專利名稱：用光學(xué)斷層成像技術(shù)對流體中微小物體成像的儀器和方法
相關(guān)申請本申請與Alan C，Nelson的申請日期為03/28/2001，系列號為60/279244，標(biāo)題為“用光學(xué)斷層成像技術(shù)對流體中微小物體成像的儀器和方法”的臨時未決申請有關(guān)，并參照該申請，而要求受益于該未決臨時申請的申請日的優(yōu)先權(quán)。
背景技術(shù)：
本發(fā)明涉及應(yīng)用點光源投射幾何特征進行三維光學(xué)斷層成像技術(shù)，更具體地說，即應(yīng)用光學(xué)斷層成像技術(shù)對流體中的顯微鏡下物體包括細(xì)胞成像。
隨著如抗體探針和核酸雜交探針等的分子探針的出現(xiàn)，一些與新疾病有關(guān)的問題可通過對上述分子探針進行標(biāo)記然后檢測其在細(xì)胞和組織中的定位及濃度而得到解決。由于出現(xiàn)了對這些探針進行更精確定位和定性的需要，同時就需要更先進的技術(shù)在顯微鏡下測定探針的二維(2D)和三維(3D)密度。傳統(tǒng)的光學(xué)顯微鏡觀察堆積于玻片上的細(xì)胞，只能進行近似的2D或3D成像，原因是受以下因素的影響，如焦平面的深度、取樣角度以及細(xì)胞處理所帶來的問題，其典型的問題是使得細(xì)胞在觀察平面上相互重疊。光學(xué)顯微鏡的另一缺點是通過物鏡進行觀察的固有缺陷，即只有焦平面內(nèi)的區(qū)域才能提供用于分析的確切數(shù)據(jù)。
流式細(xì)胞分析方法通過讓細(xì)胞一個接一個地在流體中流動而克服了細(xì)胞相互重疊的問題。但遺憾的是，流式細(xì)胞分析系統(tǒng)不能獲得像傳統(tǒng)光學(xué)顯微鏡一樣質(zhì)量的細(xì)胞圖像，而且，在任何情況下，這些圖像都不是三維的。對于上述背景，熟悉本領(lǐng)域的人士可參考Shapiro，HM主編的《實用流式細(xì)胞分析術(shù)》，第三版，Wiley-liss，1995。
在計算機輔助斷層成像領(lǐng)域，Johnson等人申請的、發(fā)布日期1995年3月28日、標(biāo)題為“三維顯微斷層成像分析系統(tǒng)”的美國專利5,402,460公布了一個用于生成標(biāo)本的高分辨率、三維圖像的顯微斷層成像系統(tǒng)，該系統(tǒng)采用了一個X線發(fā)生儀和一個能探測X線束在通過標(biāo)本后衰減情況的X線探測儀。Johnson等人的顯微斷層成像技術(shù)在對標(biāo)本進行每次成像時作兩個投射，這兩個投射的X線束能量不同。在一次成像的兩個投射完成后，在標(biāo)本托架上旋轉(zhuǎn)標(biāo)本進行下一輪投射。對標(biāo)本每次成像的兩個投射一起分析可以提供標(biāo)本中所含物質(zhì)的斷面上的定量信息。將不同成像的投射進行結(jié)合可提供標(biāo)本的三維影像。美國專利5,402,460在此結(jié)合作為參考。雖然美國專利5,402,460介紹的X線技術(shù)可用于某些實際應(yīng)用，但該專利并未提供用于流式細(xì)胞分析術(shù)的光學(xué)解決方案。
為克服本系統(tǒng)中前面提到的以及其他已發(fā)現(xiàn)的缺陷，本發(fā)明將流式細(xì)胞分析術(shù)的“一個接一個”細(xì)胞呈遞與多點光源投射計算機光學(xué)斷層成像結(jié)合起來，從多個投射中重建2D和3D細(xì)胞密度信息。
發(fā)明概述本發(fā)明提供了一種應(yīng)用點光源投射和斷層影像重建技術(shù)對流體中微小物體成像的儀器和方法。該流式光學(xué)斷層成像(FOT)系統(tǒng)包括一種流式細(xì)胞儀(如

圖1所示)和一個置于毛細(xì)管2周圍的重建柱(如圖4所示)。光子源25和光子感應(yīng)器26與脈沖高度分析器27共同構(gòu)成觸發(fā)設(shè)備。脈沖高度分析器27根據(jù)已知的原理提供一個細(xì)胞開始的第一個觸發(fā)點28，而第二個觸發(fā)點29用于該細(xì)胞的結(jié)束。脈沖高度分析器27輸出與每個細(xì)胞開始和結(jié)束相對應(yīng)的觸發(fā)信號30，該觸發(fā)信號由重建柱20接收。來自重建柱的信號通過計算機斷層影像重建技術(shù)進行直接分析或處理，從而提供有關(guān)細(xì)胞的二維或三維信息。
附圖的簡要描述圖1為根據(jù)本發(fā)明的實施方案構(gòu)建的一個流式細(xì)胞分析系統(tǒng)的實例示意圖。
圖2為根據(jù)本發(fā)明的實施方案構(gòu)建的一個單細(xì)胞流式處理過程的實例示意圖。
圖3A和圖3B為根據(jù)本發(fā)明的實施方案構(gòu)建的一個細(xì)胞和重建的橫斷面實例示意圖。
圖4為根據(jù)本發(fā)明的實施方案構(gòu)建的一個重建柱的實例示意圖。
圖5為根據(jù)本發(fā)明的實施方案構(gòu)建的一個流式光學(xué)斷層成像(FOT)系統(tǒng)的實例示意圖。
圖6為根據(jù)本發(fā)明的實施方案構(gòu)建的一個重建柱內(nèi)投射光的實例示意圖。
圖7為根據(jù)本發(fā)明的實施方案構(gòu)建的一個重建柱從頂面觀察的實例示意圖。
圖8為根據(jù)本發(fā)明的實施方案構(gòu)建的用于細(xì)胞重建過程的源/線排列配置幾何特征的實例示意圖。
優(yōu)選實施方案的具體描述本發(fā)明在此描述的是基于與生物學(xué)細(xì)胞有關(guān)的特定例子，但應(yīng)當(dāng)明確的是，這些舉例的目的是為了闡述本發(fā)明的原則，而本發(fā)明并不僅限于此。在一個實例中，在一個顯微鏡下空間中構(gòu)建點密度和發(fā)射強度的三維分布使得能夠測定在一個顯微鏡下空間中任意位點的密度和熒光，并確定感興趣的結(jié)構(gòu)、分子和分子探針的所在部位。通過使用標(biāo)記的分子探針，就可以測定顯微鏡下物體中附著于特殊結(jié)構(gòu)上的探針的量。出于說明的目的，一個物體如一個細(xì)胞，可以用至少一個標(biāo)記的分子探針進行標(biāo)記，對該探針的數(shù)量和定位進行檢測可能獲得有關(guān)該細(xì)胞疾病狀態(tài)的重要信息，包括各種癌，如肺、乳腺、前列腺、子宮頸和卵巢癌，但并不僅限于此。
準(zhǔn)備用于流式細(xì)胞分析的生物學(xué)細(xì)胞以用于特定疾病診斷的標(biāo)記分子探針進行染色或標(biāo)記，這些細(xì)胞要流過一個柱狀的裝置，該裝置提供投射影像并根據(jù)與細(xì)胞流動的矢狀方向大致垂直的光學(xué)投射路徑而重建2D和3D密度信息。通過控制細(xì)胞沿軸流動的速率，重建的2D垂直平面可以沿細(xì)胞的軸正確地定位(或堆積)，從而獲得整個細(xì)胞的3D圖像，或者直接根據(jù)2D光學(xué)發(fā)射或散射投影估計細(xì)胞的3D圖像。
由于以下特性，流式細(xì)胞儀非常適合于圖像重建。這些特性有·細(xì)胞以單列流過毛細(xì)管，使得細(xì)胞重疊和阻塞的可能性被降至最小，
·細(xì)胞通過毛細(xì)管的速率可以直接測定并保持穩(wěn)定，·細(xì)胞趨向于沿毛細(xì)管的中心軸流動，從而在結(jié)構(gòu)上呈放射狀對稱，以及·根據(jù)細(xì)胞的固定和懸浮情況，細(xì)胞可保持其可塑性，同時其形狀因毛細(xì)管內(nèi)的速率梯度而沿Z軸方向伸長。
本發(fā)明利用上述特性提供了一個用于點投射成像和斷層影像重建的系統(tǒng)。
圖1為根據(jù)本發(fā)明的實施方案構(gòu)建的流式細(xì)胞分析系統(tǒng)的一個實例的示意圖。該系統(tǒng)參照一個有x，y和z軸坐標(biāo)的坐標(biāo)系統(tǒng)11排列。在實際操作過程中，細(xì)胞1通過一個已知的注射裝置4注射進入注射管3。毛細(xì)管在注射末端5較寬，并包含一個壓力帽6。鞘液7進入管8中，在毛細(xì)管2中形成層流。這是一種典型的流式細(xì)胞分析形式，即細(xì)胞1在溶液中制備和懸浮后在壓力下通過毛細(xì)管2，從而沿流動的長軸延伸并大致沿毛細(xì)管的中心軸移動，如圖中的虛線9所示。細(xì)胞可以很容易地在柱狀毛細(xì)管中沿中心軸以軸向?qū)ΨQ和穩(wěn)定速率10呈單列流動。
圖2為根據(jù)本發(fā)明的實施方案構(gòu)建的單細(xì)胞流式處理過程的一個實例示意圖。細(xì)胞1在由速率向量10所示的穩(wěn)定速率(V)下通過毛細(xì)管2。細(xì)胞1含有一個胞漿壁12和一個胞核壁13。在細(xì)胞流過毛細(xì)管2的過程中，細(xì)胞1穿過多個重建平面，圖中分別以14a、14b和14c表示第一、第二和第三重建平面。第一個平面切面15a穿過位于重建平面14a內(nèi)的胞漿壁。與之類似，第二個平面切面15b穿過位于第二個重建平面14b內(nèi)的細(xì)胞漿和細(xì)胞核的壁。而第三個平面切面15c則位于第三個重建平面14c內(nèi)。本發(fā)明的一個中心特征在于多個波長可選的點光源以毛細(xì)管為中心分布。點光源與對面的光學(xué)探測器陣列一起運行，后者對光譜中經(jīng)選擇的部分非常敏感，從而能獲取穿過細(xì)胞的投射光。獲取的投射影像可以直接分析，或應(yīng)用斷層影像重建算法進行處理，從而提供細(xì)胞內(nèi)密度分布和/或發(fā)散強度的空間圖或圖像。需要明確的是，在實際操作中，重建平面的數(shù)量可以是幾個，也可以是幾百甚至更多，這要根據(jù)系統(tǒng)所處理的物體需要的圖像分辨率而定。一組重建的平行平面切面在軟件中進行組合或疊加，從而產(chǎn)生有關(guān)細(xì)胞內(nèi)致密程度和發(fā)散強度的三維(3D)圖像。另外，通過使用平面(2D)而非線性(1D)的光探測器陣列，以及圓錐形而非扇形的光照射形式，可同時得到穿過流動細(xì)胞的多個鄰近的平面切面的投影。結(jié)果，通過圓錐光束重建算法就可以從二維(2D)的投射中直接計算出細(xì)胞空間中密度分布和發(fā)散強度的三維(3D)圖像。另外，可直接分析含有無窮景深(infinite depth of field)的2D點光源投射影像。
對于一個生物學(xué)細(xì)胞，重建平面間的距離d可以是幾個微米或更小。細(xì)胞1內(nèi)的各個點將與各時間間隔中的每個重建平面相對應(yīng)，該時間間隔(t)可根據(jù)下述相互關(guān)系進行描述t＝d÷V(等式1)圖3A和圖3B所示為根據(jù)本發(fā)明的實施方案構(gòu)建的一個重建的橫斷面16示意圖。根據(jù)穿過細(xì)胞的光投射進行的細(xì)胞內(nèi)點致密度重建得益于流動細(xì)胞的軸向?qū)ΨQ和中心性。另外，投射取樣的空間可以模式化為由以下三個不連續(xù)的腔室組成1.細(xì)胞外液體17(如鞘液或細(xì)胞懸液)，2.細(xì)胞漿18，以及3.細(xì)胞核19。
掌握上述三個腔室中光密度或分子探針的定量分布狀況就足以解決很多細(xì)胞生物學(xué)和疾病診斷方面的重要問題。另外，如果某種分子探針優(yōu)先與界面結(jié)合，那么就可以計算出兩個界面，包括胞漿或細(xì)胞壁12和胞核壁13。否則，也足以將這些壁確定為三個不同腔室間的轉(zhuǎn)換界面。
通過整合重組的細(xì)胞各個切面，或以螺旋狀、空間測定的方式進行重組，就可以獲得3D形態(tài)學(xué)和空間信息，但獲得絕對(與相對對應(yīng))空間信息則有賴于細(xì)胞定位的確切信息。細(xì)胞定位是流體速率的函數(shù)。然而，在幾個實例中，密度和分子探針的相對濃度足以解決診斷問題如，與背景液中的非結(jié)合探針相比，有多少探針存在于相對胞核的胞漿中？或，這種探針主要定位于細(xì)胞膜還是細(xì)胞核表面？盡管細(xì)胞在穿過毛細(xì)管時可能成為放射性對稱的結(jié)構(gòu)，但至少一種結(jié)合的分子探針在胞核和胞漿區(qū)域的分布可能不具有這種軸對稱性。因此這就要求成像系統(tǒng)和(尤其是發(fā)散)重建算法能夠提供足夠的空間分辨率，以定位結(jié)合的、含熒光的分子探針的空間，而使用的尺度要比用于上述三個腔室分析的尺度更精細(xì)。同時還進一步要求系統(tǒng)提供在兩個細(xì)胞內(nèi)腔室中呈不對稱分布的探針濃度的定量信息。亞微米級的空間分辨率可以更容易地分析探針與胞漿或胞核中特殊亞細(xì)胞腔室、結(jié)構(gòu)或細(xì)胞器的關(guān)系。
一個更具體的例子是早期發(fā)現(xiàn)高危癌癥患者。在該例子中，當(dāng)細(xì)胞進行轉(zhuǎn)化時某些基因的功能表達可能上調(diào)或下調(diào)。檢測基因產(chǎn)物(通常是一種蛋白)在于相對胞核的胞漿中表達水平的相對上調(diào)或下調(diào)，并以背景懸浮液中的非結(jié)合探針進行標(biāo)準(zhǔn)化在診斷學(xué)上具有重要意義。如果基因產(chǎn)物是一種蛋白，那么標(biāo)記的抗體探針就可以通過對基因蛋白產(chǎn)物的定位和/或定量來評價細(xì)胞的疾病狀態(tài)。因此，這種三腔室分析方法足以用于疾病狀態(tài)的評定。
圖4為根據(jù)本發(fā)明的實施方案構(gòu)建的一個重建柱的實例示意圖，該重建柱環(huán)繞著含有流動細(xì)胞1的流式管2。舉例說，一個重建柱20包括一個點光源21的螺旋24，這些點光源以一個預(yù)先確定的螺旋傾斜角(傾斜角為θ)分布。每個點光源21產(chǎn)生一束光子22，光子束呈典型的圓錐形或扇型。如圖4舉例中顯示，光源的分布呈螺旋形，而光源的分布也可采取其他各種幾何形式，這將部分取決于電子的速度、細(xì)胞速率和在感應(yīng)器(探測器)獲得不重疊投射信號的幾何特征。排列的感應(yīng)元件23用于接收從點光源來的光。
在細(xì)胞1流經(jīng)光源時，固定的點光源21和對面環(huán)繞著毛細(xì)管的探測器23一起獲取穿過整個細(xì)胞的多個投射角。通過記錄光源和減弱的傳輸光和/或發(fā)散光和/或散射光的發(fā)射和/或讀出的時間，每個檢測信號都將與流動細(xì)胞z向軸上的一個特定的已知部位相對應(yīng)。通過這種方法，細(xì)胞1以已知速率沿與光源垂直的已知軸流動導(dǎo)致該光源發(fā)射或以同步方式被檢測，細(xì)胞被穿過的投射光進行光學(xué)橫斷從而可在x-y平面上重建一個2D切面。對一系列切面進行疊加或數(shù)學(xué)組合，將形成細(xì)胞的3D圖像。還可以將細(xì)胞運動與圍繞流動軸的一個光源(或多個光源)的位置結(jié)合起來，從而獲得可用于重建的數(shù)據(jù)，例如，以一種螺旋的方式構(gòu)建細(xì)胞的3D圖像。圖像重建可以用扇形光束重建算法將由線性(1D)投射重建的連續(xù)平面圖像疊加而獲得，也可以直接將平面(2D)投射用錐形光束重建算法獲得。細(xì)胞的3D圖像可以提供亞細(xì)胞結(jié)構(gòu)的定量數(shù)據(jù)，并對提供診斷信息的標(biāo)記分子探針進行定位和定量。
如前所述，重建橫斷面或立體空間的2D或3D密度結(jié)構(gòu)需要不只一個的穿過細(xì)胞橫斷面的投射。在傳統(tǒng)的一個一個切面的醫(yī)學(xué)X線計算機斷層成像術(shù)中，獲取多個投射是通過固定患者，而X線光源和對面的感應(yīng)器沿一個環(huán)移動從而產(chǎn)生穿過患者的多個投射角。與之類似，本發(fā)明的流式光學(xué)斷層成像系統(tǒng)在一個預(yù)先確定的速率(V)下使細(xì)胞通過多個光源，這些光源以不同的角度定位于毛細(xì)管周圍，從而在細(xì)胞流過各個點光源時產(chǎn)生多個穿過細(xì)胞的投射。這些點光源發(fā)射光子穿過細(xì)胞，被排列于光源對面的感應(yīng)器所檢測。在毛細(xì)胞管周圍的點光源可以沿螺旋24排列，或以其他合適的幾何圖形排列，從而使細(xì)胞流經(jīng)光源陣列時從多個角度對細(xì)胞中的每個點進行取樣。為獲得一個較好的取樣幾何圖形，這些點光源至少應(yīng)覆蓋180度圓周。較小的覆蓋角度(如，小于取樣角度)在某些情況下也可行，而增加額外的放射狀覆蓋將改善計算機重建的精確度和信噪比。根據(jù)幾何學(xué)排列，應(yīng)用傳統(tǒng)的分析、疊加或統(tǒng)計學(xué)運算將有利于錐形或扇形光束的圖像重建(例如，見Gilbert，P，“源自投射的物體三維重建的疊加方法”，Journal ofTheoretical Biology，36105-17，1972，Oppenheim，BE，“疊加三維重建的更精確算法”IEEE Transaction on Nuclear Science NS-2172-7，1974，Singer，JR，Grumbaum，F(xiàn)A，Kohn，P，和Zubelli，JP，“漫射物體內(nèi)部的圖像重建”，Science 248(4958)990-3，1990.Mueller，K和Yage，R，“應(yīng)用2D紋理作圖硬件的同步重建技術(shù)(SART)進行快速3D錐形束重建”，IEEE Transaction on Medical imaging 19(12)1227-37，2001)。相關(guān)的方法包括下述方法，但不僅限于此ART(代數(shù)重建技術(shù)，如Beooman，SH，Bender，R，Gordon，R，和Rowe，JE所闡述，“ART是一種用于三維電子顯微鏡代數(shù)重建的科學(xué)”，Journal of Theoretical Biology 32205-16，1971)，SIRT(同步疊加重建技術(shù)，如Gilbert所闡述，id.#1493)，MLEM(最大相似度預(yù)測的最大化，如Manglos，SH，Jaszcak，RJ，和Floyd，CE所闡述，“錐形束SPECT的最大相似度重建構(gòu)建和初步測試”，Physics in Medicine and Biology 34(12)1947-57，1989，#1382)，和OSEM(有序子集預(yù)測的最大化，如Mangols，SH，Gagne，GM，Krol A，Thomas，F(xiàn)D，和Narayanaswamy，R，“用有序子集對錐形束CT進行傳輸最大相似度重建”，Phsics in Medicine and Biology 40(7)1225-41，1995，#4389)。
方法流式細(xì)胞分析儀圖5為根據(jù)本發(fā)明的實施方案構(gòu)建的一個流式光學(xué)斷層成像(FOT)系統(tǒng)的實例示意圖。該流式光學(xué)斷層成像系統(tǒng)包括一種流式細(xì)胞儀，重建柱20位于毛細(xì)管2的周圍。光子源25、光子感應(yīng)器26和脈沖高度分析儀27一起形成一個觸發(fā)裝置。脈沖高度分析儀27根據(jù)已知的原則工作，提供用于細(xì)胞開始的第一個觸發(fā)點28以及用于細(xì)胞結(jié)束的第二個觸發(fā)點29。脈沖高度分析儀27輸出與每個細(xì)胞開始和結(jié)束相對應(yīng)的觸發(fā)信號30，這些觸發(fā)信號由重建柱20接收。
計算機40通過信號線41-43耦連以傳輸數(shù)據(jù)、控制信號和記錄信號到點光源21、感應(yīng)元件23和脈沖高度分析儀27的時間。上述計算機可以包括足以用于圖像獲取和圖像重建處理的一個或多個已知的計算機和處理器陣列。
商用流式細(xì)胞儀有三個基本的流式配置，即柱狀流式管、矩形流式管和空氣系統(tǒng)中的流式。(見Shapirl，HM，實用流式細(xì)胞分析術(shù)，第三版，Wiley-liss，1995)。柱狀流式管屬優(yōu)先配置，因為對于重建算法來說保持最佳的柱狀幾何特征對于減少由于流式硬件帶來的任何半徑依賴非常重要(見圖1)。而且，柱狀流式管具有與毛細(xì)管橫斷面相關(guān)的均一薄壁。
另外，觸發(fā)裝置可位于重建模塊的上游，當(dāng)細(xì)胞以最優(yōu)方式進入和流出重建柱時該裝置提供一個“開始”和“終止”數(shù)據(jù)收集的記時信號。觸發(fā)裝置可包括一個激光二極管、CCD、PMT、一個光檢測器組合、一個固態(tài)光檢測器以及前述元件的聯(lián)合體。觸發(fā)裝置有一個用于感知流過細(xì)胞的閾值設(shè)定，從而產(chǎn)生觸發(fā)信號，與已知的細(xì)胞速率一起用于計算下游的重建柱何時開始收集感興趣細(xì)胞的數(shù)據(jù)。另外，第一和第二觸發(fā)點的時間間隔對應(yīng)于細(xì)胞流入和流出重建柱，該時間間隔可被分為均等或不均等的增量，在每個增量中可通過控制光源21和讀取感應(yīng)陣列23而獲取額外的投射數(shù)據(jù)。
細(xì)胞流的速率需精確控制和測量。這可通過高端的商用系統(tǒng)實現(xiàn)，該系統(tǒng)使用的速率在1米/秒到10米/秒之間。最佳細(xì)胞速率將取決于對數(shù)據(jù)收集速度和信噪比的考慮，這一點將在下面進行討論。
重建模塊圖6為根據(jù)本發(fā)明的實施方案構(gòu)建的一個重建柱20內(nèi)扇形光束投射的實例示意圖。構(gòu)建重建柱的目的在于提供一種投射光的方式，即從沿著一小段圓周的多個固定的點光源21a-21c向柱狀的毛細(xì)管進行投射。從點光源發(fā)射的光子具有已知的投射幾何學(xué)特征，如呈扇形或圓錐形，這些光束穿過毛細(xì)管、被一列感應(yīng)元件23a、23b或者23c所檢測，這些感應(yīng)元件可以位于點光源對面的較大段圓周上，這要依具體情況而定。盡管為了闡述問題這里描述了適于扇形光束透射的弧線形(1D)排列的感應(yīng)器陣列，需要明確是適于錐形光束透射的直線形(1D)感應(yīng)器陣列或平面(2D)感應(yīng)器陣列也可類似地應(yīng)用。通過上述方式，可產(chǎn)生一套投射光，這些投射光像直線一樣將點光源與一個感應(yīng)元件聯(lián)系起來。沿某一特定的投射線路(如線路31)離開光源的光子數(shù)目和特定的感應(yīng)元件接收到的光子數(shù)目之間的差異，與光子同投射光路中流式管內(nèi)的細(xì)胞以及其他成分相互作用時丟失或衰減的光子數(shù)目有關(guān)。
然而，光散射可帶來一些問題，如光子能量偏移、幾何學(xué)缺陷、準(zhǔn)度差，以及多個光源同時發(fā)光時來自不同光源的光子均到達一個特定的感應(yīng)元件。通過仔細(xì)構(gòu)建重建柱，例如謹(jǐn)慎選擇點光源及其對面感應(yīng)器排列的幾何學(xué)圖形(如本發(fā)明所述)，正確調(diào)定或多路記數(shù)(multiplexing)多個點光源激發(fā)和感應(yīng)器讀取的時間，上述因素導(dǎo)致的光子污染可被最小化，但不能完全消除。
例如在沒有細(xì)胞時，光子污染可通過系統(tǒng)校準(zhǔn)來解決。即，每個點光源依次發(fā)光，測定其對每個感應(yīng)器的效應(yīng)，從而提供用于標(biāo)化系統(tǒng)的偏移數(shù)據(jù)?？梢圆捎靡粋€額外的校準(zhǔn)步驟，如對乳膠多聚體顆粒、其他小球或扁球形物成像，它們的光學(xué)特性已知并具有與細(xì)胞成像有關(guān)的密度變化范圍。通過應(yīng)用位于感應(yīng)器的光譜帶通濾波器(spectralbandpass filter)可以區(qū)別從熒光探針發(fā)出的光子和來自點光源的光子。這將在下面進行討論。
光源每個光源可有一些相同的一般特性，首選的是·可以是一個近似的小環(huán)狀點光源，·可以很亮并具有已知的光譜，·從光源發(fā)出的光子具已知的幾何學(xué)特征，如錐形束或扇形束。每個光源為產(chǎn)生一個投射角的數(shù)據(jù)。多個投射角沿螺旋排列，該螺旋的軸即流式管的中心軸，在細(xì)胞流過模塊時這些光源產(chǎn)生穿過每個連續(xù)平面(或重建切面)的多個投射角數(shù)據(jù)。依據(jù)感應(yīng)器排列的幾何學(xué)特征，幾個點光源可在同一個圓周上線性排列，使得投射光在感應(yīng)器上不發(fā)生重疊。在一個180度螺旋上等距排列光源可以得到一個好的幾何學(xué)取樣模式，盡管較小的角度覆蓋范圍在某些情況也可被接受，而采用360度角可以改善信噪比。光源的數(shù)目是每個平面重建(x-y平面)或立體重建所需分辨率的函數(shù)。雖然在闡述問題時使用的是點光源的螺旋狀排列方式，應(yīng)明確的是點光源的排列可采取許多種幾何方式。此外，光源的波長可以選擇，可使用多種二極管或其他激光，或?qū)Π坠饣蚱渌麑捵V光源，例如汞或氙氣弧光燈，進行帶通過濾。
圖7為根據(jù)本發(fā)明的實施方案構(gòu)建的一個重建柱(如圖6)從上面觀察的實例示意圖。圖示第一個點光源21a和感應(yīng)陣列23a，含細(xì)胞核19的細(xì)胞以與頁面垂直的方向流動，光源投射的軌跡以二維的形式參與構(gòu)成一個重建環(huán)32。重建環(huán)中的所有投射，即使以按時間順序堆積的方式獲取，被描述為相互重疊；這個重建環(huán)包含整個細(xì)胞。第二點光源21b和第二個感應(yīng)陣列23b位于螺旋上約30°的方位。第三點光源21c和第三個感應(yīng)陣列23c位于螺旋上約90°的方位。
數(shù)據(jù)收集與細(xì)胞速率同步設(shè)門，這一設(shè)門在細(xì)胞的一個“厚”的軸橫斷面內(nèi)。所需的平面厚度是要求的z軸方向分辨率的函數(shù)。一般情況下，軸向(z向)分辨率要小于穿軸平面方向的分辨率。另外，最佳重建環(huán)由各投射扇的重疊交集確定，這些投射扇的頂端為點光源，而底寬為感應(yīng)器陣列。理想的情況是，重建柱的幾何學(xué)特性應(yīng)確保流動細(xì)胞的橫斷面被完全包含在重建環(huán)中。
在構(gòu)建點光源時可以采取如下措施
·位于激光或其他高能量光源前的針孔，·小橫斷面的光纖，·光源前的短焦距透鏡，·照射磷面上一個點的電子束(一種CRT)，以及·上述因素的各種組合。
由于幾何特征的因素，點光源與感興趣物體(細(xì)胞)的距離越近，放大倍數(shù)就越高，這是因為，物體離光源越近，其包含的幾何學(xué)角度越大。相反，如基于系統(tǒng)設(shè)計已知所需的分辨率，那么就可以對該幾何特征進行優(yōu)化以獲得特定的分辨率。對于上述背景，熟悉本領(lǐng)域的技術(shù)人員可參考Blass，M主編光學(xué)手冊纖維光學(xué)和非線性光學(xué)，第二版，第IV卷，Mcgraw-Hill，2001。
參見圖8，圖8為根據(jù)本發(fā)明的實施方案構(gòu)建的用于細(xì)胞重建過程的直線陣列23的實例示意圖。例如，假定一個細(xì)胞橫斷面12和核19包含在一個直徑30微米的重建環(huán)中，分辨率為0.5微米，那么以Nyquist取樣(如以因子2進行重疊取樣)顯示，對于每個點光源21，至少需要120個感應(yīng)元件33。位于頂部的點光源21和基底部的線性陣列長度34構(gòu)成一個三角形35，從而使直徑30微米的細(xì)胞位于三角形35內(nèi)的情況下盡可能地與點光源21相接近。在這個例子中，如果陣列(如CCD)中的每個元件是20微米寬，陣列長度為2400微米，那么，細(xì)胞中心應(yīng)位于離點光源100微米處(為毛細(xì)管直徑的一半)，而點光源與線性陣列的距離是8毫米，放大倍數(shù)為80。
第二個例子，一個直徑30微米的重建環(huán)和一個互補金屬氧化物半導(dǎo)體(CMOS)感應(yīng)陣列，其中的像素單元大小為4微米。在本例中，陣列含120個元件，寬度為480微米，點光源與細(xì)胞的距離為100微米時，離點光源的距離為1.6mm，放大倍數(shù)為16。
感應(yīng)元件每個點光源應(yīng)有相應(yīng)的感應(yīng)元件陣列如CCD，該陣列呈直線或曲線形幾何形狀排列，位于點光源的對面以接收穿過重建環(huán)的光子。一般情況下，感應(yīng)元件的線性陣列的中點位于過點光源與流動中心軸的直線上，且該陣列線可與流動軸垂直?？赡苡玫?D陣列，位于2D陣列中的每一列元件只有某一子集被讀取用于重建輸入。在2D陣列中，每個連續(xù)的元件亞單位可通過合適的元件數(shù)目而交錯排列，這些元件根據(jù)沿螺旋排列的每個不同點光源作適當(dāng)?shù)呐帕小?br> 對于一個一個切面的扇形束重建，采用30微米重建環(huán)，每扇120個感應(yīng)元件、分辨率0.5微米，2000×2000的20微米元件的2D陣列足以感應(yīng)以1個放射角增量排列的136個點光源，而連續(xù)觀測間的平均偏移是300微米，相當(dāng)于15個感應(yīng)元件(在陣列中央，偏移可能是140微米，或7個元件，而在陣列邊緣，掃過觀察間的1個放射角可以有一個相當(dāng)大的偏移)。如果平均15個感應(yīng)器陣列以提供一個切面的投射數(shù)據(jù)，那么細(xì)胞圖像在z軸的分辨率為3.75微米；如果每個投射平均需2個陣列，那么物體空間的軸向分辨率為0.5微米，與橫軸分辨率相等。
在本發(fā)明的一項優(yōu)選實施方案中，2D陣列沿柱狀圓周弧形分布，該圓周與重建柱同軸，使得光線的長度均等。對于30微米重建環(huán)，弧形的2D陣列僅含有對面螺旋形點光源所需的元件，這個陣列可呈螺旋帶狀，有120個元件寬，136個元件高(長)，如上例所述。
雖然前面出于說明的目的描述了平面或“厚”扇形照射，需要明確的是，真實的、非校準(zhǔn)的錐形束照射可與2D平面感應(yīng)器一起使用，從而通過錐形束算法獲得3D重建。2D投射圖像可直接分析以獲得有關(guān)細(xì)胞疾病情況或轉(zhuǎn)化狀態(tài)的信息。對于直接的、空間錐形束重建，假如點光源和感應(yīng)器呈幾何學(xué)排列，來自多個點光源的照射是多路傳輸?shù)?，使得來自不同點光源的錐形光束在感應(yīng)器陣列上不發(fā)生重疊。
另外，如果細(xì)胞以1米/秒(或1,000,000微米/秒)的速率流動，同時2D陣列中的每個元件寬度為20微米，那么每隔20微秒的一個線性讀出(read-out)就可以獲取一個細(xì)胞0.25微米切面上的數(shù)據(jù)。對于下述例子，如果平均15個感應(yīng)器均勻排列用以提供一個3.75微米切面的數(shù)據(jù)，那么每隔300微秒發(fā)生一次讀出。使用一個更大的2D陣列可使重建圖像的質(zhì)量獲得顯著改善。
本發(fā)明的一個實施方案尤其適用于含多個透射或發(fā)射光波段的多光譜成像，該方案可以包括兩個或更多連續(xù)排列的重建模塊。上述多個重建柱以毛細(xì)管上的插入部分相互隔開，而每個重建模塊提供的投射信息均足以為流經(jīng)的物體產(chǎn)生完整的重建影像。每個重建模塊的點光源和/或感應(yīng)陣列均有一種最佳的特定光譜波段。例如，第一個重建模塊可采用高亮的白光照射、無濾光的感應(yīng)器，從而提供完整的投射數(shù)據(jù)以重建物體的光密度、吸收或散射系數(shù)圖，而第二個重建模塊可采用諸如氬離子激光(488nm)作照射、波長在495nm左右的較狹窄光譜，從而激發(fā)熒光探針標(biāo)記的蛋白以用于免疫熒光分析，和對520nm散射敏感的濾光感應(yīng)陣列一起產(chǎn)生第二個完整的投射數(shù)據(jù)，通過應(yīng)用如下述的散射重建算法，足以構(gòu)建被標(biāo)記蛋白濃度分布圖。第三個重建模塊采用535nm和/或342nm左右的窄帶光譜進行照射以激發(fā)與DNA化學(xué)計量(stoichiometrically)結(jié)合的碘化丙錠(propidium iodide)，其濾光感應(yīng)器優(yōu)先檢測紅色散射光(617nm)以進行倍性(ploidy)研究。需要明確的是，舉上述例子出于說明的需要，該方法管用適用于任何波長的照射和感應(yīng)。
圖像重建最常用和最易執(zhí)行的重建算法是濾過背景投射方，該方法源自采用錐形束和扇形束幾何特征的計算機X線斷層成像術(shù)(CT)的相似范例。(參見下述文獻，如，Kak，AC和Slaney，M.計算機斷層成像原理，IEEE Press，紐約，1988，以及Herman，G，緣自投射的圖像重建計算機斷層成像基礎(chǔ)，Academic Press，紐約，1988。)這些方法均基于改良的Radon變形法則，反映了光源/感應(yīng)器配置的特定幾何特征和照射光束的路徑。然而，對于用以一個接一個切面獲取圖像的臨床用X線CT，人體通常被固定，而X線光源和感應(yīng)器則沿繞著患者的圓弧移動以收集在一個切面內(nèi)來自多個投射角的數(shù)據(jù)。接著，人體在z軸上重新定位，于是收集另一個切面的數(shù)據(jù)，如此等等。而對于更現(xiàn)代的螺旋CT，患者在z軸上連續(xù)運動的同時光源-感應(yīng)器連續(xù)旋轉(zhuǎn)以提供螺旋投射數(shù)據(jù)，這些數(shù)據(jù)提供了與患者z軸垂直的投射。在流式光學(xué)斷層成像術(shù)中，物體(細(xì)胞)相對于靜止的光源和感應(yīng)器陣列以恒速運動，而多個光源/感應(yīng)系統(tǒng)以沿細(xì)胞速率向量的特定時間點同步獲取數(shù)據(jù)，其方式是在一個給定的切面或空間產(chǎn)生多個投射角數(shù)據(jù)。對于一個接一個切面的掃描，重建算法將計算垂直于軸向運動平面的2D圖像，多個切面的連續(xù)堆積就產(chǎn)生了物體的3D影像，對應(yīng)的分別是CT或流式光學(xué)斷層成像中物體X線衰減系數(shù)或光密度變化的函數(shù)。對于空間、錐形束掃描，重建算法直接從平面?zhèn)鞑セ蛏⑸涔獾耐渡渲杏嬎慵?xì)胞或其他物體內(nèi)某個空間的3D圖像，對應(yīng)的分別是光密度和/或標(biāo)記探針的密度分布函數(shù)。
對于產(chǎn)生細(xì)胞密度重建的光傳播數(shù)據(jù)或/和重建標(biāo)記探針分布的光散射數(shù)據(jù)，可采用圖像重建算法而不是濾過背景投射。通常稱為迭代重建算法，該算法在某些情況下更為有效，尤其是對于散射斷層成像，和可能的本發(fā)明中物體軸向?qū)ΨQ、具三腔的情況，從而可以在重建算法中整合一些預(yù)先信息以提高重建的質(zhì)量(見，如Gilbert，P，“用于投射物體三維重建的迭代方法”，Journal of Theoretical Biology 36105-17，1972，以及上述其他參考文獻)。
類似地，一種方法可以采用基于有限元模式(FEM)的統(tǒng)計學(xué)重建算法。FEM算法源自線性轉(zhuǎn)移理論，即光子彌散/轉(zhuǎn)移方程通過元件的所有邊界得到解決，從而產(chǎn)生一個將被成像物體的吸收、散射、折射指數(shù)和各種異性因子特性結(jié)合起來的二維或三維圖像。關(guān)于該方法的范例見Psulsen，KD和Jiang，H，“應(yīng)用有限元彌散等式近似進行空間變化光學(xué)性質(zhì)重建”，Medical Physics 22(691-701)1995，Hampel，U和Freyer，R，“用于放射性對稱邊緣介質(zhì)中光學(xué)吸收斷層成像的快速圖像重建”，Medical Physics 25(1)92-101，1998，和Jiang，H，Paulsen，KD，和Osterberg，UL，“頻率區(qū)域近紅外光子彌散成像在多靶位類組織模型中的初步評價”，Medical Physics 25(2)183-93，1998。
色譜分離如果采用多色譜點光源(如白光)，那么不同的色譜著色(如chromaphor)就可以用來對一個既定細(xì)胞內(nèi)多個分子探針和結(jié)構(gòu)特征進行區(qū)別。在這里，光源或感應(yīng)器(或二者)中的系列帶通濾過器對波長數(shù)據(jù)進行分離，使得可以對各個染色的分子進行重建和空間定位。對多探針成像的一個更有效的方法是采用高亮白光源、在感應(yīng)器陣列端同時收集多個濾過波段，使得圖像重建算法可以對每種色計算空間圖像切面。這些可以顯示為彩色圖像。
熒光、磷光、化學(xué)發(fā)光和納米-顆粒發(fā)射作為流式光學(xué)斷層成像系統(tǒng)的一個特例，某些分子探針可以標(biāo)記上一個“報道者”，其在原始光源刺激后可以發(fā)出不同(更長)波長的光。來自報道者的繼發(fā)光可以被標(biāo)準(zhǔn)的濾光器過濾，從而將原發(fā)光和繼發(fā)光區(qū)別開來。然而，繼發(fā)光圖像重建算法更為復(fù)雜，因為繼發(fā)光不一定以直線方式來自點光源。假定繼發(fā)光以一種均勻的球形方式從繼發(fā)光源輻射，那么繼發(fā)光到達任何感應(yīng)元件的強度就是它到感應(yīng)元件距離的簡單函數(shù)。當(dāng)來自繼發(fā)光源的光子呈非球形分布時需作進一步改進，即提供一個與光源相關(guān)并位于重建切面內(nèi)繼發(fā)光球形分布的模式。每種方法都將提供一種計算繼發(fā)光源在重建切面或空間內(nèi)定位的手段。被成像物體與感應(yīng)器陣列間的對準(zhǔn)將提高圖像重建質(zhì)量。
如果用光學(xué)濾波器同時測定初始光子強度和繼發(fā)光子強度，那么源自初始光子強度的高分辨率密度重建可以被繼發(fā)光源重建重疊或融合，從而在單一重建圖像中可以得到局部探針濃度的圖像形態(tài)。根據(jù)光子強度、信噪比、光源和/或感應(yīng)器的濾光能力或產(chǎn)生窄帶光的能力，可以使用與不同的標(biāo)記分子探針相對應(yīng)的多個繼發(fā)光源。
美國專利6,201,628，標(biāo)題為“高通量光學(xué)掃描儀”，發(fā)布日期2001年3月13日，作者Basiji等，公布了一種可以對物質(zhì)熒光、光密度或磷光進行自動、快速和敏感掃描的掃描儀。該掃描儀采用固定路徑長度的光學(xué)序列，將用于高速掃描的移動光束和用于減噪的相位敏感檢測結(jié)合起來。該掃描儀含有一個光源，一個掃描鏡用以接收來自光源的光并將其掃過操縱鏡(steering mirror)，一個操縱鏡用以接收來自掃描鏡的光并將其反射到底物，光沿一個掃描弧掃過底物，以及一個光感應(yīng)器以接收從底物發(fā)射或散射的光，其中光源到感應(yīng)器的光路長度在光掃描底物的過程中大體上保持穩(wěn)定。光學(xué)序列還可包含一個波導(dǎo)或鏡子以收集從底物發(fā)射或散射的光并將其引導(dǎo)至光感應(yīng)器。對于相位敏感檢測，光源的強度可調(diào)節(jié)，而感應(yīng)器與相位敏感的感應(yīng)電子設(shè)備相連接。還提供一個使用底物移動的掃描儀。對于二維成像，底物在一維方向被移動，而掃描鏡在第二維方向掃描光束。對于一個高通量的掃描儀，堆積的底物從一個加樣盤裝載到傳送帶上。美國專利6,201,628列在此作為參考。
本發(fā)明在此描述相當(dāng)詳細(xì)，目的是為了順應(yīng)專利法規(guī)，同時為熟悉本專業(yè)的人士提供應(yīng)用本發(fā)明的新原則所需的信息，并按要求構(gòu)建和使用上述例示性的和特定的部件。然而，需要明確的是，本發(fā)明也可在特定的不同裝備、儀器以及重建算法下進行實施，而在不偏離本發(fā)明的真實精神和范圍的前提下，可以對具體裝備和操作步驟進行各種改良。
權(quán)利要求
1.一種用于顯微鏡下物體成像和分析的流式光學(xué)斷層成像方法，該方法包括以下幾個步驟(a)將至少一個物體注射至一只注射管(3)內(nèi)；(b)控制至少一個物體使之流過毛細(xì)管(2)，由此該至少一個物體沿著液流的軸向延伸并緊鄰毛細(xì)管(2)的中心軸(9)移動；(c)以排列在毛細(xì)管(2)周圍的至少一個點光源(21)取樣，并與排列在至少一個點光源(21)對側(cè)離毛細(xì)管(2)有一段距離的至少一個對應(yīng)的光學(xué)感應(yīng)器(23)相連，因此在至少一個物體內(nèi)沒有焦平面，當(dāng)至少一個物體流經(jīng)至少一個點光源(21)及其至少一個對應(yīng)的光學(xué)傳感器(23)時采集通過此至少一個物體的多投射角；以及(d)生成一系列的計時信號(28，29)，每一計時信號(28，29)都與沿著至少一個物體的Z-向軸(9)的特定位置相對應(yīng)，從而產(chǎn)生穿過至少一個物體的一系列時控的光學(xué)投射。
2.根據(jù)權(quán)利要求1中所述的方法進一步包括重建一系列時控的光學(xué)投射來形成二維(2D)切面的步驟。
3.根據(jù)權(quán)利要求1中所述的方法進一步包括重建一系列時控的光學(xué)投射來形成三維(3D)空間的步驟。
4.根據(jù)權(quán)利要求2中所述的方法進一步包括將至少一個物體的連續(xù)的2D切面組合起來制成三維(3D)圖像的步驟。
5.根據(jù)權(quán)利要求1中所述的方法，其中所述的光學(xué)投射包括二維(2D)光學(xué)投射，進一步包括根據(jù)至少一個物體的二維(2D)光學(xué)投射生成三維(3D)圖像的步驟。
6.權(quán)利要求1中所述的方法進一步包括在毛細(xì)管(2)內(nèi)產(chǎn)生層流，從而使至少一個物體能夠以恒定的速度移動。
7.根據(jù)權(quán)利要求1中所述的方法，其中所述的至少一個物體是一個細(xì)胞(1)。
8.權(quán)利要求5中所述的方法進一步包括用3D圖像來定量測定顯微鏡下結(jié)構(gòu)的步驟。
9.根據(jù)權(quán)利要求8中所述的方法，其中所述的顯微鏡下結(jié)構(gòu)包括亞細(xì)胞結(jié)構(gòu)。
10.根據(jù)權(quán)利要求5中所述的方法，其中所述的至少一個物體包括含有至少一種標(biāo)記的分子探針的細(xì)胞(1)，進一步包括用3D圖像來測定至少一種標(biāo)記的分子探針的位置和數(shù)量的步驟。
11.根據(jù)權(quán)利要求2中所述的方法，其中所述的至少一個物體包括含有至少一種分子探針的細(xì)胞(1)，這種分子探針提供分子探針信息，該方法進一步包括將2D切面和分子探針信息組合起來用來確定特定的亞細(xì)胞結(jié)構(gòu)與至少一種分子探針之間的聯(lián)系。
12.根據(jù)權(quán)利要求1中所述的方法，其中所述的至少一個物體包括一個細(xì)胞(1)，該方法進一步包括用于細(xì)胞成像和分析的重建環(huán)中的操作步驟，從而使通過投射進行采樣的空間含至少下述三個腔室(a)細(xì)胞(1)外的液體，(b)細(xì)胞漿(18)，以及(c)細(xì)胞核(19)。
13.根據(jù)權(quán)利要求12中所述的方法進一步包含下述步驟(a)如果至少一個分子探針中的特定探針僅與細(xì)胞壁(12)和核壁(13)的表面結(jié)合，那么計算包括細(xì)胞壁(12)和核壁(13)的界面；以及(b)否則將三個不同腔室間的轉(zhuǎn)移界面確定為細(xì)胞壁(12)和核壁(13)的表面。
14.根據(jù)權(quán)利要求12中所述的方法進一步包含下述步驟(a)測定某一基因產(chǎn)物在相對于細(xì)胞核(18)的細(xì)胞漿(19)中表達相對上調(diào)或下調(diào)情況；(b)以背景懸液中的非結(jié)合探針進行標(biāo)化。
15.根據(jù)權(quán)利要求14中所述的方法進一步包含下述步驟如果基因產(chǎn)物是一種蛋白，用一種標(biāo)記的抗體探針評價細(xì)胞(1)的至少一種疾病狀態(tài)和轉(zhuǎn)化狀態(tài)。
16.根據(jù)權(quán)利要求14中所述的方法進一步包含下述步驟如果基因產(chǎn)物是一種蛋白，用一種核酸探針評價細(xì)胞(1)的至少一種疾病狀態(tài)和轉(zhuǎn)化狀態(tài)。
17.用于顯微鏡下物體成像和分析的流式光學(xué)斷層成像系統(tǒng)包括(a)含毛細(xì)管(2)的流式細(xì)胞儀；(b)環(huán)繞毛細(xì)管(2)設(shè)置的至少一個重建柱(20)；(c)一個觸發(fā)裝置(25，26，27)，定位以觀測流經(jīng)毛細(xì)管(2)的至少一個物體，對至少一個物體產(chǎn)生觸發(fā)信號(28，29)，該觸發(fā)信號(28，29)被至少一個重建柱(20)接收，至少一個重建柱(20)響應(yīng)觸發(fā)信號(28，29)，并產(chǎn)生代表至少一個物體投射圖像的信號，這些信號被處理以提供至少一個物體的三維信息。
18.根據(jù)權(quán)利要求17中所述的流式光學(xué)斷層成像系統(tǒng)，至少一個物體以某一速度(V)流經(jīng)毛細(xì)管(2)，其中至少一個物體包括一個細(xì)胞(1)，該細(xì)胞有細(xì)胞漿壁和細(xì)胞核壁(13)，細(xì)胞(1)在流經(jīng)毛細(xì)管(2)的過程中穿過多個重建平面，一個穿過細(xì)胞核壁(13)的平面切面位于每個重建平面內(nèi)，典型情況下重建平面之間的距離(d)小于10微米，每個細(xì)胞(1)的一個點與時間間隔(t)中的每個重建平面相一致，時間間隔根據(jù)下述關(guān)系進行描述t＝d÷V。
19.根據(jù)權(quán)利要求18中所述的流式光學(xué)斷層成像系統(tǒng)，其中細(xì)胞(1)以至少一種用于疾病診斷的標(biāo)記分子探針進行標(biāo)記。20.根據(jù)權(quán)利要求17中的流式光學(xué)斷層成像系統(tǒng)，進一步包括(a)用以控制至少一個物體接近沿某一軸流動的速度(V)的裝置；(b)沿至少一個物體的軸(9)定位二維(2D)重建平面以產(chǎn)生至少一個物體的三維(3D)圖像的裝置；以及(c)在重建柱(20)中正確定位至少一個物體、從一系列或多個二維(2D)投射數(shù)據(jù)中產(chǎn)生細(xì)胞(1)的三維(3D)圖像的裝置(27，40)。
21.根據(jù)權(quán)利要求17中所述的系統(tǒng)，其中所述的至少一個重建柱包括(a)以預(yù)先確定的螺旋斜度分布的一個點光源(21)螺旋，其中每個點光源(21)產(chǎn)生一束光子(22)，該光子束(22)呈扇形或錐形，至少一個物體移動并穿過點光源螺旋，在穿過至少一個物體的不同角度方向產(chǎn)生多個投射；(b)環(huán)繞至少一個重建柱(20)、以毛細(xì)管軸(9)為中心，以幾何圖形分布的點光源(21)軌跡；(c)點光源(21)發(fā)射光子以放射狀投射穿過至少一個物體并被點光源(21)對面的至少一個感應(yīng)器(23)所檢測。
22.根據(jù)權(quán)利要求21中所述的系統(tǒng)，多個重建柱(20)呈系列設(shè)置，照射流經(jīng)毛細(xì)管的至少一個物體的點光源(21)發(fā)射的光波波長涵蓋從X線到遠(yuǎn)紅外線的電磁波譜。
23.根據(jù)權(quán)利要求22中所述的系統(tǒng)，其中所述的位于重建柱(20)間和/或重建柱(20)內(nèi)的光源發(fā)射的光譜不同。
24.根據(jù)權(quán)利要求23中所述的系統(tǒng)，其中所述的發(fā)射光譜含以最大觸發(fā)免疫熒光染料和標(biāo)志為中心的窄帶光譜。
25.根據(jù)權(quán)利要求22中所述的系統(tǒng)，其中所述的多個重建柱(20)呈系列設(shè)置，光感應(yīng)器陣列(23)經(jīng)光譜帶寬濾過，以感測對用于至少一個免疫熒光研究和倍性研究的熒光團發(fā)射光的波長。
26.根據(jù)權(quán)利要求22中所述的系統(tǒng)，其中所述的多個重建柱(20)呈系列設(shè)置，隔以毛細(xì)管(2)的插入部分。
27.根據(jù)權(quán)利要求22中所述的系統(tǒng)，其中所述的發(fā)射光波長范圍跨越從10埃到2000微米的電磁波譜。
28.根據(jù)權(quán)利要求17中所述的系統(tǒng)，其中所述的多個點光源(21)在毛細(xì)管(2)上以一種幾何圖形排列，使得至少一個物體穿過點光源陣列(21)時其中的每一個點通過多個角度被取樣。
29.根據(jù)權(quán)利要求28中所述的系統(tǒng)，其中所述的幾何圖形包括螺旋形。
30.根據(jù)權(quán)利要求29中所述的系統(tǒng)，點光源(21)覆蓋圓周的任意角度范圍，沿至少180度角以等角遞增分布。
31.根據(jù)權(quán)利要求17中所述的系統(tǒng)，其中所述的毛細(xì)管(2)包含與毛細(xì)流橫斷面相關(guān)的均一薄壁。
32.根據(jù)權(quán)利要求17中所述的系統(tǒng)，其中所述的觸發(fā)狀置(25，26)位于重建模塊的上游，從而在至少一個物體進入然后從重建柱中流出時提供一個用以起始并接著終止數(shù)據(jù)接收的計時信號。
33.根據(jù)權(quán)利要求17中所述的系統(tǒng)，其中所述的觸發(fā)裝置選自激光二極管、CCD、PMT、固相光檢測器，以及上述元件的各種組合。
34.根據(jù)權(quán)利要求17中所述的系統(tǒng)，其中的觸發(fā)裝置產(chǎn)生觸發(fā)信號，該信號與至少一個物體的速度(V)一起用于計算下游的重建模塊何時開始收集感興趣的至少一個物體的數(shù)據(jù)。
35.根據(jù)權(quán)利要求34中所述的系統(tǒng)，其中所述的觸發(fā)裝置(25，26，27)產(chǎn)生觸發(fā)信號(28，29)，觸發(fā)信號與至少一個物體的速度(V)一起用于計算下游重建模塊的時間點，以獲得基于上游觸發(fā)信號(28，29)設(shè)定的沿時間增量的多個投射數(shù)據(jù)。
36.根據(jù)權(quán)利要求17中所述的系統(tǒng)，其中所述的毛細(xì)管(2)用于產(chǎn)生從1m/s至10m/s的速度。
37.根據(jù)權(quán)利要求17中所述的系統(tǒng)，其中的重建柱(20)產(chǎn)生從多個固定點光源(21)進入毛細(xì)管(2)的投射光線，從點光源發(fā)射的光子有一個選擇的幾何學(xué)特征，使得在物體內(nèi)部不存在焦平面。
38.根據(jù)權(quán)利要求17中所述的系統(tǒng)，其中所選的投射幾何學(xué)特征選自從錐形和扇形。
39.根據(jù)權(quán)利要求37中所述的系統(tǒng)，其中所述的投射光線穿過至少一個物體、被至少一個感應(yīng)元件陣列所檢測。
40.根據(jù)權(quán)利要求39中所述的系統(tǒng)，其中(a)至少一個感應(yīng)元件陣列(23)置于對應(yīng)的光源(21)對面，陣列(23)以任意幾何圖形設(shè)置；(b)至少一個感應(yīng)元件陣列(23)有光學(xué)帶寬過濾器，其中穿過的光譜波段依感應(yīng)器陣列而不同，這些陣列在多個重建模塊(20)內(nèi)部或之間。
41.根據(jù)權(quán)利要求17中所述的系統(tǒng)，其中所述的偏移數(shù)據(jù)用以對系統(tǒng)進行標(biāo)化。
42.根據(jù)權(quán)利要求41中所述的系統(tǒng)，其中所述的系統(tǒng)通過下述方式校準(zhǔn)i)在流式管中沒有至少一個物體時獲取圖像；ii)獲取已知光學(xué)特性的至少一個物體的圖像。
43.根據(jù)權(quán)利要求42中所述的系統(tǒng)，其中所述的校準(zhǔn)數(shù)據(jù)經(jīng)過重建。
44.根據(jù)權(quán)利要求42中所述的系統(tǒng)，其中所述已知光學(xué)特性的至少一個物體選自乳膠微球、多聚微球和扁球體。
45.根據(jù)權(quán)利要求37中所述的系統(tǒng)，其中所述的各個點光源包括一個環(huán)形光源。
46.根據(jù)權(quán)利要求37中所述的系統(tǒng)，其中所述的重建環(huán)由來自頂部光源和基底部寬的感應(yīng)陣列構(gòu)成的放射狀重疊的扇形投射所確定。
47.根據(jù)權(quán)利要求37中所述的系統(tǒng)，其中所述的點光源選自下述點光源設(shè)備(a)激光前方的針孔；(b)光纖；(c)光子源前的短焦距透鏡；(d)照射熒光表面一個點的電子束；(e)高強度光子源；以及(f)上述元件從(a)至(e)的任意組合。
48.根據(jù)權(quán)利要求37中所述的系統(tǒng)，其中所述的感應(yīng)器元件陣列選自下列元件電荷耦合器(CCD)、光電二極管、CMOS、CdZnTe、MgI感應(yīng)器、固相感應(yīng)器、以及包括線性排列的任意元件組合的光敏元件陣列。
49.根據(jù)權(quán)利要求48中所述的系統(tǒng)，其中所述的感應(yīng)器陣列以光源和流式中心軸間的直線為中心。
50.根據(jù)權(quán)利要求49中所述的系統(tǒng)，其中所述的感應(yīng)器陣列與流式軸垂直排列。
51.根據(jù)權(quán)利要求29中所述的系統(tǒng)進一步含連續(xù)的亞元件交錯排列的多個固定點光源，上述元件與沿螺旋排列的點光源(21)上的每一個不同點光源組成適當(dāng)排列。
52.根據(jù)權(quán)利要求29中所述的系統(tǒng)，其中所述的感應(yīng)元件陣列(23)沿一個柱形圓周弧形排列，該圓周與重建柱(20)同心。
53.根據(jù)權(quán)利要求17中所述的系統(tǒng)，其中所述的重建柱(20)提供采用濾波背景投射算法進行重建的重建信號，該算法計算與移動軸垂直的二維(2D)切面圖像，而多個切面的連續(xù)堆積產(chǎn)生了至少一個物體的三維(3D)圖像，對照的差異是至少一個物體內(nèi)光密度變量的函數(shù)。
54.根據(jù)權(quán)利要求17中所述的系統(tǒng)，其中所述的色譜分析儀用來區(qū)分一個細(xì)胞(1)內(nèi)的多個分子探針和結(jié)構(gòu)特征。
55.根據(jù)權(quán)利要求17中所述的系統(tǒng)進一步包含與重建柱耦合的系列帶寬濾波器，用以分離波長數(shù)據(jù)，并對各個染色分子進行重建和空間定位。
56.根據(jù)權(quán)利要求1中所述方法進一步包含采用高強度白光源照射至少一個物體、同時收集多個濾過波長。
57.根據(jù)權(quán)利要求1中所述方法進一步包含下述步驟(a)以一個報道者來標(biāo)記分子探針，該報道者在原發(fā)光子源激發(fā)后發(fā)射不同波長的光；(b)濾過來自報道者的繼發(fā)發(fā)射光，從而將原發(fā)光子和繼發(fā)發(fā)射光子區(qū)分開來。
58.根據(jù)權(quán)利要求17中所述的系統(tǒng)，其中所述的重建柱(20)以微制作技術(shù)制造。
59.用于顯微鏡下物體成像和分析的流式光學(xué)斷層成像系統(tǒng)，該裝置包括一個脈高度分析儀(27)、一個光子源和光子感應(yīng)器(23)，光子源、光子感應(yīng)器(23)和脈沖高度分析儀(27)一起組成一個觸發(fā)裝置，脈沖高度分析儀(27)提供至少一個物體開始的第一個觸發(fā)點(28)以及至少一個物體結(jié)束的第二個觸發(fā)點(29)，從而產(chǎn)生一個對應(yīng)的觸發(fā)信號發(fā)送至重建柱，使得物體速度(V)與每個投射切面的位置同步。
60.根據(jù)權(quán)利要求3中所述的方法，其中所述的細(xì)胞(1)包含至少一種分子探針，這里的分子探針提供分子探針信息，該方法進一步包含將3D和分子探針信息結(jié)合起來的步驟，從而明確特定的亞細(xì)胞結(jié)構(gòu)與至少一種分子探針間的聯(lián)系。
61.根據(jù)權(quán)利要求4中所述的方法，其中所述的細(xì)胞(1)包含至少一種分子探針，這里的分子探針提供分子探針信息，該方法進一步包含將3D和分子探針信息結(jié)合起來的步驟，從而明確特定的亞細(xì)胞結(jié)構(gòu)與至少一種分子探針間的聯(lián)系。
62.根據(jù)權(quán)利要求5中所述的方法，其中所述的細(xì)胞(1)包含至少一種分子探針，這里的分子探針提供分子探針信息，該方法進一步包含將3D和分子探針信息結(jié)合起來的步驟，從而明確特定的亞細(xì)胞結(jié)構(gòu)與至少一種分子探針間的聯(lián)系。
63.根據(jù)權(quán)利要求7中所述的方法進一步包含對投射圖像進行處理和分析以直接評價細(xì)胞(1)的疾病狀態(tài)或轉(zhuǎn)化狀態(tài)的步驟。
64.根據(jù)權(quán)利要求20中所述的系統(tǒng)進一步包含對一系列投射圖像進行直接處理和分析以評價細(xì)胞(1)的疾病狀態(tài)或轉(zhuǎn)化狀態(tài)的裝置。
65.根據(jù)權(quán)利要求37中所述的系統(tǒng)，其中所述的一個重建空間由頂部點光源和底部寬的感應(yīng)器陣列構(gòu)成的投射圓錐的放射狀重疊確定。
66.根據(jù)權(quán)利要求17中的系統(tǒng)，其中所述的重建柱(20)提供采用濾波背景投射重建算法重建的圖像信號，該算法計算與移動軸垂直的切面的二維(2D)圖像，對多個切面的連續(xù)堆積產(chǎn)生至少一個物體的三維(3D)圖像，對照的差異是至少一個物體內(nèi)探針發(fā)射光密度變量的函數(shù)。
全文摘要
一種流式細(xì)胞儀和至少一個重建柱環(huán)繞毛細(xì)管(2)設(shè)置。光子源(25)、光子感應(yīng)器(26)和脈沖高度分析儀(27)一起工作，提供一個物體或細(xì)胞(1)開始的第一個觸發(fā)點(28)和細(xì)胞(1)結(jié)束的第二個觸發(fā)點(29)。重建柱(20)接收觸發(fā)信號(28，29)。重建柱(20)包含可選發(fā)射光波長的點光源(21)，點光源以幾何圖形沿著與毛細(xì)管軸(9)垂直并且同心的柱分布，使獲取流動細(xì)胞(1)傳輸?shù)?、衰減的投射圖像更為容易。感應(yīng)器(23)還收集與細(xì)胞核和/或細(xì)胞漿結(jié)構(gòu)或細(xì)胞膜相關(guān)的標(biāo)記分子探針發(fā)射的熒光投射。這些投射通過算法處理，提供有關(guān)細(xì)胞(1)及其疾病狀態(tài)的三維信息。
文檔編號G01N15/14GK1511299SQ02810742
公開日2004年7月7日 申請日期2002年3月27日 優(yōu)先權(quán)日2001年3月28日
發(fā)明者A·C·尼爾森, A C 尼爾森 申請人:維森蓋茨有限公司