專利名稱：展青霉素免疫層析檢測試紙的制作方法與應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于生物技術(shù)領(lǐng)域，公開了一種展青霉素免疫層析檢測試紙的制作方法與應(yīng)用。
背景技術(shù)：
展青霉素Patulin，PAT是由真菌產(chǎn)生的一種有毒代謝產(chǎn)物，由Glister在1941首先發(fā)現(xiàn)并分離純化。實驗發(fā)現(xiàn)展青霉素是一種廣譜抗生素，但隨后的研究證實它對實驗動物有較強的毒性。從此對展青霉素的研究轉(zhuǎn)移到其毒性及對食品和飼料的污染上。
真菌中共3個屬16種，如擴張青霉、展青霉、棒型青霉、土壤青霉等，能產(chǎn)生展青霉素，調(diào)查發(fā)現(xiàn)一些展青霉素的產(chǎn)生菌在自然界分布廣泛，經(jīng)常引起蘋果、山楂等水果霉?fàn)€、大米和飼料等的霉變。宋家玉等在1995對山東省蘋果和山楂及其制品進行展青霉素檢測，爛蘋果展青霉素的污染率為40％，而且距霉?fàn)€部1cm處取樣展青霉素平均含量為329μg/kg，蘋果制品污染率為70％，陽性樣品平均含量為80.6μg/kg。我國國家標(biāo)準G B 14974-94《蘋果和山楂制品中展青霉素限量衛(wèi)生標(biāo)準》規(guī)定的展青霉毒素最大限量水果半成品的原汁、果醬為100μg/kg，果汁、果醬、果酒、罐頭、山楂條、餅為50μg/kg。
展青毒素具有強烈的神經(jīng)毒，奶牛中毒時出現(xiàn)上行神經(jīng)麻痹、中樞神經(jīng)系統(tǒng)水腫及灶性出血；小鼠則出現(xiàn)皮下水腫、腹腔和胸腔積液，腎瘀血及變性、肺水腫、呼吸困難、尿量減少；小鼠反復(fù)皮下注射展青霉素可產(chǎn)生局部肉瘤；并且有致畸性、致突變作用。
目前真菌毒素檢測的方法可分為兩類。一類為色譜分析法，包括薄層色譜法TLC、氣相色譜法GC、高效液相色譜法HPLC等。70年代首先建立了薄層液相色譜法TLC檢測展青霉素。目前我國GB 14974-1994蘋果和山楂制品中展青霉素國標(biāo)檢測方法采用薄層色譜法TLC。但TLC對于展青霉素與羥甲基糠醛HMF的分離效果不好，只能半定量，且靈敏度不高20μg/L，因此很快被高效液相色譜法HPLC取代。之后氣相色譜法GC、氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)機法GC-MS也相繼建立。但這些方法都需要較昂貴的設(shè)備，因此推廣使用受到一定的限制。另一類是免疫化學(xué)方法。該方法對樣品的純度要求不高，并具有較高的靈敏度和特異性，適合于大批量樣本的檢測。近年來被廣泛應(yīng)用于各種真菌毒素的檢測。這類方法包括放射免疫分析法RIA和酶聯(lián)免疫分析法ELISA等。RIA方法盡管具有較高的靈敏度，但由于使用了對人體有害的放射性物質(zhì)，無法推廣使用。ELISA方法由于操作簡單、使用安全而被普遍采用。但目前未檢索到展青霉素免疫化學(xué)檢測方法的報道。
免疫層析技術(shù)目前已廣泛應(yīng)用于臨床醫(yī)療檢測中。國內(nèi)外現(xiàn)有的商品供應(yīng)及文獻報道的檢測項目主要包括以下方面違禁藥物檢測，如苯丙胺、可卡因、大麻、嗎啡、海洛因等、傳染病病原檢測，如梅毒螺旋體、淋球菌、泌尿生殖系沙眼衣原體、幽門螺桿菌等、激素檢測、寄生蟲、腫瘤標(biāo)記物、心血管病檢測標(biāo)志物等。免疫層析技術(shù)用于檢測展青霉素目前尚未見報道。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的在于提供一種展青霉素免疫層析檢測試紙的制作方法。
本發(fā)明的另一目的在于應(yīng)用該檢測試紙。
本發(fā)明的技術(shù)方案為一種展青霉素免疫層析檢測試紙，包括襯墊，樣品墊，示蹤粒子結(jié)合物墊，硝酸纖維素膜，吸水墊，檢測線，質(zhì)控線；在襯墊上按順序有樣品墊，示蹤粒子結(jié)合物墊，硝酸纖維素膜，吸水墊；示蹤粒子結(jié)合物墊上有示蹤粒子標(biāo)記的抗展青霉素的抗體，硝酸纖維素膜上還設(shè)有檢測線和質(zhì)控線，檢測線上有展青霉素檢測抗原，質(zhì)控線上有抗抗體，其中抗抗體是抗展青霉素的抗體的抗體。
一種展青霉素免疫層析檢測試紙的制作方法示蹤粒子標(biāo)記為如下任意一種膠體金顆粒；乳膠顆粒；膠體硒顆粒；明膠顆粒；磁性顆粒。
檢測原理是這樣的在樣品墊上滴加樣品，如果樣品中有展青霉素，則展青霉素經(jīng)層析作用移動到示蹤粒子結(jié)合物墊，與限量的抗展青霉素的抗體結(jié)合，當(dāng)移動到檢測線時，示蹤粒子標(biāo)記的抗展青霉素的抗體已無多余的結(jié)合位點與檢測線上的檢測抗原結(jié)合，檢測線不顯色或不出現(xiàn)磁性增強。示蹤粒子標(biāo)記的抗展青霉素的抗體繼續(xù)向前移動到質(zhì)控線，與質(zhì)控線上的抗抗體反應(yīng)，質(zhì)控線顯色或出現(xiàn)磁性增強。若樣品中無展青霉素，則示蹤粒子結(jié)合物墊上的示蹤粒子標(biāo)記的抗展青霉素的抗體和檢測線上的檢測抗原結(jié)合，檢測線顯色或出現(xiàn)磁性增強，質(zhì)控線顯色或出現(xiàn)磁性增強。
一種展青霉素免疫層析檢測試紙的制作方法包括如下步驟，(A)展青霉素抗原的制備，包括多克隆抗體或單克隆抗體的免疫抗原和展青霉素檢測抗原的制備；(B)硝酸纖維素膜的檢測線和質(zhì)控線的制備；(C)示蹤粒子結(jié)合物墊的制備；(D)組裝試紙條。
一種展青霉素免疫層析檢測試紙的制作方法展青霉素抗原的制備，包括如下步驟(A)展青霉素通過戊二酸酐法使其羥基與戊二酸羧基以酯鍵相連，形成新的化合物。(B)該化合物再次通過活性酯法與高分子量載體物質(zhì)的蛋白質(zhì)、多糖、多核苷酸、多聚賴氨酸、多聚苯乙烯或其它人工合成的高分子量物質(zhì)相連形成人工抗原；(C)選擇展青霉素抗原的一種作為免疫抗原。(D)選擇展青霉素抗原的一種作為檢測抗原。
一種展青霉素免疫層析檢測試紙的制作方法硝酸纖維素膜的檢測線和質(zhì)控線的制備，包括如下步驟(A)用展青霉素檢測抗原在硝酸纖維素膜上線狀點樣制備一條檢測線；(B)用抗抗體在硝酸纖維素膜上進行線狀點樣制備一條質(zhì)控線。
一種展青霉素免疫層析檢測試紙的制作方法檢測線和質(zhì)控線是這樣制備的將硝酸纖維素膜按10-35mm寬的尺寸剪裁；將經(jīng)生理鹽水緩沖液充分透析，濃度調(diào)整為0.01-5mg/mL的展青霉素檢測抗原在膜上線狀點樣作為檢測線，檢測線點樣位置離膜底邊4-16mm，然后在膜的頂端用濃度調(diào)整為0.01-5mg/mL的抗抗體噴涂質(zhì)控線，硝酸纖維素膜4室溫干燥30分鐘，置于0.1-5％脫脂奶粉的生理鹽水中浸泡30分鐘，取出吸干水分，于37℃孵育30分鐘，置室溫下干燥處密封儲藏。
一種展青霉素免疫層析檢測試紙的制作方法示蹤粒子結(jié)合物墊的制備包括如下步驟(A)用示蹤粒子標(biāo)記抗展青霉素的抗體，抗體包括IgG型抗體、IgM型抗體、IgA抗體；(B)把示蹤粒子標(biāo)記好的抗展青霉素的抗體分散在硝酸纖維素膜上。
一種展青霉素免疫層析檢測試紙的制作方法制備示蹤粒子結(jié)合物墊的示蹤粒子為如下任意一種膠體金顆粒；乳膠顆粒；膠體硒顆粒；明膠顆粒；磁性顆粒。
一種展青霉素免疫層析檢測試紙的制作方法組裝試紙條，步驟如下在襯墊1上加上有檢測線和質(zhì)控線的硝酸纖維素膜；在襯墊上加上示蹤粒子結(jié)合物墊；在襯墊上加上樣品墊；在襯墊上加上吸水墊；組裝為檢測試紙條。
一種展青霉素免疫層析檢測試紙在檢測展青霉素中的應(yīng)用。
免疫層析法是在免疫化學(xué)基礎(chǔ)上發(fā)展起來的定性測定方法，它往往以條狀纖維層析材料為固相，通過毛細作用使樣品溶液在層析條上泳動，并同時使樣品中的待測物與層析材料上針對待測物的受體，如抗體或抗原，發(fā)生高特異高親和性的免疫反應(yīng)，層析過程中免疫復(fù)合物被富集或截留在層析材料的一定區(qū)域如檢測帶，通過酶反應(yīng)或直接運用可目測的標(biāo)記物，如膠體金，而得到直觀的實驗現(xiàn)象，如顯色。而游離標(biāo)記物則越過檢測帶，達到與結(jié)合標(biāo)記物自動分離之目的。免疫層析技術(shù)常見的示蹤粒子有膠體金，乳膠，膠體硒、明膠等，其中運用最成功的標(biāo)記物為膠體金。
示蹤粒子選用常用的顯色標(biāo)記，當(dāng)檢測線、質(zhì)控線如正常顯色，肉眼可很容易分辨，但儀器分辨磁性顆粒的靈敏度。更高。
本發(fā)明免疫層析技術(shù)檢測展青霉素，測定的原理類似于間接競爭ELISA方法，在玻璃纖維上涂布一定濃度示蹤粒子標(biāo)記的抗展青霉素的抗體，在硝酸纖維膜上分別吸附檢測抗原(由于展青霉素不直接固定于硝酸纖維膜，故需制備展青霉素與載體蛋白質(zhì)的偶聯(lián)物作為檢測抗原)和抗抗體作為檢測線和質(zhì)控線。以塑料底板、吸水濾紙、玻璃纖維和硝酸纖維膜組成檢測試紙夾。樣品加入后，液體沿濾紙向上滲透，若樣品中含有待檢毒素，則會與硝酸纖維膜上的檢測抗原競爭玻璃纖維上的標(biāo)記抗體，當(dāng)毒素含量高時，它們會占據(jù)絕大多數(shù)標(biāo)記抗體的抗原結(jié)合部位，從而阻止標(biāo)記抗體與檢測線上的檢測抗原結(jié)合，因而在檢測線上不顯色。相反，若樣品中不含待檢毒素，標(biāo)記抗體就會與檢測線上的抗原結(jié)合而顯色。質(zhì)控線上的抗抗體則通過富集標(biāo)記抗體而顯色，以證明結(jié)果的可靠性。
展青霉素屬于小分子化合物，只有反應(yīng)原性而無免疫原性，不能刺激機體產(chǎn)生免疫應(yīng)答反應(yīng)，必須和大分子載體偶聯(lián)后制成人工抗原才能激發(fā)有效的免疫反應(yīng)。能否成功地得到對展青霉素有高度親和力、高度特異性的多克隆抗體或單克隆抗體，人工抗原(免疫抗原)的制備尤為重要，需要根據(jù)展青霉素的分子大小、空間構(gòu)像、化學(xué)性質(zhì)等慎重選擇偶聯(lián)方法。偶聯(lián)過程要盡量保持展青霉素結(jié)構(gòu)的完整性，尤其是不能破壞其分子構(gòu)像，因為正是其特殊的三維空間結(jié)構(gòu)，抗原決定簇，與相應(yīng)的淋巴細胞表面的受體相吻合，才能啟動針對它的免疫應(yīng)答。若其構(gòu)像發(fā)生了細微的變化，就有可能導(dǎo)致其抗原改變。另外，只有抗原決定簇與淋巴細胞表面相應(yīng)的受體相接觸，才能啟動免疫應(yīng)答，展青霉素屬小分子化合物，當(dāng)它和載體蛋白質(zhì)直接偶聯(lián)時，不易接近受體，如能在兩者之間加上一個連接側(cè)鏈，將有助于半抗原暴露在外面，形成理想的空間易近性，則效果可能會更好。由于展青霉素分子上具有羥基，本發(fā)明設(shè)計用戊二酸酐法使其羥基與戊二酸羧基以酯鍵相連，形成新的化合物。再通過活性酯法使其與載體蛋白質(zhì)相連，形成一個偶聯(lián)橋，取得了比較理想的效果。
本發(fā)明的優(yōu)點及應(yīng)用范圍本發(fā)明與以往檢測食品、飼料及紅曲制品中展青霉素的技術(shù)相比具有如下優(yōu)點(1)操作簡便、快捷，僅需5-10分鐘；(2)靈敏度高；(3)無需特殊儀器設(shè)備，除商品試劑外不需任何儀器設(shè)備，所耗費用低；特別適合展青霉素的現(xiàn)場快速檢測。(4)無需另外再加底物顯色指示，而直接通過顏色判斷結(jié)果；(5)室溫保存、單份測定，可隨身攜帶。
本發(fā)明屬于免疫生物技術(shù)領(lǐng)域，主要用于展青霉素檢測。本發(fā)明的試紙條的使用單位主要為食品、飼料的加工生產(chǎn)部門、食品衛(wèi)生檢驗部門、產(chǎn)品質(zhì)量監(jiān)督部門等。


圖1為本發(fā)明的展青霉素免疫層析檢測試紙直觀結(jié)構(gòu)示意圖。
圖2為本發(fā)明的展青霉素免疫層析檢測試紙的示蹤粒子結(jié)合物墊局部放大圖。
圖3為本發(fā)明的展青霉素免疫層析檢測試紙的檢測線局部放大圖。
圖4為本發(fā)明的展青霉素免疫層析檢測試紙的質(zhì)控線局部放大圖。
圖5為本發(fā)明的展青霉素免疫層析檢測試紙工作原理示意圖。
具體實施例方式
實施例1
一種展青霉素免疫層析檢測試紙，包括襯墊1，樣品墊2，示蹤粒子結(jié)合物墊3，硝酸纖維素膜4，吸水墊5，檢測線6，質(zhì)控線7，在襯墊1上按順序有樣品墊2，示蹤粒子結(jié)合物墊3，硝酸纖維素膜4，吸水墊5；示蹤粒子結(jié)合物墊3上有示蹤粒子9標(biāo)記的抗展青霉素的抗體10，硝酸纖維素膜4上還設(shè)有檢測線6和質(zhì)控線7，檢測線6上有展青霉素檢測抗原8，質(zhì)控線7上有抗抗體11，其中抗抗體11是抗展青霉素的抗體10的抗體。
檢測原理是這樣的在樣品墊2上滴加樣品12，如果樣品12中有展青霉素，則展青霉素經(jīng)層析作用移動到示蹤粒子結(jié)合物墊3，與限量的抗展青霉素的抗體10結(jié)合，當(dāng)移動到檢測線6時，示蹤粒子9標(biāo)記的抗展青霉素的抗體10已無多余的結(jié)合位點與檢測線6上的檢測抗原8結(jié)合，檢測線6不顯色或不出現(xiàn)磁性增強。示蹤粒子9標(biāo)記的抗展青霉素的抗體10繼續(xù)向前移動到質(zhì)控線7，與質(zhì)控線7上的抗抗體11反應(yīng)，質(zhì)控線7顯色或出現(xiàn)磁性增強。若樣品12中無展青霉素8，則示蹤粒子結(jié)合物墊3上的示蹤粒子9標(biāo)記的抗展青霉素的抗體10和檢測線6上的檢測抗原8結(jié)合，檢測線6顯色或出現(xiàn)磁性增強，質(zhì)控線7顯色或出現(xiàn)磁性增強。
展青霉素免疫層析檢測試紙的制作方法，包括如下步驟，(A)展青霉素抗原的制備，包括多克隆抗體或單克隆抗體的免疫抗原和展青霉素檢測抗原8的制備；(B)硝酸纖維素膜4的檢測線6和質(zhì)控線7的制備；(C)示蹤粒子結(jié)合物墊3的制備；(D)組裝試紙條。
實施例2示蹤粒子9選用膠體金顆粒。其余同實施例1。
實施例3示蹤粒子9選用乳膠顆粒。其余同實施例1。
實施例4示蹤粒子9選用膠體硒顆粒。其余同實施例1。
實施例5示蹤粒子9選用明膠顆粒。其余同實施例1。
實施例6示蹤粒子9選用乳膠顆粒。其余同實施例1。
實施例7示蹤粒子9選用磁性顆粒。其余同實施例1。
在實施例2-7中示蹤粒子9選用常用的顯色標(biāo)記，當(dāng)檢測線6、質(zhì)控線7如正常顯色，肉眼可很容易分辨，但儀器分辨磁性顆粒的靈敏度。更高。
實施例8一種展青霉素免疫層析檢測試紙的制作方法，展青霉素抗原的制備，包括如下步驟(A)展青霉素通過戊二酸酐法使其羥基與戊二酸羧基以酯鍵相連，形成新的化合物。(B)該化合物再次通過活性酯法與高分子量載體物質(zhì)的蛋白質(zhì)、多糖、多核苷酸、多聚賴氨酸、多聚苯乙烯或其它人工合成的高分子量物質(zhì)相連形成人工抗原；(C)選擇展青霉素抗原的一種作為免疫抗原。(D)選擇展青霉素抗原的一種作為檢測抗原。其余同實施例1。
實施例9硝酸纖維素膜4的檢測線6和質(zhì)控線7的制備，包括如下步驟(A)用展青霉素檢測抗原8在硝酸纖維素膜4上線狀點樣制備一條檢測線6；(B)用抗抗體11在硝酸纖維素膜4上進行線狀點樣制備一條質(zhì)控線7。其余同實施例1。
實施例10一種展青霉素免疫層析檢測試紙的制作方法，檢測線6和質(zhì)控線7是這樣制備的將硝酸纖維素膜4按10-35mm寬的尺寸剪裁；將經(jīng)生理鹽水緩沖液充分透析，濃度調(diào)整為0.01-5mg/mL的展青霉素檢測抗原8在膜上線狀點樣作為檢測線6，檢測線6點樣位置離膜底邊4-16mm，然后在膜的頂端用濃度調(diào)整為0.01-5mg/mL的抗抗體11噴涂質(zhì)控線7，硝酸纖維素膜4室溫干燥30分鐘，置于0.1-5％脫脂奶粉的生理鹽水中浸泡30分鐘，取出吸干水分，于37℃孵育30分鐘，置室溫下干燥處密封儲藏。其余同實施例1。
實施例11一種展青霉素免疫層析檢測試紙的制作方法，示蹤粒子結(jié)合物墊3的制備包括如下步驟(A)用示蹤粒子標(biāo)記抗展青霉素的抗體10，抗體10包括IgG型抗體、IgM型抗體、IgA抗體；(B)把示蹤粒子9標(biāo)記好的抗展青霉素的抗體10分散在硝酸纖維素膜4上。其余同實施例1。
實施例12一種展青霉素免疫層析檢測試紙的制作方法，組裝試紙條，步驟如下在襯墊1上加上有檢測線6和質(zhì)控線7的硝酸纖維素膜4；在襯墊1上加上示蹤粒子結(jié)合物墊3；在襯墊1上加上樣品墊2；在襯墊1上加上吸水墊5；組裝為檢測試紙條。其余同實施例1。
實施例13一種免疫層析檢測展青霉素試紙的制備，并將其具體應(yīng)用于具體的檢測。
包括如下步驟(1).展青霉素人工抗原的制備，包括用于免疫動物以制備多克隆抗體或單克隆抗體的免疫抗原和用于制備檢測線的檢測抗原。
(2).硝酸纖維素膜檢測線6和質(zhì)控線7的制備。
①用展青霉素與載體蛋白質(zhì)的偶聯(lián)物作為檢測抗原線狀點樣作為檢測線6。
②用展青霉素的抗體10的抗體線狀點樣作為質(zhì)控線7。
(3).示蹤粒子結(jié)合物墊3的制備將示蹤粒子9標(biāo)記的抗展青霉素的抗體10分散在玻璃纖維上制作示蹤粒子結(jié)合物墊3。
(4).試紙條的組裝①在襯墊1上加上有檢測線6和質(zhì)控線7的硝酸纖維素膜4；②在襯墊1上加上示蹤粒子結(jié)合物墊3；③在襯墊1上加上樣品墊2；④在襯墊1上加上吸水墊5；組裝為檢測試紙條。
(5).待檢樣品的處理。
方案具體可細分為五部分1.展青霉素人工抗原(包括免疫抗原和檢測抗原)的制備，包括如下步驟①將0.5mg展青霉素、7.4mg戊二酸酐和1.6mg4-二甲氨基吡啶溶于200μL無水四氫呋喃中，37℃振蕩反應(yīng)1小時；加100μL酸性蒸餾水(pH2-3)終止反應(yīng)；②12000rpm離心5分鐘去沉淀，上清液抽真空去除四氫呋喃；用300μL氯仿抽提三次；用薄層層析法純化出反應(yīng)產(chǎn)物展青霉素-半戊二酸。
③將純化的展青霉素-半戊二酸溶解于100μL四氫呋喃中，0.6mg氮羥基琥珀酸(NHS)和3.2mg二環(huán)己基碳化二亞胺(DCC)溶解于200μL四氫呋喃中。二者混勻，置室溫避光振蕩反應(yīng)24小時。
④反應(yīng)完全后，12000rpm離心5分鐘去沉淀。上清液真空抽干，溶解于300μL二甲基亞砜中，再加入600μL載體(鑰孔貝血藍蛋白、牛血清白蛋白、卵清白蛋白、甲狀腺球蛋白、人血清白蛋白、多聚賴氨酸、多聚谷氨酸或多聚混合氨酸的一種)溶液中(4mg溶于600μL0.13M NaHCO3中)，室溫下振蕩，避光反應(yīng)2小時。
⑤反應(yīng)結(jié)束后，0.01M PBS(pH7.4)4℃透析72小時，紫外掃描分析測定偶聯(lián)產(chǎn)物的摩爾比，真空凍干待用。
2.硝酸纖維素膜檢測線6和質(zhì)控線7的制備(1)制備檢測線6的展青霉素檢測抗原8的選擇選擇牛血清白蛋白、鑰眼貝血藍蛋白、卵清白蛋白、甲狀腺球蛋白或人血清白蛋白與展青霉素-半戊二酸偶聯(lián)制備的檢測抗原的一種用于制備一條檢測線6；(2)制備質(zhì)控線7的抗抗體11的選擇①選擇展抗青霉素的IgG型、IgM型、IgA型單克隆抗體的抗抗體的一種用于制備一條質(zhì)控線；②選擇展青霉素的多克隆抗體的抗抗體11的一種用于制備一條質(zhì)控線7；(3)硝酸纖維素膜檢測線6和質(zhì)控線7的制備方法將硝酸纖維素膜4按10mm寬的尺寸剪裁；將經(jīng)生理鹽水緩沖液充分透析，濃度調(diào)整為0.01mg/mL的展青霉素檢測抗原8在膜上線狀點樣作為檢測線6，檢測線6點樣位置離膜底邊4mm，然后在膜的頂端用濃度調(diào)整為0.01mg/mL的抗抗體11噴涂質(zhì)控線7，硝酸纖維素膜4室溫干燥30分鐘，置于0.1％脫脂奶粉的生理鹽水中浸泡30分鐘，取出吸干水分，于37℃孵育30分鐘，置室溫下干燥處密封儲藏。
3.示蹤粒子結(jié)合物墊3的制備(1)制備示蹤粒子結(jié)合物墊的示蹤粒子為如下一種①膠體金顆粒②乳膠顆粒③膠體硒顆粒④明膠顆粒⑤磁性顆粒(2)示蹤粒子的制備和標(biāo)記①膠體金溶膠制備標(biāo)記a)膠體金溶膠制備取0.01％四氯化金水溶液200mL，加熱至沸騰，加入1-20mL 1％檸檬酸鈉水溶液，煮沸5分鐘，出現(xiàn)橙紅色，膠體金顆粒直徑由電鏡測定為10-80nm；b)膠體金標(biāo)記抗體取50mL膠體金，用0.1mol/L碳酸鉀調(diào)pH(8.0)，攪拌下將膠體金溶膠和抗體混合，再加入聚乙二醇水溶液，使最終濃度為0.05％。將粗制品6000g離心45分鐘，沉淀用生理鹽水混懸至1.5mL，4℃保存。
②膠體硒溶膠制備和抗體標(biāo)記a)膠體硒溶膠制備在1升容量的四頸圓底燒瓶內(nèi)加入去離子水550mL和聚丙烯酸10g，通氮室溫攪拌并加入水合肼69.5mL，繼續(xù)攪拌20分鐘。亞硒酸9.63g溶解于280mL水，室溫攪拌下滴入反應(yīng)混合液內(nèi)，得到120nm紅色硒溶膠。
b)膠體硒抗體標(biāo)記抗體IgG用20mmol/L pH7.3磷酸鹽緩沖液配成4.6mg/mL濃度溶液，加25ul于pH7.3的25mL硒溶膠中，室溫攪拌10分鐘后加1％PEG8000 1mL，混勻，于4℃以5000rpm離心5分鐘，得到松軟的紅色沉淀，用含0.05％NaN3的磷酸鹽緩沖液配成1mL懸液。
③乳膠的制備和抗體標(biāo)記彩色乳膠顆粒購自Bangs Laboratories公司?？贵w標(biāo)記程序為用pH7.1的磷酸鹽緩沖液將乳膠稀釋到1％濃度，攪拌下加入一定量的IgG溶液，室溫攪拌30分鐘后于37℃水浴孵化60分鐘，4℃放置4-5小時。15000rpm離心30分鐘，用適量磷酸鹽緩沖液重懸。
④磁性顆粒結(jié)合物墊的制備磁性顆粒購自Bangs Laboratories公司。用pH7.1的磷酸鹽緩沖液將磁性顆粒稀釋到1％濃度，分別取50mL，攪拌下將其與抗展青霉素抗體混合，室溫攪拌30分鐘后于37℃水浴孵化60分鐘，4℃放置4-5小時。15000rpm離心30分鐘，用2mL磷酸鹽緩沖液重懸。
(3)示蹤粒子結(jié)合物墊3的制備將標(biāo)記示蹤粒子9的抗體按比例混合分散在厚度為1mm的玻璃纖維紙上，凍干密封干燥保存。
4.試紙條的組裝①在襯墊1上加上有檢測線6和質(zhì)控線7的硝酸纖維素膜4；②在襯墊1上加上示蹤粒子結(jié)合物墊3；③在襯墊1上加上樣品墊2；④在襯墊1上加上吸水墊5；組裝為檢測試紙條。
5.待檢樣品的處理(1)液體樣品處理方法量取等待樣品25mL，置于分液漏斗中，加入等體積的乙酸乙酯，振搖2分鐘，靜置分層，重復(fù)以上步驟兩次，合并有機相，加2.5mL1.5％碳酸鈉振搖1分鐘，靜置分層后，棄去碳酸鈉層，同上步驟再用碳酸鈉處理一次。將提取液濾入100mL梨形瓶中，于40℃水浴上用真空減壓濃縮至近干，用少許氯仿清洗瓶壁，濃縮干，加蒸餾水0.4mL定容備用。
(2)固體和半固體樣品處理方法稱取樣品25g置于乳缽中，加適量無水硫酸鈉研磨后，加至三角瓶中，加80mL乙酸乙酯浸泡30分鐘，振蕩30分鐘，過濾，取濾液50mL，置于分液漏斗中，加入等體積的乙酸乙酯，振搖2分鐘，靜置分層，重復(fù)以上步驟兩次，合并有機相，加2.5mL1.5％碳酸鈉振搖1分鐘，靜置分層后，棄去碳酸鈉層，同上步驟再用碳酸鈉處理一次。將提取液濾入100mL梨形瓶中，于40℃水浴上用真空減壓濃縮至近干，用少許氯仿清洗瓶壁，濃縮干，加蒸餾水0.4mL定容備用。
實施例14膠體金免疫層析檢測展青霉素的方法及試紙的制備并用于檢測固體樣品本實施例分為6部分(1)展青霉素人工抗原8的制備；(2)硝酸纖維素膜4的制備；(3)膠體金結(jié)合物墊的制備；(4)試紙條的組裝；(5)待檢樣品的處理；(6)檢測和結(jié)果判斷。
(1)展青霉素檢測抗原8的制備，包括如下步驟①將0.5mg展青霉素、7.4mg戊二酸酐和1.6mg 4-二甲氨基吡啶溶于200μL無水四氫呋喃中，37℃振蕩反應(yīng)1小時；加100μL酸性蒸餾水(pH2-3)終止反應(yīng)；②12000rpm離心5分鐘去沉淀，上清液抽真空去除四氫呋喃；用300μL氯仿抽提三次，合并抽提液；用薄層層析法純化出反應(yīng)產(chǎn)物(展青霉素-半戊二酸)。
③將純化的展青霉素-半戊二酸溶解于100μL四氫呋喃中，0.6mg氮羥基琥珀酸(NHS)和3.2mg二環(huán)己基碳化二亞胺(DCC)溶解于200μL四氫呋喃中；二者混勻，置室溫避光振蕩反應(yīng)24小時。
④反應(yīng)完全后，12000rpm離心5分鐘去沉淀。上清液真空抽干，溶解于300μL二甲基亞砜中，再加入600μL脫脂奶粉的溶液中(4mg溶于600μL0.13MNaHCO3中)，室溫下振蕩反應(yīng)2小時(避光)。
⑤反應(yīng)結(jié)束后，0.01M PBS(pH7.2)4℃透析72小時，紫外掃描分析測定偶聯(lián)產(chǎn)物的摩爾比，真空凍干待用。
(2)硝酸纖維素膜4的制備①選擇制備檢測線6的檢測抗原和制備質(zhì)控線7的抗抗體11a.選擇脫脂奶粉與展青霉素-半戊二酸偶聯(lián)制備的檢測抗原用于制備檢測線6；b.選擇展青霉素的IgG型單克隆抗體的抗抗體11用于制備質(zhì)控線7。
②制備檢測線6和質(zhì)控線7
將硝酸纖維素膜4按10-35mm寬的尺寸剪裁；將經(jīng)生理鹽水緩沖液充分透析，濃度調(diào)整為0.2mg/mL的展青霉素檢測抗原8在膜上線狀點樣作為檢測線6，檢測線6點樣位置離膜底邊8mm，然后在膜的頂端用濃度調(diào)整為0.5mg/mL的抗抗體11噴涂質(zhì)控線7，硝酸纖維素膜4室溫干燥30分鐘，置于0.5％脫脂奶粉的生理鹽水中浸泡30分鐘，取出吸干水分，于37℃孵育30分鐘，置室溫下干燥處密封儲藏。
(3)膠體金結(jié)合物墊的制備分別取50mL顆粒直徑為30-50nm膠體金，用0.1mol/L碳酸鉀調(diào)pH至8.0，攪拌下將膠體金溶膠和展青霉素單克隆抗體混合，再加入聚乙二醇水溶液，使最終濃度為0.05％。將粗制品6000g離心45分鐘，沉淀用生理鹽水混懸至1.5mL，4℃保存。將標(biāo)記膠體金顆粒的抗體混合并分散在厚度為1mm的玻璃纖維紙上，凍干密封干燥保存。
(4)試紙條的組裝①在襯墊1上加上有檢測線6和質(zhì)控線7的硝酸纖維素膜4；②在襯墊1上加上膠體金結(jié)合物墊；③在襯墊1上加上樣品墊2；④在襯墊1上加上吸水墊5；組裝為檢測試紙條。
(5)樣品的處理稱取固體樣品25g置于乳缽中，加適量無水硫酸鈉研磨后，稱至三角瓶中，加80mL乙酸乙酯浸泡30分鐘，振蕩30分鐘，過濾，取濾液50mL，置于分液漏斗中，加入等體積的乙酸乙酯，振搖2分鐘，靜置分層，重復(fù)以上步驟兩次，合并有機相，加2.5mL 1.5％碳酸鈉振搖1分鐘，靜置分層后，棄去碳酸鈉層，同上步驟再用碳酸鈉處理一次。將提取液濾入100mL梨形瓶中，于40℃水浴上用真空減壓濃縮至近干，用少許氯仿清洗瓶壁，濃縮干，加蒸餾水0.4mL定容備用。
(6)檢測和結(jié)果判斷檢測取處理好的樣本0.4mL，離心片刻，垂直插入試紙條，插入深度不超過樣品墊，在樣本中停留約5秒，垂直取出試紙，5分鐘后觀察。
結(jié)果判斷檢測線6和質(zhì)控線7處有紅線出現(xiàn)為陰性；檢測線6無紅線出現(xiàn)，質(zhì)控線7出現(xiàn)紅色為陽性；質(zhì)控線7無紅線出現(xiàn)為失效。

實施例15膠體硒免疫層析檢測展青霉素試紙的制備并用于檢測液體樣品本實施例分為6部分(1)展青霉素檢測抗原8的制備；(2)硝酸纖維素膜4的制備；(3)膠體硒結(jié)合物墊的制備；(4)試紙條的組裝；(5)待檢樣品的處理；(6)檢測和結(jié)果判斷。
(1)展青霉素檢測抗原8的制備，包括如下步驟①將0.5mg展青霉素、7.4mg戊二酸酐和1.6mg 4-二甲氨基吡啶溶于200μL無水四氫呋喃中，37℃振蕩反應(yīng)1小時；加100μL酸性蒸餾水(PH2-3)終止反應(yīng)；②12000rpm離心5分鐘去沉淀，上清液抽真空去除四氫呋喃；用300μL氯仿抽提三次；用薄層層析法純化出反應(yīng)產(chǎn)物(展青霉素-半戊二酸)。
③將純化的展青霉素-半戊二酸溶解于100μL四氫呋喃中，0.6mg氮羥基琥珀酸(NHS)和3.2mg二環(huán)己基碳化二亞胺(DCC)溶解于200μL四氫呋喃中；二者混勻，置室溫避光振蕩反應(yīng)24小時。
④反應(yīng)完全后，12000rpm離心5分鐘去沉淀。上清液真空抽干，溶解于300μL二甲基亞砜中，再加入600μL鑰孔貝血藍蛋白(KLH)溶液中(4mg溶于600μL 0.13M NaHCO3中)，室溫下振蕩反應(yīng)2小時(避光)。
⑤反應(yīng)結(jié)束后，0.01M PBS(pH7.2)4℃透析72小時，紫外掃描分析測定偶聯(lián)產(chǎn)物的摩爾比，真空凍干待用。
(2)硝酸纖維素膜4的制備①選擇制備檢測線6的檢測抗原和制備質(zhì)控線7的抗抗體11a.選擇鑰眼貝血藍蛋白(KLH)與展青霉素-半戊二酸偶聯(lián)制備的檢測抗原用于制備檢測線6。
b.選擇展青霉素的IgG型單克隆抗體的抗抗體用于制備質(zhì)控線。
②制備檢測線6和質(zhì)控線7將硝酸纖維素膜4按18mm寬的尺寸剪裁；將經(jīng)生理鹽水緩沖液充分透析，濃度調(diào)整為1mg/mL的展青霉素檢測抗原8在膜上線狀點樣作為檢測線6，檢測線6點樣位置離膜底邊6mm，然后在膜的頂端用濃度調(diào)整為0.05mg/mL的抗抗體11噴涂質(zhì)控線7，硝酸纖維素膜4室溫干燥30分鐘，置于5％脫脂奶粉的生理鹽水中浸泡30分鐘，取出吸干水分，于37℃孵育30分鐘，置室溫下干燥處密封儲藏。
(3)膠體硒結(jié)合物墊的制備a.膠體硒溶膠制備在1升容量的四頸圓底燒瓶內(nèi)加入去離子水550mL和聚丙烯酸10g，通氮室溫攪拌并加入水合肼69.5mL，繼續(xù)攪拌20分鐘。亞硒酸9.63g溶解于280mL水，室溫攪拌下滴入反應(yīng)混合液內(nèi)，得到120nm紅色硒溶膠。
b.膠體硒抗體標(biāo)記將展青霉素單克隆抗體用20mmol/L pH7.3磷酸鹽緩沖液配成4.6mg/mL濃度溶液，加25μL于pH7.3的25mL硒溶膠中，室溫攪拌10分鐘后加1％PEG8000 1mL，混勻，于4℃以5000rpm離心5分鐘，得到松軟的紅色沉淀，用含0.05％ NaN3的磷酸鹽緩沖液配成1mL懸液。
c.將標(biāo)記膠體硒顆粒的抗體混合并分散在厚度為1mm的玻璃纖維紙上，凍干密封干燥保存。
(4)試紙條的組裝①在襯墊1上加上有檢測線6和質(zhì)控線7的硝酸纖維素膜4；②在襯墊1上加上膠體硒結(jié)合物墊；③在襯墊1上加上樣品墊2；④在襯墊1上加上吸水墊5；組裝為檢測試紙條。
(5)樣品的處理量取等檢樣品25mL，置于分液漏斗中，加入等體積的乙酸乙酯，振搖2分鐘，靜置分層，重復(fù)以上步驟兩次，合并有機相，加2.5mL 1.5％碳酸鈉振搖1分鐘，靜置分層后，棄去碳酸鈉層，同上步驟再用碳酸鈉處理一次。將提取液濾入100mL梨形瓶中，于40℃水浴上用真空減壓濃縮至近干，用少許氯仿清洗瓶壁，濃縮干，加蒸餾水0.4mL定容備用。
(6)檢測和結(jié)果判斷檢測取處理好的樣本0.4mL，離心片刻，垂直插入試紙條，插入深度不超過樣品墊，在樣本中停留約5秒，垂直取出試紙，5分鐘后觀察。
結(jié)果判斷檢測線6和質(zhì)控線7處有紅線出現(xiàn)為陰性；檢測線6無紅線出現(xiàn)，質(zhì)控線7出現(xiàn)紅色為陽性；質(zhì)控線6無紅線出現(xiàn)為失效。

實施例16乳膠顆粒免疫層析檢測展青霉素試紙的制備并用于檢測半固體樣品本實施例分為6部分(1)展青霉素檢測抗原8的制備；(2)硝酸纖維素膜4的制備；(3)乳膠顆粒結(jié)合物墊的制備；(4)試紙條的組裝；(5)待檢樣品的處理；(6)檢測和結(jié)果判斷。
(1)展青霉素檢測抗原8的制備，包括如下步驟①將0.5mg展青霉素、7.4mg戊二酸酐和1.6mg 4-二甲氨基吡啶溶于200μL無水四氫呋喃中，37℃振蕩反應(yīng)1小時；加100μL酸性蒸餾水(PH2-3)終止反應(yīng)；②12000rpm離心5分鐘去沉淀，上清液抽真空去除四氫呋喃；用300μL氯仿抽提三次；用薄層層析法純化出反應(yīng)產(chǎn)物(展青霉素-半戊二酸)。
③將純化的展青霉素-半戊二酸溶解于100μL四氫呋喃中，0.6mg氮羥基琥珀酸(NHS)和3.2mg二環(huán)己基碳化二亞胺(DCC)溶解于200μL四氫呋喃中。二者混勻，置室溫避光振蕩反應(yīng)24小時。
④反應(yīng)完全后，12000rpm離心5分鐘去沉淀。上清液真空抽干，溶解于300μL二甲基亞砜中，再加入600μL卵清白蛋白(OVA)溶液中(4mg溶于600μL 0.13M NaHCO3中)，室溫下振蕩反應(yīng)2小時(避光)。
⑤反應(yīng)結(jié)束后，0.01M PBS(pH7.2)4℃透析72小時，紫外掃描分析測定偶聯(lián)產(chǎn)物的摩爾比，真空凍干待用。
(2)硝酸纖維素膜4的制備①選擇制備檢測線6的檢測抗原和制備質(zhì)控線7的抗抗體11a.選擇卵清白蛋白與展青霉素-半戊二酸偶聯(lián)制備的檢測抗原用于制備檢測線；b.選擇展青霉素的IgM型單克隆抗體的抗抗體用于制備質(zhì)控線。
②制備檢測線6和質(zhì)控線7將硝酸纖維素膜4按18mm寬的尺寸剪裁；將經(jīng)生理鹽水緩沖液充分透析，濃度調(diào)整為0.04mg/mL的展青霉素檢測抗原(8)在膜上線狀點樣作為檢測線(6)，檢測線(6)點樣位置離膜底邊7mm，然后在膜的頂端用濃度調(diào)整為3mg/mL的抗抗體(11)噴涂質(zhì)控線(6)，硝酸纖維素膜(4)室溫干燥30分鐘，置于3％脫脂奶粉的生理鹽水中浸泡30分鐘，取出吸干水分，于37℃孵育30分鐘，置室溫下干燥處密封儲藏。
(3)乳膠結(jié)合物墊的制備彩色乳膠顆粒購自Bangs Laboratories公司，顏色為蘭色。用pH7.1的磷酸鹽緩沖液將乳膠顆粒稀釋到1％濃度，分別取50mL，攪拌下將乳膠溶液展青霉素單克隆抗體混合，室溫攪拌30分鐘后于37℃水浴孵化60分鐘，4℃放置4-5小時。15000rpm離心30分鐘，用2mL磷酸鹽緩沖液重懸。將標(biāo)記乳膠顆粒的抗體混合并分散在厚度為1mm的玻璃纖維紙上，凍干密封干燥保存。
(4)試紙條的組裝①在襯墊1上加上有檢測線6和質(zhì)控線7的硝酸纖維素膜4；②在襯墊1上加上乳膠結(jié)合物墊；③在襯墊1上加上樣品墊2；④在襯墊1上加上吸水墊5；組裝為檢測試紙條。
(5)樣品的處理稱取半固體樣品25g置于乳缽中，加適量無水硫酸鈉研磨后，稱至三角瓶中，加80mL乙酸乙酯浸泡30分鐘，振蕩30分鐘，過濾，取濾液50mL，置于分液漏斗中，加入等體積的乙酸乙酯，振搖2分鐘，靜置分層，重復(fù)以上步驟兩次，合并有機相，加2.5mL 1.5％碳酸鈉振搖1分鐘，靜置分層后，棄去碳酸鈉層，同上步驟再用碳酸鈉處理一次。將提取液濾入100mL梨形瓶中，于40℃水浴上用真空減壓濃縮至近干，用少許氯仿清洗瓶壁，濃縮干，加蒸餾水0.4mL定容備用。
(6)檢測和結(jié)果判斷檢測取處理好的樣本0.5mL，離心片刻，垂直插入試紙條，插入深度不超過樣品墊，在樣本中停留約5秒，垂直取出試紙，5分鐘后觀察。
結(jié)果判斷如下檢測線6和質(zhì)控線7處有蘭線出現(xiàn)為陰性；檢測線6無蘭線出現(xiàn)，質(zhì)控線7出現(xiàn)蘭色為陽性；質(zhì)控線7無蘭線出現(xiàn)為失效。

實施例17明膠顆粒免疫層析檢測展青霉素試紙的制備并用于檢測半固體樣品本實施例分為6部分(1)展青霉素檢測抗原8的制備；(2)硝酸纖維素膜4的制備；(3)明膠顆粒結(jié)合物墊的制備；(4)試紙條的組裝；(5)待檢樣品的處理；(6)檢測和結(jié)果判斷。
(1)展青霉素檢測抗原的制備，包括如下步驟①將0.5mg展青霉素、7.4mg戊二酸酐和1.6mg 4-二甲氨基吡啶溶于200μL無水四氫呋喃中，37℃振蕩反應(yīng)1小時；加100μL酸性蒸餾水(pH2-3)終止反應(yīng)；②12000rpm離心5分鐘去沉淀，上清液抽真空去除四氫呋喃；用300μL氯仿抽提三次；用薄層層析法純化出反應(yīng)產(chǎn)物(展青霉素-半戊二酸)。
③將純化的展青霉素-半戊二酸溶解于100μL四氫呋喃中，0.6mg氮羥基琥珀酸(NHS)和3.2mg二環(huán)己基碳化二亞胺(DCC)溶解于200μL四氫呋喃中。二者混勻，置室溫避光振蕩反應(yīng)24小時。
④反應(yīng)完全后，12000rpm離心5分鐘去沉淀。上清液真空抽干，溶解于300μL二甲基亞砜中，再加入600μL鑰孔貝血藍蛋白溶液中(4mg溶于600μL0.13M NaHCO3中)，室溫下振蕩反應(yīng)2小時(避光)。
⑤反應(yīng)結(jié)束后，0.01M PBS(pH7.2)4℃透析72小時，紫外掃描分析測定偶聯(lián)產(chǎn)物的摩爾比，真空凍干待用。
(2)硝酸纖維素膜4的制備①選擇制備檢測線6的檢測抗原和制備質(zhì)控線7的抗抗體11a.選擇鑰孔貝血藍蛋白與展青霉素-半戊二酸偶聯(lián)制備的檢測抗原用于制備檢測線；b.選擇展青霉素的IgG型單克隆抗體的抗抗體11用于制備質(zhì)控線7。
②制備檢測線6和質(zhì)控線7將硝酸纖維素膜4按10-35mm寬的尺寸剪裁；將經(jīng)生理鹽水緩沖液充分透析，濃度調(diào)整為5mg/mL的展青霉素檢測抗原8在膜上線狀點樣作為檢測線6，檢測線6點樣位置離膜底邊16mm，然后在膜的頂端用濃度調(diào)整為5mg/mL的抗抗體11噴涂質(zhì)控線7，硝酸纖維素膜4室溫干燥30分鐘，置于2％脫脂奶粉的生理鹽水中浸泡30分鐘，取出吸干水分，于37℃孵育30分鐘，置室溫下干燥處密封儲藏。
(3)明膠結(jié)合物墊的制備明膠顆粒購自Zodolabs公司，顏色為蘭色。用pH7.1的磷酸鹽緩沖液將明膠顆粒稀釋到1％濃度，分別取50mL，攪拌下將明膠溶液展青霉素單克隆抗體混合，室溫攪拌30分鐘后于37℃水浴孵化60分鐘，4℃放置4-5小時。15000rpm離心30分鐘，用2mL磷酸鹽緩沖液重懸。將標(biāo)記明膠顆粒抗體混合并分散在厚度為1mm的玻璃纖維紙上，凍干密封干燥保存。
(4)試紙條的組裝①在襯墊1上加上有檢測線6和質(zhì)控線7的硝酸纖維素膜4；②在襯墊1上加上明膠顆粒結(jié)合物墊；③在襯墊1上加上樣品墊2；④在襯墊1上加上吸水墊5；組裝為檢測試紙條。
(5)樣品的處理稱取半固體樣品25g置于乳缽中，加適量無水硫酸鈉研磨后，加到三角瓶中，加80mL乙酸乙酯浸泡30分鐘，振蕩30分鐘，過濾，取濾液50mL，置于分液漏斗中，加入等體積的乙酸乙酯，振搖2分鐘，靜置分層，重復(fù)以上步驟兩次，合并有機相，加2.5mL1.5％碳酸鈉振搖1分鐘，靜置分層后，棄去碳酸鈉層，同上步驟再用碳酸鈉處理一次。將提取液濾入100mL梨形瓶中，于40℃水浴上用真空減壓濃縮至近干，用少許氯仿清洗瓶壁，濃縮干，加蒸餾水0.4mL定容備用。
(6)檢測和結(jié)果判斷檢測取處理好的樣本0.5mL，離心片刻，垂直插入試紙條，插入深度不超過樣品墊，在樣本中停留約5秒，垂直取出試紙，5分鐘后觀察。
結(jié)果判斷如下檢測線6和質(zhì)控線7處有蘭線出現(xiàn)為陰性；檢測線6無蘭線出現(xiàn)，質(zhì)控線7出現(xiàn)蘭色為陽性；質(zhì)控線7無蘭線出現(xiàn)為失效。

實施例18磁性顆粒免疫層析檢測展青霉素試紙的制備并用于檢測液體樣品本實施例分為6部分(1)展青霉素檢測抗原8的制備；(2)硝酸纖維素膜4的制備；(3)磁性顆粒結(jié)合物墊的制備；(4)試紙條的組裝；(5)待檢樣品的處理；(6)檢測和結(jié)果判斷。
(1)展青霉素檢測抗原8的制備，包括如下步驟①將0.5mg展青霉素、7.4mg戊二酸酐和1.6mg 4-二甲氨基吡啶溶于200μL無水四氫呋喃中，37℃振蕩反應(yīng)1小時；加100μL酸性蒸餾水(PH2-3)終止反應(yīng)；②12000rpm離心5分鐘去沉淀，上清液抽真空去除四氫呋喃；用300μL氯仿抽提三次；用薄層層析法純化出反應(yīng)產(chǎn)物(展青霉素-半戊二酸)。
③將純化的展青霉素-半戊二酸溶解于100μL四氫呋喃中，0.6mg氮羥基琥珀酸(NHS)和3.2mg二環(huán)己基碳化二亞胺(DCC)溶解于200μL四氫呋喃中。二者混勻，置室溫避光振蕩反應(yīng)24小時。
④反應(yīng)完全后，12000rpm離心5分鐘去沉淀。上清液真空抽干，溶解于300μL二甲基亞砜中，再加入600μL牛血清白蛋白(BSA)溶液中(4mg溶于600μL 0.13M NaHCO3中)，室溫下振蕩反應(yīng)2小時(避光)。
⑤反應(yīng)結(jié)束后，0.01M PBS(pH7.2)4℃透析72小時，紫外掃描分析測定偶聯(lián)產(chǎn)物的摩爾比，真空凍干待用。
(2)硝酸纖維素膜4的制備①選擇制備檢測線6的檢測抗原和制備質(zhì)控線7的抗抗體11a.選擇牛血清白蛋白與展青霉素-半戊二酸偶聯(lián)制備的檢測抗原用于制備檢測線；b.選擇展青霉素的IgG型單克隆抗體的抗抗體用于制備質(zhì)控線。
②制備檢測線6和質(zhì)控線7將硝酸纖維素膜4按251mm寬的尺寸剪裁；將經(jīng)生理鹽水緩沖液充分透析，濃度調(diào)整為0.08mg/mL的展青霉素檢測抗原8在膜上線狀點樣作為檢測線6，檢測線6點樣位置離膜底邊9mm，然后在膜的頂端用濃度調(diào)整為0.03mg/mL的抗抗體11噴涂質(zhì)控線7，硝酸纖維素膜4室溫干燥30分鐘，置于0.18％脫脂奶粉的生理鹽水中浸泡30分鐘，取出吸干水分，于37℃孵育30分鐘，置室溫下干燥處密封儲藏。
(3)磁性顆粒結(jié)合物墊的制備磁性顆粒購自Bangs Laboratories公司。用pH7.1的磷酸鹽緩沖液將磁性顆粒稀釋到1％濃度，分別取50mL，攪拌下將展青霉素單克隆抗體混合，室溫攪拌30分鐘后于37℃水浴孵化60分鐘，4℃放置4-5小時。15000rpm離心30分鐘，用2mL磷酸鹽緩沖液重懸。將標(biāo)記磁性顆粒的抗體混合并分散在厚度為1mm的玻璃纖維紙上，凍干密封干燥保存。
(4)試紙條的組裝①在襯墊1上加上有檢測線6和質(zhì)控線7的硝酸纖維素膜4；②在襯墊1上加上磁性顆粒結(jié)合物墊；③在襯墊1上加上樣品墊2；④在襯墊1上加上吸水墊5；組裝為檢測試紙條。
(5)樣品的處理量取等檢樣品25mL，置于分液漏斗中，加入等體積的乙酸乙酯，振搖2分鐘，靜置分層，重復(fù)以上步驟兩次，合并有機相，加2.5mL1.5％碳酸鈉振搖1分鐘，靜置分層后，棄去碳酸鈉層，同上步驟再用碳酸鈉處理一次。將提取液濾入100mL梨形瓶中，于40℃水浴上用真空減壓濃縮至近干，用少許氯仿清洗瓶壁，濃縮干，加蒸餾水0.4mL定容備用。
(6)檢測和結(jié)果判斷檢測取處理好的樣本0.5mL，離心片刻，垂直插入試紙條，插入深度不超過樣品墊，在樣本中停留約5秒，垂直取出試紙，5分鐘后用磁讀取儀判斷結(jié)果。
結(jié)果判斷如下相應(yīng)位置出現(xiàn)磁性增強為陽性，無磁性增強為陰性

權(quán)利要求
1.一種展青霉素免疫層析檢測試紙的制作方法，展青霉素免疫層析檢測試紙，包括襯墊(1)，樣品墊(2)，示蹤粒子結(jié)合物墊(3)，硝酸纖維素膜(4)，吸水墊(5)，檢測線(6)，質(zhì)控線(7)，在襯墊(1)上按順序有樣品墊(2)，示蹤粒子結(jié)合物墊(3)，硝酸纖維素膜(4)，吸水墊(5)；示蹤粒子結(jié)合物墊(3)上有示蹤粒子(9)標(biāo)記的抗展青霉素的抗體(10)，硝酸纖維素膜(4)上還設(shè)有檢測線(6)和質(zhì)控線(7)，檢測線(6)上有展青霉素檢測抗原(8)，質(zhì)控線(7)上有抗抗體(11)，其中抗抗體(11)是抗展青霉素的抗體(10)的抗體。其特征在于包括如下步驟，(A)展青霉素抗原的制備，包括單克隆抗體的免疫抗原和展青霉素檢測抗原(8)的制備；(B)硝酸纖維素膜(4)的檢測線(6)和質(zhì)控線(7)的制備；(C)示蹤粒子結(jié)合物墊(3)的制備；(D)組裝試紙條。
2.如權(quán)利要求書1所述的一種展青霉素免疫層析檢測試紙的制作方法，其特征在于示蹤粒子(9)標(biāo)記為如下任意一種膠體金顆粒；乳膠顆粒；膠體硒顆粒；明膠顆粒；磁性顆粒。
3.如權(quán)利要求書1所述的一種展青霉素免疫層析檢測試紙的制作方法，其特征在于展青霉素抗原的制備，包括如下步驟(A)展青霉素通過戊二酸酐法使其羥基與戊二酸羧基以酯鍵相連，形成新的化合物。(B)該化合物再次通過活性酯法與高分子量載體物質(zhì)的蛋白質(zhì)、多糖、多核苷酸、多聚賴氨酸、多聚苯乙烯或其它人工合成的高分子量物質(zhì)相連形成人工抗原；(C)選擇展青霉素抗原的一種作為免疫抗原；(D)選擇展青霉素抗原的一種作為檢測抗原；用于制備檢測線的展青霉素人工抗原和用于制備抗展青霉素抗體的免疫抗原的載體是這樣選擇的①選擇牛血清白蛋白、鑰眼貝血藍蛋白、卵清白蛋白、甲狀腺球蛋白、人血清白蛋白的一種為載體用于制備展青霉素人工抗原。②選擇多聚賴氨酸、多聚谷氨酸、多聚混合氨酸的一種為載體用于制備展青霉素人工抗原。③展青霉素免疫抗原和檢測抗原的載體可以相同，也可以不同。
4.如權(quán)利要求書1所述的一種展青霉素免疫層析檢測試紙的制作方法，其特征在于硝酸纖維素膜(4)的檢測線(6)和質(zhì)控線(7)的制備，包括如下步驟(A)用展青霉素檢測抗原(8)在硝酸纖維素膜(4)上線狀點樣制備一條檢測線(6)；(B)用抗抗體(11)在硝酸纖維素膜(4)上進行線狀點樣制備一條質(zhì)控線(7)。
5.如權(quán)利要求書4所述的一種展青霉素免疫層析檢測試紙的制作方法，其特征在于檢測線(6)和質(zhì)控線(7)是這樣制備的將硝酸纖維素膜(4)按10-35mm寬的尺寸剪裁；將經(jīng)生理鹽水緩沖液充分透析，濃度調(diào)整為0.01-5mg/mL的展青霉素檢測抗原(8)在膜上線狀點樣作為檢測線(6)，檢測線(6)點樣位置離膜底邊4-16mm，然后在膜的頂端用濃度調(diào)整為0.01-5mg/mL的抗抗體(11)噴涂質(zhì)控線(6)，硝酸纖維素膜(4)室溫干燥30分鐘，置于0.1-5％脫脂奶粉的生理鹽水中浸泡30分鐘，取出吸干水分，于37℃孵育30分鐘，置室溫下干燥處密封儲藏。
6.如權(quán)利要求書1所述的一種展青霉素免疫層析檢測試紙的制作方法，其特征在于示蹤粒子結(jié)合物墊(3)的制備包括如下步驟(A)用示蹤粒子標(biāo)記抗展青霉素的抗體(10)，抗體(10)包括IgG型抗體、IgM型抗體、IgA抗體；(B)把示蹤粒子(9)標(biāo)記好的抗展青霉素的抗體(10)分散在硝酸纖維素膜(4)上。
7.如權(quán)利要求書1所述的一種展青霉素免疫層析檢測試紙的制作方法，其特征在于組裝試紙條，步驟如下在襯墊(1)上加上有檢測線(6)和質(zhì)控線(7)的硝酸纖維素膜(4)；在襯墊(1)上加上示蹤粒子結(jié)合物墊(3)；在襯墊(1)上加上樣品墊(2)；在襯墊(1)上加上吸水墊(5)；組裝為檢測試紙條。
8.如權(quán)利要求書1所述的一種展青霉素免疫層析檢測試紙在檢測展青霉素中的應(yīng)用。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種展青霉素免疫層析檢測試紙及其制作方法與應(yīng)用。本發(fā)明的檢測試紙，包括襯墊，樣品墊，示蹤粒子結(jié)合物墊，硝酸纖維素膜，吸水墊，檢測線，質(zhì)控線；在襯墊上按順序有樣品墊，示蹤粒子結(jié)合物墊，硝酸纖維素膜，吸水墊；示蹤粒子結(jié)合物墊上有示蹤粒子標(biāo)記的抗展青霉素的抗體，硝酸纖維素膜上還設(shè)有檢測線和質(zhì)控線，檢測線上有展青霉素檢測抗原，質(zhì)控線上有抗抗體，其中抗抗體是抗展青霉素的抗體的抗體。本發(fā)明的優(yōu)點在于本發(fā)明有放射免疫分析和酶聯(lián)免疫吸附試驗ELISA的優(yōu)點。同時，本發(fā)明有簡單、快速、常溫保存、單份測定、一次試驗測出展青霉素、除商品試劑外不需任何儀器設(shè)備的優(yōu)點，特別適合展青霉素的現(xiàn)場快速檢測。
文檔編號G01N33/531GK1603829SQ03160299
公開日2005年4月6日 申請日期2003年9月30日 優(yōu)先權(quán)日2003年9月30日
發(fā)明者許楊, 鄧舜洲, 賴衛(wèi)華, 陳高明, 熊勇華 申請人:江西中德生物工程有限公司