專利名稱:中性粒細(xì)胞明膠酶相關(guān)載脂蛋白免疫層析檢測(cè)試紙條的制作方法
【專利摘要】本實(shí)用新型公開了一種中性粒細(xì)胞明膠酶相關(guān)載脂蛋白免疫層析檢測(cè)試紙條，包括底板、樣品墊、熒光標(biāo)記物結(jié)合墊、硝酸纖維素膜和吸水墊；所述試紙條由樣品墊、熒光標(biāo)記物結(jié)合墊、硝酸纖維素膜、吸水墊依次搭接粘貼在底板上構(gòu)成。所述熒光標(biāo)記物結(jié)合墊含有鏈霉親和素標(biāo)記熒光蛋白和生物素標(biāo)記的中性粒細(xì)胞明膠酶相關(guān)載脂蛋白單克隆抗體；所述硝酸纖維膜上有檢測(cè)線和質(zhì)控線。本實(shí)用新型與目前常見的檢測(cè)中性粒細(xì)胞明膠酶相關(guān)載脂蛋白的方法相比(如：化學(xué)發(fā)光法/免疫增強(qiáng)比濁法/膠體金法)，不僅大大縮短了檢測(cè)時(shí)間，同時(shí)還提高了檢測(cè)靈敏度。
【專利說(shuō)明】中性粒細(xì)胞明膠酶相關(guān)載脂蛋白免疫層析檢測(cè)試紙條

【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本實(shí)用新型屬于免疫檢測(cè)領(lǐng)域，具體涉及一種高靈敏度中性粒細(xì)胞明膠酶相關(guān)載脂蛋白免疫層析檢測(cè)試紙條。

【背景技術(shù)】
[0002]中性粒細(xì)胞明膠酶相關(guān)載脂蛋白(neutrophil gelatinase associatedlipocalin，NGAL)，又稱人脂質(zhì)運(yùn)載蛋白 2 (lipocalin 2，Ln2)或.鐵蛋白(siderocalin)，是人脂質(zhì)運(yùn)載蛋白家族中的一個(gè)新成員。NGAL是1993年Kjcldsen等研宄中性粒細(xì)胞時(shí)發(fā)現(xiàn)的一種特殊顆粒組分，與明膠酶B即基質(zhì)金屬蛋白酶9 (man-1x metalloproteinase-9,MMP-9)密切相關(guān)。
[0003]在生理狀態(tài)下，中性粒細(xì)胞、腎小管上皮細(xì)胞、肺泡巨噬細(xì)胞、支氣管上皮黏液細(xì)胞等分泌少量NGAL，而腦和周圍神經(jīng)、結(jié)腸、子宮和卵巢、胎盤、甲狀腺等組織細(xì)胞中NGAL的表達(dá)呈陰性。急性腎功能損傷(AKI)時(shí)血、尿NGAL濃度通常會(huì)迅速升高，2h最為明顯(比臨界值升高幾十至幾百倍)，血清肌酐(sCr)，尿酶等傳統(tǒng)腎功能指標(biāo)往往要在24-72h才后明顯升高，因而NGAL可用于AKI的早期診斷。NGAL作為一個(gè)新的腎損傷標(biāo)志物，能早期診斷急性腎損傷，反映腎功能損傷程度，對(duì)腎病的治療監(jiān)測(cè)和預(yù)后判斷有重要作用。隨著NGAL的各種檢測(cè)技術(shù)的快速發(fā)展，其臨床應(yīng)用研宄也越來(lái)越廣泛、深入。目前由于不同研宄結(jié)果中的對(duì)象選擇、診斷標(biāo)準(zhǔn)、實(shí)驗(yàn)方法設(shè)計(jì)各不相同，還難以進(jìn)行橫向比較。
[0004]生物素-親和素系統(tǒng)(b1tinavidin system，BAS)，是一種新型生物反應(yīng)放大系統(tǒng)。隨著各種生物素衍生物的問世，BAS很快被廣泛應(yīng)用于醫(yī)學(xué)各領(lǐng)域。將該系統(tǒng)應(yīng)用于免疫組化，酶聯(lián)免疫，熒光免疫，放射免疫等檢測(cè)技術(shù)中，可顯著地提高以上技術(shù)方法的敏感性、特異性和穩(wěn)定性，使方法更簡(jiǎn)便，有助于臨床快速診斷，并利于進(jìn)行大規(guī)模流行病學(xué)調(diào)查，成為研宄免疫反應(yīng)的有力工具。由于BAS檢測(cè)系統(tǒng)經(jīng)濟(jì)快速，又無(wú)放射物質(zhì)污染，不需復(fù)雜儀器，充分顯示了此系統(tǒng)的巨大潛力和應(yīng)用的可能性。
[0005]生物素-親和素系統(tǒng)檢測(cè)原理:BAS是在常規(guī)ELISA原理的基礎(chǔ)上，結(jié)合生物素與親和素間的高度放大作用，而建立的一種檢測(cè)系統(tǒng)。親和素是卵白蛋白中提取的一種堿性糖蛋白，分子量為68kDa，由4個(gè)亞單位組成，對(duì)生物素有非常高的親和力(結(jié)合常數(shù)高達(dá)1015M-1)。生物素很易與蛋白質(zhì)(如抗體等)以共價(jià)鍵結(jié)合。這樣，結(jié)合了酶的親和素分子與結(jié)合有特異性抗體的生物素分子產(chǎn)生反應(yīng)，既起到了多級(jí)放大作用，又由于酶在遇到相應(yīng)底物時(shí)的催化作用而呈色，達(dá)到檢測(cè)未知抗原(或抗體)分子的目的。鏈霉親和素是與親和素有相似生物學(xué)特性的一種蛋白質(zhì)，鏈霉親和素與親和素一樣分子中每條肽鏈都能結(jié)合一個(gè)生物素，因幾乎所有用于標(biāo)記的物質(zhì)均可以同親和素或鏈霉親合素結(jié)合。利用生物素-親和素系統(tǒng)研制中性粒細(xì)胞明膠酶相關(guān)載脂蛋白檢測(cè)試快速診斷試劑尚無(wú)報(bào)道。
實(shí)用新型內(nèi)容
[0006]本實(shí)用新型的目的，在于提供一種中性粒細(xì)胞明膠酶相關(guān)載脂蛋白免疫層析檢測(cè)試紙條，其基于雙抗體夾心法、熒光免疫側(cè)向?qū)游龊蜕锼?鏈霉親和素放大系統(tǒng)，提供高靈敏度中性粒細(xì)胞明膠酶相關(guān)載脂蛋白免疫層析檢測(cè)試紙條。使用本實(shí)用新型時(shí)，提高了檢測(cè)靈敏度和檢測(cè)穩(wěn)定性，降低了非特異性結(jié)合，檢測(cè)時(shí)間不大于10分鐘，大大提高了診斷效率。
[0007]本實(shí)用新型解決其技術(shù)問題的解決方案是:中性粒細(xì)胞明膠酶相關(guān)載脂蛋白免疫層析檢測(cè)試紙條，其包括底板，所述底板上依次設(shè)有樣品墊、熒光標(biāo)記物結(jié)合墊、硝酸纖維素膜和吸水墊，所述吸水墊和熒光標(biāo)記物結(jié)合墊分別交疊壓在硝酸纖維素膜的兩端后在硝酸纖維素膜的表面形成檢測(cè)區(qū)，所述樣品墊交疊壓在熒光標(biāo)記物結(jié)合墊上，所述熒光標(biāo)記物結(jié)合墊上固定有生物素標(biāo)記的中性粒細(xì)胞明膠酶相關(guān)載脂蛋白單克隆抗體和鏈霉親和素標(biāo)記的熒光蛋白；所述檢測(cè)區(qū)內(nèi)的硝酸纖維素膜上固定有識(shí)別中性粒細(xì)胞明膠酶相關(guān)載脂蛋白另外一個(gè)表位的單克隆抗體構(gòu)成的檢測(cè)線和羊抗鼠IgG多克隆抗體構(gòu)成的質(zhì)控線。
[0008]作為上述技術(shù)方案的進(jìn)一步改進(jìn)，所述熒光標(biāo)記物結(jié)合墊包括層疊的第一熒光標(biāo)記物結(jié)合墊和第二熒光標(biāo)記物結(jié)合墊，所述第一熒光標(biāo)記物結(jié)合墊的一端墊在樣品墊的下方，所述第二熒光標(biāo)記物結(jié)合墊交疊壓在硝酸纖維素膜的一端。
[0009]作為上述技術(shù)方案的進(jìn)一步改進(jìn)，所述第一焚光標(biāo)記物結(jié)合墊中插入樣品墊下方的一端設(shè)有定位條，所述樣品墊的下端面設(shè)有能容納定位條的定位槽。
[0010]作為上述技術(shù)方案的進(jìn)一步改進(jìn)，還包括卡殼，所述底板、樣品墊、熒光標(biāo)記物結(jié)合墊、硝酸纖維素膜和吸水墊均置于卡殼內(nèi)，所述卡殼殼面上對(duì)應(yīng)于硝酸纖維膜的位置設(shè)有觀察窗，卡殼殼面上對(duì)應(yīng)于樣品墊的位置設(shè)有加樣孔。
[0011]作為上述技術(shù)方案的進(jìn)一步改進(jìn)，所述觀察窗為長(zhǎng)方形孔。
[0012]作為上述技術(shù)方案的進(jìn)一步改進(jìn)，所述熒光蛋白可以是綠色熒光蛋白、藻膽蛋白中的一種。
[0013]作為上述技術(shù)方案的進(jìn)一步改進(jìn)，所述樣品墊為經(jīng)表面活性劑緩沖液浸泡處理后干燥的玻璃纖維構(gòu)件。
[0014]作為上述技術(shù)方案的進(jìn)一步改進(jìn)，所述底板為聚苯乙烯構(gòu)件或者聚乙烯構(gòu)件。
[0015]作為上述技術(shù)方案的進(jìn)一步改進(jìn)，所述卡殼包括塑料上殼和塑料下殼，所述塑料上殼扣合塑料下殼上后形成卡殼。
[0016]本實(shí)用新型與現(xiàn)有技術(shù)相比，具有如下優(yōu)點(diǎn):
[0017](I)本實(shí)用新型將熒光蛋白作為標(biāo)記物，此標(biāo)記物穩(wěn)定性良好，有利于提高檢測(cè)穩(wěn)定性。
[0018](2)本實(shí)用新型通過利用“鏈霉親和素-生物素放大系統(tǒng)”，提高檢測(cè)靈敏度，降低非特異性結(jié)合，有利于提高試劑盒性能。
[0019](3)利用本實(shí)用新型進(jìn)行降鈣素原的檢測(cè)時(shí)間不大于10分鐘，檢測(cè)線性范圍為0.10ng/ml?100.00ng/ml，極大地提高了檢測(cè)效率。
[0020](4)本實(shí)用新型可通過熒光免疫分析儀對(duì)結(jié)果進(jìn)行判讀，可實(shí)現(xiàn)自動(dòng)化，減少主觀因素的影響，提供便利、快速、可靠的診斷結(jié)果。
[0021](5)本使用新型卡殼設(shè)有樣品進(jìn)入的加樣孔和供觀測(cè)結(jié)果的觀察窗，根據(jù)分析儀器判定結(jié)果，準(zhǔn)確可靠。
[0022](6)本實(shí)用新型制作方便，體積小、便于攜帶。
[0023](7)本實(shí)用新型檢測(cè)成本較低。
[0024](8)本實(shí)用新型可批量生產(chǎn)，適用于臨床快速診斷和現(xiàn)場(chǎng)快速診斷；易于保存，有利于基層單位推廣。

【附圖說(shuō)明】

[0025]為了更清楚地說(shuō)明本實(shí)用新型實(shí)施例中的技術(shù)方案，下面將對(duì)實(shí)施例描述中所需要使用的附圖作簡(jiǎn)單說(shuō)明。顯然，所描述的附圖只是本實(shí)用新型的一部分實(shí)施例，而不是全部實(shí)施例，本領(lǐng)域的技術(shù)人員在不付出創(chuàng)造性勞動(dòng)的前提下，還可以根據(jù)這些附圖獲得其他設(shè)計(jì)方案和附圖。
[0026]圖1是本實(shí)用新型實(shí)施例一的結(jié)構(gòu)示意圖；
[0027]圖2是本實(shí)用新型實(shí)施例二的結(jié)構(gòu)示意圖；
[0028]圖3是本實(shí)用新型實(shí)施例三的結(jié)構(gòu)示意圖；
[0029]圖4是本實(shí)用新型實(shí)施例四的結(jié)構(gòu)示意圖。

【具體實(shí)施方式】
[0030]以下將結(jié)合實(shí)施例和附圖對(duì)本實(shí)用新型的構(gòu)思、具體結(jié)構(gòu)及產(chǎn)生的技術(shù)效果進(jìn)行清楚、完整地描述，以充分地理解本實(shí)用新型的目的、特征和效果。顯然，所描述的實(shí)施例只是本實(shí)用新型的一部分實(shí)施例，而不是全部實(shí)施例，基于本實(shí)用新型的實(shí)施例，本領(lǐng)域的技術(shù)人員在不付出創(chuàng)造性勞動(dòng)的前提下所獲得的其他實(shí)施例，均屬于本實(shí)用新型保護(hù)的范圍。另外，文中所提到的所有聯(lián)接/連接關(guān)系，并非單指構(gòu)件直接相接，而是指可根據(jù)具體實(shí)施情況，通過添加或減少聯(lián)接輔件，來(lái)組成更優(yōu)的聯(lián)接結(jié)構(gòu)。
[0031]參照?qǐng)D1，中性粒細(xì)胞明膠酶相關(guān)載脂蛋白免疫層析檢測(cè)試紙條，其包括底板5，所述底板5上依次設(shè)有樣品墊1、熒光標(biāo)記物結(jié)合墊2、硝酸纖維素膜3和吸水墊4，所述吸水墊4和熒光標(biāo)記物結(jié)合墊2分別交疊壓在硝酸纖維素膜3的兩端后在硝酸纖維素膜3的表面形成檢測(cè)區(qū)，熒光標(biāo)記物結(jié)合墊2為玻璃纖維膜，所述樣品墊I交疊壓在熒光標(biāo)記物結(jié)合墊2上，所述熒光標(biāo)記物結(jié)合墊2上固定有生物素標(biāo)記的中性粒細(xì)胞明膠酶相關(guān)載脂蛋白單克隆抗體(濃度0.3?1.5mg/mL)和鏈霉親和素標(biāo)記(或親和素)的熒光蛋白(使用激發(fā)光波長(zhǎng)530nm，發(fā)射光波長(zhǎng)570nm，濃度0.1?1.0mg/mL);所述檢測(cè)區(qū)內(nèi)的硝酸纖維素膜3上固定有識(shí)別中性粒細(xì)胞明膠酶相關(guān)載脂蛋白另外一個(gè)表位的單克隆抗體構(gòu)成的檢測(cè)線T (濃度0.5?3mg/mL)和羊抗鼠IgG多克隆抗體構(gòu)成的質(zhì)控線C(濃度0.2?2.0mg/mL)，質(zhì)控線C用于檢測(cè)試紙條的有效性。
[0032]將生物素標(biāo)記的中性粒細(xì)胞明膠酶相關(guān)載脂蛋白單克隆抗體和鏈霉親和素(或親和素)標(biāo)記的熒光蛋白固定在熒光標(biāo)記物結(jié)合墊2上，將有識(shí)別中性粒細(xì)胞明膠酶相關(guān)載脂蛋白另外一個(gè)表位的單克隆抗體和羊抗鼠IgG多克隆抗體固定于硝酸纖維素膜上分別作為檢測(cè)線T和質(zhì)控線C。當(dāng)待測(cè)樣品加到樣品墊I上后，通過層析作用向前移動(dòng)，樣品中中性粒細(xì)胞明膠酶相關(guān)載脂蛋白與熒光標(biāo)記物結(jié)合墊2上結(jié)合熒光標(biāo)記物(焚光蛋白)的中性粒細(xì)胞明膠酶相關(guān)載脂蛋白抗體(Mab-NGAL*Fluoro)反應(yīng)形成復(fù)合物NGAL-Mab-NGAL*Fluoro，在層析作用下反應(yīng)復(fù)合物繼續(xù)向前移動(dòng)經(jīng)過硝酸纖維膜上包被的NGAL抗體(檢測(cè)線)時(shí)，反應(yīng)復(fù)合物被包被的NGAL抗體捕獲形成復(fù)合物(Mab-NGAL-NGAL-Mab-NGAL*Fluoro)(檢測(cè)線)，通過熒光免疫分析儀讀取檢測(cè)線的反應(yīng)信號(hào)，在激發(fā)光源的作用下，熒光物質(zhì)發(fā)射特定波長(zhǎng)的熒光信號(hào)，熒光免疫分析儀俘獲熒光信號(hào)，通過信號(hào)轉(zhuǎn)化及設(shè)定的標(biāo)準(zhǔn)曲線自動(dòng)轉(zhuǎn)化為定量數(shù)值，計(jì)算出樣本中中性粒細(xì)胞明膠酶相關(guān)載脂蛋白的濃度，得到中性粒細(xì)胞明膠酶相關(guān)載脂蛋白檢測(cè)結(jié)果。
[0033]作為上述技術(shù)方案的進(jìn)一步改進(jìn)，參照?qǐng)D3，所述熒光標(biāo)記物結(jié)合墊2包括層疊的第一熒光標(biāo)記物結(jié)合墊20和第二熒光標(biāo)記物結(jié)合墊21，所述第一熒光標(biāo)記物結(jié)合墊20的一端墊在樣品墊I的下方，所述第二熒光標(biāo)記物結(jié)合墊21交疊壓在硝酸纖維素膜3的一端。熒光標(biāo)記物結(jié)合墊2的分層設(shè)置，便于將熒光標(biāo)記物結(jié)合墊2安裝在樣品墊I和硝酸纖維素膜3之間。
[0034]作為上述技術(shù)方案的進(jìn)一步改進(jìn)，參照?qǐng)D3所述第一熒光標(biāo)記物結(jié)合墊20中插入樣品墊下方的一端設(shè)有定位條22，所述樣品墊I的下端面設(shè)有能容納定位條22的定位槽。通過定位條22便于熒光標(biāo)記物結(jié)合墊2和樣品墊I之間的安裝固定。
[0035]作為上述技術(shù)方案的進(jìn)一步改進(jìn)，參照?qǐng)D2和圖4，還包括卡殼，所述底板5、樣品墊1、熒光標(biāo)記物結(jié)合墊2、硝酸纖維素膜3和吸水墊4均置于卡殼6內(nèi)，所述卡殼6殼面上對(duì)應(yīng)于硝酸纖維膜3的位置設(shè)有觀察窗8，卡殼6殼面上對(duì)應(yīng)于樣品墊I的位置設(shè)有加樣孔?。
[0036]作為上述技術(shù)方案的進(jìn)一步改進(jìn)，所述觀察窗8為長(zhǎng)方形孔。
[0037]作為上述技術(shù)方案的進(jìn)一步改進(jìn)，所述熒光蛋白可以是綠色熒光蛋白、藻膽蛋白中的一種。
[0038]作為上述技術(shù)方案的進(jìn)一步改進(jìn)，所述樣品墊I為經(jīng)表面活性劑緩沖液浸泡處理后干燥的玻璃纖維構(gòu)件。樣品墊由玻璃纖維構(gòu)成，經(jīng)表面活性劑緩沖液浸泡處理，干燥后使用。所述樣品墊I的裁剪寬度為0.3?0.5cm。
[0039]作為上述技術(shù)方案的進(jìn)一步改進(jìn)，所述底板5為聚苯乙烯構(gòu)件或者聚乙烯構(gòu)件。
[0040]作為上述技術(shù)方案的進(jìn)一步改進(jìn)，所述卡殼6包括塑料上殼60和塑料下殼61，所述塑料上殼61扣合塑料下殼61上后形成卡殼6。
[0041]以上是對(duì)本實(shí)用新型的較佳實(shí)施方式進(jìn)行了具體說(shuō)明，但本發(fā)明創(chuàng)造并不限于所述實(shí)施例，熟悉本領(lǐng)域的技術(shù)人員在不違背本實(shí)用新型精神的前提下還可作出種種的等同變型或替換，這些等同的變型或替換均包含在本申請(qǐng)權(quán)利要求所限定的范圍內(nèi)。
【權(quán)利要求】
1.中性粒細(xì)胞明膠酶相關(guān)載脂蛋白免疫層析檢測(cè)試紙條，其特征在于:其包括底板，所述底板上依次設(shè)有樣品墊、熒光標(biāo)記物結(jié)合墊、硝酸纖維素膜和吸水墊，所述吸水墊和熒光標(biāo)記物結(jié)合墊分別交疊壓在硝酸纖維素膜的兩端后在硝酸纖維素膜的表面形成檢測(cè)區(qū)，所述樣品墊交疊壓在熒光標(biāo)記物結(jié)合墊上，所述熒光標(biāo)記物結(jié)合墊上固定有生物素標(biāo)記的中性粒細(xì)胞明膠酶相關(guān)載脂蛋白單克隆抗體和鏈霉親和素標(biāo)記的熒光蛋白；所述檢測(cè)區(qū)內(nèi)的硝酸纖維素膜上固定有識(shí)別中性粒細(xì)胞明膠酶相關(guān)載脂蛋白另外一個(gè)表位的單克隆抗體構(gòu)成的檢測(cè)線和羊抗鼠IgG多克隆抗體構(gòu)成的質(zhì)控線。2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的中性粒細(xì)胞明膠酶相關(guān)載脂蛋白免疫層析檢測(cè)試紙條，其特征在于:所述熒光標(biāo)記物結(jié)合墊包括層疊的第一熒光標(biāo)記物結(jié)合墊和第二熒光標(biāo)記物結(jié)合墊，所述第一熒光標(biāo)記物結(jié)合墊的一端墊在樣品墊的下方，所述第二熒光標(biāo)記物結(jié)合墊交疊壓在硝酸纖維素膜的一端。3.根據(jù)權(quán)利要求2所述的中性粒細(xì)胞明膠酶相關(guān)載脂蛋白免疫層析檢測(cè)試紙條，其特征在于:所述第一熒光標(biāo)記物結(jié)合墊中插入樣品墊下方的一端設(shè)有定位條，所述樣品墊的下端面設(shè)有能容納定位條的定位槽。4.根據(jù)權(quán)利要求1至3任一項(xiàng)所述的中性粒細(xì)胞明膠酶相關(guān)載脂蛋白免疫層析檢測(cè)試紙條，其特征在于:還包括卡殼，所述底板、樣品墊、熒光標(biāo)記物結(jié)合墊、硝酸纖維素膜和吸水墊均置于卡殼內(nèi)，所述卡殼殼面上對(duì)應(yīng)于硝酸纖維膜的位置設(shè)有觀察窗，卡殼殼面上對(duì)應(yīng)于樣品墊的位置設(shè)有加樣孔。5.根據(jù)權(quán)利要求4所述的中性粒細(xì)胞明膠酶相關(guān)載脂蛋白免疫層析檢測(cè)試紙條，其特征在于:所述觀察窗為長(zhǎng)方形孔。6.根據(jù)權(quán)利要求4所述的中性粒細(xì)胞明膠酶相關(guān)載脂蛋白免疫層析檢測(cè)試紙條，其特征在于:所述熒光蛋白可以是綠色熒光蛋白、藻膽蛋白中的一種。7.根據(jù)權(quán)利要求4所述的中性粒細(xì)胞明膠酶相關(guān)載脂蛋白免疫層析檢測(cè)試紙條，其特征在于:所述樣品墊為經(jīng)表面活性劑緩沖液浸泡處理后干燥的玻璃纖維構(gòu)件。8.根據(jù)權(quán)利要求4所述的中性粒細(xì)胞明膠酶相關(guān)載脂蛋白免疫層析檢測(cè)試紙條，其特征在于:所述底板為聚苯乙烯構(gòu)件或者聚乙烯構(gòu)件。9.根據(jù)權(quán)利要求4所述的中性粒細(xì)胞明膠酶相關(guān)載脂蛋白免疫層析檢測(cè)試紙條，其特征在于:所述卡殼包括塑料上殼和塑料下殼，所述塑料上殼扣合塑料下殼上后形成卡殼。
【文檔編號(hào)】G01N33-558GK204287201SQ201420648456
【發(fā)明者】陳泳釵, 王小明, 夏坤, 佟順剛 [申請(qǐng)人]廣州天寶頌原生物科技開發(fā)有限公司