專利名稱：檢測混合物中配體和靶標(biāo)的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本專利是關(guān)于表征與配體結(jié)合的靶標(biāo)的方法。
背景技術(shù)：
親和層析是從某種樣品中濃縮和分離靶分子的常用方法，它是基于靶分子和其結(jié)合物(如配體)的特異性的三維相互作用。幾乎任何靶分子都可以分離或獲得與其結(jié)合的配體。潛在的配體包括生物分子如蛋白質(zhì)、抗體、肽等等。用組合合成技術(shù)可以產(chǎn)生含上百萬潛在配體的文庫，這些技術(shù)已被本領(lǐng)域所熟知(可參考Lam et al.，Nature，354，82-84(1991)和國際專利申請WO 92/00091)。為有助于從樣品中分離靶分子，可以將配體固定到一種固體支持基質(zhì)上，例如單個的顆粒(如層析樹脂珠)或連續(xù)的支持物(如芯片)。固定在固體支持基質(zhì)上的配體可以用來從復(fù)雜的溶液中純化靶標(biāo)(Baumbach andHammond，BioPharm May，24-31(1992))。
除了可以從樣品中分離靶分子外，親和層析還提供了檢測潛在的配體和靶分子間相互作用的手段。檢測靶標(biāo)-配體的結(jié)合是富有挑戰(zhàn)性的。已經(jīng)發(fā)展了一些檢測靶標(biāo)-配體復(fù)合物的方法，例如放射性標(biāo)記和免疫學(xué)方法(可參考美國專利5,834,318，國際專利申請WO01/40265，和美國專利申請09/453,115)。但是，目前可獲得的檢測技術(shù)有潛在的缺點(diǎn)，包括需要通過放射性標(biāo)記來修飾靶標(biāo)，存在來自配體-靶標(biāo)-檢測系統(tǒng)間相互作用的干擾，以及只能檢測比較少的檢測方法已經(jīng)建立的靶標(biāo)。
鑒于上述原因，有必要建立一種檢測靶標(biāo)-配體結(jié)合的方法，該方法不需要修飾待檢的靶標(biāo)，能夠檢測從配體分離的靶標(biāo)并鑒定配體，還可以通過其生物的、生化的或化學(xué)的特性來檢測靶標(biāo)。本發(fā)明提供了這樣的一種方法。本發(fā)明的上述和其他一些優(yōu)點(diǎn)，以及另外的發(fā)明特征，將在下面對本發(fā)明的說明中得到體現(xiàn)。
發(fā)明概述本發(fā)明提供了一種表征與配體結(jié)合的靶標(biāo)的方法。在一個實(shí)施方案中，該方法包括1.提供一種或多種配體，使每種配體吸附在一種支持物上形成一種或多種配體-支持物復(fù)合物；2.將配體-支持物復(fù)合物與一種或多種靶標(biāo)在一定條件下接觸，該條件可使至少一種靶標(biāo)與至少一種配體-支持物復(fù)合物結(jié)合，從而形成一種或多種靶標(biāo)-配體-支持物復(fù)合物；3.將配體-支持物復(fù)合物和靶標(biāo)-配體-支持物復(fù)合物固定在第一基質(zhì)上，使每個配體-支持物復(fù)合物和每個靶標(biāo)-配體-支持物復(fù)合物在基質(zhì)中有不同的位置；4.將至少一種靶標(biāo)-配體-支持物復(fù)合物中的至少一些靶標(biāo)轉(zhuǎn)移到第二基質(zhì)，使靶標(biāo)-配體-支持物復(fù)合物中的配體-支持物復(fù)合物仍然保留在第一基質(zhì)中，而第二基質(zhì)中的靶標(biāo)的位置與第一基質(zhì)中配體-支持物復(fù)合物的位置相對應(yīng)；5.檢測第二基質(zhì)上的靶標(biāo)。
作為替代方法，表征與配體結(jié)合的靶標(biāo)的方法包括1.提供一種或多種配體；2.將每種配體固定在第一基質(zhì)上，使每種配體在第一基質(zhì)上有不同的位置；3.將第一基質(zhì)中的配體與一種或多種靶標(biāo)在一定條件下接觸，使至少一種靶標(biāo)與至少一種配體結(jié)合，從而在第一基質(zhì)上形成一種或多種靶標(biāo)-配體復(fù)合物；4.將至少一種靶標(biāo)-配體復(fù)合物中的至少一些靶標(biāo)轉(zhuǎn)移到第二基質(zhì)，使靶標(biāo)-配體復(fù)合物中的配體仍然保留在第一基質(zhì)中，而第二基質(zhì)中的靶標(biāo)的位置與第一基質(zhì)中配體的位置相對應(yīng)；5.檢測第二基質(zhì)上的靶標(biāo)。這些方法用于表征與配體結(jié)合的靶標(biāo)。
發(fā)明詳述本發(fā)明提供一種方法可以同時檢測從樣品中分離的靶分子和鑒定能特異性結(jié)合靶分子的配體。具體地說，本發(fā)明提供了一種表征與配體結(jié)合的靶標(biāo)的方法。該方法包括1.提供一種或多種配體，使每種配體吸附在一種支持物上形成一種或多種配體-支持物復(fù)合物；2.將配體-支持物復(fù)合物與一種或多種靶標(biāo)在一定條件下接觸，該條件可使至少一種靶標(biāo)與至少一種配體-支持物復(fù)合物結(jié)合，從而形成一種或多種靶標(biāo)-配體-支持物復(fù)合物；3.將配體-支持物復(fù)合物和靶標(biāo)-配體-支持物復(fù)合物固定在第一基質(zhì)上，使每種配體-支持物復(fù)合物和每種靶標(biāo)-配體-支持物復(fù)合物在基質(zhì)中有不同的位置；4.將至少一種靶標(biāo)-配體-支持物復(fù)合物中的至少一部分靶標(biāo)(如一種或多種靶分子)轉(zhuǎn)移到第二基質(zhì)，使靶標(biāo)-配體-支持物復(fù)合物中的配體-支持物復(fù)合物仍然保留在第一基質(zhì)中，其中靶標(biāo)在第二基質(zhì)中的位置與第一基質(zhì)中配體-支持物復(fù)合物的位置相對應(yīng)；5.檢測第二基質(zhì)上的靶標(biāo)。作為替代方法，該方法包括1.提供一種或多種配體；2.將每種配體固定在第一基質(zhì)上，使每種配體在第一基質(zhì)上有不同的位置；3.將第一基質(zhì)中的配體與一種或多種靶標(biāo)在一定條件下接觸，使至少一種靶標(biāo)結(jié)合上至少一種配體，從而在第一基質(zhì)中形成一種或多種靶標(biāo)-配體復(fù)合物；4.將至少一種靶標(biāo)-配體復(fù)合物中的至少一些靶標(biāo)轉(zhuǎn)移到第二基質(zhì)，使靶標(biāo)-配體復(fù)合物中的配體仍然保留在第一基質(zhì)中，其中靶標(biāo)在第二基質(zhì)中的位置與第一基質(zhì)中配體的位置相對應(yīng)；5.檢測第二基質(zhì)上的靶標(biāo)。因此本發(fā)明的方法可以表征與配體結(jié)合的靶標(biāo)。
本發(fā)明與以往的配體與靶標(biāo)的篩選方法相比有許多優(yōu)點(diǎn)。首先，靶標(biāo)和與其相關(guān)的配體可在解離后檢測。此外，靶標(biāo)和配體在被檢測時均不需要預(yù)先修飾。因此，檢測系統(tǒng)的組分和配體、支持物或系統(tǒng)的其他元素間的相互作用就被避免了。第二，因為樣品中的所有成分可被捕獲在第一或第二基質(zhì)上的獨(dú)特位置，所以可以先后或同時從第二基質(zhì)中篩選多種獨(dú)立的靶標(biāo)的存在。而本發(fā)明的另一個優(yōu)點(diǎn)是如果需要可以保持靶標(biāo)的生物、生化或化學(xué)活性。轉(zhuǎn)移條件可以方便的控制，從而在某個時間只轉(zhuǎn)移一部分結(jié)合的靶標(biāo)，這樣可以確定靶標(biāo)的特異性洗脫條件或有選擇地轉(zhuǎn)移靶標(biāo)的不同亞型。事實(shí)上，通過不同的洗脫條件，有可能區(qū)分化學(xué)或一級結(jié)構(gòu)基本相同的分子或生物體或?qū)τ丑w，因此可以展示不同的三維或四級結(jié)構(gòu)。此外，通過用含能競爭結(jié)合靶分子上活性位點(diǎn)的分子的轉(zhuǎn)移緩沖液將靶分子轉(zhuǎn)移到第二基質(zhì)上還可以識別能特異性結(jié)合該活性位點(diǎn)的配體。這些優(yōu)點(diǎn)使本發(fā)明的方法比前面提到的本領(lǐng)域的傳統(tǒng)方法更具優(yōu)勢。
靶標(biāo)基于本發(fā)明的目的，術(shù)語“靶標(biāo)”在這里是指能與配體結(jié)合的任何生物的、化學(xué)的或生化的實(shí)體，如某種化合物、分子、病毒或細(xì)胞。靶標(biāo)可以是從自然界分離的，也可以是合成制造的，在自然界中可以是有機(jī)的也可以是無機(jī)的(如合成的無機(jī)化合物或合成的有機(jī)化合物)。舉例來說，靶標(biāo)可以是一種藥物或候選藥物(如小分子候選藥物)，一種肥料成分，一種殺蟲劑成分，或者是它們的衍生物、類似物或?qū)τ丑w。此外，靶標(biāo)對任何原核生物或真核生物來說可以是內(nèi)源的或外源的，這些生物可以是一種細(xì)菌、真菌、酵母、植物或哺乳動物。適合本發(fā)明方法的靶標(biāo)包括(并不僅限于)細(xì)胞(如干細(xì)胞或培養(yǎng)細(xì)胞)，細(xì)菌，病毒，酵母，蛋白質(zhì)，肽類，蛋白復(fù)合物(如凝血因子XIII和纖維蛋白原或凝血因子VIII和Von Willebrand因子)，朊病毒蛋白，氨基酸，核酸，糖類，脂類，以及上述物質(zhì)的同種型和它們的混合物。優(yōu)選的靶標(biāo)是蛋白質(zhì)。適合的蛋白質(zhì)靶標(biāo)包括諸如受體、抗體、免疫原、酶(如蛋白酶)和酶底物等。更優(yōu)選的蛋白質(zhì)靶標(biāo)是血漿蛋白質(zhì)。血漿蛋白質(zhì)包括諸如丁酰膽堿脂酶(BChE)，纖維蛋白原，α-1蛋白酶抑制劑，載脂蛋白A1(也稱為Apo-A1脂蛋白)，免疫球蛋白，對氧磷酶(paraoxonase)或凝固因子等，所有這些蛋白質(zhì)是機(jī)體在非疾病狀態(tài)下自然存在的。另外，血漿蛋白質(zhì)也包括在某種疾病狀態(tài)下血漿中出現(xiàn)的蛋白(可能在健康個體血漿中沒有)，或者是在使用了某種藥劑(如某種治療藥物)后出現(xiàn)在血漿中。在這點(diǎn)上，血漿蛋白質(zhì)可以是一種感染性的PrPsc朊病毒蛋白。
本發(fā)明方法的靶標(biāo)可以從任何來源獲得。含靶標(biāo)的樣品可以是一種復(fù)合溶液，如土壤浸出液、空氣、水、食物、用于評價環(huán)境污染的拭子、化學(xué)反應(yīng)的中間產(chǎn)物或終產(chǎn)物，諸如此類。含靶標(biāo)的樣品可以是一種化學(xué)的或合成的混合物，可以存在于一個組合文庫和/或極端壓力、溫度等條件下的有機(jī)溶劑中。優(yōu)選的靶標(biāo)存在于生物流體中或從生物流體中分離得到?！吧锪黧w”是指從原核生物或真核生物中獲得的任何水溶液。生物流體可以從原核生物或真核生物中直接獲得，如血液、淋巴、淚液、唾液、汗液和尿液。另外，生物流體也可以從培養(yǎng)細(xì)胞中獲得，如發(fā)酵培養(yǎng)基或細(xì)胞培養(yǎng)液。適合本發(fā)明方法的生物流體包括(并不僅限于)血液、血漿、血清、細(xì)胞勻漿、組織勻漿、條件培養(yǎng)基、發(fā)酵培養(yǎng)基、腦脊液、尿液、唾液、乳汁、導(dǎo)管液、淚液、汗液、淋巴和精液。優(yōu)選的生物流體是血液。更優(yōu)選的生物流體是血漿。
本發(fā)明方法的一個優(yōu)點(diǎn)是能夠在生物、生化或化學(xué)活性的基礎(chǔ)上識別和/或鑒定靶標(biāo)，不需要預(yù)先知道靶標(biāo)的分子特征。因而，靶標(biāo)可以具有生物活性，在實(shí)施本發(fā)明方法時不需要經(jīng)過加工(如熱滅活)。例如，在某種未知靶標(biāo)(如一種病毒)被轉(zhuǎn)移到相應(yīng)位置后，第二支持材料上生長的細(xì)胞培養(yǎng)物的活力可能增強(qiáng)或減弱。同樣的，靶標(biāo)影響更特異的細(xì)胞功能(如產(chǎn)生特殊蛋白質(zhì)或其他細(xì)胞成分)的能力可以被加強(qiáng)或減弱，從而提供靶標(biāo)的有價值的特性。靶標(biāo)也可以是一種活細(xì)胞，當(dāng)其被轉(zhuǎn)移到第二基質(zhì)上后暴露在某種毒性化合物中以鑒定細(xì)胞對毒素的抵抗力。因此，本發(fā)明提供了一種方法用于鑒定有特異生物學(xué)活性的新靶標(biāo)或未知靶標(biāo)(如在實(shí)施本發(fā)明方法前還未被鑒別的蛋白質(zhì))。一旦在第二支持物上識別出靶標(biāo)的獨(dú)特位置，就可以確定其在第一支持物上的位置，就可以鑒定最初捕獲它的配體。
配體基于本發(fā)明的目的，術(shù)語“配體”這里指能與靶標(biāo)結(jié)合的任何生物的、化學(xué)的或生化的實(shí)體，如一種化合物、分子或細(xì)胞。配體可以是從自然界分離的或是合成制造的材料。配體對一種原核生物或真核生物來說可以是內(nèi)源的或外源的，這些生物可以是一種細(xì)菌、真菌、酵母、植物或哺乳動物。適合本發(fā)明的配體包括(并不僅限于)氨基酸，肽類，核酸，抗體制品(如抗體片段、化學(xué)修飾抗體等等)，碳水化合物，糖類，脂類，有機(jī)分子，以及它們的混合物，所有上述物質(zhì)可以是潛在的預(yù)防或治療生物學(xué)上的機(jī)能紊亂的藥物。
有機(jī)分子包括，例如常被用做治療藥物的有機(jī)合成化合物。這樣的分子可以用組合合成的方法大量產(chǎn)生，也可以通過某些合成策略設(shè)計更特異的分子。同樣，有機(jī)分子也包括自然界的產(chǎn)物和類似物，無論它們是從自然環(huán)境中提取的或是人工合成的。術(shù)語“有機(jī)的”這里并不僅限于只含有碳和氫的分子，而是采用廣義用法，包括生物領(lǐng)域的大分子。
優(yōu)選的配體是肽類。更優(yōu)選地肽基本上由大約1個至15個氨基酸組成。術(shù)語“肽”這里指含至少一個肽鍵的實(shí)體，可以含有D型和/或L型氨基酸。理想的配體是基本上由2個至10個左右氨基酸組成的肽(例如約2、3、4、5、6、7、8、9或10個左右的氨基酸)。如需要，肽配體可以用常用的產(chǎn)生組合文庫的方法制備，例如切割、偶聯(lián)、重組或為本領(lǐng)域所熟知的其他方法(參考Furka et al.，Int.J.Peptide Protein Res.，37，487-493(1991)；Lam et al.，Nature，354，82-84(1991)；國際專利申請WO 92/00091；美國專利5,010,175，5,133,866，和5,498,538)。肽文庫的表達(dá)在Devlin et al.，Science，249，404-406(1990)中也有描述。在肽文庫中，含不同序列的肽的數(shù)目隨著偶聯(lián)反應(yīng)數(shù)、肽的大小和使用的不同氨基酸數(shù)的增加迅速增加。例如，將19種氨基酸隨機(jī)插入五肽可獲得多達(dá)2,476,099(195)種序列不同的肽(Lam et al.，supra)。組合方法允許直接在支持物上制備配體文庫。典型的做法是將配體合成在支持物基質(zhì)的顆粒上，使每個配體的多個拷貝合成在一個顆粒(如珠子)上，當(dāng)然這種做法不是實(shí)施本發(fā)明所必需的。
本發(fā)明方法可以通過將兩種或多種配體與一種靶標(biāo)接觸從而同時確定靶標(biāo)的多種配體。同樣，本發(fā)明方法可同時鑒定和/或確定一個樣品中的多種靶標(biāo)。在這點(diǎn)上，配體或配體-支持物復(fù)合物可以在一定條件下與兩種或多種靶標(biāo)接觸，使至少一種靶標(biāo)結(jié)合上至少一種配體-支持物復(fù)合物，從而形成一種或多種靶標(biāo)-配體復(fù)合物(該復(fù)合物可以進(jìn)一步與支持物結(jié)合形成復(fù)合物)。
支持物和基質(zhì)術(shù)語“支持物”這里指用于固定配體的任何支持基質(zhì)，例如本領(lǐng)域已知的固相支持物。合適的支持物包括(并不僅限于)薄膜、濾紙、篩網(wǎng)、或各種顆粒，這些顆粒是由下列材料構(gòu)成或是由下列材料包裹纖維素、丙烯酸樹脂、聚丙烯酰胺或多羥基化甲基丙烯酸酯聚合物、聚苯乙烯、葡聚糖、瓊脂糖、多糖、親水乙烯基聚合物、以及它們的聚合衍生物及其任意組合，適當(dāng)?shù)闹С治镞€包括各種多孔的或無孔的基質(zhì)，配體可以直接吸附在這些基質(zhì)上面或在其上合成。優(yōu)選的支持物是惰性的，因而其與靶標(biāo)和/或配體的化學(xué)反應(yīng)減到最少。一種特別優(yōu)選的支持物是多羥基甲基丙烯酸聚合物。多種樹脂都可以通過商業(yè)途徑購買到，優(yōu)選支持物是樹脂珠，如層析用的樹脂珠。許多展示潛在配體的固相支持物可以通過商業(yè)途徑購買到。另外，本發(fā)明方法的一種或多種配體可以用標(biāo)準(zhǔn)方法間接吸附或直接固定在第一支持物上，這些方法可參考Harlow and Lane，Antibodies，ColdSpring Harbor Laboratory，Cold Spring Harbor，NY(1988)；Biancala et al.，Letters in Peptide Science，7(291)，297(2000)；MacBeath et al.，Science，289，1760-1763(2000)；Cass et al.，ed.，Proceedings of the Thirteenth AmericanPeptide Symposium.Leiden，Escom，975-979(1994)；U.S.Patent5,576,220；Cook et al.，Tetrahedron Letters；35，6777-6780(1994)；and Fodor et al.，Science，251(4995)，767-773(1991)。在一個實(shí)施方案中，配體合成在支持物的表面，這種方法對制備肽文庫較有利。配體可以直接化學(xué)結(jié)合到支持物上，或者通過一些接頭與支持物連接，如鏈親和素、β丙氨酸、甘氨酸、含有甘氨酸-絲氨酸的聚合物、分子式含-(CH2)-的短鏈碳水化合物、聚乙二醇、ε氨基己酸，以及含-O(CH2)n的接頭，其中n為1-30。如需要，配體可以通過一個或多個可解離的接頭連接，如對光或?qū)λ岵环€(wěn)定的部分，這樣就可以選擇性的解離一部分配體用于分析。解離下來的配體有多種用途，如作為蛋白親和純化的基質(zhì)，對映體分離(例如濃縮、分離、檢測、鑒定、定量或識別樣品中的靶標(biāo))，作為診斷治療工具，化學(xué)反應(yīng)的催化劑和增強(qiáng)劑，以及蛋白質(zhì)的選擇性穩(wěn)定劑。
在本發(fā)明方法中，配體-支持物復(fù)合物、靶標(biāo)-配體-支持物復(fù)合物、或者配體(由實(shí)施者確定的本發(fā)明方法的參數(shù)決定)固定在第一基質(zhì)上。基質(zhì)可以是任何具有至少兩維結(jié)構(gòu)的固相材料，配體-支持物復(fù)合物、靶標(biāo)-配體-支持物復(fù)合物、或者配體可以固定在其上或其內(nèi)?；|(zhì)材料的選擇應(yīng)使靶標(biāo)可以從第一基質(zhì)上轉(zhuǎn)移到第二種基質(zhì)上。比較理想的第一基質(zhì)對靶標(biāo)和配體來說是一種化學(xué)惰性材料。第一基質(zhì)可以包括如瓊脂糖、聚丙烯酰胺、葡聚糖、纖維素、多糖，以及它們的衍生物或其任意組合。另外，第一基質(zhì)還可以包含尼龍、棉花、聚乙烯二氟尼龍、硅、玻璃、苯乙烯、聚苯乙烯、聚丙烯酸酯、聚甲基丙烯酸酯，以及它們的衍生物或其任意組合。基質(zhì)可以制成膠體、膜或其他適當(dāng)?shù)谋砻妗?br> 在本發(fā)明方法中，結(jié)合了一種或多種配體的靶標(biāo)的至少一部分(也就是一個或多個靶分子)被轉(zhuǎn)移到第二基質(zhì)上。第二基質(zhì)可以是任何具有至少兩維結(jié)構(gòu)的固相材料，靶標(biāo)可以從第一基質(zhì)轉(zhuǎn)移到其上。與第一基質(zhì)一樣，第二基質(zhì)最好對靶標(biāo)和配體來說是一種化學(xué)惰性材料。適合于第一基質(zhì)的組成材料也適合于第二基質(zhì)。較合適的第二基質(zhì)可以由諸如硝酸纖維素、硅、苯乙烯、玻璃、和/或聚乙烯二氟尼龍等構(gòu)成。
為讓靶標(biāo)-配體-支持物復(fù)合物上的至少一部分靶標(biāo)轉(zhuǎn)移到第二基質(zhì)上，可以將第一基質(zhì)與一種溶液(例如一種“轉(zhuǎn)移緩沖液”)接觸以促進(jìn)靶標(biāo)和配體的解離。轉(zhuǎn)移緩沖液可以具有不同的鹽濃度、pH值、變性能力、有機(jī)溶劑和去離子水。兩者擇一地或另外，一種電梯度能夠?qū)袠?biāo)從靶標(biāo)-配體-支持物復(fù)合物上解離下來。轉(zhuǎn)移緩沖液還可以含有配體(與靶標(biāo)-配體-支持物復(fù)合物中的配體不同)、靶標(biāo)的輔助因子、對映異構(gòu)的特異性分子等等。使用不同的轉(zhuǎn)移緩沖液可以研究靶標(biāo)的洗脫條件或者將特定的靶標(biāo)亞群轉(zhuǎn)移到第二基質(zhì)上。
本發(fā)明方法所使用的解離和轉(zhuǎn)移條件應(yīng)使第一基質(zhì)上的配體的破壞最小。換句話說，洗脫和解離條件應(yīng)不使配體(或配體-支持物復(fù)合物)從第一基質(zhì)上釋放下來(除非需要如此)。此外，靶標(biāo)固定在第二基質(zhì)上的位置應(yīng)與配體在第一基質(zhì)上的位置對應(yīng)。因此，當(dāng)在第二基質(zhì)上選擇靶標(biāo)時，可以很容易的從第一基質(zhì)上的位置確定對應(yīng)的配體。
靶標(biāo)和/或受體的檢測/表征本發(fā)明方法進(jìn)一步包括檢測第二基質(zhì)上的靶標(biāo)，由此與配體結(jié)合的靶標(biāo)得到表征。術(shù)語“表征”及其相關(guān)詞語這里指對靶標(biāo)的特別的性質(zhì)和性狀的識別，并不需要已知靶標(biāo)的確切化學(xué)特性如分子式、化學(xué)結(jié)構(gòu)、核苷酸序列或氨基酸序列等。當(dāng)然，靶標(biāo)的特性決定了如何檢測第二基質(zhì)上的靶標(biāo)。在這方面，檢測方法是使用某種可與靶標(biāo)發(fā)生可測相互作用的分子或生物的實(shí)體，從而確定第二基質(zhì)上靶標(biāo)的存在。許多這樣的方法和材料在本領(lǐng)域都是已知的。
靶標(biāo)可以用諸如免疫學(xué)和放射學(xué)的方法直接檢測。對肽類靶標(biāo)來說，可以在靶標(biāo)中摻入含放射性同位素的氨基酸，這樣可以通過將第二基質(zhì)在放射自顯影膜上曝光來進(jìn)行檢測。類似的方法也可以用于檢測其他化學(xué)靶標(biāo)。
作為替代方法，靶標(biāo)也可以通過檢測其特性或活性來鑒定，如生物學(xué)特性、化學(xué)特性、物理特性、生化特性、或者上述特性的結(jié)合。任何能產(chǎn)生可測的生物或化學(xué)反應(yīng)的生物或化學(xué)特性都可以被測定，如對底物的酶促反應(yīng)。本發(fā)明方法的一個優(yōu)點(diǎn)就是靶標(biāo)是在保持其生物學(xué)活性不變的條件下轉(zhuǎn)移到第二基質(zhì)上的。靶標(biāo)的化學(xué)特性，例如與靶標(biāo)的化學(xué)組成直接相關(guān)的某種化學(xué)特性，可以用于檢測。換句話說，靶標(biāo)可以通過檢測特異的化學(xué)亞基或部分或化學(xué)結(jié)構(gòu)的存在來鑒定?？捎糜跈z測的物理特性包括光譜信號和分子量，它們可以分別用熒光或質(zhì)譜的方法來測定。檢測方法無需單獨(dú)測定靶標(biāo)，可以有選擇的測定靶標(biāo)復(fù)合物，例如含其他生物實(shí)體如輔因子或輔酶的靶標(biāo)復(fù)合物。
檢測第二基質(zhì)上的靶標(biāo)可以進(jìn)行結(jié)合試驗。結(jié)合試驗一般是將第二基質(zhì)與一個能結(jié)合某種底物的檢測部分接觸。常用于結(jié)合試驗的檢測部分包括抗體或其抗原結(jié)合片段、蛋白質(zhì)或寡核苷酸等。優(yōu)選的方法是將第二基質(zhì)與能結(jié)合靶標(biāo)(或靶標(biāo)的化學(xué)或生物副產(chǎn)物，或前述任何之一的片段)的抗體或其抗原結(jié)合片段接觸。結(jié)合部分優(yōu)選地用某種可檢測的標(biāo)簽標(biāo)記，例如放射性同位素、發(fā)色基團(tuán)、或熒光標(biāo)簽。在這樣的結(jié)合試驗中，可檢測的標(biāo)簽發(fā)出的信號被檢測到就表示靶標(biāo)的存在。一旦第二基質(zhì)上的靶標(biāo)的位置清楚了，第一基質(zhì)上對應(yīng)的配體也就得到鑒定。檢測靶標(biāo)的結(jié)合試驗在下列文獻(xiàn)中有進(jìn)一步的闡述Harlow and Lane，supra；Sambrook et al.，Molecular Cloning，A Laboratory Manual，2d edition，Cold Spring Harbor Press，Cold Spring Harbor，N.Y.(1989)；Haugland，Handbook ofFluorescent Probes and Research Chemicals (9th ed.)，Molecular Probes，Eugene，OR(2002)；and Coico et al.，CurrentProtocols in Immunology，v1-4，Wiley & Sons，Inc.，New York，NY.本發(fā)明方法還可以包含一個洗滌步驟，用于在檢測前除去過量的未結(jié)合的檢測部分或標(biāo)記物。
作為替代方法，本發(fā)明方法可以包含一個酶活性試驗從生物活性的角度來表征靶標(biāo)。將酶底物在一定條件下接觸第二基質(zhì)，該條件可使靶標(biāo)對底物產(chǎn)生酶促反應(yīng)，形成某種產(chǎn)物。該產(chǎn)物在第二基質(zhì)上被檢測出來，從而確定靶標(biāo)的位置。酶活性檢測方法在一些文獻(xiàn)中有詳細(xì)描述，如上文Haugland的著作。
可以進(jìn)行以細(xì)胞為基礎(chǔ)的試驗，將第二基質(zhì)與細(xì)胞接觸，使基質(zhì)上的靶標(biāo)對細(xì)胞產(chǎn)生可測的生物學(xué)效應(yīng)，如改變細(xì)胞的生長、遷移、使細(xì)胞死亡、產(chǎn)生可測的副產(chǎn)物等。舉例來說，優(yōu)選的靶標(biāo)可以是一種抗菌劑。本發(fā)明方法的配體與抗菌劑的潛在活性位點(diǎn)結(jié)合，將抗菌靶標(biāo)從樣品(如潛在治療劑庫)中分離出來。將抗菌靶標(biāo)轉(zhuǎn)移到第二基質(zhì)上，再與細(xì)菌平板接觸。通過觀測平板上的殺菌環(huán)來鑒定第二基質(zhì)上的抗菌靶標(biāo)。除了鑒定抗菌靶標(biāo)以外，本發(fā)明方法還可以進(jìn)一步鑒定該抗菌靶標(biāo)的活性位點(diǎn)。
檢測多種靶標(biāo)或一種靶標(biāo)的多種特性可以僅轉(zhuǎn)移一次靶標(biāo)到第二基質(zhì)上，再進(jìn)行多個獨(dú)立的檢測程序。本發(fā)明方法可以包含步驟(6)重復(fù)步驟(5)，但是檢測的靶標(biāo)特性與步驟(5)不同。可以鑒定靶標(biāo)的不同特性或者一種不同的靶標(biāo)。例如，如果步驟(5)含酶活性試驗，其中的酶是脫氫酶，該方法可以還包含結(jié)合試驗進(jìn)一步表征靶標(biāo)。另外，本發(fā)明方法還可以包含第二個酶活性試驗，以測定靶標(biāo)的另一種活性。
除了表征靶標(biāo)以外，也可以表征結(jié)合靶標(biāo)的配體。在這種實(shí)施方案中，本發(fā)明方法還包含鑒定待測靶標(biāo)在第二基質(zhì)上的位置，根據(jù)靶標(biāo)在第二基質(zhì)上的位置鑒定配體或配體一支持物復(fù)合物在第一基質(zhì)上的位置，再確定配體的化學(xué)特性。如果在第一基質(zhì)上配體與支持物形成復(fù)合物，可以將配體從配體一支持物復(fù)合物上解離下來以方便進(jìn)一步鑒定。也可以將配體轉(zhuǎn)移到第三種基質(zhì)上(這時如果需要可以將支持物保留在第一基質(zhì)上)，配體在第三種基質(zhì)上的位置與其在第一基質(zhì)上的位置對應(yīng)。然后可以用任何適當(dāng)?shù)姆椒z測第三種基質(zhì)上的配體，包括上述的各種方法。配體的化學(xué)特性可以用一些方法測定，如質(zhì)譜、Edman降解、核酸測序、高效液相色譜(HPLC)，或上述方法的任意組合。
第二基質(zhì)可以與第一基質(zhì)配合來鑒定被測靶標(biāo)對應(yīng)的配體-支持物復(fù)合物，可以用任何可行的方法。例如，對照小珠或配體可以在第一基質(zhì)中提供正確排列的參照。到最后，一系列被標(biāo)記的或用其他方法確認(rèn)的靶標(biāo)或支持物(例如結(jié)合了可測標(biāo)示物的配體或支持物)被用作對照顆粒。一小部分對照包含在靶標(biāo)-配體-支持物復(fù)合物中，隨后被固定在第一基質(zhì)上。檢測方法被用來檢測靶標(biāo)和對照物。檢測對照位置產(chǎn)生的信號，再結(jié)合標(biāo)記的對照配體或支持物來確定第二基質(zhì)中固定的支持物的方向。也可以使用額外的或替代的方法。第一基質(zhì)的方向和第二基質(zhì)的方向可以用物理方法相互關(guān)聯(lián)，比如用分散的互補(bǔ)的標(biāo)記將兩種基質(zhì)對應(yīng)起來，或者通過互補(bǔ)的物理性質(zhì)諸如交錯搭配等的方式來對準(zhǔn)基質(zhì)。
依照本發(fā)明的一個實(shí)施方案，配體文庫固定在支持物上，配體-支持物復(fù)合物以一定排列順序吸附在多孔的第一基質(zhì)上，如瓊脂糖凝膠。包含靶標(biāo)的樣品(如某種溶液)與配體-支持物復(fù)合物接觸。含靶標(biāo)的溶液濾過多孔的第一基質(zhì)，來影響配體-支持物復(fù)合物和靶標(biāo)間的接觸。作為選擇，可以在將配體-支持物復(fù)合物固定在多孔的第一基質(zhì)上之前，讓含靶標(biāo)的溶液與配體-支持物復(fù)合物接觸。部分配體會特異性的結(jié)合靶標(biāo)。通常的優(yōu)選方案是用一個確定的配體與一個單獨(dú)靶標(biāo)親和結(jié)合，同時排除靶標(biāo)的其他相近的化學(xué)和/或結(jié)構(gòu)類似物，盡管這并非必需。
靶標(biāo)從靶標(biāo)-配體-支持物上解離下來是通過流經(jīng)多孔的第一基質(zhì)的轉(zhuǎn)移緩沖液的毛細(xì)管作用，轉(zhuǎn)移緩沖液經(jīng)過靶標(biāo)-配體-支持物復(fù)合物，將靶標(biāo)從多孔的第一基質(zhì)上洗脫下來，再被第二基質(zhì)俘獲。一旦轉(zhuǎn)移到第二基質(zhì)上(如某種膜)，靶標(biāo)可以在第二基質(zhì)上被鑒定、檢測和定位。通過檢測第二基質(zhì)上的靶標(biāo)以及將靶標(biāo)在第二基質(zhì)上的位置與配體-支持物復(fù)合物在第一基質(zhì)上的排列位置相對應(yīng)，就有可能鑒定對靶標(biāo)具有親和性的配體-支持物復(fù)合物。
在本發(fā)明方法的實(shí)施中，靶標(biāo)-配體復(fù)合物可以被重復(fù)檢測。例如，每個支持物上的部分配體通過可切割的接頭與支持物連接，如可用酸切割的接頭，或可被聚焦到單個的支持物上的激光切割的光敏感性接頭。因此，當(dāng)配體-支持物復(fù)合物得到鑒定時，切割接頭就可以將部分配體從支持物上釋放下來進(jìn)入多孔的第一基質(zhì)中。然后配體就可以被分離和表征。
一旦配體被鑒定對特定靶標(biāo)具有特異性，這些配體就可以被用來俘獲、分離、檢測、和/或表征靶標(biāo)，例如，通過色譜分離的方法。為達(dá)此目的，本發(fā)明方法進(jìn)一步包括提供多拷貝的已被鑒定的配體，將鑒定配體的每個拷貝固定在一個支持物上，從而獲得多個配體-支持物復(fù)合物。將多個配體-支持物復(fù)合物與含多個靶標(biāo)的組合物在一定條件下接觸，使配體結(jié)合靶標(biāo)形成多個靶標(biāo)-配體-支持物復(fù)合物。靶標(biāo)從靶標(biāo)-配體-支持物復(fù)合物解離，如需要，還可以進(jìn)行更多輪的篩選。例如，本方法還可以包含對分離純化的靶標(biāo)進(jìn)行質(zhì)譜分析以確定或進(jìn)一步表征靶標(biāo)。被鑒定的配體也可以在診斷試驗中使用，用于固定或選擇性的轉(zhuǎn)移靶標(biāo)，以及作為模擬的或合成的受體(參考Still，Acc.Chem.Res.，29，155-163(1996))。另外，配體本身也可以用作治療劑、催化劑等等。
其他需要考慮的事項本發(fā)明提供了利用配體檢測靶標(biāo)、鑒定結(jié)合靶標(biāo)的配體、以及在靶標(biāo)的生物學(xué)、生物化學(xué)或化學(xué)活性的基礎(chǔ)上從樣品(包含潛在的未知配體和已知或新的靶標(biāo))中表征未知配體和新靶標(biāo)的方法。本發(fā)明還提供了優(yōu)化篩選生物和化學(xué)實(shí)體的方法。
本發(fā)明方法可以用于決定將靶標(biāo)(或任何分子)轉(zhuǎn)移到第二基質(zhì)(或任何基質(zhì))的優(yōu)選條件。例如，本發(fā)明方法可以包含步驟(6)重復(fù)步驟(4)，采用的基質(zhì)和條件與前面重復(fù)步驟(4)時不同。在這點(diǎn)上，用于將靶標(biāo)轉(zhuǎn)移到第二基質(zhì)上的轉(zhuǎn)移緩沖液可以改變鹽濃度、pH、變性劑含量、特異性競爭分子，等等。然后在不同條件下洗脫得到一組基質(zhì)，分別含有不同數(shù)量或不同種群的靶標(biāo)。本方法還包含步驟(7)檢測步驟(6)中每種基質(zhì)上的靶標(biāo)，和步驟(8)比較第二基質(zhì)上及步驟(6)中每種基質(zhì)上的靶標(biāo)數(shù)量。本發(fā)明方法的這個實(shí)施方案還可以用來決定配體從靶標(biāo)上解離的優(yōu)選條件，大量親和純化的可能的洗脫條件，或者用于給各種配體排序，探究它們的結(jié)合特性。
此外，本發(fā)明方法提供了研究靶標(biāo)和/或配體結(jié)合特性的手段。例如，本方法的步驟(4)可以在含競爭性結(jié)合劑的介質(zhì)中進(jìn)行，競爭性結(jié)合劑可以結(jié)合至少一個靶標(biāo)-配體-支持物復(fù)合物或靶標(biāo)-配體復(fù)合物中的靶標(biāo)，從而導(dǎo)致靶標(biāo)從第一基質(zhì)中的配體-支持物復(fù)合物或配體上解離下來?！案偁幮越Y(jié)合劑”是指除配體外能結(jié)合靶標(biāo)的任何生物或化學(xué)實(shí)體。優(yōu)選的競爭性結(jié)合劑從下列物質(zhì)中選擇炭疽桿菌、馬爾他布魯氏菌、埃博拉病毒、肉毒桿菌神經(jīng)毒素、葡萄球菌腸毒素B和西尼羅病毒。競爭性結(jié)合劑也可以是上述任何物質(zhì)的部分或片段。同樣，競爭性結(jié)合劑也可以從下列物質(zhì)中選擇篦麻毒素、硫芥子氣、索曼毒劑、沙林毒劑、塔崩毒劑、VX毒劑和光氣，或含有上述任何物質(zhì)的片段。向第一基質(zhì)中添加競爭性結(jié)合劑可以鑒定配體和靶標(biāo)間的相互作用(如結(jié)合親和性或特異性)。在潛在底物存在的情況下競爭洗脫靶標(biāo)還可以鑒定活性位點(diǎn)的拮抗劑和激動劑。
本發(fā)明方法還可用于從樣品中分離結(jié)構(gòu)同種型和對映體。例如，分離靶標(biāo)的構(gòu)象不同型可以通過在特定條件下將靶標(biāo)轉(zhuǎn)移到第二基質(zhì)中來實(shí)現(xiàn)，該條件只允許一種構(gòu)象的靶標(biāo)洗脫下來。此外，還可以使用只特異的針對靶標(biāo)的一種同種型的檢測方法。然后就可以鑒定結(jié)合靶標(biāo)的不同型的配體。這樣的配體可在各種情況下分離靶標(biāo)同種型，包括清除錯誤折疊或翻譯后修飾的蛋白，鑒定突變的靶標(biāo)等等。
此外，通過采用針對不同蛋白的轉(zhuǎn)移條件或檢測系統(tǒng)可以鑒定、分離或定量樣品中成分復(fù)雜的靶標(biāo)。同樣，第二基質(zhì)可以先用來檢測靶標(biāo)中的一種成分，再來檢測靶標(biāo)中的第二成分。如需要，可以鑒別能結(jié)合靶標(biāo)中的多種成分的配體，這對從樣品中純化蛋白復(fù)合物很有用。本發(fā)明方法也可用于對樣品中靶標(biāo)的數(shù)量進(jìn)行定量，檢測細(xì)胞在不同條件下表達(dá)蛋白的差異，或?qū)εc疾病或正常狀態(tài)相關(guān)的生物樣品(如血漿或其他生物流體)中的蛋白進(jìn)行分離檢測。
下面的實(shí)施例進(jìn)一步說明本發(fā)明，但是不應(yīng)理解為對本發(fā)明保護(hù)范圍的任何限制。
實(shí)施例實(shí)施例1本實(shí)施例用來說明本發(fā)明方法的一個優(yōu)選實(shí)施方案。
將肽配體文庫合成或固定在色譜樹脂珠上產(chǎn)生組合珠文庫(配體-支持物復(fù)合物文庫)。然后將樹脂珠與含靶標(biāo)的混合物(也就是某個樣品)接觸，如下文所述固定在多孔的凝膠基質(zhì)上(也就是第一基質(zhì))。凝膠系統(tǒng)由多層組成。1％的瓊脂糖凝膠基底傾倒在托盤中作為“第一基質(zhì)”的一部分。瓊脂糖凝膠形成的基底可以為凝膠系統(tǒng)提供穩(wěn)定性和堅固性，使其可被重復(fù)操作和處理。當(dāng)?shù)谝换|(zhì)已經(jīng)凝固但還沒有冷至室溫時，取一定體積(與樹脂珠組合文庫混合后足夠在瓊脂糖凝膠基底上覆蓋上一層，通常是基底的1/10體積)的0.5％的低熔點(diǎn)(LMT)瓊脂糖與一定體積(足夠覆蓋瓊脂糖凝膠基底，形成分隔良好的單層，在這個例子中為1/10 0.5％LMT瓊脂糖的體積)的組合珠文庫混合。靶標(biāo)-配體-支持物復(fù)合物在約40℃時加入LMT瓊脂糖中?；旌衔镅杆僬袷幒罅⒓吹乖诃傊悄z基底上。含靶標(biāo)-配體-支持物復(fù)合物的凝膠層覆蓋在瓊脂糖凝膠基底的表面。這就使靶標(biāo)-配體-支持物復(fù)合物在瓊脂糖凝膠基底上以二維排列的方式形成單層，樹脂珠被很薄的一層LMT瓊脂糖覆蓋。凝膠系統(tǒng)置于4℃直到凝固。
將凝膠系統(tǒng)放在吸水紙上，常用3MM濾紙，浮在轉(zhuǎn)移緩沖液槽中。吸水紙的放置位置使得轉(zhuǎn)移緩沖液可以通過毛細(xì)作用流經(jīng)吸水紙。凝膠系統(tǒng)的放置是將靶標(biāo)-配體-支持物復(fù)合物朝上。結(jié)合蛋白的支持物(也就是第二基質(zhì))，常用硝酸纖維素膜或PVDF(聚偏二氟乙烯)膜，放置在膠上面。將移液管在膜和凝膠系統(tǒng)上滾動來排除凝膠系統(tǒng)和第二基質(zhì)間的所有氣泡。在膜上放兩層吸水紙，再放幾層紙巾。在頂上放上能使膠、膜和紙壓緊的重物。轉(zhuǎn)移進(jìn)行一段足夠時間，使足夠數(shù)量的靶蛋白從樹脂珠上轉(zhuǎn)移到膜上。這步操作的結(jié)果就是使轉(zhuǎn)移緩沖液通過毛細(xì)作用從緩沖液槽通過整個凝膠系統(tǒng)和膜，進(jìn)入上面的吸水紙。這個過程將靶標(biāo)從樹脂珠上帶到膜上。通過檢測系統(tǒng)產(chǎn)生信號，如在X-射線膜上顯示的化學(xué)發(fā)光信號，結(jié)合第一種支持物能夠明確的鑒定結(jié)合靶標(biāo)的含配體的樹脂珠。
轉(zhuǎn)移緩沖液的組成可以根據(jù)需要選擇最合適的條件。在一個例子中，纖維蛋白原在嚴(yán)謹(jǐn)度逐漸提高的條件下從靶標(biāo)-配體-支持物復(fù)合物上洗脫下來。某些靶標(biāo)-配體-支持物復(fù)合物在不同條件下產(chǎn)生信號，表明靶蛋白對配體的親和性可以通過使用不同的轉(zhuǎn)移緩沖液來測定。在一定條件下將靶蛋白轉(zhuǎn)移到第二基質(zhì)上可以保持靶蛋白的活性?？梢皂樞蚴褂没蚱叫惺褂貌煌木彌_液來將靶蛋白轉(zhuǎn)移到第二基質(zhì)上。
一旦靶蛋白被第二基質(zhì)俘獲，可以通過一些技術(shù)來鑒定各個蛋白。代表性的檢測技術(shù)涉及到抗體技術(shù)，如在免疫印跡(WesternBlots)中使用的抗體，當(dāng)然放射性標(biāo)記的探針和酶活性測定可以用做檢測方法。
實(shí)施例2本實(shí)施例是說明使用本發(fā)明方法來鑒定能與純化的護(hù)骨素(Osteoprotegrin)結(jié)合的配體，這些配體可以用做親和層析的樹脂。
配體-支持物復(fù)合物文庫(結(jié)合了六肽配體的聚甲基丙烯酸酯珠，六肽氨基端的氨基酸已知是D型；5mg)與200μl的1％酪蛋白，3％牛血清白蛋白一起于22℃孵育2小時，封閉非特異性的結(jié)合位點(diǎn)。護(hù)骨素配體蛋白(OPGL，330μg/ml取3μl)加入封閉液中，樹脂珠在4℃搖動孵育15小時。用配體-支持物復(fù)合物的次級文庫進(jìn)行分離反應(yīng)，次級庫中肽配體的氨基端氨基酸是16種天然氨基酸的一種(除了半胱氨酸、谷氨酸和甲硫氨酸)。孵育完成后，次級文庫被單獨(dú)用50ml的緩沖液(20mM Tris，500mM NaCl，0.1％Tween-20(TTBS)，pH7.2)洗滌，去除未結(jié)合的和結(jié)合較弱的靶蛋白。大約1mg的各種次級文庫與50μl 0.5％的低熔點(diǎn)瓊脂糖(LMP)混合。LMP瓊脂糖-樹脂珠混合物點(diǎn)在預(yù)制的1％瓊脂糖基底(10ml)上形成凝膠系統(tǒng)。在4℃放置約15分鐘使LMP瓊脂糖-樹脂珠混合物凝固。凝固后，將凝膠系統(tǒng)放在預(yù)先用轉(zhuǎn)移緩沖液(4M鹽酸胍(GuHCl)，pH5)浸濕的濾紙上，濾紙的兩頭淹沒在裝有轉(zhuǎn)移緩沖液的槽中。
將一張硝酸纖維素膜(也就是第二基質(zhì))預(yù)先用轉(zhuǎn)移緩沖液浸濕，剪裁成凝膠系統(tǒng)的大小，放在凝膠系統(tǒng)上。兩張預(yù)先浸濕的濾紙放在膜上，幾張干的紙巾放在濾紙上。將一塊300g的重物放在裝置的頂上，在22℃進(jìn)行轉(zhuǎn)移反應(yīng)18小時。
在將蛋白轉(zhuǎn)移到膜上后，將膜與凝膠分離，用TTBS緩沖液洗膜，將膜與5％的脫脂奶室溫孵育2小時封閉膜上的非特異性結(jié)合位點(diǎn)。靶蛋白用多克隆的兔抗小鼠OPGL抗體檢測。用TTBS洗膜，結(jié)合的初級抗體用HRP標(biāo)記的羊抗兔二級抗體檢測。靶蛋白用加強(qiáng)的化學(xué)發(fā)光底物檢測，在放射自顯影膠片上產(chǎn)生斑點(diǎn)，從而將結(jié)合的蛋白定位在膜上。放射自顯影膠片與原始的凝膠對照，用彎針頭將與膠片上的斑點(diǎn)對應(yīng)的樹脂珠從凝膠上挑出來。樹脂珠加熱到70℃熔化掉沾著的瓊脂糖，用8M鹽酸胍、甲醇和水洗滌。以上面描述的方法重新將樹脂珠與OPGL蛋白接觸、轉(zhuǎn)移和對照。第二次得到的對應(yīng)的樹脂珠被挑出來，洗滌后用ABI測序儀測定配體的序列。下面的序列是從好幾萬的配體(它們在N端均有一個D氨基酸，C端有一個丙氨酸)中篩選出來的LVTVWPA(SEQ ID NO1)，YDYHELA(SEQ ID NO2)，LHHPPIA(SEQ ID NO3)，RANKTQA(SEQ ID NO4)，和TTPSKKA(SEQ ID NO5)。
本實(shí)施例是示范使用本發(fā)明方法來鑒定一個已知靶蛋白的配體，再弄清這些配體的氨基酸序列。
實(shí)施例3本實(shí)施例是說明通過靶蛋白的生物活性來檢測靶蛋白。生物活性可用來在蛋白或其結(jié)合配體的特性都不知道的情況下檢測新蛋白的存在和活性。進(jìn)行生物、生物化學(xué)或酶活性試驗必須將靶蛋白轉(zhuǎn)移到第二基質(zhì)，如某種膜上，轉(zhuǎn)移條件必須保持蛋白的活性。
將BChE(2mg/ml)固定在結(jié)合了色譜樹脂珠的procainimide(PAM)配體上，形成靶標(biāo)-配體-支持物復(fù)合物。然后將色譜樹脂珠固定在覆蓋在1％常規(guī)瓊脂糖凝膠基底上的0.5％LMP瓊脂糖中，如上文所述形成凝膠系統(tǒng)。4℃放置15分鐘使LMP瓊脂糖-樹脂珠混合物凝固。凝固后，將凝膠系統(tǒng)放在一張預(yù)先用轉(zhuǎn)移緩沖液(0.5M磷酸緩沖液/0.5M NaCl，pH7.2)浸濕的濾紙上，濾紙的兩頭淹沒在裝有轉(zhuǎn)移緩沖液的槽中。將一張硝酸纖維素膜預(yù)先用轉(zhuǎn)移緩沖液浸濕，剪裁成凝膠系統(tǒng)的大小，放在凝膠系統(tǒng)上。兩張預(yù)先浸濕的濾紙放在膜上，幾張干的紙巾放在濾紙上。將一塊100g的重物放在裝置的頂上，在22℃過夜進(jìn)行轉(zhuǎn)移反應(yīng)。
在將蛋白轉(zhuǎn)移到膜上后，將硝酸纖維素膜與凝膠分離。第二張硝酸纖維素膜浸在轉(zhuǎn)移緩沖液中作為陰性對照。將膽堿脂酶底物溶液(BTC＝5mmol/l碘化丁酰硫代膽堿，0.25mmole/l 5，5′-二硫雙-2-二硝基苯甲酸，pH7.2)用移液管加在膜和凝膠系統(tǒng)上來檢測未轉(zhuǎn)移的蛋白。膜和凝膠系統(tǒng)在22℃于暗處孵育1小時。轉(zhuǎn)移上靶蛋白的膜上顯示黃色。而對照膜上不顯示黃色。一些殘余的靶蛋白保留在凝膠系統(tǒng)的樹脂珠上，提示在這些條件下并非所有的靶蛋白都被轉(zhuǎn)移。
本實(shí)施例說明通過測定生物活性可以在第二基質(zhì)上檢測和鑒定靶蛋白。特別是轉(zhuǎn)移膜上出現(xiàn)的黃色表明BChE從凝膠系統(tǒng)的樹脂珠上轉(zhuǎn)移到膜上依然保持活性。
實(shí)施例4本實(shí)施例是說明使用本發(fā)明的方法來確定將蛋白從配體上洗脫下來的條件。了解洗脫性質(zhì)有助于發(fā)展親和純化工藝從復(fù)雜混合物中大量純化靶標(biāo)。在能結(jié)合特定靶標(biāo)的多個潛在配體中，能在優(yōu)選條件下結(jié)合和洗脫的配體可以通過順序或平行使用多種洗脫條件來鑒定。在本實(shí)施例中，纖維蛋白原在幾種條件下從配體-支持物復(fù)合物文庫中洗脫下來。研究發(fā)現(xiàn)不同的配體洗脫蛋白的條件不同。
配體-支持物復(fù)合物文庫(樹脂珠，32mg)是將6氨基酸的配體合成在650-M氨基ToyoPearl樹脂(Tosohaas BioScience)上，以丙氨酸-ε氨基己酸(EACA)為間隔接頭。將樹脂珠用20％甲醇洗滌，在20mM檸檬酸緩沖液中溶脹1小時。用1％(w/v)酪蛋白/3％(w/v)牛血清白蛋白于22℃封閉樹脂珠1小時。將樹脂珠與3.2ml人血小板缺乏血漿一起于22℃孵育1小時，用50ml洗液(150mM NaCl，20mM檸檬酸，pH7.12)洗滌。將一部分文庫(320μg)與240μl 0.5％的低熔點(diǎn)瓊脂糖(LMP)混合，覆蓋在30ml 1％瓊脂糖基底(即第一基質(zhì))上。將靶蛋白轉(zhuǎn)移到第二介質(zhì)PVDF膜上的方法如實(shí)施例1-3所述。初始的轉(zhuǎn)移緩沖液含0.45M NaCl/20mM檸檬酸，pH7.2，與凝膠系統(tǒng)和PVDF膜作用24小時。在初始轉(zhuǎn)移后，將凝膠系統(tǒng)從裝置中移開，再進(jìn)行第二輪和第三輪轉(zhuǎn)移。將一張新膜放在凝膠系統(tǒng)上，在轉(zhuǎn)移緩沖液(1.0M NaCl(第二輪轉(zhuǎn)移)或1.5M NaCl(第三輪轉(zhuǎn)移)/20mM檸檬酸，pH7.12)中轉(zhuǎn)移24小時。在第三輪轉(zhuǎn)移后，進(jìn)行最后一次轉(zhuǎn)移，將凝膠系統(tǒng)和新膜置于6M鹽酸胍中轉(zhuǎn)移8小時。所有膜均保存在4℃，保持濕潤，直到所有轉(zhuǎn)移完成之后，再將所有膜同時進(jìn)行下步操作。
每張膜均用5％脫脂奶22℃封閉2小時。然后將膜與1∶8000稀釋的多克隆羊抗人纖維蛋白原抗體(Affinity Biologicals)22℃孵育1小時。用TTBS洗膜，再將膜與1∶8000稀釋的HRP標(biāo)記羊抗人纖維蛋白原抗體22℃孵育1小時，來檢測膜上轉(zhuǎn)移的蛋白。結(jié)合靶蛋白的抗體信號通過加強(qiáng)的化學(xué)發(fā)光辣根過氧化物酶(HRP)底物(孵育10分鐘)檢測，在X射線膠片上顯示。膠片與凝膠系統(tǒng)對應(yīng)后將相應(yīng)的配體-樹脂珠從凝膠系統(tǒng)上挑出來。洗滌樹脂珠，對其吸附的配體進(jìn)行測序。下列序列是從篩選的樹脂中得到的IAIWVA(SEQ ID NO13).下列的其他氨基酸序列也被鑒定AREADVA(SEQ ID NO6)；YEYARP(SEQ ID NO7)；WDGATY(SEQ ID NO8)；FDPHWS(SEQ IDNO9)；FSDVED(SEQ ID NO10)；FEYAPS(SEQ ID NO11)；HGTWEP(SEQ ID NO12)。
本實(shí)施例是示范使用本發(fā)明方法來鑒定針對未知靶蛋白的配體。研究發(fā)現(xiàn)不同的配體可在不同條件下洗脫蛋白，這就為在親和層析方法中使用鑒定出的配體提供了有價值的信息。
實(shí)施例5本實(shí)施例是說明用于鑒定能與某些疾病相關(guān)蛋白結(jié)合的配體的一種方法，這些蛋白稱作朊病毒蛋白，與傳染性海綿樣腦病相關(guān)。
一個650-M氨基聚甲基丙烯酸酯樹脂珠文庫(5mg)，含2氨基酸的配體，用1％酪蛋白4℃搖動封閉18小時。正常倉鼠腦細(xì)胞勻漿用PBS 1∶10稀釋，與0.5％(w/v)sarkosyl一起孵育30分鐘。1∶10稀釋的處理材料(1ml)與封閉的配體-粘附樹脂珠22℃搖動孵育1小時。一部分靶標(biāo)-配體-樹脂珠復(fù)合物(90μl)與800μl 0.5％LMP瓊脂糖混合后傾倒在含9ml 1％瓊脂糖的凝膠基底(即第一基質(zhì))上。在4℃放置大約15分鐘使LMP瓊脂糖-樹脂珠混合物凝固，形成凝膠系統(tǒng)。將靶蛋白轉(zhuǎn)移到第二基質(zhì)PVDF膜上的方法如實(shí)施例1-3所述，用6M鹽酸胍作為轉(zhuǎn)移緩沖液。過夜進(jìn)行轉(zhuǎn)移反應(yīng)。轉(zhuǎn)移后，將PVDF膜從凝膠系統(tǒng)上分離下來，用5％牛奶封閉。朊病毒蛋白靶標(biāo)(PrPc)用3F4檢測，3F4是對PrPc的變性形式特異的抗體，用做一抗。再用HRP標(biāo)記的羊抗小鼠二抗與加強(qiáng)的化學(xué)發(fā)光底物來檢測膜上結(jié)合的PrPc，信號在X射線膠片上顯示。膠片與凝膠系統(tǒng)對應(yīng)后將相應(yīng)的配體-樹脂珠回收并洗滌。對配體進(jìn)行測序以鑒定其氨基酸序列。
本實(shí)施例是示范本發(fā)明方法能夠鑒定結(jié)合疾病相關(guān)蛋白的配體。鑒定出的配體可用于在各種復(fù)雜混合物(如生物樣品)中診斷靶蛋白的存在或是從混合物中清除導(dǎo)致疾病的靶蛋白。
實(shí)施例6本實(shí)施例是說明通過將配體-支持物文庫與樣品孵育一次，再使用多個檢測步驟來鑒定多個靶標(biāo)。
使用以下樹脂含纖維蛋白原結(jié)合配體(GPRPGG(SEQ ID NO23))的樹脂直接合成在650-M氨基ToyoPearl樹脂(TosohaasBioscience)上，含綠色瓊脂糖PIKSIT珠(API結(jié)合的對照)的α-1蛋白酶抑制劑(API)結(jié)合樹脂，含連接了N端為D氨基酸的六肽配體的650-M氨基樹脂(Tosohaas Bioscience)的配體-支持物樹脂。GPRPGG(SEQ ID NO23)樹脂(2.5mg，預(yù)溶脹)和六肽庫樹脂(2mg，預(yù)溶脹)分別在不同的管中用1％(w/v)酪蛋白/3％(w/v)牛血清白蛋白(BSA)于22℃封閉3小時，完成后去除封閉液。分別在GPRPGG(SEQ ID NO23)樹脂和六肽庫樹脂中加入人血小板缺乏血漿(20ml)，于4℃搖動結(jié)合18小時。用50ml TTBS洗滌樹脂，洗后在管中留下50μl TTBS。每種樹脂取部分(5μl)和2.5mg預(yù)先與純的API孵育過的綠色瓊脂糖PIKSIT珠分別與330ml 0.5％LMP瓊脂糖混合。三種樹脂混合物分別點(diǎn)在1％瓊脂糖基底上，使GPRPGG(SEQ IDNO23)樹脂、六肽庫樹脂和綠色瓊脂糖PIKSIT珠分別處于凝膠基底互不重疊的位置。靶蛋白用下列條件梯度洗脫轉(zhuǎn)移到不同的硝酸纖維素膜上0.2M NaCl/20mM檸檬酸鹽，pH7.12，轉(zhuǎn)移8小時，1.5M NaCl/20mM檸檬酸鹽，pH7.2，轉(zhuǎn)移15小時，2M NaCl/20mM檸檬酸鹽，pH7.2，轉(zhuǎn)移8小時，及4M鹽酸胍，pH5，轉(zhuǎn)移13小時。膜均保存于4℃?zhèn)溆谩?br> 所有膜均同時處理。首先用5％脫脂奶22℃封閉2小時。然后用羊抗人纖維蛋白原多克隆抗體作為一抗檢測纖維蛋白原靶蛋白。洗膜后，將膜與HRP標(biāo)記羊抗人纖維蛋白原抗體一起孵育，該抗體可結(jié)合一抗。檢測信號通過加強(qiáng)的化學(xué)發(fā)光過氧化物酶(HRP)底物在放射自顯影膠片上顯示。
檢測完纖維蛋白原后，將膜與TTBS在50℃孵育來去除膜上結(jié)合的抗體。再將膜重新封閉后與羊抗人α-1抗胰蛋白酶多克隆抗體孵育。洗膜后，將膜與HRP標(biāo)記兔抗羊IgG多克隆抗體一起孵育，檢測信號通過加強(qiáng)的化學(xué)發(fā)光過氧化物酶(HRP)底物在X射線膠片上顯示。
在本實(shí)施例中，已知可結(jié)合不同血漿蛋白的配體與含靶蛋白的血漿樣品混合。使用的檢測方法表明纖維蛋白原和API被同時從凝膠系統(tǒng)轉(zhuǎn)移到膜上。另外，每種樹脂珠僅結(jié)合了兩種蛋白的一種。所以本實(shí)施例表明一張膜上的多種蛋白可通過反復(fù)的去除和檢測來分別鑒定。
實(shí)施例7本實(shí)施例是說明用本發(fā)明的方法來鑒定能優(yōu)先結(jié)合生物流體樣品中的靶蛋白API的配體。
在ToyoPearl 650-M氨基樹脂(Tosoh BioScien ce)上建立N端為D氨基酸的六肽庫，得到配體-支持物復(fù)合物文庫。將約10mg配體-支持物復(fù)合物文庫洗滌、溶脹、洗滌后，與用等體積平衡緩沖液(140mM NaCl，20mM檸檬酸鹽，pH7.4)稀釋的1ml血漿在BioRad柱中室溫孵育1小時，不停攪動。完成后，將BioRad柱流干，用10柱體積的平衡緩沖液洗滌樹脂珠。將樹脂珠(現(xiàn)在實(shí)際為靶標(biāo)-配體-支持物復(fù)合物)用1ml平衡緩沖液混懸。取約10μl樹脂珠與900μl LMP瓊脂糖混合，如實(shí)施例1-3所述。將樹脂珠-瓊脂糖混合物鋪在凝固的普通瓊脂糖基底(第一基質(zhì))的表面，形成凝膠系統(tǒng)。4℃放置使樹脂珠-瓊脂糖混合物凝固。用一張膜做第二基質(zhì)準(zhǔn)備轉(zhuǎn)移系統(tǒng)，如實(shí)施例1-3所述。用加入2M NaCl的平衡緩沖液于室溫過夜轉(zhuǎn)移，將血漿蛋白轉(zhuǎn)移到第二基質(zhì)膜上。將膜與HRP標(biāo)記的多克隆羊抗人α1抗胰蛋白酶抗體(ICN)孵育，該抗體能結(jié)合α1抗胰蛋白酶(API)。確定API蛋白在膜上的位置。挑選出與API蛋白在膜上的位置相對應(yīng)的樹脂珠，洗滌后再與血漿孵育。將血漿蛋白從靶標(biāo)-配體-支持物復(fù)合物轉(zhuǎn)移到膜上，重復(fù)檢測API靶蛋白以確認(rèn)潛在的陽性，鑒定出能結(jié)合靶蛋白的配體-支持物復(fù)合物。陽性樹脂珠收集洗滌后，用ABI測序儀以Edman降解法測定樹脂珠結(jié)合的配體的序列。鑒定出的幾種序列合成后用來作為制備用樹脂，從去除了纖維蛋白原和Apo-A1脂蛋白的血漿中純化API。下列序列是鑒定出的序列的一部分KFQARA(SEQ ID NO14)；KWSITN(SEQ ID NO15)；KSPRWP(SEQ ID NO16)；AKVSKG(SEQ ID NO17)。結(jié)果顯示鑒定出的配體能優(yōu)先結(jié)合API。
用本發(fā)明方法可以從肽文庫中鑒定出特異結(jié)合靶蛋白的配體，如本實(shí)施例所示。鑒定出的配體優(yōu)先俘獲已知的靶蛋白，適合用于靶蛋白的大規(guī)模純化。
實(shí)施例8本實(shí)施例是說明鑒定能結(jié)合蛋白復(fù)合物即因子VIII(fVIII)和von Willebrand因子(vWF)的配體。
約10mg含六肽文庫的配體-支持物復(fù)合物用實(shí)施例7的方法準(zhǔn)備。含六肽文庫的樹脂珠與用等體積平衡緩沖液稀釋的1ml血漿在BioRad柱中室溫孵育1小時，不停攪動。完成后，將BioRad柱流干，用10柱體積的平衡緩沖液洗滌樹脂珠。將樹脂珠(現(xiàn)在實(shí)際為靶標(biāo)-配體-支持物復(fù)合物)用1ml平衡緩沖液混懸。取約10μl樹脂珠與900μl LMP瓊脂糖混合，鋪在瓊脂糖基底上。樹脂珠-瓊脂糖混合物凝固后形成凝膠系統(tǒng)，靶蛋白轉(zhuǎn)移過程如實(shí)施例1-7所述。用加入2MNaCl的平衡緩沖液于室溫過夜轉(zhuǎn)移，將靶蛋白從靶標(biāo)-配體-支持物復(fù)合物轉(zhuǎn)移到第二基質(zhì)(膜)上。將膜與HRP標(biāo)記的多克隆抗人vWF抗體(Enzyme Research Labs)孵育1小時，用標(biāo)準(zhǔn)的ECL plus化學(xué)發(fā)光底物確定vWF靶蛋白在膜上的位置。挑選出與靶蛋白在膜上的位置相對應(yīng)的樹脂珠，洗滌后再與血漿孵育。將靶蛋白轉(zhuǎn)移到第二基質(zhì)(膜)上，重復(fù)檢測膜上的靶蛋白以確認(rèn)潛在的陽性，鑒定出含能結(jié)合vWF的配體的樹脂珠。陽性樹脂珠收集洗滌后，用ABI測序儀以Edman降解法測定樹脂珠結(jié)合的配體的序列。鑒定出的幾種序列合成后用來作為制備用樹脂。另外，將與未濾血漿孵育的樹脂珠轉(zhuǎn)移到96孔微量滴定板中，與Coatest fVIII活性試驗試劑(Chromagenix)共同孵育。用顏色變化(黃色)鑒定出含fVIII配體的樹脂珠，將其挑選出來用于進(jìn)一步的評價。鑒定出的能共同純化vWF和fVIII的配體包括FSYDED(SEQ ID NO18)，LEDnal′EE(SEQ ID NO19)，WEEPEQ(SEQ ID NO20)，EADnaLED(SEQ ID NO21)，YVDEDD(SEQ ID NO22)。
本實(shí)施例說明了本發(fā)明方法的一個實(shí)例，用多種檢測方法鑒定蛋白復(fù)合物，并從生物樣品中將起其清除。
如同每篇參考文獻(xiàn)在其引用處都單獨(dú)特別的指出的那樣，這里引用的所有參考文獻(xiàn)，包括出版物、專利申請書和專利，都是本發(fā)明的參考。
“個”、“種”以及類似詞在說明書(特別是在下面的權(quán)利要求中)的使用應(yīng)被理解為同時包括單數(shù)和復(fù)數(shù)，除非特別指出或根據(jù)上下文明顯矛盾。術(shù)語“包含”、“有”、“包括”和“含有”應(yīng)被理解為開放式的詞語(即表示“包括，但不僅限于”)，除非特別指出。這里列舉的數(shù)值范圍僅意味著對每一個單獨(dú)落在范圍內(nèi)的數(shù)值的一種速記方法，除非特別指出，每個單獨(dú)的數(shù)值都引入說明書中，如同每一個數(shù)被單獨(dú)列舉出來一樣。這里描述的所有方法可以用任何合適的順序來完成，除非特別指出或根據(jù)上下文明顯矛盾。任何或所有實(shí)施例的使用，或這里提供的舉例語言，如“例如”，僅意味著更好的說明本發(fā)明，并不是對本發(fā)明應(yīng)用范圍的限制，除非特別申明。本說明書的任何語言都不應(yīng)理解為指出了本發(fā)明實(shí)施中任何重要的未主張要素。
這里描述了本發(fā)明的優(yōu)選實(shí)施方案，包括本發(fā)明的發(fā)明者所知的最佳模式。在閱讀了前面的描述后，這些優(yōu)選實(shí)施方案的一些變化形式對本領(lǐng)域的普通技術(shù)人員來說可能是顯而易見的。發(fā)明人期望有經(jīng)驗的技術(shù)人員恰當(dāng)?shù)氖褂眠@些變化方法，發(fā)明人也希望本發(fā)明能被用與這里描述不同的方式實(shí)施。因此，依據(jù)適用的法律，本發(fā)明包括所有后面權(quán)利要求書中列舉的主題的修改或相似形式。此外，本發(fā)明還包含所有上述要素及其可能的變化形式的任何聯(lián)合應(yīng)用，除非特別指出或根據(jù)上下文明顯矛盾。
序列表<110>American National Red Cross<120>檢測混合物中配體和靶標(biāo)的方法<130>221007<150>US 60/372,091<151>2002-04-15<160>23<170>PatentIn version 3.2<210>1<211>7<212>PRT<213>人工的<220>
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<223>合成的<400>4Arg Ala Asn Lys Thr Gln Ala1 5<210>5<211>7<212>PRT<213>人工的<220>
<223>合成的<400>5Thr Thr Pro Ser Lys Lys Ala1 5<210>6<211>7<212>PRT
<213>人工的<220>
<223>合成的<400>6Ala Arg Glu Ala Asp Val Ala1 5<210>7<211>6<212>PRT<213>人工的<220>
<223>合成的<400>7Tyr Glu Tyr Ala Arg Pro1 5<210>8<211>6<212>PRT<213>人工的<220>
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<223>合成的<400>11Phe Glu Tyr Ala Pro Ser1 5<210>12<211>6<212>PRT<213>人工的<220>
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<400>12His Gly Thr Trp Glu Pro1 5<210>13<211>6<212>PRT<213>人工的<220>
<223>合成的<400>13Ile Ala Ile Trp Val Ala1 5<210>14<211>6<212>PRT<213>人工的<220>
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1 5<210>19<211>6<212>PRT<213>人工的<220>
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<221>MISC_特征<222>(4)..(4)<223>Xaa是萘基丙氨酸<400>19Leu Glu Asp Xaa Glu Glu1 5<210>20<211>6<212>PRT<213>人工的<220>
<223>合成的<400>20Trp Glu Glu Pro Glu Gln1 5<210>21<211>7<212>PRT<213>人工的<220>
<223>合成的
<220>
<221>MISC_特征<222>(4)..(4)<223>Xaa是萘基丙氨酸<400>21Glu Ala Asp Xaa Leu Glu Asp1 5<210>22<211>6<212>PRT<213>人工的<220>
<223>合成的<400>22Tyr Val Asp Glu Asp Asp1 5<210>23<211>6<212>PRT<213>人工的<220>
<223>合成的<400>23Gly Pro Arg Pro Gly Gly1 權(quán)利要求
1.一種表征與配體結(jié)合的靶標(biāo)的方法，該方法包括(i)提供一種或多種配體，其中每種配體吸附于一種支持物以形成一種或多種配體-支持物復(fù)合物，(ii)將配體-支持物復(fù)合物與一種或多種靶標(biāo)在一定條件下接觸，該條件可使至少一種靶標(biāo)與至少一種配體-支持物復(fù)合物結(jié)合，從而形成一種或多種靶標(biāo)-配體-支持物復(fù)合物，(iii)將配體-支持物復(fù)合物和靶標(biāo)-配體-支持物復(fù)合物固定于第一基質(zhì)，使每個配體-支持物復(fù)合物和每個靶標(biāo)-配體-支持物復(fù)合物在第一基質(zhì)上有不同的位置，(iv)將至少一種靶標(biāo)-配體-支持物復(fù)合物中的至少一部分靶標(biāo)轉(zhuǎn)移到第二基質(zhì)，使靶標(biāo)-配體-支持物復(fù)合物中的配體-支持物復(fù)合物保留在第一基質(zhì)，其中靶標(biāo)在第二基質(zhì)的位置與第一基質(zhì)中配體-支持物復(fù)合物的位置相對應(yīng)，和(v)檢測第二基質(zhì)上的靶標(biāo)，于是與配體結(jié)合的靶標(biāo)得到表征。
2.如權(quán)利要求1所述的方法，其中，在步驟(ii)，將配體-支持物復(fù)合物與兩種或多種靶標(biāo)在一定條件下接觸，該條件可使至少一種靶標(biāo)與至少一種配體-支持物復(fù)合物結(jié)合，從而形成一種或多種靶標(biāo)-配體-支持物復(fù)合物。
3.如權(quán)利要求1或2所述的方法，其中支持物是樹脂珠。
4.如權(quán)利要求1-3中任一項的方法，其中第一基質(zhì)包含選自如下的材料瓊脂糖、聚丙烯酰胺、葡聚糖、纖維素、多糖、前述材料的衍生物及其任意組合。
5.一種表征與配體結(jié)合的靶標(biāo)的方法，該方法包括(i)提供一種或多種配體，(ii)將每種配體固定在第一基質(zhì)上，使每個配體在第一基質(zhì)上有不同的位置，(iii)將第一基質(zhì)中的配體與一種或多種靶標(biāo)在一定條件下接觸，使至少一種靶標(biāo)與至少一種配體結(jié)合，從而在第一基質(zhì)中形成一種或多種靶標(biāo)-配體復(fù)合物，(iv)將第一基質(zhì)中的至少一種靶標(biāo)-配體復(fù)合物中的至少一部分靶標(biāo)轉(zhuǎn)移到第二基質(zhì)，使靶標(biāo)-配體復(fù)合物中的配體仍然保留在第一基質(zhì)中，其中靶標(biāo)在第二基質(zhì)中的位置與配體在第一基質(zhì)中的位置相對應(yīng)，和(v)檢測第二基質(zhì)上的靶標(biāo)，于是與配體結(jié)合的靶標(biāo)得到表征。
6.如權(quán)利要求1-5中任一項的方法，其中，在步驟(i)，提供兩種或多種配體。
7.如權(quán)利要求1-6中任一項的方法，其中靶標(biāo)存在于生物流體中。
8.如權(quán)利要求7所述的方法，其中生物流體選自血液、血漿、血清、細(xì)胞勻漿、組織勻漿、條件培養(yǎng)基、發(fā)酵培養(yǎng)基、腦脊液、尿液、唾液、乳汁、導(dǎo)管液、淚液、汗液、淋巴和精液。
9.如權(quán)利要求1-8中任一項的方法，其中靶標(biāo)選自細(xì)胞、細(xì)菌、病毒、酵母、蛋白質(zhì)、肽類、氨基酸、核酸、碳水化合物、脂類、藥物、合成的無機(jī)化合物、合成的有機(jī)化合物、前述物質(zhì)的同種型及其任意組合。
10.如權(quán)利要求1-9中任一項的方法，其中靶標(biāo)是血漿蛋白質(zhì)。
11.如權(quán)利要求10所述的方法，其中血漿蛋白質(zhì)選自丁酰膽堿脂酶、纖維蛋白原、α-1蛋白酶抑制劑、朊病毒蛋白、載脂蛋白A1、免疫球蛋白，對氧磷酶、凝血因子及其前述物質(zhì)的任意組合。
12.如權(quán)利要求1-11中任一項的方法，其中配體選自氨基酸、肽類、核酸、抗體或其抗原結(jié)合片段、碳水化合物、糖類、脂類、有機(jī)分子及其組合。
13.如權(quán)利要求12所述的方法，其中配體基本上是由大約1個至15個氨基酸組成的肽類。
14.如權(quán)利要求5-13中任一項的方法，其中第一基質(zhì)包含選自下述的材料尼龍、棉花、聚二氟乙烯尼龍、硅、玻璃、苯乙烯、聚苯乙烯、聚丙烯酸酯、聚甲基丙烯酸酯、前述材料的衍生物和其任意組合。
15.如權(quán)利要求1-14中任一項的方法，其中第二基質(zhì)包括選自下列的材料硝酸纖維素、硅、苯乙烯和聚二氟乙烯尼龍。
16.如權(quán)利要求1-15中任一項的方法，其中步驟(v)包括檢測生物學(xué)特性、化學(xué)特性、物理特性、生化特性、或者前述特性的任意組合。
17.如權(quán)利要求16所述的方法，其中步驟(v)包括進(jìn)行結(jié)合試驗。
18.如權(quán)利要求17所述的方法，其中結(jié)合試驗包括將第二基質(zhì)與抗體或其抗原結(jié)合片段接觸。
19.如權(quán)利要求17所述的方法，其中結(jié)合試驗包括將第二基質(zhì)與標(biāo)記了可檢測標(biāo)簽的結(jié)合部分接觸。
20.如權(quán)利要求19所述的方法，其中可檢測標(biāo)簽選自放射性同位素、發(fā)色基團(tuán)和熒光標(biāo)簽。
21.如權(quán)利要求16所述的方法，其中步驟(v)包括進(jìn)行酶活性試驗。
22.如權(quán)利要求16所述的方法，其中步驟(v)包括進(jìn)行以細(xì)胞為基礎(chǔ)的試驗，其中將第二基質(zhì)與細(xì)胞接觸并觀察靶標(biāo)對細(xì)胞的作用。
23.如權(quán)利要求16-22中任一項的方法，其進(jìn)一步包括步驟(vi)重復(fù)步驟(v)，但是檢測的特性與步驟(v)不同，從而可以鑒定靶標(biāo)的不同特性或者不同的靶標(biāo)。
24.如權(quán)利要求1-23中任一項的方法，其進(jìn)一步包括(vi)鑒定檢測的靶標(biāo)在第二基質(zhì)上的位置，(vii)鑒定與所檢測的靶標(biāo)在第二基質(zhì)上的位置相對應(yīng)的配體-支持物復(fù)合物或配體在第一基質(zhì)上的位置，和(viii)確定配體的化學(xué)特性。
25.如權(quán)利要求24所述的方法，其進(jìn)一步包括(ix)提供鑒定出的配體的多個拷貝，(x)將鑒定出的配體的每個拷貝附著于支持物上，由此獲得多個配體-支持物復(fù)合物，(xi)將含多拷貝靶標(biāo)的組合物與多個配體-支持物復(fù)合物在一定條件下接觸，使配體與靶標(biāo)結(jié)合，形成多個靶標(biāo)-配體-支持物復(fù)合物，和(xii)將靶標(biāo)從靶標(biāo)-配體-支持物復(fù)合物上解離。
26.如權(quán)利要求25所述的方法，其進(jìn)一步包括步驟(xiii)用質(zhì)譜分析鑒定靶標(biāo)。
27.如權(quán)利要求1-23中任一項的方法，所述方法進(jìn)一步包括(vi)重復(fù)步驟(iv)，但是基質(zhì)和條件與前面重復(fù)步驟(iv)時不同，從而產(chǎn)生一組基質(zhì)，每種基質(zhì)含有不同數(shù)量或不同群體的靶標(biāo)，(vii)檢測步驟(vi)中每種基質(zhì)上的靶標(biāo)，和(viii)比較第二基質(zhì)和步驟(vi)中每種基質(zhì)上的靶標(biāo)數(shù)量。
28.如權(quán)利要求1-23中任一項的方法，其進(jìn)一步包括(vi)鑒定檢測的靶標(biāo)在第二基質(zhì)上的位置，(vii)鑒定與所檢測的靶標(biāo)在第二基質(zhì)上的位置相對應(yīng)的配體-支持物復(fù)合物或配體在第一基質(zhì)上的位置，(viii)將配體從支持物和/或第一基質(zhì)上解離，(ix)將配體轉(zhuǎn)移到第三基質(zhì)，使支持物保留在第一基質(zhì)，其中配體在第三基質(zhì)的位置與其在第一基質(zhì)的位置對應(yīng)，和(x)檢測第三基質(zhì)上的配體。
29.如權(quán)利要求28所述的方法，其中步驟(x)包括確定配體的化學(xué)特性。
30.如權(quán)利要求29所述的方法，其中配體的化學(xué)特性用下列方法確定質(zhì)譜分析、Edman降解、核酸測序、高效液相色譜(HPLC)或其任意組合。
31.如權(quán)利要求1-30中任一項的方法，其中步驟(iv)是在含競爭性結(jié)合劑的介質(zhì)中進(jìn)行，該競爭性結(jié)合劑與至少一種靶標(biāo)-配體-支持物復(fù)合物或靶標(biāo)-配體復(fù)合物中的靶標(biāo)結(jié)合，從而使配體從靶標(biāo)上解離。
32.如權(quán)利要求29所述的方法，其中競爭性結(jié)合劑選自炭疽桿菌、馬爾他布魯氏菌、埃博拉病毒、肉毒桿菌神經(jīng)毒素、葡萄球菌腸毒素B、西尼羅病毒、篦麻毒素、硫芥子氣、索曼毒劑、沙林毒劑、塔崩毒劑、VX毒劑和光氣。
全文摘要
本發(fā)明提供了一種表征與配體結(jié)合的靶標(biāo)的方法。該方法包括提供配體，可以是附著于支持物上的配體，將配體與靶標(biāo)接觸，使至少一種靶標(biāo)結(jié)合上至少一種配體。該方法還包括將得到的復(fù)合物固定在第一基質(zhì)上，使每種復(fù)合物在第一基質(zhì)上有不同的位置，再將復(fù)合物中的靶標(biāo)轉(zhuǎn)移到第二基質(zhì)上。靶標(biāo)在第二基質(zhì)上的位置與配體－支持物復(fù)合物在第一基質(zhì)上的位置對應(yīng)。然后再檢測第二基質(zhì)上的靶標(biāo)。
文檔編號G01N33/554GK1659432SQ03813727
公開日2005年8月24日 申請日期2003年4月14日 優(yōu)先權(quán)日2002年4月15日
發(fā)明者D·J·哈蒙德, J·T·拉斯羅普 申請人:美國國家紅十字會