專(zhuān)利名稱(chēng)：等位基因的測(cè)定方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及通過(guò)鑒定基因中一個(gè)或多個(gè)異源序列位點(diǎn)而分離和鑒定等位基因的方法。更具體地，本發(fā)明涉及使用一個(gè)或多個(gè)引物分離和鑒定等位基因的方法。
背景技術(shù)：
個(gè)體之間序列差異最常見(jiàn)的形式是單核苷酸多態(tài)性，普遍公知為SNP。隨著人體基因組計(jì)劃的完成，估計(jì)SNP存在的平均數(shù)是每1000個(gè)核苷酸中有一個(gè)，但是在某些DNA區(qū)存在的頻率更高一些?，F(xiàn)在努力的焦點(diǎn)在于利用SNP來(lái)鑒定與疾病或藥物反應(yīng)有關(guān)的靶基因。但是，由于關(guān)聯(lián)性不強(qiáng)，很多科學(xué)家和研究人員懷疑以個(gè)體SNP為基礎(chǔ)對(duì)藥物和疾病個(gè)性化的觀點(diǎn)，從而單元型(Haplotype)分析的重要性浮現(xiàn)出來(lái)，成為SNP醫(yī)學(xué)應(yīng)用的關(guān)鍵方法。
單元型是個(gè)體SNP沿著給定DNA片段的組織形式，這是普遍公知的。單元型的經(jīng)典定義是單一染色體中趨向于在給定種群中共同從一代遺傳到下一代的緊密連鎖基因座的等位基因組合。分子單元型測(cè)定的另一方面是連鎖不平衡圖譜的繪制，其現(xiàn)在被認(rèn)為是疾病基因的定位克隆中的重要工具，隨著復(fù)雜表型的遺傳學(xué)刨析，很多種應(yīng)用就變得顯而易見(jiàn)了。
1989年以來(lái)，科學(xué)家們研究了各種分子單元型測(cè)定方法，他們利用基因組DNA的單分子稀釋物(SMD)，以物理方法分離等位基因，或者通過(guò)等位基因特異性引物從雜合模板選擇性擴(kuò)增半合子DNA片段進(jìn)行等位基因辨別。然而，只是針對(duì)短片段(大約500bp)開(kāi)發(fā)了這些方法，但是最近分子單元型測(cè)定已應(yīng)用于長(zhǎng)范圍的PCR(標(biāo)記物間隔再擴(kuò)大10-20倍)，并且使用CD4基因座作為開(kāi)發(fā)這項(xiàng)分析方法的原型系統(tǒng)。也嘗試過(guò)測(cè)定DNA序列單元型的其它方法，但是這些方法非常不成功、不可靠或者成本高。因此仍存在著對(duì)可靠、處理量大的經(jīng)濟(jì)型分子單元型測(cè)定方法的需要。
發(fā)明概述本發(fā)明涉及通過(guò)鑒定基因中一個(gè)或多個(gè)異源序列位點(diǎn)來(lái)測(cè)定等位基因的方法。該方法可以用來(lái)測(cè)定具體基因的單元型，并且在很多領(lǐng)域具有應(yīng)用價(jià)值，包括人白細(xì)胞抗原(HLA)類(lèi)型的測(cè)定。本發(fā)明還涉及用于這種類(lèi)型測(cè)定的試劑盒。
本發(fā)明包括分離等位基因特異性核酸分子的方法。向包含一個(gè)或多個(gè)異源序列位點(diǎn)的單鏈核酸分子中，加入一中或多中異源序列位點(diǎn)特異性核酸引物，并且使其雜交。在一個(gè)實(shí)施方案中，各引物的3′端對(duì)應(yīng)于靶異源序列位點(diǎn)的多態(tài)性位點(diǎn)。在這樣的實(shí)施方案中，可以使該3′端進(jìn)行單堿基延伸，連接于5′端與該異源序列位點(diǎn)特異性引物的3′端相鄰的第二引物，或者可以延伸數(shù)個(gè)堿基。然后分離延伸的或連接的異源序列位點(diǎn)特異性雜交引物和核酸分子，并根據(jù)需要回收，用于進(jìn)一步的基因型測(cè)定。在另一個(gè)實(shí)施方案中，各引物包含位于引物內(nèi)的一個(gè)或多個(gè)多態(tài)性堿基，這樣能夠選擇性去除與少于100％互補(bǔ)堿基雜交的引物，而100％互補(bǔ)堿基雜交的那些引物不受影響。
本發(fā)明還涉及鑒定包含該等等位基因的核酸分子中的多個(gè)等位基因的方法。選擇含有多個(gè)異源序列位點(diǎn)的單鏈核酸分子，向該核酸分子中加入兩種引物，一種異源引物、一種同源引物。所述異源引物能夠與位于同一核酸分子上5′異源序列位點(diǎn)的3′端的3′端異源序列位點(diǎn)雜交。所述異源引物的3′端堿基相應(yīng)于所述異源序列位點(diǎn)的多態(tài)性堿基，這樣只有在異源引物的3′端與所述單鏈核酸雜交時(shí)才發(fā)生延伸。所述同源引物能在位于5′異源序列位點(diǎn)的5′端位置與同一核酸分子雜交。這些引物與核酸分子雜交，并且延伸異源引物，這樣就可復(fù)制位于引物之間的、核酸分子的所述5′異源序列位點(diǎn)，當(dāng)延伸的異源引物達(dá)到同源引物時(shí)，同源引物起到終止異源引物延伸的作用。將核酸分子和延伸的異源引物變性，并分離和分析異源引物，以確定5′異源序列位點(diǎn)。利用這些信息確定新一套含有另一種異源引物和另一種同源引物的核酸引物，該新一套引物的異源引物能與5′異源序列位點(diǎn)雜交(該異源引物的3′端堿基相應(yīng)于多態(tài)性堿基)，該5′異源序列位點(diǎn)位于相同核酸分子上另一個(gè)異源序列位點(diǎn)的3′端，該新一套引物的同源引物能在另一個(gè)異源序列位點(diǎn)的5′端與同一核酸分子雜交。重復(fù)前面的步驟，在每下一輪雜交/延伸中使用新的一套引物，直到在該核酸分子上鑒定出足夠的異源序列位點(diǎn)，用來(lái)鑒定等位基因。可以用這種方式測(cè)定核酸分子的單元型。
本發(fā)明還涉及鑒定核酸分子中多個(gè)等位基因的方法，包括向一組小珠加入含有多個(gè)等位基因的核酸樣品，每一個(gè)小珠連接有兩個(gè)不同的引物，各小珠上至少一個(gè)引物是對(duì)一種獨(dú)特等位基因的引物，使一種獨(dú)特等位基因的至少一種引物與該核酸樣品的一部分雜交。將雜交的引物擴(kuò)增，延伸雜交引物，產(chǎn)生延伸的引物核酸。然后將雜交的核酸樣品和引物變性，并從小珠上除去核酸樣品。延伸的引物然后與小珠上的第二種引物雜交，并擴(kuò)增該第二種引物。然后對(duì)含有雙重?cái)U(kuò)增引物的小珠進(jìn)行分析，確定核酸樣品中存在的等位基因。
附圖簡(jiǎn)要說(shuō)明

圖1是說(shuō)明應(yīng)用本發(fā)明的等位基因特異性引物延伸方法鑒定等位基因的示意圖。
圖2是說(shuō)明應(yīng)用引物大小標(biāo)記方法的單堿基延伸多等位基因鑒定方法的示意圖。
圖2A是說(shuō)明應(yīng)用引物大小標(biāo)記方法的單堿基延伸多等位基因鑒定方法的示意圖。
圖3是說(shuō)明應(yīng)用本發(fā)明的等位基因特異性連接和引物大小標(biāo)記鑒定等位基因的示意圖。
圖4是說(shuō)明應(yīng)用本發(fā)明的雜交和引物大小標(biāo)記鑒定等位基因的示意圖。
圖5是說(shuō)明應(yīng)用本發(fā)明的同源引物和異源引物組的多等位基因鑒定方法的示意圖。
圖6A-6F是說(shuō)明應(yīng)用本發(fā)明的包含多種引物的熒光小珠鑒定多個(gè)等位基因的方法示意圖。
本發(fā)明的詳細(xì)描述本發(fā)明以美國(guó)臨時(shí)專(zhuān)利申請(qǐng)No.60/228,994為基礎(chǔ)(該專(zhuān)利全文在這里引作參考)，涉及確定等位基因標(biāo)記的方法。
本申請(qǐng)自始至終使用下面的術(shù)語(yǔ)，并且定義如下等位基因給定基因的變體形式。這樣的變體包括單核苷酸多態(tài)性、插入、反轉(zhuǎn)、易位和缺失。
抗生物素蛋白從功能上以其高親合力、特異性結(jié)合生物素的能力定義的蛋白質(zhì)家族?？股锼氐鞍资窍喈?dāng)小的寡聚體蛋白，由四個(gè)相同的亞基組成，每一個(gè)亞基帶有一個(gè)單一的生物素結(jié)合位點(diǎn)。因此每摩爾抗生物素蛋白能結(jié)合4摩爾的生物素。抗生物素蛋白包括(a)兩棲動(dòng)物、爬行動(dòng)物和鳥(niǎo)類(lèi)產(chǎn)生的蛋白質(zhì)，所述蛋白質(zhì)存在于它們的蛋中，稱(chēng)為抗生物素蛋白，和(b)鏈霉菌屬阿維丁鏈霉菌(Streptomycesavidinii)產(chǎn)生的蛋白質(zhì)，稱(chēng)為鏈霉抗生物素蛋白。這里使用的″抗生物素蛋白″包括所有的上述蛋白。
生物素這里使用的″生物素″包括生物素、其中生物素通過(guò)加入烷基被修飾的商業(yè)生物素產(chǎn)品、和生物素衍生物如活性酯、胺、酰肼和巰基，所述衍生物在聚合物上有額外的反應(yīng)基團(tuán)如胺、?；屯榛x去基團(tuán)、羰基和烷基鹵化物或米歇爾型受體。
檢測(cè)分子一般通過(guò)外部能源使核酸可檢測(cè)和/或去除的與核酸共價(jià)連接的分子。這樣的分子可以包括染料、可變重量分子(包括聚腺苷酸尾和聚胸苷酸尾)、可以與小珠(包括磁小珠)連接的接頭、生物素、抗生物素蛋白、地高辛配基、地高辛配基抗體和本領(lǐng)域公知的其它類(lèi)似材料。
基因型在基因座上攜帶的特定等位基因。
單元型表示若干緊密連鎖基因座的集體基因型，為同一染色體上等位基因的完全序列。
異源引物在嚴(yán)格條件下與一個(gè)獨(dú)特等位基因雜交的引物。
異源序列位點(diǎn)在確定的序列位點(diǎn)具有不同序列的兩個(gè)等位基因被稱(chēng)為具有異源序列位點(diǎn)。
同源引物與親代雙方的等位基因都雜交的引物。
親代等位基因含有一套來(lái)自母系一邊的染色體和一套來(lái)自父系一邊的染色體的哺乳動(dòng)物二倍體細(xì)胞的等位基因。
引物能夠與DNA模板雜交的寡核苷酸。
這里引述的所有的專(zhuān)利文獻(xiàn)和參考文獻(xiàn)在這里引作參考。
本發(fā)明的方法具有幾點(diǎn)重要的優(yōu)點(diǎn)。本發(fā)明的方法可以快速、低成本、精確測(cè)定等位基因，包括完整基因型和單元型測(cè)定。該方法能夠分析的核酸長(zhǎng)度是本領(lǐng)域公知的標(biāo)準(zhǔn)擴(kuò)增方法(例如聚合酶鏈反應(yīng))所不能完全擴(kuò)增的核酸片段長(zhǎng)度。
本發(fā)明涉及分離和鑒定等位基因特異性核酸分子的方法。可以使用任何核酸分子，優(yōu)選脫氧核糖核酸?？梢澡b定和分離的等位基因特異性核酸分子包括多列基因(polyallelic genes)的等位基因、基因片段和非表達(dá)片段。
本發(fā)明的方法和試劑盒可以用于所有具有兩個(gè)或多個(gè)異源序列位點(diǎn)、因此具有多種等位基因類(lèi)型的二倍體遺傳物質(zhì)?？梢詰?yīng)用本發(fā)明的帶有多個(gè)等位基因之基因的例子是哺乳動(dòng)物MHC基因如人白細(xì)胞抗原(HLA)I類(lèi)和II類(lèi)基因，哺乳動(dòng)物T細(xì)胞受體基因，TAP，LMP，ras，非典型HLAI類(lèi)基因，人補(bǔ)體因子C4和C2的基因，人HLA復(fù)合體中的Bf，和位于線粒體DNA、細(xì)菌染色體和病毒DNA中的基因。
在本發(fā)明的一個(gè)方法中，獲得含有多個(gè)等位基因的核酸樣品，每個(gè)等位基因帶有獨(dú)特的一套異源序列位點(diǎn)。通過(guò)本領(lǐng)域公知的任何方法擴(kuò)增該核酸樣品，一個(gè)實(shí)施方案是通過(guò)聚合酶鏈反應(yīng)(PCR)，如Mullis的1988年7月28日公開(kāi)的美國(guó)專(zhuān)利No.4,683,202中所述。然后將擴(kuò)增的核酸樣品變性為單鏈核酸。然后可以對(duì)這種單鏈核酸進(jìn)行分析，通過(guò)本發(fā)明的各種方法測(cè)定存在的異源序列位點(diǎn)，確定存在的等位基因。
本發(fā)明的方法使用一種或多種引物。本發(fā)明的引物包含與目的序列雜交的核苷酸序列。在某些情況下，要求引物在能夠于擴(kuò)增期間延伸的條件下雜交。在另外一些情況下，要求雜交時(shí)100％互補(bǔ)匹配的引物具有比雜交時(shí)小于100％互補(bǔ)匹配的引物更高的Tm。一般情況下，本發(fā)明的引物可以是任何有效的長(zhǎng)度，但是一般包含大約12-25個(gè)核苷酸或者至少18個(gè)核苷酸，優(yōu)選長(zhǎng)度是大約18-22個(gè)核苷酸。在本發(fā)明的方法中，需要鑒定對(duì)于樣品中靶DNA獨(dú)特的一個(gè)或多個(gè)引物序列，以便鑒定目的序列的多態(tài)性位點(diǎn)。很多多等位基因的這種多態(tài)性鑒定是本領(lǐng)域公知的。例如，HLA-A、HLA-B和HLA-C基因有大約222種已知的等位基因，這些等位基因的序列是本領(lǐng)域公知的。參見(jiàn)Arnett和Parham，組織抗原(Tissue Antigens)45217-257頁(yè)，1995，和Baxter-Lowe等，1997年12月30日公開(kāi)的美國(guó)專(zhuān)利No.5,702,885。
本發(fā)明使用的描述核酸分子雜交的短語(yǔ)″在高度嚴(yán)格條件下雜交″指在低離子強(qiáng)度和高洗滌溫度條件下雜交。短語(yǔ)″在低嚴(yán)格條件下雜交″指在高離子強(qiáng)度和低溫條件下雜交。
影響嚴(yán)格性的變量包括，例如，溫度、鹽濃度、探針/樣品同源性和洗滌條件。隨著雜交溫度的升高，其它都相同時(shí)，嚴(yán)格性提高。嚴(yán)格性提高使得非特異性雜交降低，即背景干擾小。核酸雜交的″高度嚴(yán)格條件″和″中等嚴(yán)格條件″在下面文獻(xiàn)中有解釋Current Protocols inMolecular Biology，Ausubel等，1998，Green Publishing Associatesand Wiley Interscience，NY，其中的教導(dǎo)內(nèi)容引作參考。當(dāng)然，技術(shù)人員明白，為了包括或排除探針和分析物之間不同的互補(bǔ)程度，為了達(dá)到要求的檢測(cè)范圍，雜交條件的嚴(yán)格性可以根據(jù)需要而變化。
在本發(fā)明中可以使用各種各樣的檢測(cè)分子。這些分子可以與一種或多種引物偶聯(lián)，或者可以直接與在延伸步驟中插入到核酸中的ddNTPs偶聯(lián)。這些分子可以包含檢測(cè)所述分子的工具，例如染料、放射性標(biāo)記等；或者它們可以包含分離所述分子的工具，例如生物素/抗生物素蛋白，磁性和/或熒光珠等；或者含有兩者。例如當(dāng)使用生物素/抗生物素蛋白時(shí)，可以用生物素標(biāo)記一種或多種引物，這樣當(dāng)引物與單鏈核酸雜交時(shí)，產(chǎn)生的雙鏈DNA中一條鏈帶有生物素標(biāo)記。然后該雙鏈DNA可以與包被有抗生物素蛋白的固相載體結(jié)合。
本發(fā)明中使用的固相載體可以是本領(lǐng)域公知的任何這種載體，例如小珠、親和色譜柱。優(yōu)選的載體是磁珠形式。當(dāng)載體是小珠形式時(shí)，通過(guò)用磁鐵吸引小珠并在使雙鏈核酸解離為單鏈核酸的條件下洗滌小珠，來(lái)分離擴(kuò)增的核酸的兩條鏈。通常在堿性條件下，一般是0.1M或0.15M NaOH，室溫下，通過(guò)幾次反復(fù)溫育小珠約5-10分鐘，進(jìn)行解離作用。然后可以回收各條鏈并且進(jìn)一步分析。
應(yīng)用各種各樣的分析技術(shù)鑒定分離的異源序列位點(diǎn)來(lái)確定等位基因。這些技術(shù)是本領(lǐng)域公知的，包括但不限于，電泳如聚丙烯酰胺凝膠電泳、流式細(xì)胞術(shù)、高壓液相色譜、激光掃描和質(zhì)譜法。這些技術(shù)可以手工操作或者通過(guò)自動(dòng)系統(tǒng)操作。這樣的自動(dòng)系統(tǒng)是本領(lǐng)域公知的并且包括能掃描多種顏色熒光的自動(dòng)測(cè)序儀或者毛細(xì)管電泳儀。
本發(fā)明的第一種方法已在圖1和2中圖示說(shuō)明，該方法依賴(lài)于雜交的異源序列位點(diǎn)特異性引物的延伸。該方法特別適用于測(cè)定高度多態(tài)性染色體區(qū)中的等位基因或單元型特異性基因型信息。如圖1所示，DNA樣品擴(kuò)增和變性之后產(chǎn)生單鏈DNA片段，加入在5′端用檢測(cè)分子標(biāo)記的一種或多種異源序列位點(diǎn)特異性引物。將異源序列位點(diǎn)特異性引物加入單鏈核酸分子中并且使其雜交。在優(yōu)選的實(shí)施方案中，各引物的3′端與異源序列位點(diǎn)的多態(tài)性堿基互補(bǔ)。因此，如果引物與其中3′端堿基不互補(bǔ)的異源序列位點(diǎn)雜交的話，當(dāng)使之處于延伸條件下時(shí)引物不會(huì)延伸。優(yōu)選地，使用能區(qū)別單個(gè)核苷酸差異的酶。如圖1所示，然后使雜交的引物延伸，只有與互補(bǔ)3′端堿基匹配雜交的引物才能延伸。然后通過(guò)檢測(cè)分子去除引物，圖1中以生物素為例說(shuō)明。使用包被抗生物素蛋白的磁珠通過(guò)引物上的生物素去除引物。然后在與那些未經(jīng)延伸的引物結(jié)合的DNA片段被去除的條件下洗滌雜交的引物/DNA片段。然后使延伸的雙鏈核酸變性。分析不再與小珠結(jié)合的鏈，確定異源序列位點(diǎn)。
或者，本發(fā)明中使用的引物可以不在5′端與檢測(cè)分子偶聯(lián)，而是如前所述使引物雜交，使用與檢測(cè)分子偶聯(lián)的ddNTPs使那些與互補(bǔ)3′端雜交的引物進(jìn)行單堿基延伸，如圖2所示。利用延伸引物上的檢測(cè)分子分離引物，然后使引物變性并進(jìn)行分析，確定存在的異源序列位點(diǎn)。
使用以下的方法時(shí)，本發(fā)明還適用于使用能掃描四種顏色熒光的自動(dòng)測(cè)序儀或者毛細(xì)管電泳儀的高通量單核苷酸多態(tài)性測(cè)定。也可以將同樣的方法加以修改來(lái)測(cè)定單核苷酸多態(tài)性之外的其它遺傳變異類(lèi)型，包括多堿基多態(tài)性、插入、反轉(zhuǎn)、易位和缺失。
本發(fā)明的另一種方法依賴(lài)于等位基因特異性連接。圖3說(shuō)明了這種方法。如圖3所示，將異源序列位點(diǎn)特異性引物加入含有一個(gè)或多個(gè)異源序列位點(diǎn)的單鏈DNA片段中。所述異源序列特異性引物的各引物的3′端與一個(gè)異源序列位點(diǎn)的多態(tài)性堿基互補(bǔ)，并且使其與所述DNA片段雜交。然后加入連接引物，并使其與所述DNA片段雜交。各連接引物具有與所述DNA片段之一的一部分互補(bǔ)的序列，使得連接引物的5′端直接鄰接異源序列位點(diǎn)特異性引物的3′端。如果該異源序列位點(diǎn)特異性引物不與所述DNA片段雜交，則當(dāng)處于連接條件下時(shí)，連接引物不能與異源序列位點(diǎn)特異性引物連接。如果可能，則引物被連接起來(lái)，然后使之處于足以使沒(méi)有連接的引物變性但是不足以使與DNA片段雜交的連接的引物變性的溫度條件下。一般情況下，當(dāng)使用20個(gè)核苷酸的引物時(shí)，這樣的溫度是大約60℃。然后可以通過(guò)本領(lǐng)域公知的任何方法去除雜交的連接引物。如圖3所示，一套引物可以連接有檢測(cè)分子，如生物素。檢測(cè)分子可以連接在異源序列特異性引物上或連接在連接引物上。此外，可以將所描述的不同方法組合，如圖3所示，通過(guò)一種方法檢測(cè)一個(gè)異源序列位點(diǎn)處的多態(tài)性，通過(guò)這里描述的其它方法測(cè)定其它位點(diǎn)處的多態(tài)性。也如圖3所示，一種或多種引物可以有可變重量的分子與各引物的5′端偶聯(lián)，這樣，沒(méi)有兩個(gè)引物具有相同的分子量。這種可變重量的分子可以是在雜交/擴(kuò)增步驟中不反應(yīng)的任何合適的材料，包括多聚同型核酸尾，例如聚腺苷酸尾(poly A)。這樣的聚腺苷酸尾的長(zhǎng)度差是2-4個(gè)堿基，但是可以是在標(biāo)準(zhǔn)分離儀器例如凝膠電泳上足以分離具poly A尾引物的任何不同長(zhǎng)度。
圖4說(shuō)明本發(fā)明的另一種方法。根據(jù)這樣的方法，將一套異源序列特異性引物加入包含多個(gè)異源序列位點(diǎn)的DNA片段中。各引物具有至少一個(gè)多態(tài)性堿基，其位于各引物之內(nèi)，這樣，在引物與DNA片段雜交之后，雜交中有錯(cuò)配堿基的那些引物的Tm比沒(méi)有錯(cuò)配堿基的那些引物的Tm低。然后利用Tm的這種差異來(lái)去除少于100％互補(bǔ)雜交的那些引物。這樣的堿基錯(cuò)配一般發(fā)生于引物序列中心附近。去除少于100％互補(bǔ)雜交的引物/DNA片段綴合物之后，分析留下的綴合物，測(cè)定特異性異源序列位點(diǎn)，確定具體的等位基因。這可以用各種各樣的方法進(jìn)行。根據(jù)圖4所示，所有的引物都可以連接可變重量的分子。各特異性異源序列位點(diǎn)的所有引物可以連接特定的可變重量的分子。在一個(gè)或多個(gè)特異性異源序列位點(diǎn)的各多態(tài)性的各引物連接不同的檢測(cè)分子。按照檢測(cè)分子將雜交的引物分成各個(gè)組，并通過(guò)進(jìn)一步測(cè)定各組引物中存在哪一種可變重量分子，來(lái)確定等位基因特異身份。
本發(fā)明的另一種方法能夠測(cè)定核酸長(zhǎng)片段上的多個(gè)異源序列位點(diǎn)，所述核酸長(zhǎng)片段可能太長(zhǎng)，用常規(guī)方法例如PCR不能完全擴(kuò)增。如圖5所示，選擇含有多個(gè)異源序列位點(diǎn)的單鏈核酸分子。向該核酸分子中加入兩種引物，一種異源引物和一種同源引物。異源引物能與位于相同核酸分子上的5′異源序列位點(diǎn)的3′端的3′異源序列位點(diǎn)雜交。所述異源引物的3′端堿基相應(yīng)于所述異源序列位點(diǎn)的多態(tài)性堿基，這樣只有在異源引物的3′端與所述單鏈核酸雜交時(shí)才發(fā)生延伸。所述同源引物能與同一核酸分子在5′異源序列位點(diǎn)的5′端位置雜交。引物與核酸分子雜交，并延伸異源引物，以便復(fù)制位于引物之間的核酸分子的5′異源序列位點(diǎn)。將核酸分子和延伸的異源引物變性，并分離和分析異源引物，確定5′異源序列位點(diǎn)。利用這種信息鑒定新的一套含有異源引物和同源引物的核酸引物，該新的一套引物的異源引物能與5′異源序列位點(diǎn)雜交(該異源引物的3′端堿基相應(yīng)于多態(tài)性堿基)，所述5′異源序列位點(diǎn)位于同一核酸分子上另一個(gè)異源序列位點(diǎn)的3′端，該新的一套引物的同源引物能與位同一核酸分子于另一個(gè)異源序列位點(diǎn)的5′端的位置雜交。重復(fù)前面的步驟，以下每一輪雜交/延伸中使用一套新的引物，直到鑒定出足夠量的用來(lái)鑒定等位基因的核酸分子上的異源序列位點(diǎn)?？梢杂眠@種方式測(cè)定核酸分子的單元型。
如圖6A-6F所示，本發(fā)明還涉及鑒定核酸分子中多個(gè)等位基因的方法。如圖6A所示，該方法包括，向一組小珠加入含有多個(gè)等位基因的核酸樣品，每個(gè)小珠連接有兩個(gè)不同的引物，各小珠上的至少一個(gè)引物是對(duì)一種獨(dú)特等位基因的引物。然后如圖6B所示，使該核酸反應(yīng)，以便使獨(dú)特等位基因的至少一種引物與該核酸樣品的一部分雜交。使雜交的引物擴(kuò)增，以延伸雜交的引物，產(chǎn)生延伸的引物核酸，如圖6C所示。參見(jiàn)圖6D，然后將雜交的核酸樣品和引物變性，從小珠上除去核酸樣品。延伸的引物然后與小珠上的第二種引物雜交(6E)，并擴(kuò)增該第二種引物(6F)。然后對(duì)含有雙重?cái)U(kuò)增引物的小珠進(jìn)行分析，確定核酸樣品中存在的等位基因。為了容易從小珠上去除引物，引物可以具有裂解位點(diǎn)。
本發(fā)明還涉及用于實(shí)施本發(fā)明所述方法的試劑盒。在大多數(shù)基礎(chǔ)實(shí)施方案中，本發(fā)明的試劑盒包含關(guān)于實(shí)施上述方法的說(shuō)明。另外，試劑盒可以含有至少一種或幾種本發(fā)明方法中使用的必要的試劑，例如一套或幾套位點(diǎn)特異性擴(kuò)增引物、聚合酶鏈反應(yīng)緩沖劑、雙脫氧核苷酸(其中一種或多種是根據(jù)需要被標(biāo)記的)、核酸擴(kuò)增試劑、產(chǎn)生單鏈核酸片段所用試劑、一種或多種異源序列位點(diǎn)特異性引物(根據(jù)需要與至少一種檢測(cè)分子偶聯(lián))、一種或多種連接引物、用于連接鄰近雜交引物的試劑、包含一種或多種檢測(cè)分子的小珠和一個(gè)或多個(gè)無(wú)菌微管。
從下面的實(shí)施例會(huì)更好地理解本發(fā)明。但是，本領(lǐng)域技術(shù)人員容易理解，所討論的具體方法和結(jié)果只是為了詳細(xì)說(shuō)明本發(fā)明而不是要限制本發(fā)明。
實(shí)施例本實(shí)施例涉及應(yīng)用三種策略來(lái)驗(yàn)證不同等位基因的捕獲，所述不同的等位基因與HLA基因中特定的多態(tài)性有關(guān)i)雜交；ii)單堿基延伸；和iii)連接。
使用這些條件的每一種作為建立一項(xiàng)有助于鑒定合適的等位基因、從而鑒定與該等位基因有關(guān)的特定多態(tài)性的測(cè)試方法的試驗(yàn)。后兩種方法是以酶為基礎(chǔ)的測(cè)試，要求使用Taq連接酶和Thermus測(cè)序酶，利用這些酶區(qū)別單鏈DNA上特定位點(diǎn)單個(gè)核苷酸差異的能力。已觀察到，這些方法對(duì)分辨所研究的特定等位基因中的單核苷酸多態(tài)性或突變足夠靈敏。
1.A.雜交一種檢測(cè)方法是捕獲的特異靶物與寡核苷酸偶聯(lián)的微球雜交，并且分析該復(fù)合體。如下所述進(jìn)行反應(yīng)。對(duì)要捕獲的等位基因進(jìn)行兩輪雜交。第一輪雜交使用不同的純合DNA和雜合DNA以及識(shí)別特定序列的特異寡核苷酸偶聯(lián)小珠。第二輪雜交使用另一套識(shí)別靶物中特異序列的小珠，證實(shí)捕獲的等位基因的存在。但是，開(kāi)始先進(jìn)行單輪雜交作為測(cè)定寡核苷酸偶聯(lián)微球?qū)Π形镏胁煌任换虻奶禺愋缘膶?duì)照實(shí)驗(yàn)。
使用從UCLA登記處獲得的各種基因組DNA樣品(UCLA 210，UCLA 230和UCLA 243)，使用有義引物5′A200A和反義引物3′A322-1擴(kuò)增HLA-A基因座的158 bp DNA片段。對(duì)于該實(shí)施例，應(yīng)用標(biāo)準(zhǔn)擴(kuò)增方法制備該158 bp片段。在該實(shí)施例中用來(lái)擴(kuò)增純合DNA和雜合DNA的引物是5′A200A 5′-ACA GCG ACG CCG CGA GCC A-3′，位置182-200，有義引物3′A322-1 5′-CCTCGCTCTGGTTGTAGTA-3′，位置322-340，反義引物通過(guò)不對(duì)稱(chēng)PCR制備用于連接、單堿基延伸或雜交的單鏈DNA(ss)。除了加入的有義引物濃度比反義引物低50倍之外，不對(duì)稱(chēng)PCR的條件如上所述。反義引物是生物素化的，產(chǎn)生5′端生物素標(biāo)記的單鏈PCR片段。
或者，使用5′-3′外切酶、T7基因6外切酶制備ssDNA。在這種情況下，在寡核苷酸合成期間通過(guò)在PCR引物的5′端引入4硫代磷酸酯鍵來(lái)保護(hù)目的鏈。T7外切酶將引物的5′端不包含硫代磷酸酯堿基的鏈降解1.B.單堿基延伸反應(yīng)(SBER)該實(shí)施例中單堿基延伸反應(yīng)(SBER)使用延伸引物，設(shè)計(jì)該引物使其3′端在鄰近多態(tài)性堿基處退火。該實(shí)施例的延伸方法使用Thermo測(cè)序酶或者Klenow大片段聚合酶，分別在循環(huán)或非循環(huán)反應(yīng)中引入多態(tài)性堿基。
使用單堿基延伸反應(yīng)試圖捕獲特異等位基因；使用引物混合物(PM)H001和H002進(jìn)行等位基因特異性PCR(ASPCR)。使用這兩個(gè)引物混合物在多態(tài)性位點(diǎn)引入特定堿基。兩個(gè)PM使用共同的5′引物(agcgacgccgcgagcca)，但是使用等位基因特異性3′引物。使用雜合DNA時(shí)，PM H001在相應(yīng)的多態(tài)性位點(diǎn)處特異性引入″C″(ccaagagcgcaggtcctcg)堿基，而PM H002特異性地引入″A″(ccaagagcgcaggtcctct)。
如上所述進(jìn)行延伸反應(yīng)。來(lái)自延伸反應(yīng)的產(chǎn)物被純化并且與鏈霉抗生物素蛋白磁珠結(jié)合。鏈霉抗生物素蛋白對(duì)生物素的高結(jié)合親和性使得生物素標(biāo)記的靶物分子的分離快速而有效。將復(fù)合體洗滌數(shù)次，以減小任何非結(jié)合標(biāo)記的可能性，該非結(jié)合標(biāo)記是可能影響實(shí)驗(yàn)的下一步反應(yīng)的因素。
對(duì)多種不同的樣品進(jìn)行試驗(yàn)，以通過(guò)ASPCR驗(yàn)證捕獲的等位基因。使用PMH001和H002進(jìn)行5次ASPCR。典型的延伸反應(yīng)方法的實(shí)驗(yàn)條件和陰性對(duì)照如下延伸反應(yīng)中使用的實(shí)驗(yàn)樣品是生物素化的A或C。假設(shè)測(cè)序酶會(huì)正確地引入特定堿基，因此來(lái)自捕獲的特異等位基因的正確信號(hào)將會(huì)在使用引物混合物的基礎(chǔ)上被檢測(cè)。兩個(gè)陰性對(duì)照和SBER中實(shí)驗(yàn)樣品具有相同的成分，只是從反應(yīng)中取消了ddNTPs A或C。另一個(gè)陰性對(duì)照只使用沒(méi)有標(biāo)記的ddNTPs A、C、G和T。使用引物混合物H001和H002，通過(guò)ASPCR驗(yàn)證下面各組反應(yīng)的上清液。測(cè)試的上清液分如下5組延伸之后、延伸產(chǎn)物與磁珠結(jié)合之后、洗滌數(shù)次之后、和高溫下從磁珠洗脫產(chǎn)物之后。
循環(huán)反應(yīng)每20μl反應(yīng)使用100ng HLA A基因座的單鏈(ss)DNA，如上所述對(duì)基因組DNA PCR擴(kuò)增后獲得該單鏈DNA；向反應(yīng)混合物加入2μM延伸引物、125nM各沒(méi)有標(biāo)記的雙脫氧終止子(ddG、T、A或C)、和500nM的生物素-標(biāo)記的ddNTP(A或者C，取決于要在多態(tài)性位點(diǎn)引入的特異堿基)、10X酶反應(yīng)緩沖劑(稀釋至1X的終濃度)和5單位的測(cè)序酶。反應(yīng)在94℃下進(jìn)行1分鐘，接著進(jìn)行40個(gè)循環(huán)的94℃10秒和60℃30秒。在72℃10分鐘進(jìn)行最終的延伸循環(huán)，并在4℃下保持，此為本實(shí)施例中的延伸反應(yīng)。
非循環(huán)反應(yīng)當(dāng)使用Klenow大片段聚合酶反應(yīng)進(jìn)行延伸時(shí)，第一步要求延伸引物與單鏈DNA雜交。100ng的ssDNA與20μM的延伸引物退火。引物和DNA在90℃下混合5分鐘，然后緩慢冷卻到室溫，這樣生成雜交物。該過(guò)程持續(xù)大約1小時(shí)。下一步包括加入特異性沒(méi)有標(biāo)記的和標(biāo)記的生物素ddNTPs(1.5μM)和5U Klenow大片段，并在37℃下溫育30分鐘。延伸結(jié)束后，向反應(yīng)混合物中加入1.5μl的0.5M EDTA。
使用QIAQUICK柱(Qiagen)純化延伸產(chǎn)物(循環(huán)或非循環(huán)的)，去除沒(méi)有被摻入的生物素。將10μl鏈霉抗生物素蛋白包被的磁珠(于2X結(jié)合緩沖液10mM Tris pH7.5，1mM EDTA，2.0mM NaCl中)與20μl純化的延伸產(chǎn)物在室溫下混合20分鐘。對(duì)磁珠施加磁場(chǎng)，棄除沒(méi)有結(jié)合的延伸產(chǎn)物。用1ml相同的結(jié)合緩沖液將磁珠洗滌至少兩次，通過(guò)在95℃下加熱2分鐘將目的鏈從磁珠上洗脫下來(lái)。
然后使用特異引物對(duì)洗脫的鏈進(jìn)行等位基因特異性PCR(ASPCR)來(lái)證實(shí)特異性等位基因的多態(tài)性。同時(shí)進(jìn)行合適的對(duì)照實(shí)驗(yàn)以驗(yàn)證該結(jié)果。
1.C.連接方法該實(shí)施例涉及利用在與單鏈DNA模板退火之前兩種引物之間的連接。本實(shí)施例的實(shí)施是基于這樣的理解與ssDNA完全匹配的兩種引物的連接會(huì)生成強(qiáng)的雙螺旋，因此可耐受較高溫度洗滌(高于各引物的Tm)。而錯(cuò)配模板將難以耐受高于引物Tm的溫度洗滌，因此其本身會(huì)從雙螺旋游離出來(lái)并且最終被洗掉。
使兩種引物彼此鄰近，其中一種引物是等位基因特異性或異源序列引物，其在3′端有一個(gè)多態(tài)性位點(diǎn)，在5′端有一個(gè)生物素標(biāo)記。第二種引物是連接引物，其在5′端有一個(gè)介導(dǎo)連接的磷酸基團(tuán)。假設(shè)兩種引物在與ssDNA模板雜交之前被連接在一起，但是本發(fā)明方法不依賴(lài)于該假設(shè)。20μl反應(yīng)混合物含有10μl(100ng)特異ssDNA、1μl各種引物(1μM)、2μl 10X連接緩沖液和10U Taq連接酶。
混合物在熱循環(huán)儀中在90℃下加熱2分鐘，接著在37℃下溫育30分鐘，此時(shí)通過(guò)加入EDTA終止反應(yīng)。使用QIAQUICK柱純化混合物，去除所有的沒(méi)有結(jié)合的引物和生物素，它們是等位基因特異性PCR反應(yīng)中的非特異性因素。
如上所述，純化的復(fù)合體與鏈霉抗生物素蛋白包被的磁珠結(jié)合。在高嚴(yán)格洗滌條件下洗滌復(fù)合體。通過(guò)提高洗滌緩沖液的溫度(55-95℃)控制洗滌的嚴(yán)格性，以便達(dá)到分離等位基因特異性DNA片段的閾值溫度。利用識(shí)別所捕獲等位基因的多態(tài)性位點(diǎn)的引物，通過(guò)等位基因特異性PCR，進(jìn)一步驗(yàn)證洗脫的模板。
2.單元型測(cè)定的雜交方法HLA A基因座特異性多態(tài)性的不同寡核苷酸與用于雜交方法的不同組的小珠(Luminex)偶聯(lián)。選擇與寡核苷酸偶聯(lián)小珠雜交的模板，以提供完全的序列同源性。根據(jù)廠商說(shuō)明(Luminex Corp.)進(jìn)行小珠與特異性寡核苷酸的偶聯(lián)。Luminex小珠-探針偶聯(lián)物與上面制備的PCR片段雜交。用于分離等位基因特異性PCR片段的探針序列是L5′A107A1AGGTATTTCTACACCTCCGTGL5′A107C1AGGTATTTCTCCACATCCGTG洗掉沒(méi)有雜交的PCR模板，并從Luminex小珠上洗脫與5′A107A或5′A107C特異性雜交的PCR片段。有和沒(méi)有間隔區(qū)(即寡核苷酸序列中間含有另外20個(gè)隨機(jī)堿基)的不同大小的寡核苷酸，與不同的小珠組偶聯(lián)，并與不同的模板雜交，測(cè)定不同等位基因的特異性。引物標(biāo)識(shí)中的數(shù)字與小珠上偶聯(lián)的不同寡核苷酸相關(guān)聯(lián)，并且表明特異性等位基因的多態(tài)性位點(diǎn)。例如，107 A或C表示多態(tài)性位點(diǎn)在107位堿基處，其中每個(gè)等位基因在107位有一個(gè)A或者C。
雜交反應(yīng)程序如下17μl的ssDNA在95℃下變性5分鐘，接著加入33μl特異性寡核苷酸偶聯(lián)的小珠(5000小珠/每種寡核苷酸)(與模板互補(bǔ))，并在55℃下溫育30分鐘。當(dāng)使用有間隔區(qū)的寡核苷酸時(shí)，雜交溫度提高至65℃，以保證特異性。將小珠混合物充分渦流混合并超聲處理，在加入ssDNA之前升至要求的雜交溫度。雜交之后，將混合物在2000xg下離心；用1.5X TMAC(3M TMAC，0.1％SDS，50mM Tris-Cl，pH8.0，4mM EDTA pH8.0)洗滌兩次，每次用1ml，棄除上清液。
向復(fù)合體加入20μl的H2O，在95℃下洗脫與寡核苷酸偶聯(lián)磁珠結(jié)合的捕獲模板5分鐘。對(duì)1μl洗脫的模板進(jìn)行不對(duì)稱(chēng)PCR，獲得更大豐度的洗脫模板，用于第二輪雜交。
用與捕獲模板互補(bǔ)的第二套小珠進(jìn)行第二輪雜交，作為驗(yàn)證模板準(zhǔn)確性的試驗(yàn)。向各試管加入120ng鏈霉抗生物素蛋白-藻紅蛋白(SA-PE)并在雜交溫度下再溫育5分鐘之后，在Luminex 100流式細(xì)胞儀上測(cè)定樣品。獲得的熒光信號(hào)量是生物素與SA-PE相互反應(yīng)的真實(shí)表現(xiàn)。該方法是一種定量測(cè)試方法，陽(yáng)性信號(hào)的量以對(duì)于給定反應(yīng)獲得的最大數(shù)目表示。
第二輪雜交使用的其它等位基因-特異性Luminex小珠-探針如下用于證實(shí)等位基因特異性分離的Luminex小珠-探針L5′A107A1AGGTATTTCTACACCTCCGTGL5′A107C1AGGTATTTCTCCACATCCGTGL5′A153A1CTTCATCGCAGTGGGCTACL5′A153C1CTTCATCGCCGTGGGCTACL5′A249T1GCAGGAGGGTCCGGAGTATL5′A249G1GCAGGAGGGGCCGGAGTATL5′A291C1GAAGGCCCACTCACAGACTL5′A291G1GAAGGCCCAGTCACAGACT
表1.預(yù)期的雜交之后等位基因特異性反應(yīng)模式

表2.觀察到的雜交之后等位基因特異性反應(yīng)模式

表3.使用陰性對(duì)照觀察到的雜交之后等位基因特異性反應(yīng)模式

上面表中的結(jié)果證明了成功的等位基因特異性雜交，因?yàn)榈任换蛱禺愋詳?shù)目比非等位基因特異性反應(yīng)的大。
正如本領(lǐng)域技術(shù)人員明理解的，對(duì)于任何和所有的目的，特別是就提供書(shū)面描述來(lái)說(shuō)，這里公開(kāi)的所有的范圍包括任何和所有可能的次級(jí)范圍及其組合。容易理解，所有列出的范圍是對(duì)相同范圍分為至少相等的一半、三分之一、四分之一、五分之一、十分之一等的充分公開(kāi)和描述。作為非限制性例子，這里討論的各范圍容易分為下三分之一、中間的三分之一和上三分之一等。本領(lǐng)域技術(shù)人員還明白，所有例如″至多″、″至少″、″大于″、″小于″等描述是指可以如上所述接著分成次級(jí)范圍的范圍。
盡管只是描述了幾個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案，本領(lǐng)域普通技術(shù)人員明白可以修飾和改變?cè)搶?shí)施方案而不脫離本發(fā)明中心精神和范圍。因此，上面描述的優(yōu)選的實(shí)施方案在所有的方面均為舉例說(shuō)明而不是限制本發(fā)明的范圍，本發(fā)明的范圍由權(quán)利要求書(shū)指明，而不是由前面的說(shuō)明書(shū)限定，而且落在權(quán)利要求含義之內(nèi)和等同范圍之內(nèi)的所有變化都包含在本發(fā)明范圍內(nèi)。
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權(quán)利要求
1.一種分離帶有特定等位基因的核酸分子的方法，包括(a)將包含異源序列位點(diǎn)的核酸與至少一種對(duì)該異源序列位點(diǎn)特異的核酸引物雜交，生成雜交的核酸序列，其中所述至少一種特異性核酸引物只有當(dāng)其與該異源序列位點(diǎn)雜交時(shí)才能延伸；(b)將雜交的核酸序列置于允許所述至少一種核酸引物延伸的條件下；和(c)將沒(méi)有雜交的核酸序列和沒(méi)有經(jīng)歷延伸的核酸引物與所述進(jìn)行了核酸序列延伸的雜交的核酸序列分離。
2.權(quán)利要求1的方法，其中所述至少一種核酸引物的3′端相應(yīng)于所述異源序列位點(diǎn)中的多態(tài)性堿基的位置，并且所述核酸引物只有在所述至少一種核酸引物的3′端與所述異源序列位點(diǎn)中所述多態(tài)性堿基互補(bǔ)和雜交時(shí)才能進(jìn)行延伸。
3.權(quán)利要求2的方法，其中一種引物或一種延伸引物用檢測(cè)分子標(biāo)記，并且(d)該方法進(jìn)一步包括利用檢測(cè)分子分離所述經(jīng)過(guò)延伸的雜交的核酸序列。
4.權(quán)利要求1的方法，進(jìn)一步包括(d)在與所述至少一種核酸引物雜交之前擴(kuò)增所述包含異源序列位點(diǎn)的核酸分子；和(e)鑒定所述異源序列位點(diǎn)。
5.權(quán)利要求1的方法，其中所述異源序列位點(diǎn)包括單核苷酸多態(tài)性。
6.一種用于分離帶有特定等位基因的核酸分子的試劑盒，該試劑盒包括關(guān)于實(shí)施權(quán)利要求1的方法的說(shuō)明。
7.一種分離帶有特定等位基因的核酸分子的方法，包括(a)將包含一個(gè)或多個(gè)異源序列位點(diǎn)的核酸與至少一種對(duì)所述異源序列位點(diǎn)特異的核酸引物和一種連接引物雜交，生成雜交的核酸序列，其中所述至少一種核酸引物的3′端相應(yīng)于所述異源序列位點(diǎn)中多態(tài)性堿基的位置，而連接引物的5′端鄰近所述至少一種核酸引物的3′端；(b)將所述至少一種核酸引物和連接引物置于允許所述至少一種核酸引物和所述連接引物連接的條件下；和(c)分離其中引物已連接的雜交的核酸序列。
8.權(quán)利要求7的方法，其中所述至少一種核酸引物和連接引物中的一種用檢測(cè)分子標(biāo)記，并且(c)該方法進(jìn)一步包括利用檢測(cè)分子分離經(jīng)過(guò)延伸的雜交的核酸序列。
9.權(quán)利要求8的方法，其中所述至少一種核酸引物包括多個(gè)具有不同序列的引物，并且各序列與特定檢測(cè)分子結(jié)合，以至于沒(méi)有兩個(gè)序列與相同的檢測(cè)分子結(jié)合。
10.一種用于分離帶有特定等位基因的核酸分子的試劑盒，該試劑盒包括關(guān)于實(shí)施權(quán)利要求7的方法的說(shuō)明。
11.一種分離帶有一個(gè)特定等位基因的核酸分子的方法，包括(a)將包含一個(gè)或多個(gè)異源序列位點(diǎn)的核酸與至少一種對(duì)所述異源序列位點(diǎn)特異的核酸引物雜交，生成雜交的核酸復(fù)合體；和(b)將沒(méi)有完全互補(bǔ)雜交的雜交核酸復(fù)合體與完全互補(bǔ)雜交的雜交核酸復(fù)合體分離。
12.權(quán)利要求11的方法，進(jìn)一步包括測(cè)定所述含有一個(gè)或多個(gè)異源序列位點(diǎn)的核酸的序列。
13.權(quán)利要求11的方法，其中步驟(b)包括將雜交的核酸復(fù)合體加熱至所述不完全互補(bǔ)雜交的核酸復(fù)合體發(fā)生解離，而完全互補(bǔ)雜交的核酸復(fù)合體不發(fā)生解離的溫度。
14.權(quán)利要求11的方法，其中所述至少一種核酸引物是用檢測(cè)分子標(biāo)記的。
15.一種用于分離帶有特定等位基因的核酸分子的試劑盒，該試劑盒包括關(guān)于實(shí)施權(quán)利要求11的方法的說(shuō)明。
16.一種分離帶有特定等位基因的核酸分子的方法，包括(a)將包含至少一個(gè)5′端異源序列位點(diǎn)和一個(gè)3′端異源序列位點(diǎn)的核酸與對(duì)所述3′端異源序列位點(diǎn)特異的一種異源引物和一種同源引物雜交，生成雜交的核酸序列，其中所述異源引物的3′端相應(yīng)于所述3′端異源序列位點(diǎn)中多態(tài)性堿基的位置，而所述同源引物能在位于5′端異源序列位點(diǎn)的5′端的位置處與該核酸雜交，所述異源引物只有在所述異源引物的3′端與所述3′端異源序列位點(diǎn)中所述多態(tài)性堿基互補(bǔ)和雜交時(shí)才能進(jìn)行延伸；(b)延伸所述雜交的異源引物，以產(chǎn)生異源引物和同源引物之間的核酸序列，其包含5′端異源序列位點(diǎn)；和(c)測(cè)定5′端異源序列位點(diǎn)的性質(zhì)。
17.權(quán)利要求16的方法，進(jìn)一步包括(d)利用5′端異源序列位點(diǎn)的性質(zhì)，制備另一種異源引物和另一種同源引物，其中所述另一種異源引物的3′端相應(yīng)于所述5′端異源序列位點(diǎn)中多態(tài)性堿基的位置，所述5′端異源序列位于另一個(gè)5′端異源序列的3′端，所述同源引物能在位于另一個(gè)5′端異源序列位點(diǎn)的5′端位置處與該核酸雜交，所述異源引物只有在所述異源引物的3′端與所述5′端異源序列位點(diǎn)中所述多態(tài)性堿基互補(bǔ)和雜交時(shí)才能進(jìn)行延伸；(e)將核酸序列與所述另一種異源引物和所述另一種同源引物雜交；并且(f)將步驟(a)至(e)重復(fù)一次或多次。
18.權(quán)利要求16的方法，進(jìn)一步包括確定所述核酸分子的單元型。
19.一種用于分離帶有特定等位基因的核酸分子的試劑盒，該試劑盒包括關(guān)于實(shí)施權(quán)利要求16的方法的說(shuō)明。
20.一種鑒定核酸分子中等位基因的方法，包括(a)將包含多個(gè)異源序列位點(diǎn)的核酸與至少一種引物雜交，產(chǎn)生雜交的核酸，其中所述至少一種引物與小珠連接；(b)將所述雜交的引物延伸，產(chǎn)生延伸的引物；(c)將核酸與延伸的引物解離；(d)將延伸的引物和與小珠連接的第二種引物雜交；(e)將所述第二引物延伸，產(chǎn)生第二種延伸引物；和(f)用所述延伸引物、第二種延伸引物或者兩者，鑒定核酸的異源序列位點(diǎn)。
21.一種用于鑒定核酸分子中等位基因的方法，該方法包括關(guān)于實(shí)施權(quán)利要求20的方法的說(shuō)明。
全文摘要
本發(fā)明提供分離和鑒定基因組DNA樣品中的等位基因，從而分離和鑒定單元型的方法和試劑盒。該方法通常涉及使對(duì)等位基因中的多態(tài)性位點(diǎn)特異的引物與該DNA樣品雜交，將引物延伸一個(gè)或多個(gè)核酸，分離延伸的引物，并且利用延伸的引物鑒定等位基因。該方法還可以進(jìn)行兩個(gè)引物的連接，它們的分離以及接著在鑒定目標(biāo)等位基因中的應(yīng)用。該方法中還可以使用另一種引物作為延伸第一引物的封閉位點(diǎn)，以便復(fù)制和鑒定包含多態(tài)性位點(diǎn)的DNA片段。可以對(duì)延伸或沒(méi)有延伸的引物進(jìn)行標(biāo)記，使得引物容易被分離和/或鑒定。
文檔編號(hào)G01N33/53GK1501982SQ01818367
公開(kāi)日2004年6月2日 申請(qǐng)日期2001年8月30日 優(yōu)先權(quán)日2000年8月30日
發(fā)明者劉向軍 申請(qǐng)人:哈普洛根有限責(zé)任公司