專利名稱：檢測鹽酸克倫特羅的免疫膠體金試劑及其制備方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種用免疫膠體金方法檢測鹽酸克倫特羅的試劑，還涉及該試劑的制備方法。
背景技術(shù)：
鹽酸克倫特羅(Clenbuterol)，俗稱瘦肉精，是一種人工合成的腎上腺素神經(jīng)興奮劑，屬β-興奮劑類激素藥物。如果用作畜禽飼料添加劑，則能降低胴體脂肪含量，提高瘦肉率，并促進(jìn)畜禽生長。大量使用，則造成畜禽中藥物殘留，人食用含有鹽酸克倫特羅殘留的畜禽肉、蛋后，人體會產(chǎn)生心悸、嘔吐、肌肉不自主震顫等中毒癥狀。
目前對鹽酸克倫特羅常的檢測方法為色譜法和酶聯(lián)免疫吸附法。
1.色譜技術(shù)對鹽酸克倫特羅檢測是非常有效、準(zhǔn)確和敏感的，但也存在如下缺點(1)待檢測樣品預(yù)處理程序繁瑣費時，從樣品預(yù)處理到得出檢測結(jié)果至少需要2天；(2)對操作時使用的水及各種溶劑有著嚴(yán)格的要求；(3)需要經(jīng)過專業(yè)培訓(xùn)的技術(shù)人員操作，操作人員要有豐富的相關(guān)經(jīng)驗，操作人員必須了解影響色譜分析的各種干擾因素，了解所使用的預(yù)處理方法的優(yōu)缺點，才能獲得可靠的分析結(jié)果；(4)需要昂貴的儀器設(shè)備輔助，難以在中小城市及中小企業(yè)中普及，更無法實現(xiàn)現(xiàn)場檢測；(5)儀器保養(yǎng)的要求高，保養(yǎng)的好壞直接影響分析結(jié)果的準(zhǔn)確性；(6)檢測費用高。
2.酶聯(lián)免疫吸附法是以競爭性酶聯(lián)反應(yīng)為檢測原理，以鹽酸克倫特羅抗體包被酶標(biāo)板，檢測時將被檢樣品和酶標(biāo)結(jié)合物同時加入酶標(biāo)板，反應(yīng)后通過顯色測OD值。存在的缺點是(1)需要專門的儀器設(shè)備如酶標(biāo)儀來配合使用，不利于在基層單位進(jìn)行推廣使用；(2)檢測操作人員需要經(jīng)過專業(yè)培訓(xùn)；(3)操作過程相對比較復(fù)雜，檢測所需時間比較長，全程需要2h～4h；(4)檢測所需費用較高，不能實現(xiàn)單人份檢測。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的任務(wù)是解決上述存在的如檢測時間長、不能現(xiàn)場檢測、檢測費用高等缺點，提供一種特異性強、敏感性高、簡易快速、費用低廉、能現(xiàn)場檢測的適用于鹽酸克倫特羅檢測的膠體金免疫層析試劑，并提供該試劑的制備方法。應(yīng)用該試劑檢測鹽酸克倫特羅，全過程只需30分鐘。
本發(fā)明的檢測鹽酸克倫特羅的免疫膠體金試劑，是由包被了單克隆抗體膠體金標(biāo)記物的膠體金結(jié)合墊、包被了鹽酸克倫特羅-BSA和羊抗鼠IgG的硝酸纖維素膜、樣品墊、吸水墊、不干膠、PVC背襯(及塑料模具)等組成，在PVC背襯的一端依次粘附樣品墊、結(jié)合墊、不干膠，中間粘附硝酸纖維素膜，另一端依次粘附吸水墊和不干膠。
制備本發(fā)明檢測鹽酸克倫特羅的免疫膠體金試劑的方法是(1)單克隆抗體取雜交瘤細(xì)胞株在體外常規(guī)培養(yǎng)、傳代后，用鹽酸克倫特羅-BSA注射BALB/C小鼠腹腔，收取腹水，以親和層析法提純單克隆抗體；(2)膠體金將100ml 0.01％氯化金用2ml 1％檸檬酸三鈉還原成20nm～40nm的顆粒；(3)單克隆抗體膠體金標(biāo)記物用上述0.1mol/L K2CO3將膠體金溶液的pH值調(diào)至8.2左右，將膠體金溶液與單克隆抗體按100ml膠體金溶液中加入0.5mg～1mg單克隆抗體的比例混合均勻，使膠體金與抗體形成穩(wěn)定的膠體金復(fù)合物，再通過純化、濃縮后形成膠體金標(biāo)記物；(4)羊抗鼠IgG用鹽酸克倫特羅-BSA多次免疫小鼠，提取抗血清免疫山羊，純化后得羊抗鼠IgG；(5)將單克隆抗體金標(biāo)記物噴涂在膠體金結(jié)合墊上，將鹽酸克倫特羅-BSA和羊抗鼠IgG噴涂在硝酸纖維素膜上，在37℃干燥箱烘干；(6)將硝酸纖維素膜、膠體金結(jié)合墊、樣品墊、吸水墊、不干膠等依次粘在PVC背襯上；(7)將粘好的PVC材料切成一定寬度的試劑條。如果制作成試劑板則再將制成的試劑條裝到一定大小的塑料盒內(nèi)即可。
本發(fā)明的積極效果在于(1)低價格產(chǎn)品生產(chǎn)流程簡單，生產(chǎn)成本低，檢測的費用只需氣相色譜/液相色譜的1/5～1/10，比酶標(biāo)試劑盒也要便宜得多(氣相色譜/液相色譜通常檢測一個樣品需要200元～300元，酶標(biāo)試劑盒通常一個樣品檢測也要80元～100元，而本發(fā)明制備的免疫膠體金試劑盒一般只需20元～50元)；(2)檢測速度快全過程只需30分鐘，可以實現(xiàn)自我檢測；(3)可以現(xiàn)場檢測；(4)高質(zhì)量本方法制備而成的試劑盒特異性好、靈敏度高、重復(fù)性好；(5)操作簡便本方法制備而成的試劑盒以膠體金作為指示標(biāo)記，快速定性，結(jié)果準(zhǔn)確、快速，操作簡便，無需沖洗過程和標(biāo)準(zhǔn)對照，可分批或單個樣品及時檢測；(6)易于推廣使用操作人員無需專業(yè)培訓(xùn)，按說明書即可完成操作。


圖1為本發(fā)明檢測鹽酸克倫特羅的免疫膠體金試劑盒的剖示結(jié)構(gòu)圖，圖中 1.不干膠 2.樣品墊 3.結(jié)合墊 4.硝酸纖維素膜 5.吸水墊 6.不干膠 7.PVC背襯 8.上蓋 9.盒底 10.試劑盒(板)圖2為本發(fā)明檢測鹽酸克倫特羅的免疫膠體金試劑條的正視結(jié)構(gòu)圖，圖中 15.檢測線 16.質(zhì)控線 17.標(biāo)記線圖3為本發(fā)明檢測鹽酸克倫特羅的免疫膠體金試劑盒的正視結(jié)構(gòu)圖，圖中 8.上蓋 11.加樣孔 12.顯示窗(五)具體實施方案實施例1圖1、圖2、圖3所示的實施例圖中7為PVC背襯；2為樣品墊；3為結(jié)合墊，該結(jié)合墊上包被了單克隆抗體膠體金標(biāo)記物；4為硝酸纖維素膜，該硝酸纖維素膜上包被了鹽酸克倫特羅-BSA和羊抗鼠IgG；5為吸水墊，由吸水材料如濾紙制成；6為起保護(hù)作用的不干膠。
在PVC背襯7的一端上(樣品端)粘附樣品墊2、結(jié)合墊3，樣品墊2和結(jié)合墊3為并排結(jié)構(gòu)。在樣品墊2和結(jié)合墊3上粘附保護(hù)層不干膠1。在不干膠1上偏向樣品墊2處印有標(biāo)記線17、箭頭和MARK字樣。
在PVC背襯7的中間粘附硝酸纖維素膜4。在硝酸纖維素膜4上設(shè)置有羊抗鼠IgG質(zhì)控線16和鹽酸克倫特羅-BSA檢測線15。
在PVC背襯7的另一端粘附吸水墊5，在吸水墊5上粘附保護(hù)層不干膠6。硝酸纖維素膜4的一端與結(jié)合墊3略交叉，另一端與吸水墊5略交叉。該試劑條可裝入由塑料模具制成的試劑盒內(nèi)，制成試劑盒10，也叫試劑板，在試劑板10的上蓋8上設(shè)有加樣孔11和結(jié)果顯示窗12。
實施例2制備本發(fā)明檢測鹽酸克倫特羅的免疫膠體金試劑條(盒)的方法1)單克隆抗體的制備將雜交瘤細(xì)胞株在體外常規(guī)培養(yǎng)、傳代后，用鹽酸克倫特羅-BSA注射BALB/C小鼠腹腔，收取腹水，以親和層析法提純單克隆抗體；2)羊抗鼠IgG的制備用鹽酸克倫特羅-BSA多次免疫小鼠，提取抗血清免疫山羊，純化后得羊抗鼠IgG；3)膠體金的制備將100ml 0.01％氯化金用2ml 1％檸檬酸三鈉還原成20nm～40nm大小的顆粒；4)單克隆抗體膠體金標(biāo)記物用0.1mol/L K2CO3將膠體金溶液的pH值調(diào)至8.2左右，將膠體金溶液與單克隆抗體按100ml膠體金溶液中加入0.5mg～1mg單克隆抗體的比例混合均勻，使膠體金與抗體形成穩(wěn)定的膠體金復(fù)合物，再通過多次離心、棄上清、清洗，再濃縮后形成抗體，冷藏備用；5)用Biodot點膜機將單克隆抗體膠體金標(biāo)記物噴涂在膠體金結(jié)合墊上，用Biodot點膜機將鹽酸克倫特羅-BSA和羊抗鼠IgG噴涂在硝酸纖維素膜上，放在37℃干燥箱里烘干，也可以采用低溫真空干燥后備用；6)將硝酸纖維素膜、膠體金結(jié)合墊、樣品墊、吸水墊、不干膠等依次粘在PVC背襯上；7)用Biodot切割機將粘好的PVC材料切成一定寬度的試劑條。即制成本發(fā)明檢測鹽酸克倫特羅的免疫膠體金試劑條。如果將切好的試劑條裝到一定大小的塑料模具內(nèi)，即制成本發(fā)明檢測鹽酸克倫特羅的免疫膠體金試劑板(盒)。
實施例3本發(fā)明制備的檢測鹽酸克倫特羅的免疫膠體金試劑條(板)的應(yīng)用(1)待檢樣本采集稱取5g(±0.1g)新鮮豬肉樣品。
(2)待檢樣本簡單處理將樣品用小型絞肉機絞碎，放入50ml離心管中加入10ml甲醇，充分?jǐn)嚢?，振?0min，于3000r/min離心10min，將上清液移出；殘渣中再加入10ml甲醇，混勻后振蕩20min，于3000r/min離心10min，合并上清液備用。
(3)檢測a.在檢測前先將樣本和試劑條(板)放在室溫條件下放置一段時間(10分鐘)，使其恢復(fù)至室溫；b.從鋁箔袋中取出檢測試劑條，按MARK線下箭頭所示的方向?qū)⒃噭l浸入樣本溶液中，液面不得超過MARK線，5秒～8秒后取出，平放在操作臺上；從鋁箔袋中取出檢測試劑板，平放在操作臺上，往加樣孔11中滴加3滴(約120μl)待檢測樣品溶液；c.3分鐘～15分鐘內(nèi)即可判斷結(jié)果，30分鐘后判斷的結(jié)果無效。
(3)結(jié)果判斷如果樣品中沒有要檢測的“瘦肉精”存在，則檢測線處出現(xiàn)紅色條帶，同時質(zhì)控線上也出現(xiàn)紅色條帶，此時結(jié)果為陰性；如果樣品中存在要檢測的“瘦肉精”，則檢測線處無條帶出現(xiàn)，但質(zhì)控線上出現(xiàn)紅色條帶，此時結(jié)果為陽性。如果質(zhì)控線上沒有紅色條帶出現(xiàn)，則產(chǎn)品無效。
權(quán)利要求
1.一種檢測鹽酸克倫特羅的免疫膠體金試劑，包括不干膠、樣品墊、結(jié)合墊、硝酸纖維素膜、吸水墊和PVC背襯，PVC背襯一端依次粘附樣品墊、結(jié)合墊、不干膠，中間粘附硝酸纖維素膜層，另一端依次粘附吸水墊和不干膠，其特征結(jié)合墊為由包被了單克隆抗體膠體金標(biāo)記物的膠體金結(jié)合墊，硝酸纖維素膜包為被了鹽酸克倫特羅-BSA和羊抗鼠IgG的硝酸纖維素膜。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的免疫膠體金試劑的制備方法，其特征是(1)單克隆抗體取雜交瘤細(xì)胞株在體外常規(guī)培養(yǎng)、傳代后，用鹽酸克倫特羅-BSA注射BALB/C小鼠腹腔，收取腹水，以親和層析法提純單克隆抗體；(2)膠體金將100ml 0.01％氯化金用2ml 1％檸檬酸三鈉還原成20nm～40nm的顆粒；(3)單克隆抗體膠體金標(biāo)記物用上述0.1mol/LK2CO3將膠體金溶液的pH值調(diào)至8.2左右，將膠體金溶液與單克隆抗體按100ml膠體金溶液中加入0.5mg～1mg單克隆抗體的比例混合均勻，使膠體金與抗體形成穩(wěn)定的膠體金復(fù)合物，再通過純化、濃縮后形成膠體金標(biāo)記物；(4)羊抗鼠IgG用鹽酸克倫特羅-BSA多次免疫小鼠，提取抗血清免疫山羊，純化后得羊抗鼠IgG(5)將單克隆抗體金標(biāo)記物噴涂在膠體金結(jié)合墊上，將鹽酸克倫特羅-BSA和羊抗鼠IgG噴涂在硝酸纖維素膜上，在37℃干燥箱烘干。
3.根據(jù)權(quán)利要求2所述的免疫膠體金試劑的制備方法，其特征是將單克隆抗體金標(biāo)記物噴涂在膠體金結(jié)合墊上，將鹽酸克倫特羅-BSA和羊抗鼠IgG噴涂在硝酸纖維素膜上，以低溫真空干燥。
全文摘要
本發(fā)明涉及檢測鹽酸克倫特羅的免疫膠體金試劑，包括不干膠、樣品墊、結(jié)合墊、硝酸纖維素膜、吸水墊和PVC背襯，PVC背襯一端依次粘附樣品墊、結(jié)合墊、不干膠，中間粘附硝酸纖維素膜層，另一端依次粘附吸水墊和不干膠，其特點是結(jié)合墊為由包被了單克隆抗體膠體金標(biāo)記物的膠體金結(jié)合墊，硝酸纖維素膜包為被了鹽酸克倫特羅－BSA和羊抗鼠IgG的硝酸纖維素膜。該檢測鹽酸克倫特羅的免疫膠體金試劑是一種特異性強、敏感性高、簡易快速、費用低廉、能現(xiàn)場檢測，全過程只需30分鐘，操作人員無需專業(yè)培訓(xùn)，按說明書即可完成操作。
文檔編號G01N33/53GK1508545SQ02157708
公開日2004年6月30日 申請日期2002年12月17日 優(yōu)先權(quán)日2002年12月17日
發(fā)明者張少恩 申請人:湖州瑞澤生物技術(shù)有限公司