如果，給LAPS外加反向偏置電壓時(shí)(n型硅加負(fù)壓，P型硅加正壓)，半導(dǎo)體中產(chǎn)生耗盡層，這時(shí)靠近耗盡層的電子空穴對(duì)就被耗盡層拉開。當(dāng)固定光強(qiáng)時(shí)，就會(huì)產(chǎn)生光電壓，LAPS采用強(qiáng)度調(diào)制的光照射在器件的正面或背面，就可以在外電路中測(cè)量到電流。電流的大小，與光強(qiáng)、耗盡層的厚度(即外偏壓)等有關(guān)。
如圖5所示是n型硅襯底光尋址電位傳感器的特性曲線示意圖，該曲線可以分為截止區(qū)、過渡區(qū)(工作區(qū))和飽和區(qū)，這是由硅的特性決定的。特性曲線沿偏壓軸的平移就是膜響應(yīng)值，特性曲線決定了偏壓的選擇點(diǎn)、LAPS靈敏度、膜響應(yīng)與測(cè)量值的對(duì)應(yīng)關(guān)系等。
單細(xì)胞傳感器檢測(cè)細(xì)胞動(dòng)作電位實(shí)施例選擇了1∶10000、1∶100000、1∶1000000(g/ml)三種濃度的乙酰膽堿(Ach)作為神經(jīng)元的刺激藥物，實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，乙酰膽堿對(duì)于大腦皮層的神經(jīng)元是興奮作用。
如圖6所示，為未加任何藥物刺激時(shí)，細(xì)胞傳感器測(cè)得的信號(hào)，是信號(hào)分析的基線，圖中可以看出，有很小不規(guī)則的擾動(dòng)，主要是由于測(cè)量系統(tǒng)同軸纜線未能起到很好的屏蔽作用以及環(huán)境的微小震動(dòng)所引起的。如圖7所示，是在1∶1000000低濃度Ach作用下，細(xì)胞傳感器的響應(yīng)，圖中曲線與基線相似，幾乎沒有變化，說明在該濃度下，Ach還未能引起細(xì)胞產(chǎn)生動(dòng)作電位。如圖8所示，是在1∶100000中濃度Ach作用下，細(xì)胞傳感器的響應(yīng)，由此圖可以看出，胞外的電位頻度和幅度都發(fā)生變化，檢測(cè)到有一頻率約為1Hz幅度約為1.8mV的電信號(hào)，初步判定為細(xì)胞的動(dòng)作電位。如圖9所示，是在1∶10000高濃度Ach作用下，細(xì)胞傳感器的響應(yīng)，該信號(hào)頻度和幅度都有很大的變化。
該結(jié)果說明，當(dāng)Ach溶液在一定濃度范圍內(nèi)變化，會(huì)引起細(xì)胞的胞外電位的改變，單細(xì)胞傳感器可以檢測(cè)到電信號(hào)頻度和幅度變化，而且，隨Ach濃度增加，電位的幅度增大。
權(quán)利要求1.一種用于細(xì)胞胞外動(dòng)作電位測(cè)量的單細(xì)胞傳感器，其特征在于在鋁板(1)上固定敷銅板(2)，敷銅板(2)上粘附具有SiO2層(3.2)的打磨的Si片(3.1)，聚二甲基硅氧烷作的微型測(cè)量腔(7)固定在SiO2層(3.2)上，微型測(cè)量腔(7)上覆蓋一層生物兼容性膠(8)，與下表面鍍金膜參考電極(5)的光學(xué)玻璃(4)粘接，玻璃上兩個(gè)開口處分別接通藥物和培養(yǎng)液的進(jìn)液乳膠管(12)和出液乳膠管(13)，敷銅板上引出工作電極(10)，對(duì)電極(11)與金膜參考電極(5)相連。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種用于細(xì)胞胞外動(dòng)作電位測(cè)量的單細(xì)胞傳感器，其特征在于所說的微型測(cè)量腔(7)為1～2個(gè)。
專利摘要本實(shí)用新型公開了一種用于細(xì)胞胞外動(dòng)作電位測(cè)量的單細(xì)胞傳感器。在早期多光源細(xì)胞微生理計(jì)的基礎(chǔ)上，利用光尋址電位傳感器(LAPS)技術(shù)，克服傳感器幾何特性對(duì)細(xì)胞培養(yǎng)的限制，采用光源移動(dòng)尋址，對(duì)隨機(jī)培養(yǎng)的單個(gè)細(xì)胞跟蹤定位測(cè)量。本實(shí)用新型配套改進(jìn)的光源系統(tǒng)，提高了精度和穩(wěn)定度，可以將測(cè)量定位于單個(gè)細(xì)胞甚至單個(gè)離子通道，從而將精確測(cè)量藥物對(duì)單個(gè)細(xì)胞的作用及作用靶點(diǎn)。這種單細(xì)胞傳感器，可以實(shí)現(xiàn)神經(jīng)細(xì)胞外動(dòng)作電位的快速、實(shí)時(shí)監(jiān)測(cè)，定性分析不同濃度不同藥物對(duì)細(xì)胞的興奮和抑制作用，主要應(yīng)用于藥物篩選、分析和評(píng)價(jià)。
文檔編號(hào)G01N27/26GK2709979SQ20032012296
公開日2005年7月13日 申請(qǐng)日期2003年12月25日 優(yōu)先權(quán)日2003年12月25日
發(fā)明者王平, 許改霞, 秦利鋒, 徐瑩 申請(qǐng)人:浙江大學(xué)