專利名稱：檢測序列差異的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及鑒定個體基因組中相對于個體所在群體序列的序列差異的分子遺傳學方法。更具體地說，本發(fā)明涉及鑒定基因組序列中單核苷酸差異的方法。
背景技術(shù)：
包含生物有機體基因組的核酸攜帶有該生物有機體的遺傳信息。個體間基因序列的變異導致多種明顯表型差異(如頭發(fā)、皮膚等的顏色)和多種不明顯差異(如藥物耐受性和疾病敏感性)。即使核苷酸序列中細微的改變，包括單堿基對替換也對蛋白質(zhì)的質(zhì)量或數(shù)量有顯著的影響。單核苷酸改變指單核苷酸多態(tài)性或簡稱SNP，發(fā)生SNP的位點在本文中稱為多態(tài)性位點。DNA多態(tài)性定位于整個基因組中，定位在基因之中和基因之間，各種形式會導致或不導致不同的基因功能(通過比較同一序列的兩種替代形式的功能而確定)。大多數(shù)多態(tài)性不改變基因功能，稱為“中性”多態(tài)性。其他的多態(tài)性例如通過改變蛋白質(zhì)的氨基酸序列，或改變諸如啟動子或RNA剪切或降解信號的控制序列而改變基因功能，更通常地稱為突變。與SNP相關(guān)的疾病包括.鐮刀形紅細胞貧血病、β-地中海貧血癥、糖尿病、囊腫性纖維化、高脂蛋白血癥、各種自身免疫性疾病和一些癌癥的形成，例如由突變的p53所致的癌癥。除了導致或影響疾病狀態(tài)，點突變還改變對疾病的致病性或易感性，并導致對治療的耐受性。
檢測DNA序列中特定核苷酸改變或突變的能力可用于許多醫(yī)療和非醫(yī)療目的。鑒定核苷酸改變的方法使得能夠篩選并診斷和SNP相關(guān)的疾病。在鑒定疾病相關(guān)基因的遺傳學研究中多態(tài)性也是有用的。如果一種多態(tài)性改變一個或多個基因的功能，使疾病易感性增加，則與未患病的個體相比，該多態(tài)性將更經(jīng)常存在于患病的個體中。統(tǒng)計學方法可以用來評價患病群體相對于正常群體來說出現(xiàn)多態(tài)性的頻率，并促進多態(tài)性和疾病表型之間因果關(guān)系的建立。
能夠快速鑒定與疾病相關(guān)的序列改變的方法在批準預防措施、評估發(fā)病可能性和評價疾病的診斷中是有價值的。例如，SNP的非醫(yī)療應(yīng)用包括微生物或其具體菌株的檢測，以及法醫(yī)檢定。
SNP有用性的中心在于根據(jù)已知的SNP鑒定個體基因型的能力。已經(jīng)采取了許多方法來解決該問題。例如，一些多態(tài)性意外地導致限制性內(nèi)切酶切割位點的改變，從而對切割的基因組DNA樣品進行電泳分離時可以發(fā)現(xiàn)片段模式改變。這是限制性片段長度多態(tài)性分析或RFLP分析的基礎(chǔ)。RFLP分析的缺點是它只能檢測影響限制性內(nèi)切酶切割位點的改變，且該方法依賴于凝膠電泳和染色，該特點限制其檢測量。
還可以使用單鏈構(gòu)象多態(tài)性(SSCP)分析來檢測擴增DNA片段中的SNP。在該方法中，將擴增的片段變性，然后使之在電泳時的非變性聚丙烯酰胺凝膠中重新退火。單核苷酸序列變化的存在會導致相對于野生型序列的構(gòu)象和電泳遷移率方面的可檢測變化。該方法的缺點是依賴于聚丙烯酰胺凝膠電泳。
基于雜交的方法采用等位基因特異性寡核苷酸(ASO)探針(例如參見歐洲專利申請EP-237362和EP-329311)。例如，基于雜交的方法包括在探針RNA樣品DNA雙鏈體中的錯配位點進行核糖核酸酶A切割，或?qū)μ结楧NA樣品DNA雙鏈體中的錯配位點進行變性梯度凝膠電泳(在Landegren et.，Science 242229-237，1988；Rossiter et al.，J.Biol.Chem.26512753-12756，1990中作有評論)。
分析SNP基因型的其他方法采用等位基因特異性擴增(例如參見美國專利No.5,521,301；5,639,611和5,981,176)、微測序(mini-sequencing)方法、定量RT-PCT方法(例如所謂的“TaqMan分析”；例如參見授權(quán)給Gelfand的美國專利No.5,210,015；授權(quán)給Livak等人的美國專利No.5,538,848；和授權(quán)給Haaland的美國專利No.5,863,736；以及Heid，C.A.，et al.，Genome Research，6986-994(1996)；Gibson，U.E.M，et al.，Genome Research 6995-1001(1996)；Holland，P.M.，et al.，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 887276-7280，(1991)；和Livak，K.J.，et al.，PCR Methods andApplications 357-362(1995))和單核苷酸引物延伸(SnuPE)分析(例如美國專利No.5,846,710)及相關(guān)的延伸分析(例如美國專利No.6,004,744；5,888,819；5,856,092；5,710,028和6,013,431)。在本領(lǐng)域中需要有改進的SNP基因型分析方法。
大多數(shù)SNP基因型分析方法都一定程度上依賴于PCR擴增，以產(chǎn)生用于分析的足夠材料(如SSCP分析)，或使一種形式相對于另一種形式差異擴增，以檢測差異(如引物延伸分析)。為了增加基于PCR方法的檢測量，正致力于放大反應(yīng)體系，以便在一次反應(yīng)中可以檢測到多種SNP。通過簡單地加入對包含多種SNP的片段特異的引物對來放大面臨一個問題，導致該問題的原因是引物的相互作用致使靶片段不足量擴增并產(chǎn)生假陽性片段。在本領(lǐng)域中需要有改進的放大SNP基因型分析方法。
已經(jīng)使用毛細電泳(CE)來驗證SNP。一項研究使用了CE對單核苷酸聚合酶延伸分析的結(jié)果進行分析(Piggee et al.，1997，J.ChromatographyA.781367-375)。在該項研究中，PCR擴增的、含有已知SNP的DNA按照下述方法進行分析使引物緊靠多態(tài)性位點雜交，用單熒光標記的鏈終止子對引物進行延伸，然后對摻入的探針進行CE分離并檢測。在另一項研究中，PCR擴增的、含有已知SNP的DNA用一種或兩種相同熒光標記的鏈終止子進行延伸，然后進行摻入標記物的CE分離和檢測。根據(jù)寡核苷酸的CE遷移率的序列特異性差異確定摻入的終止子。McClay等(2002，Anal.Biochem.301200-206)描述了一種SNP基因型分析方法，包括使用3’-端堿基不同、具有通用上游引物的一組兩種不同熒光標記物的引物進行PCR，然后進行CE和熒光檢測。通過將不同大小和電泳特征的擴增產(chǎn)物混合在一起而增加了檢測量。
美國專利No.6,074,831教導了根據(jù)圖論技術(shù)同時將分子分離成亞組的CE的用途，和該方法在SNP基因型分析上的應(yīng)用。
美國專利No.6,322,980描述了在利用聚合酶的外切酶活性使熒光標記物從與多態(tài)性位點雜交的引物中釋放的SNP檢測方法中CE的用途。美國專利No.6,270,973也描述了在涉及核酸探針解聚活性的SNP基因型分析方法中CE的用途。
美國專利No.6,312,893描述了產(chǎn)生帶有有機標簽的片段的測序方法，其中所述標簽和特定的核苷酸相關(guān)。所述片段通過CE分離，然后從片段切除標簽，通過非熒光分光光度法或電勢測定法檢測切下的標簽。
美國專利No.6,156,178描述了在利用解聚活性從與多態(tài)性位點雜交的引物中釋放識別性核苷酸的SNP檢測方法中CE的用途。
上述方法都沒有在引物延伸或擴增步驟中使用核酸序列標簽，使用不同的引物進行延伸和擴增，使用通用擴增引物組或進行實時擴增監(jiān)測和檢測。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明提供了用于分析核酸樣品中序列差異基因型的方法。在優(yōu)選的方面中，該方法可用于確定單核苷酸差異，如單核苷酸多態(tài)性。本發(fā)明方法包括對包含異源序列標簽的引物延伸產(chǎn)物進行PCR擴增，然后進行毛細電泳大小分離并檢測擴增的延伸產(chǎn)物。在一個方面中，實時進行大小分離和產(chǎn)物檢測。因為CE分離和檢測技術(shù)提供包括擴增片段大小和任何給定擴增產(chǎn)物上標記物特性在內(nèi)的信息，公開的方法非常適于同時分析樣品基因型的多種已知SNP。通過擴增帶有可區(qū)分標記序列標簽的截然不同大小的擴增片段，可以檢測到每種已知SNP，其中所述序列標簽與多態(tài)性位點處特定核苷酸的存在特異地相關(guān)。根據(jù)本發(fā)明的方法還具有以下優(yōu)點，即需要一組擴增引物來檢測多種SNP，從而減小與使用多個不同的擴增引物相關(guān)的問題所產(chǎn)生的影響。
本發(fā)明包括一種鑒別給定核酸樣品中已知多態(tài)性位點處的核苷酸的方法，該方法包括a)使從核酸樣品產(chǎn)生的引物延伸產(chǎn)物群經(jīng)歷擴增過程，每個引物延伸產(chǎn)物包含一個標簽序列，所述標簽序列特異對應(yīng)于已知多態(tài)性位點處一個特定核苷酸的存在，其中擴增過程使用一個上游擴增引物和一組可區(qū)分標記的下游擴增引物進行，所述下游擴增引物組的每個成員包含引物延伸產(chǎn)物群成員所帶有的標簽序列和可區(qū)分標記物，其中每種可區(qū)分標記物特異對應(yīng)于多態(tài)性位點處特定核苷酸的存在；和b)檢測可區(qū)分標記物向核酸分子中的摻入，從而鑒別多態(tài)性位點處的核苷酸。
在一個實施方案中，可區(qū)分標記物是熒光標記物。
在另一個實施方案中，步驟(b)包括根據(jù)大小和/或電荷分離在擴增過程中生成的核酸分子。在一個優(yōu)選的實施方案中，分離包括毛細電泳。
在另一個實施方案中，擴增過程包括至少兩個擴增反應(yīng)循環(huán)，其中每個循環(huán)包括下列步驟1)核酸鏈分離；2)寡核苷酸引物退火；和3)退火引物的聚合酶延伸。在一個優(yōu)選的實施方案中，該方法在擴增過程中和至少一個反應(yīng)循環(huán)之后還包括下列步驟取出擴增反應(yīng)的部分樣品，根據(jù)大小和/或電荷分離核酸分子，并檢測可區(qū)分標記物的摻入，其中所述檢測鑒別多態(tài)性位點處的核苷酸。在另一個優(yōu)選的實施方案中，在擴增過程中的每個循環(huán)之后進行取出、分離和檢測。在另一個優(yōu)選實施方案中，分離包括毛細電泳。
在另一個實施方案中，步驟(a)和(b)在包括熱循環(huán)儀、取樣裝置、毛細電泳裝置和熒光檢測儀的模塊化設(shè)備(modular apparatu)中進行。
在另一個實施方案中，標簽序列包含15-40個核苷酸。
在另一個實施方案中，可區(qū)分標記的下游擴增引物組由下述引物組成包含特異對應(yīng)于多態(tài)性位點處A的存在的標簽序列的引物；包含特異對應(yīng)于多態(tài)性位點處C的存在的標簽序列的引物；包含特異對應(yīng)于多態(tài)性位點處G的存在的標簽序列的引物；和包含特異對應(yīng)于多態(tài)性位點處T的存在的標簽序列的引物。
在另一個實施方案中，可區(qū)分標記的下游擴增引物組由一對寡核苷酸組成，其中一個寡核苷酸包括特異對應(yīng)于多態(tài)性位點處第一個等位基因的標簽序列，另一個寡核苷酸包括特異對應(yīng)于多態(tài)性位點處第二個等位基因的標簽序列。
另一個實施方案在步驟(a)之前還包括將生成引物延伸產(chǎn)物群時未摻入的引物除去的步驟。在另一個優(yōu)選的實施方案中，除去引物的步驟包括將生成引物延伸產(chǎn)物群時未摻入的引物降解。在另一個優(yōu)選的實施方案中，使用熱不穩(wěn)定的外切酶進行降解。在另一個優(yōu)選的實施方案中，熱不穩(wěn)定的外切酶選自外切酶I和外切酶VII。在另一個優(yōu)選的實施方案中，熱不穩(wěn)定的外切酶在進行步驟(a)之前熱滅活。
本發(fā)明還包括一種鑒別給定核酸樣品中待測的一組已知多態(tài)性位點處的核苷酸的方法，該方法包括a)使從核酸樣品產(chǎn)生的引物延伸產(chǎn)物群經(jīng)歷擴增過程，每個引物延伸產(chǎn)物包含標簽序列組的一個成員，所述標簽序列特異對應(yīng)于已知多態(tài)性位點處一個特定核苷酸的存在，其中擴增過程使用一個上游擴增引物和一組可區(qū)分標記的下游擴增引物進行，所述上游擴增引物用于每個包含待測的已知多態(tài)性位點的序列，所述下游擴增引物組的每個成員包含引物延伸產(chǎn)物群成員所帶有的標簽序列和特異對應(yīng)于多態(tài)性位點處特定核苷酸存在的可區(qū)分標記物，其中上游擴增引物的選擇應(yīng)使待測的已知多態(tài)性位點組的每個多態(tài)性位點對應(yīng)于截然不同大小的擴增產(chǎn)物；和b)檢測可區(qū)分標記物向截然不同大小的擴增產(chǎn)物中的摻入，從而鑒別每個多態(tài)性位點處的核苷酸。
在一個實施方案中，可區(qū)分標記物是熒光標記物。
在另一個實施方案中，步驟(b)包括根據(jù)大小和/或電荷分離在擴增過程中生成的核酸分子。在一個優(yōu)選的實施方案中，分離包括毛細電泳。
在另一個實施方案中，擴增過程包括至少兩個擴增反應(yīng)循環(huán)，其中每個循環(huán)包括下列步驟1)核酸鏈分離；2)寡核苷酸引物退火；和3)退火引物的聚合酶延伸。
一個優(yōu)選的實施方案在擴增過程中和至少一個反應(yīng)循環(huán)之后還包括下列步驟取出擴增反應(yīng)的部分樣品，根據(jù)大小和/或電荷分離核酸分子，并檢測可區(qū)分標記物的摻入，其中所述檢測鑒別多態(tài)性位點處的核苷酸。在另一個優(yōu)選的實施方案中，在擴增過程中的每個循環(huán)之后進行取出、分離和檢測。在另一個優(yōu)選實施方案中，分離包括毛細電泳。
在另一個實施方案中，步驟(a)和(b)在包括熱循環(huán)儀、取樣裝置、毛細電泳裝置和熒光檢測儀的模塊化設(shè)備中進行。
在另一個實施方案中，標簽序列包含15-40個核苷酸。
在另一個實施方案中，可區(qū)分標記的下游擴增引物組由下述亞組組成包含特異對應(yīng)于多態(tài)性位點處A的存在的標簽序列的亞組；包含特異對應(yīng)于多態(tài)性位點處C的存在的標簽序列的亞組；包含特異對應(yīng)于多態(tài)性位點處G的存在的標簽序列的亞組；和包含特異對應(yīng)于多態(tài)性位點處T的存在的標簽序列的亞組。
另一個實施方案在步驟(a)之前還包括將生成引物延伸產(chǎn)物群時未摻入的引物除去的步驟。在一個優(yōu)選的實施方案中，除去引物的步驟包括將生成引物延伸產(chǎn)物群時未摻入的引物降解。在另一個優(yōu)選的實施方案中，使用熱不穩(wěn)定的外切酶進行降解。在一個優(yōu)選的實施方案中，熱不穩(wěn)定的外切酶選自外切酶I和外切酶VII。在另一個優(yōu)選的實施方案中，熱不穩(wěn)定的外切酶在進行步驟(a)之前熱滅活。
本發(fā)明進一步包括一種鑒別給定核酸樣品中待測的一組已知多態(tài)性位點處的核苷酸的方法，該方法包括a)使從核酸樣品產(chǎn)生的引物延伸產(chǎn)物群經(jīng)歷擴增過程，每個引物延伸產(chǎn)物包括第一標簽序列或其互補物和一組第二標簽序列或其互補物的一個成員，第二標簽序列或其互補物的存在特異對應(yīng)于已知多態(tài)性位點處一個特定核苷酸的存在，其中對于多態(tài)性位點組中的每個多態(tài)性位點來說，相對于第一標簽序列到包含其他多態(tài)性位點的樣品分子中一個多態(tài)性位點的距離，第一標簽序列位于多態(tài)性位點5’端的距離處，其中擴增過程使用一個包含第一標簽序列的上游擴增引物和一組可區(qū)分標記的下游擴增引物進行，下游擴增引物組的每個成員包含引物延伸產(chǎn)物群成員所帶有的標簽序列和特異對應(yīng)于多態(tài)性位點處特定核苷酸存在的可區(qū)分標記物，其中上游擴增引物的選擇應(yīng)使待測的已知多態(tài)性位點組中的每個多態(tài)性位點對應(yīng)于截然不同大小的擴增產(chǎn)物；和b)檢測可區(qū)分標記物向截然不同大小的擴增產(chǎn)物中的摻入，從而確定每個多態(tài)性位點處的核苷酸。
在一個實施方案中，可區(qū)分標記物是熒光標記物。
在另一個實施方案中，步驟(b)包括根據(jù)大小和/或電荷分離在擴增過程中生成的核酸分子。在一個優(yōu)選的實施方案中，分離包括毛細電泳。
在另一個實施方案中，擴增過程包括至少兩個擴增反應(yīng)循環(huán)，其中每個循環(huán)包括下列步驟1)核酸鏈分離；2)寡核苷酸引物退火；和3)退火引物的聚合酶延伸。一個優(yōu)選的實施方案在擴增過程中和至少一個反應(yīng)循環(huán)之后還包括下列步驟取出擴增反應(yīng)的部分樣品，根據(jù)大小和/或電荷分離核酸分子，并檢測可區(qū)分標記物的摻入，其中所述檢測鑒別多態(tài)性位點處的核苷酸。在另一個優(yōu)選的實施方案中，在擴增過程中的每個循環(huán)之后進行取出、分離和檢測。在另一個優(yōu)選實施方案中，分離包括毛細電泳。
在另一個實施方案中，步驟(a)和(b)在包括熱循環(huán)儀、取樣裝置、毛細電泳裝置和熒光檢測儀的模塊化設(shè)備中進行。
在另一個實施方案中，標簽序列包含15-40個核苷酸。
在另一個實施方案中，可區(qū)分標記的下游擴增引物組由下述亞組組成包含特異對應(yīng)于多態(tài)性位點處A的存在的標簽序列的亞組；包含特異對應(yīng)于多態(tài)性位點處C的存在的標簽序列的亞組；包含特異對應(yīng)于多態(tài)性位點處G的存在的標簽序列的亞組；和包含特異對應(yīng)于多態(tài)性位點處T的存在的標簽序列的亞組。
另一個實施方案在步驟(a)之前還包括將生成引物延伸產(chǎn)物群時未摻入的引物除去的步驟。在一個優(yōu)選的實施方案中，除去引物的步驟包括將生成引物延伸產(chǎn)物群時未摻入的引物降解。在另一個優(yōu)選的實施方案中，使用熱不穩(wěn)定的外切酶進行降解。在另一個優(yōu)選的實施方案中，熱不穩(wěn)定的外切酶選自外切酶I和外切酶VII。在另一個優(yōu)選的實施方案中，熱不穩(wěn)定的外切酶在進行步驟(a)之前熱滅活。
本發(fā)明還包括一種鑒別已知多態(tài)性位點處的單核苷酸的方法，該方法包括I)提供包含多態(tài)性位點的核酸樣品；II)分離核酸樣品的鏈，在下列引物的存在下進行重新退火a)第一寡核苷酸引物，包含與已知多態(tài)性位點上游已知距離的序列雜交的3’區(qū)域，第一寡核苷酸引物包含位于3’區(qū)域5’端的第一序列標簽；和b)一組第二寡核苷酸引物，其中所述組的每個成員包含i)與多態(tài)性位點的3’端和附近雜交的區(qū)域；ii)可變的3’末端核苷酸，其中當所述成員與已知序列雜交時，3’末端核苷酸和多態(tài)性位點相對，并且其中，當且只有當3’末端核苷酸與多態(tài)性位點處的核苷酸互補時，3’末端核苷酸才與多態(tài)性位點處的核苷酸進行堿基配對；和iii)與(ii)中的可變3’末端核苷酸對應(yīng)的標簽序列，所述標簽序列位于所述成員上區(qū)域(i)的5’端；III)使步驟(II)所得的退火寡核苷酸在一定條件下和核酸聚合酶接觸，所述條件使退火的寡核苷酸延伸，從而生成延伸產(chǎn)物，其中從第一寡核苷酸引物生成的引物延伸產(chǎn)物和其互補物分離時，可以作為模板，用于合成第二寡核苷酸引物組的成員的延伸產(chǎn)物，反之亦然；IV)重復鏈分離和接觸步驟(II)和(III)兩次，從而產(chǎn)生核酸分子群，其包含與第一寡核苷酸相同或互補的序列，以及與第二寡核苷酸組的一個成員相同或互補的序列；V)將步驟(IV)中產(chǎn)生的核酸分子群在使未退火的寡核苷酸引物降解的條件下和熱不穩(wěn)定的外切酶接觸，使引物降解；VI)熱滅活熱不穩(wěn)定的外切酶；VII)使核酸分子群經(jīng)歷擴增過程，其中擴增過程使用包含第一寡核苷酸引物所帶有的第一序列標簽的上游擴增引物和一組下游擴增引物進行，下游擴增引物組的每個成員包含第二寡核苷酸引物組成員所帶有的標簽和可區(qū)分標記物；和VIII)檢測至少一種可區(qū)分標記物的摻入，從而鑒別已知多態(tài)性位點處的核苷酸。
在一個實施方案中，可區(qū)分標記物是熒光標記物。
在另一個實施方案中，步驟(VIII)包括根據(jù)大小和/或電荷分離在擴增過程中所生成的核酸分子。在一個優(yōu)選的實施方案中，分離包括毛細電泳。
在另一個實施方案中，擴增過程包括至少兩個擴增反應(yīng)循環(huán)，其中每個循環(huán)包括下列步驟1)核酸鏈分離；2)寡核苷酸引物退火；和3)退火引物的聚合酶延伸。一個優(yōu)選的實施方案在擴增過程中和至少一個反應(yīng)循環(huán)之后還包括下列步驟取出擴增反應(yīng)的部分樣品，根據(jù)大小和/或電荷分離核酸分子，并檢測可區(qū)分標記物的摻入，其中所述檢測鑒別多態(tài)性位點處的核苷酸。在另一個優(yōu)選的實施方案中，在擴增過程中的每個循環(huán)之后進行取出、分離和檢測。
在另一個實施方案中，步驟I-VIII在包括熱循環(huán)儀、取樣裝置、毛細電泳裝置和熒光檢測儀的模塊化設(shè)備中進行。
在另一個實施方案中，每個標簽序列包含15-40個核苷酸。
在另一個實施方案中，與已知多態(tài)性位點上游的已知距離序列雜交的3’區(qū)域包含10-30個核苷酸。
在另一個實施方案中，與多態(tài)性位點的3’端和附近雜交的區(qū)域包含10-30個核苷酸。
在另一個實施方案中，可區(qū)分標記的下游擴增引物組由下述亞組組成包含特異對應(yīng)于多態(tài)性位點處A的存在的標簽序列的亞組；包含特異對應(yīng)于多態(tài)性位點處C的存在的標簽序列的亞組；包含特異對應(yīng)于多態(tài)性位點處G的存在的標簽序列的亞組；和包含特異對應(yīng)于多態(tài)性位點處T的存在的標簽序列的亞組。
本發(fā)明還包括一種鑒別存在于一組已知多態(tài)性位點處的單核苷酸的方法，該方法包括I)提供包含多態(tài)性位點組的核酸樣品；II)分離核酸樣品的鏈，在下列引物的存在下進行重新退火a)第一寡核苷酸引物組，每個引物包含與已知多態(tài)性位點上游的已知距離序列雜交的3’區(qū)域，第一寡核苷酸引物組的每個成員包含位于3’區(qū)域5’端的通用序列標簽，第一寡核苷酸引物組的每個成員的選擇應(yīng)使對于已知多態(tài)性位點組中的每個多態(tài)性位點來說產(chǎn)生截然不同大小的擴增產(chǎn)物；和b)下游擴增引物組，以5’至3’的順序包含i)序列標簽，選自特異對應(yīng)于引物的3’末端核苷酸G的標簽；特異對應(yīng)于引物的3’末端核苷酸A的標簽；特異對應(yīng)于引物的3’末端核苷酸T的標簽；和特異對應(yīng)于引物的3’末端核苷酸C的標簽；ii)與多態(tài)性位點組中一個多態(tài)性位點附近和3’端的序列特異性雜交的區(qū)域，其中下游擴增引物組包含引物亞組，引物亞組包含與多態(tài)性位點組中的每個多態(tài)性位點附近特異性雜交的區(qū)域；和iii)選自G、A、T或C的3’末端核苷酸，其中末端核苷酸特異對應(yīng)于(i)中所述在下游擴增引物上的序列標簽，其中當下游擴增引物與多態(tài)性位點附近和3’端的序列雜交時，3’末端核苷酸和多態(tài)性位點相對；III)使步驟(II)所得的退火寡核苷酸在一定條件下和核酸聚合酶接觸，所述條件使退火的寡核苷酸延伸，從而生成延伸產(chǎn)物，其中從第一寡核苷酸引物生成的引物延伸產(chǎn)物和其互補物分離時，可以作為模板，用于合成第二寡核苷酸引物組的成員的延伸產(chǎn)物，反之亦然；IV)重復鏈分離和接觸步驟(II)和(III)兩次，從而產(chǎn)生包含核酸分子群的反應(yīng)混合物，包含與第一寡核苷酸相同或互補的序列，以及與下游擴增引物組的一個成員相同或互補的序列；V)將步驟(IV)中產(chǎn)生的核酸分子群在使未退火的寡核苷酸引物降解的條件下和熱不穩(wěn)定的外切酶接觸，使未退火的引物降解；VI)熱滅活熱不穩(wěn)定的外切酶；VII)使核酸分子群經(jīng)歷擴增過程，其中擴增過程使用包含第一寡核苷酸引物所帶有的通用序列標簽的上游擴增引物和一組下游擴增引物進行，下游擴增引物組的每個成員包含第二寡核苷酸引物組成員所帶有的標簽和可區(qū)分標記物；和VIII)檢測至少一個可區(qū)分標記物的摻入，從而鑒別已知多態(tài)性位點處存在的核苷酸。
在一個實施方案中，可區(qū)分標記物是熒光標記物。
在一個實施方案中，步驟(VIII)包括根據(jù)大小和/或電荷分離在擴增過程中所生成的核酸分子。在一個優(yōu)選的實施方案中，分離包括毛細電泳。
在另一個實施方案中，擴增過程包括至少兩個擴增反應(yīng)循環(huán)，其中每個循環(huán)包括下列步驟1)核酸鏈分離；2)寡核苷酸引物退火；和3)退火引物的聚合酶延伸。一個優(yōu)選的實施方案在擴增過程中和至少一個反應(yīng)循環(huán)之后還包括下列步驟取出擴增反應(yīng)的部分樣品，根據(jù)大小和/或電荷分離核酸分子，并檢測可區(qū)分標記物的摻入，其中所述檢測鑒別多態(tài)性位點處的核苷酸。在另一個優(yōu)選的實施方案中，在擴增過程中的每個循環(huán)之后進行取出、分離和檢測。
在另一個實施方案中，步驟I-VIII在包括熱循環(huán)儀、取樣裝置、毛細電泳裝置和熒光檢測儀的模塊化設(shè)備中進行。
在另一個實施方案中，標簽序列包含15-40個核苷酸。
在另一個實施方案中，與已知多態(tài)性位點上游的已知距離序列雜交的3’區(qū)域包含10-30個核苷酸。
在另一個實施方案中，與多態(tài)性位點的3’端和附近雜交的區(qū)域包含10-30個核苷酸。
在另一個實施方案中，可區(qū)分標記的下游擴增引物組由下述亞組組成包含特異對應(yīng)于多態(tài)性位點處A的存在的標簽序列的亞組；包含特異對應(yīng)于多態(tài)性位點處C的存在的標簽序列的亞組；包含特異對應(yīng)于多態(tài)性位點處G的存在的標簽序列的亞組；和包含特異對應(yīng)于多態(tài)性位點處T的存在的標簽序列的亞組。
本發(fā)明還包括一種鑒別核酸樣品上多態(tài)性位點處存在的核苷酸的試劑盒，所述試劑盒包括一組上游引物，包括a)第一引物，包含5’標簽序列和足以與已知多態(tài)性位點上游的已知距離序列特異性雜交的3’序列；和b)4個下游第二引物組成的一組引物，以5’至3’的順序包含i)序列標簽，選自特異對應(yīng)于引物的3’末端核苷酸G的標簽；特異對應(yīng)于引物的3’末端核苷酸A的標簽；特異對應(yīng)于引物的3’末端核苷酸T的標簽；和特異對應(yīng)于所述的3’末端核苷酸C的標簽；ii)與多態(tài)性位點組中一個多態(tài)性位點附近和3’端的序列特異性雜交的區(qū)域，其中下游擴增引物組包含引物亞組，所述引物亞組包含與多態(tài)性位點組中的每個多態(tài)性位點附近特異性雜交的區(qū)域；和iii)選自G、A、T或C的3’末端核苷酸，其中所述末端核苷酸特異對應(yīng)于(i)中在下游擴增引物上的序列標簽，其中當下游擴增引物與多態(tài)性位點附近和3’端的序列雜交時，3’末端核苷酸和多態(tài)性位點相對。
一個實施方案還包括5個引物組成的引物組，所述引物缺少對待驗證多態(tài)性的生物有機體基因組中的基因特異的序列，所述引物包括含有第一引物的標簽序列的一個引物，和四個可區(qū)分標記的引物組成的組，其中含有四個下游第二引物組成的組中的標簽序列。
本文所用的術(shù)語“樣品”指從其天然環(huán)境中分離、包含多聚核苷酸的生物材料。根據(jù)本發(fā)明的“樣品”可以由純的或分離的多聚核苷酸組成，或可以包含生物樣品如含有多聚核苷酸的組織樣品、生物流體樣品或細胞樣品。生物流體包括血液、血漿、唾液、尿液、腦脊液、灌洗液和leukophoresis樣品。本發(fā)明的樣品可以是包含多聚核苷酸的任何植物、動物、細菌或病毒材料。
本文所用的術(shù)語“多態(tài)性”指核酸序列變異。當和天然發(fā)生的序列相比時，多態(tài)性在群體中存在的頻率大于0.01％、0.1％、1％或更大。本文所用的多態(tài)性可以是插入、缺失、重復或重排。本文所用的“單核苷酸多態(tài)性”或“SNP”指單核苷酸殘基上的核酸序列變異，包括單核苷酸缺失、插入或堿基改變。多態(tài)性，包括SNP，可以是表型上中性的，或者具有和該基因座上顯性(predominant)序列所表現(xiàn)的表型相區(qū)別的不同表型。本文所用的“中性多態(tài)性”指序列變異不改變基因功能的多態(tài)性，“突變”或“功能多態(tài)性”指改變基因功能并具有相關(guān)表型的序列變異。
當指個體的SNP基因型時，“顯性等位基因“是在受試群體中最常出現(xiàn)的等位基因(即，當有兩個等位基因時，出現(xiàn)超過群體的50％的等位基因是顯性等位基因；當有兩個以上等位基因時，“顯性等位基因”是在受試群體中與該位點的其他等位基因相比以最高頻率出現(xiàn)的等位基因，例如頻率至少高出5％)。術(shù)語“變體等位基因”用來指群體中發(fā)生頻率比顯性等位基因低的一個或多個等位基因(例如，有兩個等位基因時，變體等位基因是發(fā)生少于受試群體的50％的等位基因；有兩個以上的等位基因時，變體等位基因是其發(fā)生頻率比顯性等位基因低，例如至少低5％的等位基因)。
本文所用的術(shù)語“多態(tài)性位點”指多態(tài)性核苷酸序列中在個體間發(fā)生變異的核苷酸位置。
本文所用的“寡核苷酸引物”指能夠與多聚核苷酸模板退火、提供3’端以生成與多聚核苷酸模板互補的延伸產(chǎn)物的多聚核苷酸分子(即DNA或RNA)。起始和延伸條件通常包括合適緩沖液(“緩沖液”包括作為輔助因子或影響pH、離子強度等的組分(substituent))中四種不同脫氧核苷酸三磷酸和聚合誘導試劑如DNA聚合酶或逆轉(zhuǎn)錄酶的存在，以及合適的溫度。根據(jù)本發(fā)明的引物可以是單鏈或雙鏈的。引物是單鏈可進行最大效率的擴增，引物和其互補物形成雙鏈多聚核苷酸。本發(fā)明中有用的“引物”長度小于或等于100個核苷酸，例如長度小于或等于90、或80、或70、或60、或50、或40、或30、或20、或15個核苷酸，或等于10個核苷酸。
本文所用的術(shù)語“聚合酶延伸”指通過核酸聚合酶的、至少一個互補核苷酸向退火引物3’端的依賴于模板的摻入。聚合酶延伸優(yōu)選加入一個以上的核苷酸，優(yōu)選最多并包括對應(yīng)于全長模板的核苷酸。聚合酶延伸的條件隨聚合酶的特性而變動。聚合酶延伸的溫度根據(jù)酶的已知活性特性而定。一般來說，雖然在低于其最佳延伸溫度的條件下該酶保留有至少部分的活性，大多數(shù)常用的熱穩(wěn)定性聚合酶(如Taq聚合酶和其變體)引發(fā)的聚合酶延伸在65℃-75℃進行，優(yōu)選在約68-72℃進行。
本文所用的術(shù)語“引物延伸產(chǎn)物”指由聚合酶延伸方法產(chǎn)生的核酸分子。
本文所用的術(shù)語“標簽序列”或簡稱“標簽”指通過標準的磷酸二酯鍵(即標簽的3’OH和寡核苷酸的5’磷酸之間的磷酸二酯鍵)結(jié)合到寡核苷酸引物上、使得能夠鑒定或跟蹤摻入(例如，通過引物延伸的摻入或引物延伸產(chǎn)物的擴增摻入)“標簽”的多聚核苷酸的核苷酸序列，優(yōu)選異源或人工核苷酸序列。根據(jù)本發(fā)明的“標簽”序列將包含至少15個核苷酸，優(yōu)選20-30個核苷酸，并優(yōu)選在引物延伸條件下不和進行基因型分析的生物有機體基因組中的序列雜交。根據(jù)本發(fā)明的標簽序列可以但不必須是隨機的。
本文所用的術(shù)語“特異對應(yīng)于”指寡核苷酸上的給定核酸標簽僅配合給定的3’末端核苷酸使用，從而使該標簽序列的存在成為3’末端核苷酸存在的標志。例如，標簽序列“1”僅配合3’末端A用在寡核苷酸上，標簽序列“2”僅配合3’末端C用在寡核苷酸上，標簽序列“3”僅配合3’末端G用在寡核苷酸上，標簽序列“4”僅配合3’末端T用在寡核苷酸上。因此，在根據(jù)本發(fā)明的方法中，如果一個片段用對標簽2特異的引物擴增，已知原始引物延伸引物中的3’末端核苷酸為C，則樣品中的多態(tài)性核苷酸為G。
本文所用的術(shù)語“擴增過程”指特異擴增，即增加目的核酸序列的過程。根據(jù)本發(fā)明的擴增過程包括至少兩個，優(yōu)選至少5、10、15、20、25、30、35個或更多反復循環(huán)，其中循環(huán)包括下列步驟1)鏈分離(如熱變性)；2)寡核苷酸引物與模板分子退火；和3)退火引物的核酸聚合酶延伸。這些步驟中的每一個步驟所需的溫度和時間是本領(lǐng)域中公知的。使用擴增過程所實現(xiàn)的擴增優(yōu)選是指數(shù)性的，也可以是線性的。根據(jù)本發(fā)明的一個擴增過程優(yōu)選在熱循環(huán)儀中進行，許多熱循環(huán)儀都是可以購買得到的。
本文所用的術(shù)語“組”指核酸樣品、引物或其他實體的組。一組將包括已知數(shù)目的、至少兩個的這種實體。
本文所用的術(shù)語“亞組”指包括在本文所限定的組中的組，其中亞組少于組中的每一個成員。本文所用的亞組可以由單個實體組成。
本文所用的術(shù)語“上游”和“下游”用來指相對于多態(tài)性位點的多聚核苷酸的位置。一般來說，“上游”指多態(tài)性位點的5’端，“下游”指多態(tài)性位點的3’端。應(yīng)該理解雙鏈DNA中“上游”和“下游”的選擇是非常隨意的，這是因為人們可以把注意力集中在任意一條鏈上，多態(tài)性位點“上游”或“下游”的方向隨所選擇的“參照”鏈而變化。為了避免任何的不明確性，本文中描述給定方法用到的、用來選擇術(shù)語“上游”和“下游”的“參照”鏈在所述方法中始終是相同的。
本文所用的術(shù)語“可區(qū)分標記的”指一種標記的寡核苷酸引物或其摻入的核酸分子的信號可以和另一種標記引物或核酸分子的信號相區(qū)分。例如，可檢測標記物可以包括光吸收染料、熒光染料或放射性標記物。熒光染料是優(yōu)選的。一般來說，如果一種熒光信號和另一種熒光信號的峰發(fā)射波長分開有至少20nm，則是可區(qū)分的。更大的發(fā)射峰間隔是優(yōu)選的，尤其是當給定反應(yīng)物中熒光團的發(fā)射峰寬、而非窄或更陡峭的峰時更是如此。
本文所用的術(shù)語“分離核酸分子”指在大小和/或電荷的基礎(chǔ)上物理分離樣品或部分樣品中核酸分子的過程。電泳分離是優(yōu)選的，毛細電泳分離是最優(yōu)選的。
本文所用的“檢測摻入”指檢測給定的標記寡核苷酸引物是否已經(jīng)得以延伸并將標記物摻入到引物延伸或擴增產(chǎn)物中的過程。檢測可以通過與可檢測標記物相容的任何方法進行，但是優(yōu)選涉及熒光標記物的檢測。檢測包括確定引物延伸或擴增產(chǎn)物中標記物的存在和量。熒光檢測儀是本領(lǐng)域中所熟知的。
本文所用的術(shù)語“特異雜交”是指在給定的雜交條件下探針或引物僅和包含靶序列的樣品中的靶序列雜交。給定的雜交條件包括在擴增過程中退火步驟的條件，即在預測的Tm的基礎(chǔ)上選擇的退火溫度和適于所選聚合酶的鹽條件。
本文所用的術(shù)語“鏈分離”或“分離鏈”指處理核酸樣品，使互補的雙鏈分子分離成可以和寡核苷酸引物退火的兩條單鏈。根據(jù)本發(fā)明的鏈分離通過將核酸樣品加熱到其Tm以上實現(xiàn)。一般來說，對于在適于核酸聚合酶的緩沖液中包含核酸分子的樣品來說，加熱到94℃足以實現(xiàn)根據(jù)本發(fā)明的鏈分離。示例性的緩沖液包含50mMKCl、10mM Tric-HCl(pH8.8@25℃)、0.5-3mM MgCl2和0.1％BSA。
本文所用的術(shù)語“引物退火”或“重新退火”指將寡核苷酸引物與模板核酸鏈雜交。引物退火的條件隨引物的長度和序列而變動，以計算的引物Tm為基礎(chǔ)。一般來說，擴增過程中的退火步驟涉及在鏈分離步驟之后將溫度降至以根據(jù)引物序列計算的Tm為基礎(chǔ)的溫度，持續(xù)足以實現(xiàn)退火的一段時間。本領(lǐng)域的技術(shù)人員可以使用各種現(xiàn)有的算法(例如OligoTM，Primer Design和互聯(lián)網(wǎng)上可獲得的程序，包括Primer3和Oligo Calculator)容易地預測Tm。對于大多數(shù)擴增過程來說，退火溫度選擇為比預測Tm低約5℃，雖然可以使用Tm附近或之上的溫度(例如比預測Tm低1℃-5℃，或比預測Tm高1℃-5℃)，也可以使用比預測Tm低或高5℃以上的溫度(例如低6℃、8℃、10℃和高6℃、8℃或10℃)。一般來說，退火溫度越接近Tm，退火就越特異。引物退火的時間很大程度上依賴于反應(yīng)體積，較大的體積需要較長的時間，另外還取決于引物和模板濃度，引物與模板的較高相對濃度與較低的相對濃度相比需要較少的時間。根據(jù)體積和相對引物/模板濃度，擴增過程中的引物退火步驟可以是1秒至5分鐘，但是通常為10秒至2分鐘之間，優(yōu)選為30秒至2分鐘。
本文所用的術(shù)語“與已知多態(tài)性位點上游的已知距離序列雜交的3’區(qū)域”指位于寡核苷酸的3’端、與核酸樣品中進行基因型分析的已知多態(tài)性位點上游(即5’)的序列特異雜交的核苷酸序列。所述“雜交的3’區(qū)域”長度至少為12個核苷酸，優(yōu)選至少為15、18、21、24、27、30個核苷酸或更多。所述“雜交的區(qū)域”選擇距離多態(tài)性位點已知的距離，從而在根據(jù)本發(fā)明的方法中產(chǎn)生相對于其他擴增產(chǎn)物的截然不同大小的擴增產(chǎn)物?！耙阎嚯x”可以是50-1000個核苷酸，優(yōu)選50-500個核苷酸，或50-250個核苷酸。
本文所用的術(shù)語“與多態(tài)性位點的3’端和附近雜交的區(qū)域”是長度通常為10至約25個核苷酸、與多態(tài)性位點的3’端特異雜交從而使該區(qū)域的倒數(shù)第二個3’端核苷酸與多態(tài)性位點下游的一個核苷酸雜交的寡核苷酸序列。本發(fā)明使用包含這種區(qū)域的4個引物組成的組，所述組包括具有四個不同3’末端核苷酸G、A、T或C的寡核苷酸，只有其中一個會與多態(tài)性位點處的核苷酸雜交，通過核酸聚合酶進行引物延伸。
本文所用的術(shù)語“可變的3’末端核苷酸”指寡核苷酸中的3’末端核苷酸，可以是G、A、T或C。
本文所用的術(shù)語“和多態(tài)性位點相對”指如果3’末端核苷酸與多態(tài)性位點處的核苷酸互補的話，核苷酸，即與包含多態(tài)性的核酸鏈雜交的寡核苷酸引物上的3’末端核苷酸的定位將和多態(tài)性位置上的核苷酸形成Watson-Crisk氫鍵堿基對。
本文所用的術(shù)語“互補”指四個脫氧核苷酸G、A、T和C之間氫鍵堿基對形成傾向的層次，A與T配對，G與C配對。
本文所用的術(shù)語“核酸聚合酶”指催化依賴于模板的核苷酸三磷酸聚合、形成與模板核酸序列的一個核酸鏈互補的引物延伸產(chǎn)物的酶。核酸聚合酶在退火引物的3’端啟動合成，并向模板5’端的方向繼續(xù)合成。許多核酸聚合酶是本領(lǐng)域中公知的，可以通過商業(yè)途徑得到。一組優(yōu)選的核酸聚合酶是熱穩(wěn)定性的，即它們在經(jīng)受足以使互補的退火核酸鏈變性的溫度后仍保留有功能。
本文所用的術(shù)語“部分樣品(aliquot)“指在循環(huán)過程中取出的擴增反應(yīng)物樣品。部分樣品小于總反應(yīng)體積，優(yōu)選為0.1-30％的體積。在本發(fā)明的一個實施方案中，對于取出的各部分樣品來說，加入包含反應(yīng)所必需試劑(如緩沖液、鹽、核苷酸和聚合酶)的等體積反應(yīng)緩沖液。
本文所用的術(shù)語“使得退火寡核苷酸延伸從而生成延伸產(chǎn)物的條件”指一組條件，例如包括核酸聚合酶能夠催化引物延伸的溫度、鹽與輔助因子濃度、pH和酶濃度。這種條件隨所用核酸聚合酶的特性而變動，但是多數(shù)有用聚合酶的條件是本領(lǐng)域技術(shù)人員所熟知的。示例性的一組條件是50mM KCl、10mM Tric-HCl(pH 8.8@25℃)，0.5-3mM MgCl2、200μM每種dNTP和0.1％BSA，72℃，Taq聚合酶在上述條件下催化引物延伸。
本文所用的術(shù)語“實時”指核酸擴增反應(yīng)中產(chǎn)物積累的測定至少在擴增過程的過程中開始或至少同時開始，優(yōu)選完成。因此，對于“實時”測定方法來說，至少每部分樣品中擴增產(chǎn)物測定或檢測的啟動是和擴增過程同時進行的?！皢印敝覆糠謽悠啡〕霾⒅糜诜蛛x裝置中并開始分離，所述分離裝置如毛細電泳毛細管。測定的完成是在從部分樣品分離的核酸中檢測到標記物質(zhì)。因為分離和檢測時間會超過擴增過程的每個循環(huán)時間，擴增產(chǎn)物的檢測相對于擴增過程的完成來說會有最長120分鐘的滯后。優(yōu)選這種滯后或延遲少于30分鐘，例如25分鐘、20分鐘、15分鐘、10分鐘、5分鐘、4分鐘、3分鐘、2分鐘、1分鐘或更少，包括無滯后或延遲。
本文所用的術(shù)語“毛細電泳”指擴增反應(yīng)物的部分樣品中核酸分子的電泳分離，其中分離在毛細管中進行?？色@得的毛細管內(nèi)徑為約10-300μm，長度為約0.2cm-約3m，較優(yōu)選為0.5cm-20cm，更較優(yōu)選為0.5cm-10cm。另外，使用微量液體的微毛細管(例如得自Caliper或Agilent Technologies)尤其包括在“毛細電泳”的含義之內(nèi)。
本文所用的術(shù)語“模塊化設(shè)備”指包括個體單元的設(shè)備，其中進行根據(jù)本發(fā)明的方法中的某些過程。模塊化設(shè)備的個體單元可以但并非必須物理相連，但優(yōu)選的是個體單元受中央控制器如計算機的控制。根據(jù)本發(fā)明有用的模塊化設(shè)備的實例具有熱循環(huán)單元、取樣器單元和帶有熒光檢測儀的毛細電泳單元。根據(jù)本發(fā)明有用的模塊化設(shè)備包括將樣品從循環(huán)反應(yīng)物轉(zhuǎn)移到電泳單元的機器手(robotic arm)。
本文所用的術(shù)語“取樣裝置”指在擴增過程中從擴增產(chǎn)物中取出部分樣品的機械裝置。根據(jù)本發(fā)明有用的取樣裝置優(yōu)選能盡可能減小循環(huán)反應(yīng)物的污染，例如使用一次取樣后就除掉的移液tip頭或針，或在每次取樣后引入一個或多個洗滌針或tip頭的步驟。作為替代方案，取樣裝置可以使用于毛細電泳的毛細管直接接觸擴增反應(yīng)物，以將部分樣品加到毛細管中。作為替代方案，取樣裝置可以包括與控制閥相連的液體線(fluidic line)(如管)，其中所述控制閥在特定的循環(huán)時打開。例如，本領(lǐng)域中公知的取樣裝置包括多用Robbins Scientific Hydra 96移液器，其適于向或從96孔板中取樣。這種和其他取樣裝置易于根據(jù)本發(fā)明方法使用。
本文所用的術(shù)語“機器手”指將樣品、包含樣品的管或板從一個位置機械轉(zhuǎn)移到另一個位置的裝置，優(yōu)選由微處理器控制。每個位置可以是根據(jù)本發(fā)明有用的模塊設(shè)備中的一個單元。根據(jù)本發(fā)明有用的機器手的一個例子是Mitsubishi RV-E2Robotic Arm?？刂茩C器手的軟件通?？蓮臋C器手廠商獲得。
本文所用的術(shù)語“擴增產(chǎn)物”指部分特定多聚核苷酸序列和/或其互補序列的多拷貝多聚核苷酸，核苷酸序列對應(yīng)于模板多聚核苷酸序列和其互補序列。根據(jù)本發(fā)明的“擴增產(chǎn)物”可以是DNA或RNA，可以是雙鏈或單鏈。
本文所用的術(shù)語“截然不同大小的擴增產(chǎn)物”指不同大小的擴增產(chǎn)物中可分辨的擴增產(chǎn)物。“不同大小”指長度至少有一個核苷酸差異的核酸分子。一般來說，用于本發(fā)明的截然不同大小的擴增產(chǎn)物的差異大于或等于比用在本發(fā)明給定方法的分離方法中的分辨限度更多的核苷酸。例如，當分離的分辨限度是一個堿基時，截然不同大小的擴增產(chǎn)物長度至少有一個堿基的不同，但是也可以有2個堿基、5個堿基、10個堿基、20個堿基、50個堿基、100個堿基或更多個堿基的不同。例如，當分辨限度是10個堿基時，截然不同大小的擴增產(chǎn)物將至少有10個堿基的差異，但是也可以有11個堿基、15個堿基、20個堿基、30個堿基、50個堿基、100個堿基或更多個堿基的不同。
本文所用的術(shù)語“圖譜”或等同術(shù)語“擴增曲線”和“擴增圖”指所作的數(shù)學曲線，其中說明擴增過程的兩個或多個步驟中摻入到目的核酸序列中的檢測標記信號是所取樣品循環(huán)數(shù)的函數(shù)。該圖譜優(yōu)選在毛細電泳分離各反應(yīng)樣品中的核酸后對所檢測到的每條帶的熒光進行作圖而成。大多數(shù)商業(yè)來源的熒光檢測儀都有軟件界面，使得根據(jù)所檢測的信號生成曲線。
能夠在一次反應(yīng)中分析的基因數(shù)可以根據(jù)產(chǎn)物大小的可測差異(1-2個堿基)和PCR產(chǎn)物的可分離大小(500-1000bp)來估計，可以多達1000，但優(yōu)選100-200。
本文所用的術(shù)語“熱不穩(wěn)定的外切酶“指降解單鏈核酸分子或特定雙鏈核酸分子上的突出單鏈、在較高溫度下孵育而不可逆滅活的酶。滅活的溫度隨酶和例如緩沖液條件與酶濃度的不同而變化。酶滅活的條件是本領(lǐng)域的技術(shù)人員所公知的。根據(jù)本發(fā)明有用的熱不穩(wěn)定外切酶的一個非限制性例子是大腸桿菌(E.coli)的外切酶I(ExoI)(例如，可購自New England Biolabs，Beverly MA)。ExoI在80℃孵育20分鐘而滅活。
本文所用的術(shù)語“基本缺少對生物有機體基因組中基因特異的序列”指當給定引物在引物延伸條件下和待鑒定多態(tài)性的生物有機體基因組DNA孵育時不產(chǎn)生引物延伸產(chǎn)物。


圖1所示為在本發(fā)明的一個實施方案中有用的引物延伸反應(yīng)的示意圖。S1和S5是不同的序列標簽。
圖2所示為在本發(fā)明的一個實施方案中有用的擴增過程和檢測的示意圖。S1和S5是彼此不同、但與圖1中的S1至S5相同的標簽序列引物。
具體實施例方式
本發(fā)明提供了根據(jù)已知單核苷酸多態(tài)性確定核酸樣品基因型的方法。本發(fā)明的方法采用通過摻入序列標簽而同時鑒定SNP群處存在的特定核苷酸的引物延伸反應(yīng)，然后使用對標簽特異的、其中下游引物加以標記的引物組擴增帶有標簽的片段。在擴增過程中，取出反應(yīng)物的部分樣品，對擴增片段進行大小分離和檢測。多態(tài)性位點處存在的核苷酸根據(jù)結(jié)合在擴增片段上的標記物的大小和特性進行鑒定。因為檢測擴增物大小和摻入的標記物，該系統(tǒng)非常適于放大。另外，在擴增反應(yīng)過程中進行分離和檢測，擴增反應(yīng)圖實時生成。實時特征提供了快速的分析以及與擴增過程相關(guān)的信息，其在例如由引物間的相互作用所致的假陽性信號的鑒定和消除中是有用的。
生成帶有序列標簽的引物延伸產(chǎn)物作為第一步驟，本發(fā)明需要生成帶有序列的引物延伸產(chǎn)物。該步驟的關(guān)鍵點是任何特定延伸產(chǎn)物上的標簽特異對應(yīng)于多態(tài)性位點處的核苷酸。在該步驟中，標簽通過具有下述通用結(jié)構(gòu)的引物的延伸摻入5’-Tagc-靶互補物-Vc-3’其中“Tagc”是對應(yīng)于引物3’末端核苷酸的標簽序列，“靶互補物”是與已知SNP附近特異雜交的引物3’區(qū)域，“Vc”是對應(yīng)于Tagc序列的3’末端核苷酸。Tagc序列長度優(yōu)選為20-30個核苷酸，優(yōu)選在引物延伸條件下不與待分析基因型的生物有機體基因組序列雜交，或不與給定反應(yīng)中所用的任何其他引物雜交。“靶互補物”足夠長，以提供引物和已知SNP附近序列之間的特異雜交，通常長度為約10-25個核苷酸。Vc選自dG、dA、dT和dC，當引物與待測核酸樣品雜交時，Vc位置和已知的多態(tài)性位點相對。只有當Vc和多態(tài)性位點處的核苷酸互補時，Vc才和該位點處的核苷酸進行堿基配對。只有3’末端核苷酸與模板鏈上的臨近核苷酸進行堿基配對時，核酸聚合酶如Taq聚合酶才會使引物延伸，帶有與多態(tài)性位點相對的已知3’末端核苷酸的引物的延伸鑒別存在于多態(tài)性位點處的核苷酸，其為3’末端核苷酸的互補物。
用于鑒定SNP的一組下游引物延伸引物將包括四個不同的標簽序列，每個對應(yīng)于3’末端dG、dA、dT或dC。因此，舉例來說，如果標簽為標簽1-4，標簽1將用在終止于3’dG的引物上，標簽2將用在終止于3’dA的引物上，標簽3將用在終止于3’dT的引物上，標簽4將用在終止于3’dC的引物上。本文所公開方法的主要優(yōu)點是多處SNP的分析中可以使用相同的一組四個下游Tagc序列，因為所得的擴增產(chǎn)物大小不同。這限制了擴增步驟中影響放大擴增的非模板指導的引物間相互作用。
使用帶有序列標簽的上游引物來生成含給定SNP序列的相對鏈。這些引物將具有下述通用結(jié)構(gòu)5’-Tag-靶互補物-3其中“Tag”是與下游引物延伸引物組中所用的序列標簽不同的序列標簽，“靶互補物”指與已知SNP的上游區(qū)域互補的序列。上游引物上“Tag”序列長度優(yōu)選為20-30個核苷酸，優(yōu)選在引物延伸條件下不與待分析基因型的生物有機體基因組序列雜交，或不與給定反應(yīng)中所用的任何其他引物雜交。“靶互補物”足夠長，以提供引物和已知SNP上游序列之間的特異雜交，通常長度為約10-25個核苷酸。遠距離上游通常位于多態(tài)性位點上游至少50個核苷酸，但是可以是50-1000個核苷酸或更多，優(yōu)選50-500，或50-250個核苷酸。上游引物序列到多態(tài)性位點的距離決定最終擴增產(chǎn)物的大小或長度。最終擴增產(chǎn)物大小的選擇必須超過用于大小分離的系統(tǒng)的分辨限度。因此，如果分離的分辨限度是一個堿基，則擴增產(chǎn)物的大小應(yīng)該在長度上至少有一個堿基的差異，優(yōu)選更多(例如，至少5、10、15個堿基或更多)。例如，當分辨限度為10個堿基時，擴增產(chǎn)物的大小應(yīng)該至少有10個堿基的差異，優(yōu)選更多(例如，至少15、20、25、30個堿基或更多)。
本文中使用術(shù)語“上游”和“下游”以便于說明本發(fā)明。但是，應(yīng)該認識到由于DNA的雙鏈特征，使用任何一側(cè)，即上游或下游的SNP特異性引物，通過引物和與之相對的一條鏈的雜交都可以獲得多態(tài)性。本發(fā)明具體考慮了基因組DNA任一鏈上的SNP問題。
為了根據(jù)本發(fā)明生成帶有序列標簽的引物延伸產(chǎn)物，使核酸樣品變性，優(yōu)選通過加熱，例如95℃2分鐘或更長時間，并在上游延伸引物和針對反應(yīng)中待測的每個SNP的一組下游延伸引物存在下重新退火。變性和退火最好在與引物延伸反應(yīng)所用的核酸聚合酶相容的緩沖液中進行，例如在1×Taq聚合酶緩沖液中進行。重新退火在低于引物Tm的溫度下進行，通常在約20℃-60℃進行，雖然對于某些引物來說適合使用更低或更高的溫度。引物的存在量應(yīng)是每個引物約15-500nM。本領(lǐng)域的技術(shù)人員可以根據(jù)經(jīng)驗通過最少的實驗來確定最佳引物濃度，例如進行引物在15-500nM范圍內(nèi)變動的測試反應(yīng)，根據(jù)延伸或擴增反應(yīng)的相對分辨率、產(chǎn)量和特異性對結(jié)果進行分析。
在引物的存在下退火后，使用核酸聚合酶進行聚合。能夠用于該步驟的各種聚合酶是公知的，可以由本領(lǐng)域的技術(shù)人員進行選擇。最常用的酶是熱穩(wěn)定的Taq酶和其他熱穩(wěn)定的聚合酶，例如Pfu聚合酶。引物延伸在所選用酶的標準條件下進行，例如50mM KCl、10mM Tric-HCl(pH 8.8@25℃)，0.5-3mM MgCl2、0.1％BSA和100μM每種dNTP，72℃ 2分鐘。
第一輪引物延伸產(chǎn)生一個群體，其中一條鏈具有上游引物和摻入的標簽序列，其他鏈具有下游引物和摻入的標簽序列。對于每種SNP來說，摻入的下游引物3’末端核苷酸與靶DNA上多態(tài)性位點處的核苷酸互補。下游引物的摻入必須包括與3’末端核苷酸相關(guān)或?qū)?yīng)的標簽序列。為了生成其中代表每條鏈的分子都具有上游標簽或其互補物與下游標簽或其互補物的一個群體，第一引物延伸反應(yīng)的產(chǎn)物進行另一輪變性、在同樣引物的存在下重新退火和那些引物的聚合酶延伸。
第二輪引物延伸之后，除去未延伸的引物?？梢允褂贸ヒ锏娜魏畏椒?，例如電泳或柱層析，但是優(yōu)選使用對單鏈DNA特異的熱不穩(wěn)定的外切酶。使用熱不穩(wěn)定的外切酶避免對耗時的分離和純化步驟的需要，以及污染或樣品損失的可能性。例如，根據(jù)本發(fā)明的熱不穩(wěn)定的外切酶通常包括大腸桿菌外切酶I(ExoI)和外切酶VII(ExoVII)。例如，ExoI在37℃有活性，但是80℃孵育20分鐘后失活。
除去用于引物延伸的引物，以便可以使用與摻入的上游和下游標簽序列對應(yīng)的新引物來擴增引物延伸產(chǎn)物。除去第一引物后，加入包括上游標簽序列引物和四個下游標簽序列引物組成的一組引物。四個下游標簽序列引物的每一個都用熒光燃料進行可區(qū)分標記(如末端標記)。使加有新引物的混合物經(jīng)歷擴增過程，包括熱變性、重新退火和聚合酶延伸的循環(huán)。擴增過程應(yīng)包括至少兩個循環(huán)，但優(yōu)選包括2-35個循環(huán)，較優(yōu)選10-30個循環(huán)，更優(yōu)選15-25個循環(huán)。
在本發(fā)明的這一方面中，循環(huán)過程中，變性、引物退火和引物延伸的至少一個循環(huán)之后，從管或反應(yīng)容器中取出反應(yīng)物樣品或部分樣品，對部分樣品中的核酸進行分離和檢測。分離和檢測和循環(huán)過程同時進行，使在循環(huán)發(fā)生時生成表示產(chǎn)物量為循環(huán)數(shù)函數(shù)的曲線。本文所用的術(shù)語“同時”指分離至少在進行循環(huán)過程的時候啟動。根據(jù)所用的分離技術(shù)(例如毛細電泳)和給定反應(yīng)物中要分離物質(zhì)的數(shù)目和大小，每部分樣品的分離最常需要1-120分鐘。因此，當分離步驟長于每個循環(huán)過程時，例如每個循環(huán)之后取出樣品時，分離步驟將在全部循環(huán)過程結(jié)束后完成。但是，如本文所用的，只要每個樣品的分離是在循環(huán)過程過程中啟動的，這種情況仍認為是“同時”分離。同時分離最優(yōu)選的是使用自動取樣器進行，在樣品從循環(huán)反應(yīng)物取出后，所述自動取樣器立即將樣品置于分離裝置中。
以上述的方式，通過檢測大小分離的擴增產(chǎn)物上的熒光信號來鑒別多態(tài)性位點處的核苷酸。因為四個下游標簽引物中的每一個都標記有可區(qū)分的熒光標記物，且給定引物上的標簽對應(yīng)于原始下游引物延伸引物的3’末端核苷酸，熒光標記的標簽的摻入和檢測可鑒別多態(tài)性位點處的核苷酸。
在優(yōu)選的方面中，原始的引物延伸反應(yīng)物包括識別多個SNP的引物組。在該方面中，每個不同多態(tài)性將表現(xiàn)為截然不同大小的擴增產(chǎn)物。例如，人們可以加入其他上游引物，每個引物包含同樣的標簽序列，在另一個已知SNP的截然不同距離的上游雜交的3’區(qū)域是變化的。和其他的上游引物相一致的是，待測的其他每個SNP需要四個下游引物延伸引物組成的組，該組的每個成員以5’到3’的順序包括a)對應(yīng)于引物的3’末端核苷酸的標簽序列，其中所述標簽序列和與用于同系列反應(yīng)中的其他待測SNP的下游引物上3’末端核苷酸對應(yīng)的標簽序列相同；b)足以指導引物與已知SNP下游或附近特異性雜交的區(qū)域；和c)對應(yīng)于引物上標簽序列的可變3’末端核苷酸，其中引物與其基因組中的靶序列雜交，3’末端核苷酸與多態(tài)性位點相對，如果其互補的話則與該位點的核苷酸進行堿基配對。如上所述兩次引物延伸反應(yīng)和除去未摻入的引物之后，使用與測定單SNP時所用相同的單擴增引物組。也就是說，擴增引物組將包括含有上游標簽的上游引物，和含有引物延伸引物上四個上游標簽的四個可區(qū)分標記的引物組成的引物組，其中所述標記物對應(yīng)于標簽，其對應(yīng)于和多態(tài)性位點相對的核苷酸。對于每個待測SNP來說可以使用相同的擴增引物組，這是因為摻入的標簽在組間是通用的。也就是說，所有的上游引物都具有相同的標簽序列，且所有的下游引物延伸引物組都具有與相同的3’末端核苷酸相對應(yīng)的相同標簽序列。當分離時待測定的每個SNP都具有截然不同的大小，摻入到所述大小分子中的標記物的識別能夠明確地鑒別多態(tài)性位點處存在的核苷酸。用由五個擴增引物組成的一組引物擴增和檢測多處SNP的能力具有一個優(yōu)點，即可以避免與使用大量引物相關(guān)的引物相互作用的問題。另外，還將大大降低引物退火效率差異的影響，因為用一個給定的擴增引物組測定的所有SNP都同等程度地受這種差異的影響。
使用更多個由五個標簽序列組成的組可以進一步進行放大。其他組將包含與同時使用的其他標簽截然不同的標簽。應(yīng)注意避免同時使用與其他標簽互補的標簽。如上所述，每一組將包含上游標簽和下游標簽，所述上游標簽的選擇應(yīng)使擴增產(chǎn)物的大小截然不同，所述下游標簽中的各標簽對應(yīng)于引物延伸引物的3’末端核苷酸。對于擴增來說，下游引物可以標記有與其他組相同的相應(yīng)熒光標記物，或優(yōu)選標記有不同的可區(qū)分熒光標記物組。大小分離后，如上所述根據(jù)大小對擴增的、含SNP的片段進行鑒定，通過摻入的標記物鑒別多態(tài)性位點處的核苷酸。
引物設(shè)計的通?？紤]事項寡核苷酸引物長度通常為5-100個核苷酸，優(yōu)選17-45個核苷酸，雖然也可以使用不同長度的引物。用于引物延伸反應(yīng)的引物長度優(yōu)選為10-60個核苷酸，但用于擴增的引物長度優(yōu)選為17-25個核苷酸。通過溶解溫度估算法，根據(jù)本發(fā)明有用的引物可以設(shè)計為具有特定的溶解溫度(Tm)?？梢允褂蒙虡I(yè)化程序，包括OligoTM、Primer Design和從互聯(lián)網(wǎng)上獲得的程序，包括Primer3和Oligo Calculator來計算根據(jù)本發(fā)明有用的多聚核苷酸序列的Tm。優(yōu)選的是，例如通過Oligo Calculator計算的、根據(jù)本發(fā)明有用的擴增引物的Tm為約45℃-65℃，更優(yōu)選為約50℃-60℃。
多聚核苷酸的Tm影響其與另一種多聚核苷酸的雜交(例如，寡核苷酸引物與模板多聚核苷酸的退火)。在本發(fā)明的方法中，優(yōu)選各步驟中所用的寡核苷酸選擇性地與靶模板或來源于靶模板的多聚核苷酸雜交。典型地，當兩個多聚核苷酸序列基本上互補(至少14-25個核苷酸的長度中至少約65％互補，優(yōu)選至少約75％，更優(yōu)選至少約90％互補)時發(fā)生選擇性地雜交。參見Kanehisa，M.，1984，Polynucleotide Res.12203，通過引用并入本文。結(jié)果是，需要耐受引物位點處某種程度的錯配。這種錯配可以是少的，如一個、兩個或三個核苷酸。作為替代方案，錯配區(qū)域可以包括環(huán)，該環(huán)定義為在連續(xù)系列中存在有四個或更多個核苷酸錯配的區(qū)域。
許多因素影響引物與第二多聚核苷酸分子雜交的效率和選擇性。這些因素，包括引物長度、核苷酸序列和/或組成、雜交溫度、緩沖液組分和引物需要與之雜交的區(qū)域中空間位阻都是根據(jù)本發(fā)明設(shè)計寡核苷酸引物時應(yīng)考慮的。
在引物長度和引物與靶序列退火的效率及準確性之間存在有正相關(guān)。具體地說，較長的序列比較短的序列具有更高的溶解溫度(Tm)，更不可能在給定的靶序列內(nèi)重復，因此最大限度地減少雜亂的雜交。具有較高G-C含量或包含回文序列的引物序列傾向于自身雜交，其目標性的靶位點也是如此，這是因為單分子，而非雙分子的雜交動力學通常在溶液中是有利的。但是，設(shè)計包含足夠數(shù)目G-C核苷酸對的引物也是重要的，因為G-C對由三個氫鍵來結(jié)合靶序列，從而形成更緊而強的鍵，而非A和T堿基對中的兩個氫鍵所束縛。雜交溫度隨引物退火效率反向變化，包括在引發(fā)反應(yīng)或雜交混合物中的有機溶劑，如甲酰胺的濃度也是如此，而鹽濃度增加促進結(jié)合。在嚴格的退火條件下，較長的雜交探針或合成引物比更隨意的條件下足夠用的較短探針或引物更有效地結(jié)合。優(yōu)選的是，嚴格的雜交在合適的緩沖液(例如1×Taq聚合酶緩沖液或適用于引物延伸和擴增中所用酶的其他緩沖液)中、在使多聚核苷酸序列與寡核苷酸引物雜交的條件下進行?？梢愿鶕?jù)長度和/或多聚核苷酸組分或寡核苷酸引物來改變嚴格的雜交條件(例如，從低于約1M的鹽濃度，更通常低于約500mM，優(yōu)選低于200mM)和改變雜交溫度(例如，從0℃低溫到高于22℃，高于約30℃，(最經(jīng)常)超過37℃)。較長的片段會需要更高的雜交溫度以進行特異性雜交。由于多種因素影響雜交的嚴格性，參數(shù)的組合比單一因素的絕對度量更為重要。
和識別給定基因上任意部位序列的引物設(shè)計不同，設(shè)計用來在已知SNP附近雜交的引物受到對其修改以操縱Tm的限制。例如，正常情況下人們能夠在序列的上游或下游移動以尋找具有更有利GC含量的區(qū)域，當引物設(shè)計用來和SNP附近雜交時，人們不能夠?qū)⒁镆苿拥搅硪粋€位置。因此在這種情況下，操縱Tm的主要含義是改變引物中互補序列的長度。
根據(jù)本發(fā)明有用的序列標簽根據(jù)本發(fā)明有用的標簽優(yōu)選是異源的或人工合成的核苷酸序列，長度至少為15個核苷酸，優(yōu)選20-30個核苷酸。在PCR退火條件下，標簽優(yōu)選不與待分析基因型的生物有機體基因組序列雜交。根據(jù)本發(fā)明的標簽序列可以是但不必須是隨機的?？梢允褂脴撕灅撕炐蛄凶鳛橐镅由旆磻?yīng)中的標記引物、使用目標生物有機體的基因組DNA作為模板，確定PCR退火條件下潛在的標簽序列是否與生物有機體的基因組序列雜交。在用于本發(fā)明方法的擴增步驟的退火溫度下，標記引物與基因組DNA雜交，然后在延伸條件下和熱穩(wěn)定性的聚合酶孵育。將反應(yīng)產(chǎn)物和單獨的標記探針并排進行電泳分離。如果標記的標簽出現(xiàn)在比標簽引物大的一個或多個條帶中，則在PCR退火條件下標簽引物與待分析基因型的生物有機體的基因組序列雜交了。應(yīng)該注意避免在相同的反應(yīng)中使用與要用的其他標簽互補的標簽。
標記寡核苷酸引物根據(jù)本發(fā)明有用的寡核苷酸引物可以如下所述摻入可通過分光光度法、光化學法、生物化學法、免疫化學法、酶法或化學法檢測的部分(moiety)進行標記。將標記物與寡核苷酸連接或偶聯(lián)的方法理所當然取決于所用標記物的類型和標記物在引物上的位置(即，3’-末端、5’末端或整體標記)。
優(yōu)選熒光染料，適用于本發(fā)明的各種標記物和其摻入引物的方法是本領(lǐng)域所公知的，包括但不局限于酶(如堿性磷酸酶和辣根過氧化物酶)和酶底物、放射性原子、生色團、熒光淬滅劑、化學發(fā)光標記物和電化學發(fā)光標記物，如OrigenTM(Igen)，其彼此相互作用以增強、改變或減弱信號。當然，如果標記的分子用在涉及熱循環(huán)的基于PCR的擴增分析中，標記物必須能夠耐受該自動化過程中所需的溫度循環(huán)。理想的是，優(yōu)選能夠使用相同的技術(shù)、方法和/或底物檢測的四種可區(qū)分標記物。本發(fā)明中用在標記引物的構(gòu)建中標記物的生色團包括但不局限于若丹明和其衍生物(如Texas Red)、熒光素和其衍生物(如5-溴甲基熒光素)、Cy5、Cy3、JOE、FAM、Oregon GreenTM、Lucifer Yellow、IAEDANS、7-Me2N-香豆素-4-乙酸酯、7-OH-4-CH3-香豆素-3-乙酸酯、7-NH2-4-CH3-香豆素-3-乙酸酯(AMCA)、monobromobimane、三磺酸芘，如Cascade Blue和monobromorimethy-amminobimane。一般來說，優(yōu)選具有寬斯托克司頻移的生色團，使得可以使用帶有濾光片的熒光計而非單色計，并提高檢測效率。
可以通過各種技術(shù)將標記物直接或間接結(jié)合到寡核苷酸上。根據(jù)所用標記物或標簽的精確類型，標記物可以位于引物的5’端，或位于引物內(nèi)部，或結(jié)合于各種大小的間隔臂和組分以促進信號的相互作用。優(yōu)選5’端標記。利用商業(yè)來源的phosphoramidite試劑，人們可以通過適當保護的phosphoramidite生成在5’末端包含官能團(例如硫醇或伯胺)的寡聚物，可以使用例如描述在PCR protocolsA Guideto Methods and Applications，Innis et al.，eds.Academic Press，Ind.，1990中的方案對它們進行標記。
美國專利No.4,914,210中描述了引入寡核苷酸功能化試劑以將一個或多個硫氫基、氨基或羥基部分引入到寡核苷酸序列中，通常在5’端的方法。通過使用多聚核苷酸激酶和γ-32P-ATP或γ-33P-ATP提供受體基團，往5’磷酸基團中引入同位素?？梢允乖诤铣蛇^程中引入的氨基胸苷或6-氨基己基殘基與生物素的N-羥基琥珀酰亞胺酯，將生物素加到5’端。
擴增PCR方法是本領(lǐng)域的技術(shù)人員所熟知的，如Mullis and Faloona，1987，MethodsEnzymol.，155335，Saiki et al.，1985，Science2301350和美國專利No.4,683,202、4,683,195與4,800,159中所描述的方法，每個通過引用并入本文。在其最簡單的形式中，PCR是使用與相對鏈雜交并位于靶DNA中目的區(qū)域旁側(cè)的兩個寡核苷酸引物、酶法合成特定DNA序列的體外方法。涉及模板變性、引物退火和退火的引物通過DNA聚合酶延伸的重復系列的反應(yīng)步驟導致末端限定為5’端引物的特定片段的指數(shù)積累。據(jù)報道，PCR能夠生成特定DNA序列的、因數(shù)為109的選擇性富集。
PCR循環(huán)中每個步驟的長度和溫度，以及循環(huán)數(shù)根據(jù)實際所需的嚴格性加以調(diào)整。退火溫度和時間通過引物與模板退火所需的效率和要耐受錯配的程度加以確定。優(yōu)化引物退火條件嚴格性的能力是本領(lǐng)域的技術(shù)人員所熟知的。20℃-72℃的退火溫度是最常用的。模板分子的初始變性正常情況下通過于92℃-99℃孵育4分鐘進行，然后進行20-40個循環(huán)，包括變性(94℃ 15秒至1分鐘)、退火(基于上述Tm的溫度，通常比反應(yīng)中具有最低Tm的寡核苷酸Tm低約5℃；通常1-2分鐘)和延伸(通常92℃ 1-3分鐘)。
取樣擴增過程中的取樣可以以所需的任何頻率或任何模式進行。優(yōu)選的取樣發(fā)生在擴增過程中每個循環(huán)之后，雖然也可以以更低的頻率取樣，例如每隔一個循環(huán)、每三個循環(huán)、每四個循環(huán)進行取樣等。雖然最常需要的是均一的取樣間隔，但也不要求取樣必須以均一的間隔進行。舉一個例子來說，取樣程序可以涉及在開始五個循環(huán)的每個循環(huán)之后取樣，然后每個一個循環(huán)進行取樣。
取樣可以簡單地從反應(yīng)物中手動移出部分樣品，但是優(yōu)選自動化取樣，以使部分樣品以預定的取樣間隔自動取出。優(yōu)選的是反應(yīng)混合物在每次取樣時都補充等體積的新鮮組分，如dNTPs、引物和DNA聚合酶。對于本發(fā)明的該方面和其他方面來說，優(yōu)選但非必須的是循環(huán)以微滴定板或微孔板形式進行。由于板的模塊特征和板上孔的均一格局，使用包括多個反應(yīng)孔的板的這種形式不僅增加分析方法的檢測量，還適合于自動化取樣步驟。舉例來說，根據(jù)本發(fā)明有用的常見微滴定板樣式具有12、24、48、96、384或更多個孔，但根據(jù)本發(fā)明可以使用能夠有形匹配在板上且容納所需反應(yīng)體積(通常10-100μl)的任何數(shù)目的孔。通常優(yōu)選96孔板或384孔板。
自動化取樣方法可以容易地實施為程序化步驟，避免取樣中的人為誤差(即，樣品大小和跟蹤樣品特性的誤差)和人為取樣污染的可能性。能夠從熱循環(huán)儀中取出部分樣品的自動取樣器是本領(lǐng)域中可獲得的。例如，Mitsubishi RV-E2 Robotic Arm可以和SciCloneTMLiquid Handler或Robbins Scientific Hydra 96 Piptettor聯(lián)用。
根據(jù)本發(fā)明有用的自動取樣器可以和熱循環(huán)儀整合在一起，或者取樣器和循環(huán)儀可以為模塊化設(shè)計。當循環(huán)儀和取樣器整合時，熱循環(huán)和取樣發(fā)生在同一位置，樣品以程序化的間隔由自動取樣器取出。當循環(huán)儀和取樣器為模塊化設(shè)計時，循環(huán)儀和取樣器是分離的模塊。在一個實施方案中，舉例來說，分析板通過機器手從循環(huán)儀向取樣器再向循環(huán)儀有形移動。
例如，取樣步驟中取出部分樣品的體積依賴于擴增反應(yīng)的總體積、產(chǎn)物檢測的敏感性和所用分離類型而變動。擴增體積可以從幾微升到幾百微升不等(例如5μl、10μl、20μl、40μl、60μl、80μl、100μl、120μl、150μl或200μl或更多)，優(yōu)選為10-150μl，更優(yōu)選為10-100μl。部分樣品體積可以在反應(yīng)混合物的0.1-30％之間變動。
核酸的分離根據(jù)本發(fā)明的核酸的分離可以通過適于分離核酸的任何方法實現(xiàn)，例如這些方法包括電泳、HPLC或質(zhì)譜。由于毛細電泳(CE)的速度和分辨率，分離優(yōu)選通過毛細電泳(CE)進行。
CE是用于分析微量樣品的有效分析性分離技術(shù)。CE分離在填充有所謂“載體電解質(zhì)”的導電介質(zhì)的窄徑毛細管中進行。在毛細管的兩端之間施加電場，樣品中的物質(zhì)以一定的速度從一個電極移向另一個電極，所述速度依賴于每種物質(zhì)的電泳遷移率，以及管中液體流動的速度?？梢栽诿毠苤惺褂媚z或液體，如緩沖液進行CE。在一個稱作“游離區(qū)帶(free-zone)電泳”的液體模式中，分離依賴于樣品物質(zhì)游離溶液遷移率的差異。在另一個液體模式中，使用膠束實現(xiàn)基于疏水性差異的分離。其稱作膠束動電毛細層析(Micellar Electrokinetic Capillary Chromatography，MECC)。
CE基于電荷分離核酸分子，有效導致核酸分子根據(jù)大小或核苷酸數(shù)的分離。當許多片段生成時，它們將以大小逐漸增加的順序通過靠近毛細管末端的熒光檢測儀。也就是說，較小的片段將遷移在較大片段的前面，首先得以檢測。
CE主要在分離速度、小量所需樣品(在1-50nl等級上)和高分辨率方面提供超出傳統(tǒng)電泳的顯著優(yōu)點。例如，使用CE的分離速度可以比傳統(tǒng)的凝膠電泳快10-20倍，并不必進行跑膠后的染色。CE提供高分辨率，分離差異少至一個堿基的約10-1,000個堿基對的分子。高分辨率可能部分由于毛細管的大表面積有效地散熱，從而可以使用高電壓。另外，由于毛細管的窄內(nèi)徑，條帶寬度降至最小。在游離區(qū)帶電泳中，發(fā)生電滲或電滲性流動(EOF)現(xiàn)象。這是影響所有樣品分子的大量液體流動，與電荷無關(guān)。在某些條件下，EOF有助于提高游離區(qū)帶CE中分辨率和分離速度。
CE可以通過本領(lǐng)域所熟知的方法進行，例如公開于美國專利No.6,217,731、6,001,230和5,963,456中的方法，這些文獻通過引用并入本文。高通量CE儀器可以通過商業(yè)途徑獲得，例如Spectrumedix Corporation(State College，PA)的HTS9610High Throughput Analysis System和SCE 9610全自動96-毛細電泳遺傳分析系統(tǒng)。其他的包括Backman Instruments Inc(Fullerton，CA)的P/ACE 5000系列和ABIPRISM 3100遺傳分析儀(Applied Biosystems，F(xiàn)oster City，CA)。其中每個儀器都在靠近CE柱的一端包括監(jiān)測樣品分子光發(fā)射的熒光檢測儀。標準的熒光檢測儀能夠區(qū)別多種不同波長的熒光發(fā)射，檢測擴增樣品進行的一次CE中的多種熒光標記物質(zhì)。
增加CE分離通量的另一種方法是使用多個毛細管，或優(yōu)選使用毛細管陣列。已經(jīng)開發(fā)了具有96個毛細管容量的Capillary Array Electrophoresis(CAE)儀(如Molecular Dynamics的MegaBACE儀)和更大，直至并包括1000個毛細管容量的儀器。為了避免檢測到由緊密并置的毛細管間的光散射所致DNA熒光的問題，可以使用共聚焦熒光掃描儀(Quesada et al.，1991，Biotechniques 10616-25)。
分離(和檢測)裝置可以和用于熱循環(huán)和取樣的裝置分離或整合。因為根據(jù)本發(fā)明分離步驟是和循環(huán)方案同時開始的，優(yōu)選將樣品直接從擴增反應(yīng)物中取出并置于分離裝置中，從而使分離和擴增同時進行。因此，雖然不是必需的，但優(yōu)選將分離裝置和熱循環(huán)與取樣裝置整合。在一個實施方案中，這些裝置是模塊化的，包括熱循環(huán)模塊和分離/檢測模塊，帶有將樣品從熱循環(huán)反應(yīng)物中取出并置于分離/檢測裝置中的自動取樣器。
檢測根據(jù)本發(fā)明有用的擴增產(chǎn)物檢測方法測定標記的引物用熒光標記物激發(fā)光譜范圍內(nèi)的光照射時所發(fā)射的熒光強度。熒光檢測技術(shù)高度發(fā)達且非常靈敏，在某些情況下甚至能檢測到一個分子。高靈敏性熒光檢測是多數(shù)商業(yè)來源的讀板儀(platereader)、微陣列檢測儀和CE裝置的標準。對于CE設(shè)備來說，經(jīng)常采用激發(fā)和發(fā)射信號的纖維光學傳輸。Spectrumedix、Applied Biosystems，Beckman Coulter和Agilent都銷售帶有熒光檢測儀的CE設(shè)備，足以進行本文所述方法所需的熒光檢測。
如果兩種或多種不同熒光標記物熒光信號的發(fā)射峰波長的頻譜(spectrum)相隔20nm或更多，則它們可以得以區(qū)分。醫(yī)師通常會選擇峰波長間相隔更大的生色團，尤其是所選的生色團具有寬的發(fā)射波長峰時。由此得出結(jié)論希望同時在樣品中包含和檢測的生色團越不同，其發(fā)射峰就應(yīng)越窄。
實施例實施例1.單核苷酸差異的檢測Leber’s遺傳性視神經(jīng)癥(LHON)和線粒體DNA中3460、11778和14459處的幾個點突變相關(guān)。
突變SNP區(qū)(多態(tài)性位點以粗體、下劃線表示)3460 5’-CGG GCT ACT ACA ACC CTT CGC TGA CGC CAT AAA-3’(SEQ ID NO1)11778 5’-TCA AAC TAC GAA CGC ACT CAC AGT CGC ATC ATA-3’(SEQ ID NO2)14459 5’-CTC AGG ATA CTC CTC AAT AGC CAT CGC TGT AGT-3’(SEQ ID NO3)人線粒體DNA中與Leber’s遺傳性視神經(jīng)癥(LHON)相關(guān)的個體SNP基因型可以如下述進行測定。
引物延伸引物a)上游引物上游引物如下所示突變上游引物(標鑒序列以小寫字母表示)34605’-gttacaagat tctcacacgc taagg-TTC ATA GTA GAA GAG CGA TGG-3’(SEQ ID NO4)11778 5’-gttacaagat tctcacacgc taagg-AAA AAG CTA TTA GTG GGA GTA-3’(SEQ ID NO5)14459 5’-gttacaagat tctcacacgc taagg-TCG GGT GTG TTA TTA TTC TGA-3’(SEQ ID NO6)b)下游引物下游引物如下所示
突變 下游引物3460 G-引物5’-agttggcgaa gcagtcgcta gaagaCGG GCT ACT ACA ACC CTT CGC TGACG-3’(SEQ ID NO7)A-引物5’-gatgctggtg tggctggtgt tcccgCGG GCT ACT ACA ACC CTT CGC TGACA-3’(SEQ ID NO8)T-引物5’-ggttggttgc acactggaga tattggCGG GCT ACT ACA ACC CTT CGC TGACT-3’(SEQ ID NO9)C-引物5’-ctggagcatc tggaaaagta gtaccCGG GCT ACT ACA ACC CTT CGC TGACC-3’(SEQ ID NO10)11778 G-引物5’-agttggcgaa gcagtcgcta gaagaTCA AAC TAC GAA CGC ACT CAC AGTCG-3’(SEQ ID NO11)A-引物5’-gatgctggtg tggctggtgt tcccgTCA AAC TAC GAA CGC ACT CAC AGTCA-3’(SEQ ID NO12)T-引物5’-ggttggttgc acactggaga tattggTCA AAC TAC GAA CGC ACT CAC AGTCT-3’(SEQ ID NO13)C-引物5’-ctggagatc tggaaaagta gtaccTCA AAC TAC GAA CGC ACT CAC AGTCC-3’(SEQ ID NO14)14459 G-引物5’-agttggcgaa gcagtcgcta gaagaCTC AGG ATA CTC CTC AAT AGC CATCG-3’(SEQ ID NO15)A-引物5’-gatgctggtg tggctggtgt tcccgCTC AGG ATA CTC CTC AAT AGC CATCA-3’(SEQ ID NO16)T-引物5’-ggttggttgc acactggaga tattggCTC AGG ATA CTC CTC AAT AGC CATCT-3’(SEQ ID NO17)C-引物5’-ctggagcatc tggaaaagta gtaccCTC AGG ATA C TC CTC AAT AGC CATCC-3’(SEQ ID NO18)用于每個多態(tài)性位點的5個引物延伸引物組成的全套引物(每個40pmol，共15個引物)和1μg受試個體的模板基因組DNA混合在1×Pfu緩沖液中(20mMTris-HCl，pH8.8，10mM KCl，10mM (NH4)2SO4，2mM MgSO4，0.1％Triton-X-100和0.1mg/ml無核酸酶的BSA)，總體積為50μl。混合物于94℃加熱2分鐘，緩慢冷卻至室溫，使引物退火。加入1μl克隆的Pfu聚合酶和1.25μl每種dNTP(終濃度為200μM)，樣品于72℃孵育3分鐘。然后使樣品進行94℃ 2分鐘、50℃ 1分鐘和72℃3分鐘的循環(huán)，以產(chǎn)生帶有上游引物或其互補物與下游引物或其互補物的引物延伸產(chǎn)物群。
加入20U的大腸桿菌外切酶I(ExoI；New England Biolabs)并于37℃孵育20分鐘除去引物延伸引物。ExoI于80℃孵育20分鐘而滅活。
擴增除去引物延伸引物之后，加入下列5個擴增引物(每個引物40pmol，1×Pfu緩沖液中，終體積75μl)a)上游引物5’-gttacaagat tctcacacgc taagg-3’(SEQ ID NO19b)下游引物(可區(qū)分標記)G-引物5’-R6G-agttggcgaa gcagtcgcta gaaga-3’(SEQ ID NO20)A-引物5’-FAM-gatgctggtg tggctggtgt tcccg-3’(SEQ ID NO21)T-引物5’-ROX-ggttggttgc acactggaga tattgg-3’(SEQ ID NO22)C-引物5’-JOE ctggagcatc tggaaaagta gtacc-3’(SEQ ID NO23)加入1μl新鮮的克隆Pfu聚合酶進行擴增，循環(huán)反應(yīng)如下94℃ 45sec、50℃ 45sec和72℃ 2分鐘，共35個循環(huán)。每個循環(huán)之后，或以任意選定間隔，取出部分樣品(0.5μl)加到準備好的毛細電泳裝置中。在擴增過程中開始并進行分離。在一定長度的毛細管上分離后，根據(jù)熒光檢測擴增的引物延伸產(chǎn)物?？梢詫γ總€循環(huán)進行每個片段信號強度的作圖，產(chǎn)生擴增圖譜。
擴增產(chǎn)物是突變 產(chǎn)物大小 野生型多態(tài)性核苷酸 突變型多態(tài)性核苷酸3460 249GA(249bp產(chǎn)物上用ROX染料檢測)11778 350GA(350bp產(chǎn)物上用ROX染料檢測)14459 456GA(456bp產(chǎn)物上用ROX染料檢測)可以通過加入其他每個SNP的其他上游引物延伸引物來進一步放大該實施例中詳述的方法，所述這些引物具有與已加入的那些引物相同的上游標簽和對截然不同大小的含不同SNP片段特異的3’區(qū)域。待測的其他每個SNP也必須具有其自己的、由4個下游引物組成的組，其帶有相同的由4個下游引物標簽組成的組、與SNP附近特異雜交的3’區(qū)域和對應(yīng)于標簽序列的可變3’末端。
還可以如上文所述加入具有不同組上游和下游標簽的新引物組進行進一步放大。
其他實施方案這里引用的所有專利、專利申請和發(fā)表文獻的整體內(nèi)容都通過引用并入本文。雖然本發(fā)明參考其優(yōu)選的實施方案進行了具體說明和描述，但本領(lǐng)域的技術(shù)人員將理解可以在不背離所附權(quán)利要求書的本發(fā)明范圍的條件下進行形式和細節(jié)上的各種改變。
序列表<110>Slepnev，Vladimir I<120>檢測核苷酸差異的方法<130>19781 /2048<140>尚未轉(zhuǎn)讓<141>2003-06-20<150>US 60/392,331<151>2002-06-28<160>23<170>PatentIn version 3.1<210>1<211>33<212>DNA<213>Homo sapiens<400>1cgggctacta caacccttcg ctgacgccat aaa 33<210>2<211>33<212>DNA<213>Homo sapiens<400>2tcaaactacg aacgcactca cagtcgcatc ata 33<210>3<211>33<212>DNA<213>Homo sapiens<400>3
ctcaggatac tcctcaatag ccatcgctgt agt 33<210>4<211>46<212>DNA<213>人工序列<220>
<221>misc_特征<222>(1)..(46)<223>包含與人工標簽序列相連的人LHON相關(guān)序列的合成引物序列<400>4gttacaagat tctcacacgc taaggttcat agtagaagag cgatgg 46<210>5<211>46<212>DNA<213>人工序列<220>
<221>misc_特征<222>(1)..(46)<223>包含與人工標簽序列相連的人LHON相關(guān)序列的合成引物序列<400>5gttacaagat tctcacacgc taaggaaaaa gctattagtg ggagta 46<210>6<211>46<212>DNA<213>人工序列<220>
<221>misc_特征<222>(1)..(46)<223>包含與人工標簽序列相連的人LHON相關(guān)序列的合成引物序列<400>6gttacaagat tctcacacgc taaggtcggg tgtgttatta ttctga 46<210>7<211>51<212>DNA<213>人工序列<220>
<221>misc_特征<222>(1)..(51)<223>包含與人工標簽序列相連的人LHON相關(guān)序列的合成引物序列<400>7agttggcgaa gcagtcgcta gaagacgggc tactacaacc cttcgctgac g 51<210>8<211>51<212>DNA<213>人工序列<220>
<221>misc_特征<222>(1)..(51)<223>包含與人工標簽序列相連的人LHON相關(guān)序列的合成引物序列<400>8gatgctggtg tggctggtgt tcccgcgggc tactacaacc cttcgctgac a 51<210>9<211>52
<212>DNA<213>人工序列<220>
<221>misc_特征<222>(1)..(52)<223>包含與人工標簽序列相連的人LHON相關(guān)序列的合成引物序列<400>9ggttggttgc acactggaga tattggcggg ctactacaac ccttcgctga ct 52<210>10<211>51<212>DNA<213>人工序列<220>
<221>misc_特征<222>(1)..(51)<223>包含與人工標簽序列相連的人LHON相關(guān)序列的合成引物序列<400>10ctggagcatc tggaaaagta gtacccgggc tactacaacc cttcgctgac c 51<210>11<211>51<212>DNA<213>人工序列<220>
<221>misc_特征<222>(1)..(51)<223>包含與人工標簽序列相連的人LHON相關(guān)序列的合成引物序列<400>11
agttggcgaa gcagtcgcta gaagatcaaa ctacgaacgc actcacagtc g 51<210>12<211>51<212>DNA<213>人工序列<220>
<221>misc_特征<222>(1)..(51)<223>包含與人工標簽序列相連的人LHON相關(guān)序列的合成引物序列<400>12gatgctggtg tggctggtgt tcccgtcaaa ctacgaacgc actcacagtc a 51<210>13<211>52<212>DNA<213>人工序列<220>
<221>misc_特征<222>(1)..(52)<223>包含與人工標簽序列相連的人LHON相關(guān)序列的合成引物序列<400>13ggttggttgc acactggaga tattggtcaa actacgaacg cactcacagt ct 52<210>14<211>51<212>DNA<213>人工序列<220>
<221>misc_特征
<222>(1)..(51)<223>包含與人工標簽序列相連的人LHON相關(guān)序列的合成引物序列<400>14ctggagcatc tggaaaagta gtacctcaaa ctacgaacgc actcacagtc c 51<210>15<211>51<212>DNA<213>人工序列<220>
<221>misc_特征<222>(1)..(51)<223>包含與人工標簽序列相連的人LHON相關(guān)序列的合成引物序列<400>15agttggcgaa gcagtcgcta gaagactcag gatactcctc aatagccatc g 51<210>16<211>51<212>DNA<213>人工序列<220>
<221>misc_特征<222>(1)..(51)<223>包含與人工標簽序列相連的人LHON相關(guān)序列的合成引物序列<400>16gatgctggtg tggctggtgt tcccgctcag gatactcctc aatagccatc a 51<210>17<211>52<212>DNA
<213>人工序列<220>
<221>misc_特征<222>(1)..(52)<223>包含與人工標簽序列相連的人LHON相關(guān)序列的合成引物序列<400>17ggttggttgc acactggaga tattggctca ggatactcct caatagccat ct 52<210>18<211>51<212>DNA<213>人工序列<220>
<221>misc_特征<222>(1)..(51)<223>包含與人工標簽序列相連的人LHON相關(guān)序列的合成引物序列<400>18ctggagcatc tggaaaagta gtaccctcag gatactcctc aatagccatc c 51<210>19<211>25<212>DNA<213>人工序列<220>
<221>misc_特征<222>(1)..(25)<223>與引物延伸引物所帶有的人工標簽序列雜交的合成擴增引物<400>19gttacaagat tctcacacgc taagg25
<210>20<211>25<212>DNA<213>人工序列<220>
<221>misc_特征<222>(1)..(25)<223>與引物延伸引物所帶有的人工標簽序列雜交的合成擴增引物<400>20agttggcgaa gcagtcgcta gaaga25<210>21<211>25<212>DNA<213>人工序列<220>
<221>misc_特征<222>(1)..(25)<223>與引物延伸引物所帶有的人工標簽序列雜交的合成擴增引物<400>21gatgctggtg tggctggtgt tcccg25<210>22<211>26<212>DNA<213>人工序列<220>
<221>misc_特征<222>(1)..(26)
<223>與引物延伸引物所帶有的人工標簽序列雜交的合成擴增引物<400>22ggttggttgc acactggaga tattgg 26<210>23<211>25<212>DNA<213>人工序列<220>
<221>misc_特征<222>(1)..(25)<223>與引物延伸引物所帶有的人工標簽序列雜交的合成擴增引物<400>23ctggagcatc tggaaaagta gtacc2權(quán)利要求
1.一種鑒別給定核酸樣品中已知多態(tài)性位點處的核苷酸的方法，該方法包括a)使從核酸樣品產(chǎn)生的引物延伸產(chǎn)物群經(jīng)歷擴增過程，每個引物延伸產(chǎn)物包含一個標簽序列，所述標簽序列特異對應(yīng)于已知多態(tài)性位點處一個特定核苷酸的存在，其中所述擴增過程使用一個上游擴增引物和一組可區(qū)分標記的下游擴增引物進行，所述下游擴增引物組的每個成員包含所述引物延伸產(chǎn)物群成員所帶有的所述標簽序列和可區(qū)分標記物，其中每種可區(qū)分標記物特異對應(yīng)于所述多態(tài)性位點處特定核苷酸的存在；和b)檢測可區(qū)分標記物向核酸分子中的摻入，從而鑒別所述多態(tài)性位點處的核苷酸。
2.權(quán)利要求1的方法，其中所述可區(qū)分標記物是熒光標記物。
3.權(quán)利要求2的方法，其中所述步驟(b)包括根據(jù)大小和/或電荷分離在所述擴增過程中生成的核酸分子。
4.權(quán)利要求3的方法，其中所述分離包括毛細電泳。
5.權(quán)利要求1的方法，其中所述擴增過程包括至少兩個擴增反應(yīng)循環(huán)，其中每個循環(huán)包括下列步驟1)核酸鏈分離；2)寡核苷酸引物退火；和3)退火引物的聚合酶延伸。
6.權(quán)利要求5的方法，其在所述擴增過程中和至少一個所述反應(yīng)循環(huán)之后還包括下列步驟取出所述擴增反應(yīng)的部分樣品，根據(jù)大小和/或電荷分離核酸分子，并檢測所述可區(qū)分標記物的摻入，其中所述檢測鑒別所述多態(tài)性位點處的核苷酸。
7.權(quán)利要求6的方法，其中所述取出、分離和檢測在所述擴增過程的每個循環(huán)之后進行。
8.權(quán)利要求6的方法，其中所述分離包括毛細電泳。
9.權(quán)利要求1的方法，其中步驟(a)和(b)在包括熱循環(huán)儀、取樣裝置、毛細電泳裝置和熒光檢測儀的模塊化設(shè)備中進行。
10.權(quán)利要求1的方法，其中所述標簽序列包含15-40個核苷酸。
11.權(quán)利要求1的方法，其中所述一組可區(qū)分標記的下游擴增引物由下列引物組成包含特異對應(yīng)于多態(tài)性位點處A的存在的序列標簽的引物；包含特異對應(yīng)于多態(tài)性位點處C的存在的序列標簽的引物；包含特異對應(yīng)于多態(tài)性位點處G的存在的序列標簽的引物；和包含特異對應(yīng)于多態(tài)性位點處T的存在的序列標簽的引物。
12.權(quán)利要求1的方法，其中所述一組可區(qū)分標記的下游擴增引物由一對寡核苷酸組成，一個寡核苷酸包含特異對應(yīng)于多態(tài)性位點處的第一等位基因的標簽序列；一個寡核苷酸包含特異對應(yīng)于多態(tài)性位點處的第二等位基因的標簽序列。
13.權(quán)利要求1的方法，其在步驟(a)之前還包括將生成引物延伸產(chǎn)物群時未摻入的引物除去的步驟。
14.權(quán)利要求13的方法，其中所述除去步驟包括將生成引物延伸產(chǎn)物群時未摻入的引物降解。
15.權(quán)利要求14的方法，其中所述降解使用熱不穩(wěn)定的外切酶進行。
16.權(quán)利要求15的方法，其中所述熱不穩(wěn)定的外切酶選自外切酶I和外切酶VII。
17.權(quán)利要求16的方法，其中所述熱不穩(wěn)定的外切酶在進行步驟(a)之前熱滅活。
18.一種鑒別給定核酸樣品中待測的一組已知多態(tài)性位點處的核苷酸的方法，該方法包括a)使從核酸樣品產(chǎn)生的引物延伸產(chǎn)物群經(jīng)歷擴增過程，每個引物延伸產(chǎn)物包含標簽序列組的一個成員，所述標簽序列特異對應(yīng)于已知多態(tài)性位點處一個特定核苷酸的存在，其中所述擴增過程使用一個上游擴增引物和一組可區(qū)分標記的下游擴增引物進行，所述上游擴增引物用于每個包含待測的已知多態(tài)性位點的序列，所述下游擴增引物組的每個成員包含所述引物延伸產(chǎn)物群成員所帶有的標簽序列和特異對應(yīng)于所述多態(tài)性位點處特定核苷酸存在的可區(qū)分標記物，其中所述上游擴增引物的選擇應(yīng)使待測的已知多態(tài)性位點組的每個多態(tài)性位點對應(yīng)于截然不同大小的擴增產(chǎn)物；和b)檢測可區(qū)分標記物向截然不同大小的擴增產(chǎn)物中的摻入，從而鑒別每個所述多態(tài)性位點處的核苷酸。
19.權(quán)利要求18的方法，其中所述可區(qū)分標記物是熒光標記物。
20.權(quán)利要求18的方法，其中所述步驟(b)包括根據(jù)大小和/或電荷分離在所述擴增過程中生成的核酸分子。
21.權(quán)利要求20的方法，其中所述分離包括毛細電泳。
22.權(quán)利要求18的方法，其中所述擴增過程包括至少兩個擴增反應(yīng)循環(huán)，其中每個循環(huán)包括下列步驟1)核酸鏈分離；2)寡核苷酸引物退火；和3)退火引物的聚合酶延伸。
23.權(quán)利要求22的方法，其在所述擴增過程中和至少一個所述反應(yīng)循環(huán)之后還包括下列步驟取出所述擴增反應(yīng)的部分樣品，根據(jù)大小和/或電荷分離核酸分子，并檢測所述可區(qū)分標記物的摻入，其中所述檢測鑒別所述多態(tài)性位點處的核苷酸。
24.權(quán)利要求23的方法，其中所述取出、分離和檢測在所述擴增過程的每個循環(huán)之后進行。
25.權(quán)利要求23的方法，其中所述分離包括毛細電泳。
26.權(quán)利要求18的方法，其中步驟(a)和(b)在包括熱循環(huán)儀、取樣裝置、毛細電泳裝置和熒光檢測儀的模塊化設(shè)備中進行。
27.權(quán)利要求18的方法，其中所述標簽序列包含15-40個核苷酸。
28.權(quán)利要求18的方法，其中所述一組可區(qū)分標記的下游擴增引物由下列亞組組成包含特異對應(yīng)于多態(tài)性位點處A的存在的標簽序列的亞組；包含特異對應(yīng)于多態(tài)性位點處C的存在的標簽序列的亞組；包含特異對應(yīng)于多態(tài)性位點處G的存在的標簽序列的亞組；和包含特異對應(yīng)于多態(tài)性位點處T的存在的標簽序列的亞組。
29.權(quán)利要求18的方法，其在步驟(a)之前還包括將生成引物延伸產(chǎn)物群時未摻入的引物除去的步驟。
30.權(quán)利要求29的方法，其中所述除去步驟包括將生成引物延伸產(chǎn)物群時未摻入的引物降解。
31.權(quán)利要求30的方法，其中所述降解使用熱不穩(wěn)定的外切酶進行。
32.權(quán)利要求31的方法，其中所述熱不穩(wěn)定的外切酶選自外切酶I和外切酶VII。
33.權(quán)利要求32的方法，其中所述熱不穩(wěn)定的外切酶在進行步驟(a)之前熱滅活。
34.一種鑒別給定核酸樣品中待測的一組已知多態(tài)性位點處的核苷酸的方法，該方法包括a)使從核酸樣品產(chǎn)生的引物延伸產(chǎn)物群經(jīng)歷擴增過程，每個引物延伸產(chǎn)物包括第一標簽序列或其互補物和一組第二標簽序列或其互補物的一個成員，所述第二標簽序列或其互補物的存在特異對應(yīng)于已知多態(tài)性位點處一個特定核苷酸的存在，其中對于所述多態(tài)性位點組中的每個多態(tài)性位點來說，相對于第一標簽序列到包含其他多態(tài)性位點的樣品分子中一個多態(tài)性位點的距離，所述第一標簽序列位于所述多態(tài)性位點5’端的距離處，其中所述擴增過程使用一個包含第一標簽序列的上游擴增引物和一組可區(qū)分標記的下游擴增引物進行，所述下游擴增引物組的每個成員包含引物延伸產(chǎn)物群成員所帶有的所述標簽序列和特異對應(yīng)于多態(tài)性位點處特定核苷酸存在的可區(qū)分標記物，其中所述上游擴增引物的選擇應(yīng)使待測的已知多態(tài)性位點組中的每個多態(tài)性位點對應(yīng)于截然不同大小的擴增產(chǎn)物；和b)檢測可區(qū)分標記物向截然不同大小的擴增產(chǎn)物中的摻入，從而確定每個所述多態(tài)性位點處的核苷酸。
35.權(quán)利要求34的方法，其中所述可區(qū)分標記物是熒光標記物。
36.權(quán)利要求34的方法，其中所述步驟(b)包括根據(jù)大小和/或電荷分離在所述擴增過程中生成的核酸分子。
37.權(quán)利要求36的方法，其中所述分離包括毛細電泳。
38.權(quán)利要求34的方法，其中所述擴增過程包括至少兩個擴增反應(yīng)循環(huán)，其中每個循環(huán)包括下列步驟1)核酸鏈分離；2)寡核苷酸引物退火；和3)退火引物的聚合酶延伸。
39.權(quán)利要求38的方法，其在所述擴增過程中和至少一個所述反應(yīng)循環(huán)之后還包括下列步驟取出所述擴增反應(yīng)的部分樣品，根據(jù)大小和/或電荷分離核酸分子，并檢測所述可區(qū)分標記物的摻入，其中所述檢測鑒別所述多態(tài)性位點處的核苷酸。
40.權(quán)利要求39的方法，其中所述取出、分離和檢測在所述擴增過程的每個循環(huán)之后進行。
41.權(quán)利要求39的方法，其中所述分離包括毛細電泳。
42.權(quán)利要求34的方法，其中步驟(a)和(b)在包括熱循環(huán)儀、取樣裝置、毛細電泳裝置和熒光檢測儀的模塊化設(shè)備中進行。
43.權(quán)利要求34的方法，其中所述標簽序列包含15-40個核苷酸。
44.權(quán)利要求34的方法，其中所述一組可區(qū)分標記的下游擴增引物由下列亞組組成包含特異對應(yīng)于多態(tài)性位點處A的存在的標簽序列的亞組；包含特異對應(yīng)于多態(tài)性位點處C的存在的標簽序列的亞組；包含特異對應(yīng)于多態(tài)性位點處G的存在的標簽序列的亞組；和包含特異對應(yīng)于多態(tài)性位點處T的存在的標簽序列的亞組。
45.權(quán)利要求34的方法，其在步驟(a)之前還包括將生成引物延伸產(chǎn)物群時未摻入的引物除去的步驟。
46.權(quán)利要求45的方法，其中所述除去步驟包括將生成引物延伸產(chǎn)物群時未摻入的引物降解。
47.權(quán)利要求46的方法，其中所述降解使用熱不穩(wěn)定的外切酶進行。
48.權(quán)利要求47的方法，其中所述熱不穩(wěn)定的外切酶選自外切酶I和外切酶VII。
49.權(quán)利要求48的方法，其中所述熱不穩(wěn)定的外切酶在進行步驟(a)之前熱滅活。
50.一種鑒別已知多態(tài)性位點處的單核苷酸的方法，該方法包括I)提供包含所述多態(tài)性位點的核酸樣品；II)分離所述核酸樣品的鏈，在下列引物的存在下進行重新退火a)第一寡核苷酸引物，包含與所述已知多態(tài)性位點上游已知距離的序列雜交的3’區(qū)域，所述第一寡核苷酸引物包含位于所述3’區(qū)域5’端的第一序列標簽；和b)一組第二寡核苷酸引物，其中所述組的每個成員包含i)與所述多態(tài)性位點的3’端和附近雜交的區(qū)域；ii)可變的3’末端核苷酸，其中當所述成員與所述已知序列雜交時，所述3’末端核苷酸和所述多態(tài)性位點相對，并且其中，當且只有當所述3’末端核苷酸與所述多態(tài)性位點處的核苷酸互補時，所述3’末端核苷酸才與所述多態(tài)性位點處的所述核苷酸進行堿基配對；和iii)與(ii)中的所述可變3’末端核苷酸對應(yīng)的標簽序列，所述標簽序列位于所述成員上區(qū)域(i)的5’端；III)使步驟(II)所得的退火寡核苷酸在一定條件下和核酸聚合酶接觸，所述條件使退火的寡核苷酸延伸，從而生成延伸產(chǎn)物，其中從第一寡核苷酸引物生成的引物延伸產(chǎn)物和其互補物分離時，可以作為模板，用于合成第二寡核苷酸引物組的成員的延伸產(chǎn)物，反之亦然；IV)重復鏈分離和接觸步驟(II)和(III)兩次，從而產(chǎn)生核酸分子群，其包含與所述第一寡核苷酸相同或互補的序列，以及與所述第二寡核苷酸組的一個成員相同或互補的序列；V)將步驟(IV)中產(chǎn)生的核酸分子群在使未退火的寡核苷酸引物降解的條件下和熱不穩(wěn)定的外切酶接觸，使所述引物降解；VI)熱滅活所述熱不穩(wěn)定的外切酶；VII)使所述核酸分子群經(jīng)歷擴增過程，其中所述擴增過程使用包含所述第一寡核苷酸引物所帶有的第一序列標簽的上游擴增引物和一組下游擴增引物進行，所述下游擴增引物組的每個成員包含所述第二寡核苷酸引物組成員所帶有的標簽和可區(qū)分標記物；和VIII)檢測至少一種可區(qū)分標記物的摻入，從而鑒別所述已知多態(tài)性位點處的核苷酸。
51.權(quán)利要求50的方法，其中所述可區(qū)分標記物是熒光標記物。
52.權(quán)利要求50的方法，其中所述步驟(VIII)包括根據(jù)大小和/或電荷分離在所述擴增過程中生成的核酸分子。
53.權(quán)利要求50的方法，其中所述分離包括毛細電泳。
54.權(quán)利要求50的方法，其中所述擴增過程包括至少兩個擴增反應(yīng)循環(huán)，其中每個循環(huán)包括下列步驟1)核酸鏈分離；2)寡核苷酸引物退火；和3)退火引物的聚合酶延伸。
55.權(quán)利要求54的方法，其在所述擴增過程中和至少一個所述反應(yīng)循環(huán)之后還包括下列步驟取出所述擴增反應(yīng)的部分樣品，根據(jù)大小和/或電荷分離核酸分子，并檢測所述可區(qū)分標記物的摻入，其中所述檢測鑒別所述多態(tài)性位點處的核苷酸。
56.權(quán)利要求55的方法，其中所述取出、分離和檢測在所述擴增過程的每個循環(huán)之后進行。
57.權(quán)利要求50的方法，其中步驟I-VIII在包括熱循環(huán)儀、取樣裝置、毛細電泳裝置和熒光檢測儀的模塊化設(shè)備中進行。
58.權(quán)利要求50的方法，其中所述每個標簽序列包含15-40個核苷酸。
59.權(quán)利要求50的方法，其中與所述已知多態(tài)性位點上游的已知距離序列雜交的所述3’區(qū)域包含10-30個核苷酸。
60.權(quán)利要求50的方法，其中與所述多態(tài)性位點3’端和附近雜交的區(qū)域包含10-30個核苷酸。
61.權(quán)利要求50的方法，其中所述的下游擴增引物組由下列亞組組成包含特異對應(yīng)于多態(tài)性位點處A的存在的標簽序列的亞組；包含特異對應(yīng)于多態(tài)性位點處C的存在的標簽序列的亞組；包含特異對應(yīng)于多態(tài)性位點處G的存在的標簽序列的亞組；和包含特異對應(yīng)于多態(tài)性位點處T的存在的標簽序列的亞組。
62.一種鑒別存在于一組已知多態(tài)性位點處的單核苷酸的方法，該方法包括I)提供包含所述多態(tài)性位點組的核酸樣品；II)分離所述核酸樣品的鏈，在下列引物的存在下進行重新退火a)第一寡核苷酸引物組，每個引物包含與已知多態(tài)性位點上游的已知距離序列雜交的3’區(qū)域，所述第一寡核苷酸引物組的每個成員包含位于所述3’區(qū)域5’端的通用序列標簽，所述第一寡核苷酸引物組的每個成員的選擇應(yīng)使對于所述已知多態(tài)性位點組中的每個多態(tài)性位點來說產(chǎn)生截然不同大小的擴增產(chǎn)物；和b)下游擴增引物組，以5’至3’的順序包含i)序列標簽，選自特異對應(yīng)于所述引物的3’末端核苷酸G的標簽；特異對應(yīng)于所述引物的3’末端核苷酸A的標簽；特異對應(yīng)于所述引物的3’末端核苷酸T的標簽；和特異對應(yīng)于所述引物的3’末端核苷酸C的標簽；ii)與所述多態(tài)性位點組中一個多態(tài)性位點附近和3’端的序列特異性雜交的區(qū)域，其中所述下游擴增引物組包含引物亞組，所述引物亞組包含與所述多態(tài)性位點組中的每個多態(tài)性位點附近特異性雜交的區(qū)域；和iii)選自G、A、T或C的3’末端核苷酸，其中所述末端核苷酸特異對應(yīng)于(i)中所述在下游擴增引物上的序列標簽，其中當所述下游擴增引物與多態(tài)性位點附近和3’端的序列雜交時，所述3’末端核苷酸和多態(tài)性位點相對；III)使步驟(II)所得的退火寡核苷酸在一定條件下和核酸聚合酶接觸，所述條件使退火的寡核苷酸延伸，從而生成延伸產(chǎn)物，其中從第一寡核苷酸引物生成的引物延伸產(chǎn)物和其互補物分離時，可以作為模板，用于合成第二寡核苷酸引物組的成員的延伸產(chǎn)物，反之亦然；IV)重復鏈分離和接觸步驟(II)和(III)兩次，從而產(chǎn)生包含核酸分子群的反應(yīng)混合物，包含與所述第一寡核苷酸相同或互補的序列，以及與下游擴增引物組的一個成員相同或互補的序列；V)將步驟(IV)中產(chǎn)生的核酸分子群在使未退火的寡核苷酸引物降解的條件下和熱不穩(wěn)定的外切酶接觸，使未退火的引物降解；VI)熱滅活熱不穩(wěn)定的外切酶；VII)使所述核酸分子群經(jīng)歷擴增過程，其中所述擴增過程使用包含所述第一寡核苷酸引物所帶有的通用序列標簽的上游擴增引物和一組下游擴增引物進行，所述下游擴增引物組的每個成員包含所述第二寡核苷酸引物組成員所帶有的標簽和可區(qū)分標記物；和VIII)檢測至少一個可區(qū)分標記物的摻入，從而鑒別所述已知多態(tài)性位點處存在的核苷酸。
63.權(quán)利要求62的方法，其中所述可區(qū)分標記物是熒光標記物。
64.權(quán)利要求62的方法，其中所述步驟(VIII)包括根據(jù)大小和/或電荷分離在所述擴增過程中生成的核酸分子。
65.權(quán)利要求64的方法，其中所述分離包括毛細電泳。
66.權(quán)利要求62的方法，其中所述擴增過程包括至少兩個擴增反應(yīng)循環(huán)，其中每個循環(huán)包括下列步驟1)核酸鏈分離；2)寡核苷酸引物退火；和3)退火引物的聚合酶延伸。
67.權(quán)利要求66的方法，其在所述擴增過程中和至少一個所述反應(yīng)循環(huán)之后還包括下列步驟取出所述擴增反應(yīng)的部分樣品，根據(jù)大小和/或電荷分離核酸分子，并檢測所述可區(qū)分標記物的摻入，其中所述檢測鑒別所述多態(tài)性位點處的核苷酸。
68.權(quán)利要求67的方法，其中所述取出、分離和檢測在所述擴增過程的每個循環(huán)之后進行。
69.權(quán)利要求62的方法，其中步驟I-VIII在包括熱循環(huán)儀、取樣裝置、毛細電泳裝置和熒光檢測儀的模塊化設(shè)備中進行。
70.權(quán)利要求62的方法，其中所述每個標簽序列包含15-40個核苷酸。
71.權(quán)利要求62的方法，其中與所述已知多態(tài)性位點上游的已知距離序列雜交的所述3’區(qū)域包含10-30個核苷酸。
72.權(quán)利要求62的方法，其中與所述多態(tài)性位點3’端和附近雜交的區(qū)域包含10-30個核苷酸。
73.權(quán)利要求62的方法，其中所述可區(qū)分標記的下游擴增引物組由下列亞組組成包含特異對應(yīng)于多態(tài)性位點處A的存在的標簽序列的亞組；包含特異對應(yīng)于多態(tài)性位點處C的存在的標簽序列的亞組；包含特異對應(yīng)于多態(tài)性位點處G的存在的標簽序列的亞組；和包含特異對應(yīng)于多態(tài)性位點處T的存在的標簽序列的亞組。
74.一種鑒別核酸樣品上多態(tài)性位點處存在的核苷酸的試劑盒，所述試劑盒包括一組上游引物，包括a)第一引物，包含5’標簽序列和足以與已知多態(tài)性位點上游的已知距離序列特異性雜交的3’序列；和b)4個下游第二引物組成的一組引物，以5’至3’的順序包含i)序列標簽，選自特異對應(yīng)于所述引物的3’末端核苷酸G的標簽；特異對應(yīng)于所述引物的3’末端核苷酸A的標簽；特異對應(yīng)于所述引物的3’末端核苷酸T的標簽；和特異對應(yīng)于所述引物的3’末端核苷酸C的標簽；ii)與所述多態(tài)性位點組中一個多態(tài)性位點附近和3’端的序列特異性雜交的區(qū)域，其中所述下游擴增引物組包含引物亞組，所述引物亞組包含與所述多態(tài)性位點組中的每個多態(tài)性位點附近特異性雜交的區(qū)域；和iii)選自G、A、T或C的3’末端核苷酸，其中所述末端核苷酸特異對應(yīng)于(i)中所述在下游擴增引物上的序列標簽，其中當所述下游擴增引物與多態(tài)性位點附近和3’端的序列雜交時，所述3’末端核苷酸和多態(tài)性位點相對。
75.權(quán)利要求74的試劑盒，其還包括5個引物組成的引物組，所述引物缺少對待驗證多態(tài)性的生物有機體基因組中的基因特異的序列，所述引物包括含有所述第一引物的標簽序列的一個引物，和四個可區(qū)分標記的引物組成的組，其中含有所述四個下游第二引物組成的組中的標簽序列。
全文摘要
本發(fā)明涉及分析核酸樣品中單核苷酸差異基因型的方法。更具體地說，本發(fā)明提供了鑒別基因組DNA樣品中多態(tài)性位點或多態(tài)性位點組處的核苷酸的方法。該方法使用標簽引物延伸，其中一組標簽序列對應(yīng)于多態(tài)性位點處的核苷酸。引物延伸產(chǎn)物使用通用的一組標簽特異性引物進行PCR擴增，其中下游引物帶有可區(qū)分標記物。根據(jù)大小和/或電荷分離后，在預期大小的產(chǎn)物中檢測可區(qū)分標記物可以確定多態(tài)性位點處的核苷酸。該方法非常適于分析一系列反應(yīng)物中多處單核苷酸差異的基因型。
文檔編號G01N27/447GK1665938SQ03815401
公開日2005年9月7日 申請日期2003年6月20日 優(yōu)先權(quán)日2002年6月28日
發(fā)明者弗拉基米爾·I·斯列普尼奧夫 申請人:桑蒂翁有限公司