專利名稱：蛋白質(zhì)測(cè)定方法、蛋白質(zhì)測(cè)定用指示劑及蛋白質(zhì)測(cè)定用試驗(yàn)片的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及用于測(cè)定含蛋白質(zhì)試樣(例如血液和尿等體液、含蛋白質(zhì)飲料、工廠廢水)中存在的蛋白質(zhì)的技術(shù)。

背景技術(shù)：
測(cè)定生物體試樣中的蛋白質(zhì)，在病理學(xué)的診斷方面是重要的。例如，在肝臟功能低下的情況下，血清白蛋白量下降，而另一方面，在腎炎、腎變病綜合癥、結(jié)石、腫瘤等的腎-尿路疾病、循環(huán)系統(tǒng)及中樞神經(jīng)系統(tǒng)的疾病等的情況下，尿中的蛋白質(zhì)的量增加。因而，測(cè)定白蛋白等蛋白質(zhì)，在這些疾病的診斷中可以成為重要的指標(biāo)。
在蛋白質(zhì)測(cè)定的領(lǐng)域中，已知使用蛋白質(zhì)誤差指示劑的簡(jiǎn)便的測(cè)定方法。在該測(cè)定方法中，作為蛋白質(zhì)誤差指示劑，例如使用著四溴酚藍(lán)(TBPB)，如果舉一個(gè)例子，使用TBPB的尿試紙，作為一次性篩選用被廣泛地使用著。當(dāng)存在蛋白質(zhì)時(shí)，在pH3附近，TBPB的酚性羥基就會(huì)解離，從黃色變?yōu)樗{(lán)色，因此就可以檢測(cè)出蛋白質(zhì)。
但是，將TBPB作為指示劑使用的試紙，因?yàn)閷?duì)于臨床必須的10～20mg/dL的低濃度蛋白質(zhì)的檢測(cè)靈敏度不夠，所以有時(shí)不能正確地檢測(cè)蛋白質(zhì)。例如，在與色表比較而進(jìn)行的目測(cè)判斷中，因?yàn)殛幮缘鞍踪|(zhì)與痕跡蛋白質(zhì)的顏色相近，所以難以區(qū)別而判斷有困難。另一方面，即使在使用尿試紙的測(cè)定裝置時(shí)，因?yàn)門(mén)BPB的靈敏度低，而經(jīng)常有判斷錯(cuò)誤的情況。
為此希望有可以以更高靈敏度定量地測(cè)定低濃度蛋白質(zhì)的技術(shù)，特別希望開(kāi)發(fā)出TBPB以外的新型指示劑。


發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明者對(duì)用于以高靈敏度測(cè)定低濃度蛋白質(zhì)的指示劑進(jìn)行了篩選，結(jié)果發(fā)現(xiàn)將特定的鹵化氧雜蒽類色素作為目的指示劑是合適的，從而完成了本發(fā)明。
即，本發(fā)明提供一種具有用下述化學(xué)式(1)表示的化學(xué)結(jié)構(gòu)的蛋白質(zhì)測(cè)定用指示劑、使用該蛋白質(zhì)測(cè)定用指示劑的蛋白質(zhì)測(cè)定方法和蛋白質(zhì)測(cè)定用試驗(yàn)片。

在化學(xué)式(1)中，X1是鹵素、硝基或亞硝基，X2是鹵素，X3是鹵素或氫，X4是羥基或其鹽，X5是羧基或其鹽。在本發(fā)明中，作為蛋白質(zhì)測(cè)定用指示劑，在化學(xué)式(1)中，優(yōu)選為，X1是碘、溴、氯或硝基，X2是碘或溴，X3是氯、溴或氫，最優(yōu)選為，X1與X2是碘或溴，X3是氯。作為X4及X5中的鹽來(lái)說(shuō)，典型的可以列舉Na鹽。
作為本發(fā)明的蛋白質(zhì)測(cè)定用指示劑來(lái)說(shuō)，典型的可以列舉下述化學(xué)式(1)-1～(1)-5所表示的指示劑。其中，特別優(yōu)選下述化學(xué)式(1)-1及(1)-2所表示的蛋白質(zhì)測(cè)定用指示劑。



這些鹵化氧雜蒽類色素，在該色素的pKa以下的pH中，如果沒(méi)有蛋白質(zhì)共存，是無(wú)色～淡橙色，而如果有蛋白質(zhì)共存，就變色為紅～紫色。因此，如果與如TBPB那樣從黃色變?yōu)樗{(lán)色的情況相比，因?yàn)樵瓉?lái)的顏色是無(wú)色～淡色，所以容易檢測(cè)顏色的變化。因此，如果使用上述的鹵化氧雜蒽類色素，不論是目測(cè)判斷、或是使用測(cè)定裝置判斷，都變得可以適當(dāng)?shù)貦z測(cè)低濃度蛋白質(zhì)。
本發(fā)明的蛋白質(zhì)定量用試驗(yàn)片，可以使吸收性載體浸入含有上述鹵化氧雜蒽類色素、緩沖劑、增感劑等的含浸液中，通過(guò)使其干燥來(lái)制造。試驗(yàn)片可以直接使用，也可以粘接于非吸收體上來(lái)使用。
含浸液中的鹵化氧雜蒽類色素的濃度，沒(méi)有特別的限制，典型的是0.1～10mM，優(yōu)選的是0.5～2mM。
含浸液的pH值，例如比本申請(qǐng)的鹵化氧雜蒽類色素的pKa值稍稍低的值即取為1.5～4.5，優(yōu)選的是2.0～3.5。
作為緩沖劑來(lái)說(shuō)，在pH1.5～4.5的范圍中，具有良好的緩沖能力，只要是不阻礙鹵化氧雜蒽類色素與蛋白質(zhì)的反應(yīng)的物質(zhì)，什么物質(zhì)都可以。作為緩沖劑來(lái)說(shuō)，可以使用例如甘氨酸緩沖液、檸檬酸緩沖液、琥珀酸緩沖液、蘋(píng)果酸緩沖液或酒石酸緩沖液。含浸液中的緩沖劑濃度，沒(méi)有特別的限制，典型的是0.1～1.5M、優(yōu)選0.3～1M。
作為增感劑來(lái)說(shuō)，可以使用例如聚乙二醇、聚丙二醇、聚碳酸酯或聚乙烯醚，優(yōu)選使用聚乙二醇或聚丙二醇。含浸液中的增感劑的濃度，沒(méi)有特定的限制，典型的是0.05～5wt％、優(yōu)選為0.1～1wt％。
作為吸收性載體來(lái)說(shuō)，可以使用不含蛋白質(zhì)成分的多孔性物質(zhì)，例如可以使用片狀或膜狀形態(tài)的材料。作為多孔性物質(zhì)來(lái)說(shuō)，可以列舉例如紙狀物、泡沫(發(fā)泡體)、織布狀物、無(wú)紡布狀物與編織狀物。作為用于形成吸收性載體的材料來(lái)說(shuō)，可以列舉例如棉、麻、纖維素、硝基纖維素、乙酸纖維素、石棉、玻璃纖維、二氧化硅纖維、碳纖維、硼纖維、聚酰胺、芳族聚酰胺、聚乙烯醇、聚乙酸乙烯酯、再生纖維素(人造絲)、聚酯、尼龍、聚丙烯酸、聚丙烯酸酯和聚烯烴。這些吸收性載體的形狀，沒(méi)有特別的限定，通常是矩形、長(zhǎng)方形、圓形或橢圓形。
作為非吸收體來(lái)說(shuō)，可以使用例如片狀或膜狀形態(tài)的非吸收體。作為用于形成非吸收體的材料來(lái)說(shuō)，可以列舉例如聚對(duì)苯二甲酸乙二醇酯、聚酯、聚丙烯、聚乙烯、聚氯乙烯、聚偏氯乙烯與聚苯乙烯。

具體實(shí)施例方式 實(shí)施例 (實(shí)施例1) 在本實(shí)施例中，對(duì)能夠檢出低濃度蛋白質(zhì)的指示劑進(jìn)行了篩選。篩選是如下這樣進(jìn)行的，即，在篩選液中添加對(duì)象化合物，使其成為0.5mM，通過(guò)目測(cè)其發(fā)色性進(jìn)行觀察。作為篩選液來(lái)說(shuō)，使用了在0.7M蘋(píng)果酸緩沖液(pH2.2)中溶解了白蛋白15mg/dL、聚乙二醇0.5wt％這樣的溶液。作為對(duì)象化合物來(lái)說(shuō)，使用了市場(chǎng)銷(xiāo)售的各種色素。其結(jié)果是，對(duì)于下述化學(xué)式(2)-1～(2)-5所示的5種化合物，看到良好的發(fā)色。關(guān)于這些化合物的銷(xiāo)售廠商，如表1所示。



表1 化學(xué)式編號(hào)商品名制造廠商(2)-1 フロキシンB 東京化成株式會(huì)社(2)-2 ロ一ズベンガル 東京化成株式會(huì)社(2)-3 エリスロシンB 東京化成株式會(huì)社(2)-4 エオシンY 和光純薬工業(yè)株式會(huì)社(2)-5 エオシンB 東京化成株式會(huì)社 (實(shí)施例2) 在本實(shí)施例中，評(píng)價(jià)了篩選過(guò)的指示劑的靈敏度。靈敏度是通過(guò)分別測(cè)定使白蛋白濃度為0.3mg/dL(陰性)或15mg/dL(陽(yáng)性)的尿含浸于試驗(yàn)片之后的反射率來(lái)進(jìn)行。試驗(yàn)片是通過(guò)將表2所示的組成的含浸液含浸于濾紙(Whatman社製“3MMChr”)之后再使其干燥而形成。使用色差計(jì)測(cè)定了反射率。各樣品的測(cè)定結(jié)果，示于表3中。在表3中，也同時(shí)表示各樣品的測(cè)定波長(zhǎng)。
表2指示劑緩沖液 增感劑 溶劑 樣品1 フロキシンB (0.5mM)蘋(píng)果酸緩沖液0.7M(pH2.2) 聚乙二醇 0.5wt％ 乙醇 (40wt％) 樣品2 フロキシンB (0.5mM)蘋(píng)果酸緩沖液0.7M(pH2.2) 無(wú) 乙醇 (40wt％) 樣品3 ロ一ズベンガル (0.5mM)蘋(píng)果酸緩沖液0.7M(pH2.6) 聚丙二醇 0.5wt％ 乙醇 (40wt％) 樣品4 ロ一ズベンガル (0.5mM)蘋(píng)果酸緩沖液0.7M(pH2.6) 無(wú) 乙醇 (40wt％) 樣品5 TBPB(0.5mM)蘋(píng)果酸緩沖液0.7M(pH3.4) 聚乙二醇 0.5wt％ 乙醇 (30wt％) 樣品6 TBPB(0.5mM)蘋(píng)果酸緩沖液0.7M(pH3.4) 無(wú) 乙醇 (30wt％) 注TBPB＝四溴酚藍(lán) 表3
由表3可知，使用化學(xué)式(2)-1所示的フロキシンB作為指示劑的樣品1、2和使用化學(xué)式(2)-2所示的ロ一ズベンガル作為指示劑的樣品3、4，與使用TBPB作為指示劑的樣品5、6相比，白蛋白濃度為0.3mg/dL(陰性)時(shí)的反射率大，白蛋白濃度為15mg/dL(陽(yáng)性)時(shí)的反射率小。也就是說(shuō)，フロキシンB或ロ一ズベンガル在這些pH條件下，因?yàn)槭菬o(wú)色的，所以與TBPB相比，非發(fā)色時(shí)(陰性)的光吸收量少，其反面，發(fā)色時(shí)(陽(yáng)性)的光吸收量變大。因此，フロキシンB或ロ一ズベンガル在陰性的尿與陽(yáng)性的尿的反射率的差分

大，該差分

就成為T(mén)BPB的兩倍。因此可以說(shuō)，フロキシンB或ロ一ズベンガル，針對(duì)フロキシンB的靈敏度高，即使白蛋白的濃度是10～20mg/dL左右的低濃度，也能夠適當(dāng)?shù)貦z出白蛋白。
本發(fā)明人還對(duì)各樣品是否能目測(cè)判定作了進(jìn)一步的研究。其結(jié)果是，使用フロキシンB或ロ一ズベンガル的樣品1～4，在白蛋白濃度為15mg/dL時(shí)，從無(wú)色發(fā)色為紅色，可以容易確認(rèn)其發(fā)色(陽(yáng)性)。與此相對(duì)，使用TBPB作為指示劑的樣品5、6，在白蛋白濃度為15mg/dL時(shí)，與陰性時(shí)的黃色幾乎沒(méi)有差別，以目測(cè)檢出有無(wú)發(fā)色是困難的。這樣，在使用フロキシンB或ロ一ズベンガル作為指示劑時(shí)，即使是白蛋白濃度低的情況下，也可以由目測(cè)容易地檢出白蛋白。
另外，實(shí)施例2中的實(shí)驗(yàn)結(jié)果是關(guān)于尿樣的，但本發(fā)明不限于尿，也可以適用于定量測(cè)定含有蛋白質(zhì)的各種試樣例如血液、含蛋白質(zhì)飲料、工廠廢水中的蛋白質(zhì)的情況。
權(quán)利要求
1.一種蛋白質(zhì)測(cè)定方法，它是使用蛋白質(zhì)測(cè)定用指示劑來(lái)測(cè)定蛋白質(zhì)的方法，其特征在于
作為蛋白質(zhì)測(cè)定用指示劑，使用具有用下述化學(xué)式(1)表示的化學(xué)結(jié)構(gòu)的物質(zhì)，
在化學(xué)式(1)中，X1是鹵素、硝基或亞硝基，X2是鹵素，X3是鹵素或氫，X4是羥基或其鹽，X5是羧基或其鹽。
2.如權(quán)利要求1所述的蛋白質(zhì)測(cè)定方法，其特征在于在所述化學(xué)式(1)中，X1是碘、溴、氯或硝基，X2是碘或溴，X3是氯、溴或氫。
3.如權(quán)利要求2所述的蛋白質(zhì)測(cè)定方法，其特征在于在所述化學(xué)式(1)中，X1和X2是碘或溴，X3是氯。
4.如權(quán)利要求3所述的蛋白質(zhì)測(cè)定方法，其特征在于作為所述蛋白質(zhì)指示劑，使用選自下述化學(xué)式(1)-1～(1)-5中的至少一種，
5.如權(quán)利要求1所述的蛋白質(zhì)測(cè)定方法，其特征在于
所述蛋白質(zhì)指示劑，在該蛋白質(zhì)指示劑的pKa以下的pH中，在不共存蛋白質(zhì)時(shí)，呈現(xiàn)無(wú)色～淡橙色，而在共存蛋白質(zhì)時(shí)，呈現(xiàn)紅～紫色。
6.如權(quán)利要求1所述的蛋白質(zhì)測(cè)定方法，其特征在于所述蛋白質(zhì)是白蛋白。
7.如權(quán)利要求6所述的蛋白質(zhì)測(cè)定方法，其特征在于在白蛋白濃度處于10～20mg/dL范圍的含白蛋白試樣中，測(cè)定白蛋白濃度。
8.一種蛋白質(zhì)測(cè)定用指示劑，它是用于測(cè)定蛋白質(zhì)的指示劑，其特征在于具有用下述化學(xué)式(2)表示的化學(xué)結(jié)構(gòu)，
在化學(xué)式(2)中，X1是鹵素、硝基或亞硝基，X2是鹵素，X3是鹵素或氫，X4是羥基或其鹽，X5是羧基或其鹽。
9.如權(quán)利要求8所述的蛋白質(zhì)測(cè)定用指示劑，其特征在于在所述化學(xué)式(2)中，X1是碘、溴、氯或硝基，X2是碘或溴，X3是氯、溴或氫。
10.如權(quán)利要求9所述的蛋白質(zhì)測(cè)定用指示劑，其特征在于在所述化學(xué)式(2)中，X1及X2是碘或溴，X3是氯。
11.如權(quán)利要求8所述的蛋白質(zhì)測(cè)定用指示劑，其特征在于具有由下述化學(xué)式(2)-1～(2)-5中的任一個(gè)表示的化學(xué)結(jié)構(gòu)，
12.如權(quán)利要求8所述的蛋白質(zhì)測(cè)定用指示劑，其特征在于在pKa以下的pH中，在共存蛋白質(zhì)時(shí)呈現(xiàn)無(wú)色～淡橙色，而在共存蛋白質(zhì)時(shí)呈現(xiàn)紅～紫色。
13.一種蛋白質(zhì)測(cè)定用試驗(yàn)片，它是用于定量或半定量地測(cè)定蛋白質(zhì)的試驗(yàn)片，其特征在于作為蛋白質(zhì)定量指示劑，使用具有用下述化學(xué)式(3)表示的化學(xué)結(jié)構(gòu)的物質(zhì)，
在化學(xué)式(3)中，X1是鹵素、硝基或亞硝基，X2是鹵素，X3是鹵素或氫，X4是羥基或其鹽，X5是羧基或其鹽。
14.如權(quán)利要求13所述的蛋白質(zhì)測(cè)定用試驗(yàn)片，其特征在于在所述化學(xué)式(3)中，X1是碘、溴、氯或硝基，X2是碘或溴，X3是氯、溴或氫。
15.如權(quán)利要求13所述的蛋白質(zhì)測(cè)定用試驗(yàn)片，其特征在于在所述化學(xué)式(3)中，X1及X2是碘或溴，X3是氯。
16.如權(quán)利要求13所述的蛋白質(zhì)測(cè)定用試驗(yàn)片，其特征在于作為所述蛋白質(zhì)指示劑，使用選自下述化學(xué)式(3)-1～(3)-5中的至少一種，
17.如權(quán)利要求13所述的蛋白質(zhì)測(cè)定用試驗(yàn)片，其特征在于所述蛋白質(zhì)指示劑，在該蛋白質(zhì)指示劑的pKa以下的pH中，在共存蛋白質(zhì)時(shí)呈現(xiàn)無(wú)色～淡橙色，而在不共存蛋白質(zhì)時(shí)呈現(xiàn)紅～紫色。
18.如權(quán)利要求13所述的蛋白質(zhì)測(cè)定用試驗(yàn)片，其特征在于還含有用于提高針對(duì)蛋白質(zhì)的發(fā)色靈敏度的增感劑。
19.如權(quán)利要求18所述的蛋白質(zhì)測(cè)定用試驗(yàn)片，其特征在于作為所述增感劑，含有聚乙二醇和聚丙二醇之中的至少一個(gè)。
全文摘要
本發(fā)明涉及測(cè)定蛋白質(zhì)的技術(shù)。在本發(fā)明中，作為蛋白質(zhì)測(cè)定用指示劑，使用具有用下述化學(xué)式(1)表示的化學(xué)結(jié)構(gòu)的物質(zhì)。在化學(xué)式(1)中，X1是鹵素、硝基或亞硝基，X2是鹵素，X3是鹵素或氫，X4是羥基或其鹽，X5是羧基或其鹽。
文檔編號(hào)G01N33/68GK1675553SQ03819039
公開(kāi)日2005年9月28日 申請(qǐng)日期2003年8月4日 優(yōu)先權(quán)日2002年8月9日
發(fā)明者小坂秀子 申請(qǐng)人:愛(ài)科來(lái)株式會(huì)社