專利名稱：光電化學標記物和用其進行光電化學分析的方法、儀器與試劑盒的制作方法
技術領域：
本發(fā)明涉及標記物、用該標記物進行分析目的物的方法、分析所用的專用儀器及試劑盒，特別是涉及光電化學標記物和用該光電化學標記物進行光電化學分析的方法及專用儀器與試劑盒。
背景技術：
目前，對檢測和量化化學、生物化學和生物物質(zhì)的快速、高度專一的方法存在著越來越多的需求。最迫切需要的是測量少量藥物、代謝物、微生物和其它具有診斷價值的物質(zhì)的方法。比如麻醉藥、毒藥、用于治療目的的藥物、激素、致病微生物、病毒、抗體、代謝物、酶和核酸等。
可以利用生物化學和生物系統(tǒng)中所具備的對某一物質(zhì)高度專一性結(jié)合的特點，來確定目的物的存在。例如，常用的基于抗原一抗體系統(tǒng)、核酸雜交技術和蛋白質(zhì)一配體系統(tǒng)等方法。在這些方法中，一般用附著在一種或多種復合物上的可觀察到的標記的存在與否來表明具有診斷價值的復合物的存在。
特定標記方法通常決定了用來檢測相關物質(zhì)的特定系統(tǒng)的有效性和多功能性。優(yōu)選的標記物應便宜、安全并且能被有效地附著在多種化學、生物化學和生物物質(zhì)上，同時這些物質(zhì)的重要的結(jié)合特性不會改變。而且，優(yōu)選的標記要穩(wěn)定且能給出高度特征性的信號。優(yōu)選標記的檢測應快速、敏感、可重現(xiàn)，不需要昂貴、專門的設備或人員。優(yōu)選標記的量化應不受諸如溫度和所分析混合物的成分等變量的影響。
已經(jīng)研究出了許多種標記物，每一種都有其特有的優(yōu)勢，但同時也存在著不足。例如，放射性標記是多功能的，可以在非常低的濃度下檢測，然而它們比較昂貴、危險，需要復雜的設備和訓練有素的操作人員，而且放射性標記不能用于均相方法。由于放射性廢品對公眾具有潛在的危害，并且沒有處理場所，對這些廢品的處理也越來越引起人們的關注。同時，放射性標記的使用也很耗費時間，有時檢測放射性標記需要好幾天的時間。
酶標記和基于吸收的檢測工具是安全的，如ELISA，但缺乏靈敏度及長期存放的穩(wěn)定性。而且，在酶免疫檢測，如ELISA中，包括大量的分析步驟，需要很長的反應時間。熒光的有機和無機分子是安全且穩(wěn)定的，但不能提供與放射同位素標記一樣的靈敏度。熒光標記需用激光作為激發(fā)源，光學檢測復雜，并且設備成本也是一個主要的劣勢?；瘜W發(fā)光和電化學發(fā)光可以提供較高的檢測靈敏度，但也具有光學檢測的缺陷且具有相對較高的設備成本。
以前已經(jīng)有對用于免疫測定的光電化學標記的描述。例如，美國專利4,293,310描述了一種儀器和方法，其中包括一種猝滅劑和一個帶有發(fā)光裝置的用來確定光電化學標記物質(zhì)存在的電化學流體池。一旦用光激發(fā)，具有光電化學活性的標記物就會將電子轉(zhuǎn)移到猝滅劑分子。隨后用來自被固定在合適電勢的流動池的電極的電子來還原被氧化的分子。該電子以光電流的形式測量，用光電流強度來確定系統(tǒng)中被標記的被測試物的數(shù)量。盡管所述方法比基于發(fā)光的檢測方法所用的成像設備便宜，但該方法的檢測范圍是有限的，而且也受到干擾物干擾。(參考Weber等，Clin.Chem.，291665-1672(1983))。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是提供一種具有光電化學活性的標記物。
本發(fā)明所提供的光電化學標記物，具有如下的分子式M[(L1)m(L2)n(L3)o(P1)p(P2)q(P3-R-X)]其中，M是金屬離子；L1、L2、L3是M的單配位基配體；P1，、P2、P3是M的多配位基配體；R是間隔基；X是能夠?qū)⒐怆娀瘜W標記物連接到底物上的化學活性基團；m、n、o、p和q是零或正整數(shù)；所有配體提供的價鍵總數(shù)等于M的配位數(shù)。
所述M優(yōu)選為鋨、釕、鋅、鎂或鋁。
所述L1、L2、L3可以相同也可以不同，優(yōu)選自氰化物或硫氰化物。
所述P1、P2、P3優(yōu)選自含氮的芳香族雜環(huán)。所述含氮的芳香族雜環(huán)為聯(lián)吡啶、聯(lián)吡嗪、聯(lián)三吡啶、菲酚、酞氰染料、取代的聯(lián)吡啶、取代的聯(lián)吡嗪、取代的聯(lián)三吡啶或取代的菲酚。所述取代基團為烷基、芳基、芳烷基、羧酸酯、羧酸醛、羧酸酰胺、氰基、氨基、羥基羧基、羥基氨基、氨基羰基、脒、胍基、酰脲、含硫基團、含磷基團和N-羥基琥珀酰亞胺的羧酸酯。
所述R可以是C2到C12烷基或聚7二醇，但優(yōu)選聚乙二醇。
所述X可以選自N-羥基琥珀酰亞胺酯、巰基、環(huán)氧化物、乙醛、順丁烯二酸酐、亞氨基酯、氨基、羧基、異硫氰酸酯、順丁烯二酸亞胺、鹵乙?；?、酰肼或磷酰胺化合物。
本發(fā)明的光電化學標記物可以通過化學合成方法獲得，優(yōu)選合成方法例子如下。首先將二氯二(2，2’-聯(lián)吡啶)合釕與4，4’-二羧酸-2，2’-聯(lián)吡啶在熱的碳酸氫鈉水/甲醇中反應。酸化后，NaPF6水溶液加入上述釕化合物。分離出的六氟磷酸鹽用N-羥基琥珀酰亞胺合成活化中間體。活化中間體可以用多種類似方法合成，也有多種結(jié)構不同但功能相似的活化中間體，用本領域的常規(guī)方法即可以得到。
本發(fā)明提供的光電化學(PEC)活性標記具有下述特征1、PEC標記在可見波長范圍內(nèi)有較強的吸收。2、PEC標記激發(fā)態(tài)的能量水平高于電極的能量水平，確保電子轉(zhuǎn)移可以發(fā)生。3、PEC標記激發(fā)態(tài)的壽命足夠長，足以使電子轉(zhuǎn)移優(yōu)于發(fā)光。4、PEC標記的還原態(tài)和氧化態(tài)是穩(wěn)定的。
本發(fā)明的第二個目的是提供一種安全、穩(wěn)定、有效、便宜且能提供廣泛檢測范圍的光電化學分析方法。
本發(fā)明提供的光電化學分析方法，包括a)將可能含有分析物的樣品與能和所述分析物在合適條件下結(jié)合和/或反應的反應物接觸；所述分析物、所述反應物或額外反應物或額外分析物或分析物類似物中的一種或幾種是用具有光電化學活性的分子標記的；b)評價所述分析物和所述反應物之間的結(jié)合和/或反應，確定在樣品中是否存在所述分析物以及所述分析物的數(shù)量；所述評價為在電極存在的情況下用光將具有光電化學活性的分子轉(zhuǎn)化成激發(fā)態(tài)，評價受激的具有光電化學活性的分子與電極之間電子轉(zhuǎn)移所產(chǎn)生的電流。
用上述方法可以確定在所述樣品中分析物的存在和/或分析物的數(shù)量。
當用光激發(fā)具有光電化學活性的分子時，處于基態(tài)的電子會吸收光能量，從基態(tài)L(G)躍遷到激發(fā)態(tài)L(E)(如式1所示)。受激電子有很強活性，可以很容易地失去。例如，受激電子可能從受激分子轉(zhuǎn)移到具有較低能量水平的半導體電極，從而產(chǎn)生光電流(如式2所示)。一旦受激電子離開分子，它將成為氧化態(tài)L(O)。如果溶液中存在還原劑，光電化學分子將回到原始態(tài)(還原基態(tài))，再次參與光電化學反應(如式3所示)。因此，光電流是不間斷的，其光電化學反應原理如圖4所示。
光激發(fā)L(G)+hv→L(E) (式1)光電流L(E)→L(O)+e(電極) (式2)再生 L(O)+還原劑→L(G) (式3)所述分析物為細胞、細胞器、病毒、分子及其集合體或復合物、來自哺乳動物的樣品或臨床樣品。所述細胞為動物細胞、植物細胞、真菌細胞、細菌細胞、重組細胞或培養(yǎng)細胞；所述細胞器為細胞核、線粒體、葉綠體、核糖體、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)、高爾基體、溶酶體、蛋白酶體、分泌小泡、液泡或微粒體；所述分子為無機分子、有機分子或其復合物；所述哺乳動物為?？?、馬科、鼠科、貓科動物，山羊、綿羊、兔、豚鼠、人、猴子、狗或豬等；所述臨床樣品為血清、血漿、全血、痰、腦脊液、羊水、尿、胃腸內(nèi)容物、頭發(fā)、唾液、汗、齒齦刮取物或活體解剖組織。所述有機分子為氨基酸、肽、蛋白質(zhì)、核苷、核苷酸、寡核苷酸、核酸、維生素(如生物素、維生素B12、葉酸、維生素E、維生素A、抗壞血酸維生素C)、單糖、寡糖、脂類、激素(如胰島素、絨毛膜促性腺激素、甲狀腺素、三碘甲腺原氨酸、卵泡刺激激素、促黃體生成激素、促甲狀腺激素和雌激素三醇)、抗原和半抗原(如鐵蛋白、血管舒緩激肽、前列腺素和腫瘤特異性抗原)、抗體(如微粒體抗體、抗肝炎抗體和抗過敏原抗體)、癌標記、代謝物(如3’，5’-腺苷一磷酸和3’，5’-鳥苷一磷酸)、類固醇、固醇、藥物化合物(如氨基糖苷抗生素像慶大霉素、氨羥丁卡那霉素A、紫蘇霉素、鴉片生物堿和麥角堿衍生物)、專一性結(jié)合受體(如甲狀腺素結(jié)合球蛋白、親和素、內(nèi)源因子、鈷胺傳遞蛋白)、碳水化合物及其復合物?！翱贵w”可以以任何合適的形式存在，并且也包括其片斷或衍生物。代表性的抗體包括多克隆抗體、單克隆抗體、Fab片斷、Fab’片斷、F(ab’)2片斷、 Fv片斷、微型雙功能抗體、單鏈抗體和由抗體片斷形成的多專一性抗體?！昂怂帷敝溉魏魏怂幔―NA(脫氧核糖核酸)、RNA(核糖核酸)或多肽核糖核酸(PNA)。但并不限于此，還包括DNA、RNA、PNA的任何已知堿基類似物，如4-乙?；拎ぁ?-羥基-N-6-甲基腺苷、吖丙啶基胞吡啶、假異胞吡啶、5-(羧基羥基甲基)尿吡啶、5-氟尿吡啶、5-溴尿吡啶、5-羧基甲基氨基甲基-2-硫脲吡啶、5-羧基甲基氨基甲基尿吡啶、二氫尿吡啶、次黃嘌呤、N-6-異戊烯基腺嘌呤、1-甲基腺嘌呤、1-甲基假尿吡啶、1-甲基鳥嘌呤、1-甲基次黃嘌呤、2，2-二甲基鳥嘌呤、2-甲基腺嘌呤、2-甲基鳥嘌呤、3-甲基胞吡啶、5-甲基胞吡啶、N-6-甲基腺嘌呤、7-甲基鳥嘌呤、5-甲基氨基甲基尿吡啶、5-甲氧基氨基甲基-2-硫胞吡啶、5’-甲氧基羧基甲基尿吡啶、5-甲氧基尿吡啶、2-硫代甲基-N-6-異戊烯基腺嘌呤、尿吡啶-5-含氧乙酸甲基酯、尿吡啶-5-含氧乙酸、假尿吡啶、2-硫胞吡啶、5-甲基-2-硫尿吡啶、2-硫尿吡啶、4-硫尿吡啶、5-甲基尿吡啶、N-尿吡啶-5-含氧乙酸甲基酯、尿吡啶-5-含氧乙酸、假尿吡啶、2-硫胞吡啶和2，6-二氨基嘌呤。
可以用任何合適的分析方式來進行本發(fā)明的光電化學分析。例如，可以用競爭分析方式來進行。在競爭分析中，不對樣品中的反應物和分析物進行標記，使用具有光電化學活性標記的分析物或分析物類似物。也可以用夾心分析方式來進行，在夾心分析方式中，不對第一種反應物和來自樣品的分析物進行標記，而是使用具有光電化學活性標記的第二種反應物。例如，第一抗體在電極上固定，作為檢測的捕獲抗體。用具有光電化學活性的分子來標記第二抗體，用含有被檢測抗原的樣品接觸電極和第二抗體。在電極表面完成免疫反應之后，用含有還原劑的溶液接觸電極。將一束光直接指向電極，并且用電子設備測量所得的光電流。還可以是專一結(jié)合對的一個成員在電極表面被固定為捕獲劑，用具有光電化學活性的分子來標記另一個專一結(jié)合對成員。在加入樣品和發(fā)生了專一結(jié)合反應之后，標記分子積聚在電極表面，其數(shù)量與分析物濃度相關。為了檢測反應，將一束光直接指向與含有還原劑的液體接觸的電極，并且測量所得的光電流?！皩Ｒ恍越Y(jié)合對”指任何物質(zhì)或一類物質(zhì)，它對配體有排除其它物質(zhì)的專一性結(jié)合的親和力。例如抗原和結(jié)合到其上的抗體；半抗原和結(jié)合到其上的抗體；寄生和宿主結(jié)合對；DNA和DNA結(jié)合對；DNA和寡核苷酸結(jié)合對；DNA和RNA結(jié)合對均屬專一性結(jié)合對。在具體應用中，專一性結(jié)合對包括與樣品配體互相作用的專一性結(jié)合分析試劑，或樣品以免疫化學方式對配體的結(jié)合。例如，在試劑和/或樣品配體或樣品對配體的結(jié)合之間將存在抗原—抗體或半抗原—抗體關系。配體和結(jié)合伴侶之間的結(jié)合交互作用是專一性結(jié)合分析的基礎，包括肽、蛋白質(zhì)、碳水化合物、糖蛋白、類固醇、激素、維生素、代謝物、藥物試劑、其它受體和結(jié)合物質(zhì)之間的結(jié)合交互作用。
所述評價分析物和反應物之間的結(jié)合和/或反應的方法可以是酶聯(lián)免疫吸附分析法(ELISA)、免疫印跡、免疫沉淀反應、放射性免疫測定(RIA)、免疫染色、乳膠凝集素、間接紅血球凝聚(IHA)、補體結(jié)合、間接熒光免疫分析(IFA)、用懸液計測量懸液法、流體細胞分析、化學發(fā)光分析、橫向流體免疫測定分析、μ-捕獲分析、抑制分析、能量轉(zhuǎn)移分析、親和力分析、濁度免疫分析或時間分辯放大穴狀化合物發(fā)射(TRACE)分析。
所述評價包括在電極和還原再生劑或氧化再生劑存在的情況下用光將具有光電化學活性的分子轉(zhuǎn)化成激發(fā)態(tài)，并且測定受激分子和電極之間的電子轉(zhuǎn)移所產(chǎn)生的電流。電子轉(zhuǎn)移后產(chǎn)生的處于基態(tài)的被氧化或還原的光電化學活性分子被再生劑還原或氧化成還原態(tài)，可以用光再次激發(fā)。所述再生劑優(yōu)選的是對苯二酚。
本發(fā)明的又一目的是提供一種用于光電化學分析的專用儀器。
一種光電化學分析儀，包括a)在合適條件下可以與分析物結(jié)合或反應的反應物；b)附著在反應物、分析物或分析物類似物上的具有光電化學活性的分子；c)適合分析受激的具有光電化學活性的分子和電極之間的電子轉(zhuǎn)移所產(chǎn)生的電流的電極；d)將被氧化或還原的光電化學活性分子轉(zhuǎn)化到可以用光再次激發(fā)的基態(tài)的再生劑；e)電化學池，該池的壁可以讓能夠激發(fā)具有光電化學活性分子的光透過；f)發(fā)光裝置，該裝置具有能激發(fā)有光電化學活性分子的光源。
這里，“電極”指電子導體或半導體，通過它們電流可以進入或離開介質(zhì)?？梢允褂靡阎娜魏坞姌O，如窄帶半導體電極和寬帶半導體電極。可以是純半導體或含添加劑的半導體。還可以是包括一個半導體或者多個半導體的混合物。一種具體的應用實例是在導電玻璃電極上涂有一層單分散的納米晶體氧化鈦薄膜。介質(zhì)可以是一種電解溶液、固體、熔體、氣體或真空。“電化學池”也可以叫“電化學流動池”，指兩個或多個電極的結(jié)合，對它們進行安排以便全部氧化還原反應可以產(chǎn)生電動勢，包括干池、濕池、標準池、燃料池、固體電解液池和儲備池。
為了使分析儀功能更完善，所述分析儀還包括分離所述發(fā)光裝置光譜的裝置。所述分離光譜的裝置包括一個單色儀或一個濾光器。被分離光譜的波長在400nm到800nm之間。
分析儀的所述光源可以選自中空的陰極燈、氙弧燈、氙汞燈、金屬鹵化物燈、發(fā)光二極管或激光(如氬離子激光，適合于激發(fā)含釕物質(zhì))。優(yōu)選的光譜范圍在400～800nm之間。
為了使分析更精確，所述儀器還包括區(qū)分受激的具有光電化學活性分子的電子轉(zhuǎn)移和其它電子轉(zhuǎn)移的裝置。所述區(qū)分受激的具有光電化學活性分子的電子轉(zhuǎn)移和其它電子轉(zhuǎn)移的裝置可以設計成包括光束斷路器、過濾器、透鏡和內(nèi)置放大器；也可以設計成包括第一個暴露在光下的工作電極和第二個黑暗中的工作電極。
本發(fā)明的再一目的是提供一種可以完成光電化學分析的試劑盒。
光電化學分析試劑盒，它包括a)在合適條件下可以與分析物結(jié)合或反應的具有光電化學活性的反應物；b)評價分析物和反應物之間結(jié)合和/或反應的裝置；所述評價包括在存在電極的情況下用光將具有光電化學活性的分子轉(zhuǎn)化成激發(fā)態(tài)，并且測量激發(fā)的具有光電化學活性的分子和電極之間的電子轉(zhuǎn)移所產(chǎn)生的電流。
為了使試劑盒的功能更完善，所述試劑盒還包括再生劑。
為了便于使用者理解使用方法，所述試劑盒中還包括使用說明書。
利用本發(fā)明的方法檢測分析物的優(yōu)點是1、激發(fā)源和檢測信號是獨立的物理參數(shù)，使得從激發(fā)源產(chǎn)生的干擾背景最小。2、與化學發(fā)光不同，本發(fā)明光電化學方法是用光啟動的，可以通過打開或關閉光源很容易地對其進行控制。當光源關閉時，即沒有光電化學反應。3、與熒光發(fā)光不同，本發(fā)明光電化學方法的光源不必是單色光。4、本發(fā)明光電化學方法的電子檢測設備比基于發(fā)光檢測(如熒光、化學發(fā)光和電化學發(fā)光)的設備中所用的成像設備便宜。白光激發(fā)和電子檢測的結(jié)合大大降低了設備成本。5、與其它光電化學分析相比，本發(fā)明的結(jié)果也比較好，其原因是在其它光電化學分析中產(chǎn)生光電流的物質(zhì)是被氧化的基態(tài)標記分子。
本發(fā)明中可以通過調(diào)整電極的能量水平、再生劑的氧化還原電勢、具有光電化學活性的分子和電極之間的距離，來確保測量到的受激的具有光電化學活性的分子和電極之間電子轉(zhuǎn)移所產(chǎn)生的電流的準確性。


圖1為吸附在氧化鈦薄膜電極上的釕三(4，4’-二羧基-2，2’-二吡啶)的光電流。
圖2為吸附在氧化鈦薄膜電極上的釕三(4，4’-二羧基-2，2’-二吡啶)的光譜。
圖3為吸附了生物素-牛血清白蛋白的氧化鈦電極的光電流反應。
圖4為光電化學反應原理圖。
具體實施例方式
實施例1、納米結(jié)晶體氧化鈦糊狀物的制備用濃縮的硝酸將水的酸度調(diào)到pH1。邊攪拌邊將四丁基鈦酸酯滴加到上述水中以獲得一種黃色溶液。在不斷攪拌的同時加入所有四丁基鈦酸酯之后，將溫度升高到80℃并且保持不變。溶液變成乳白色。在石英燒杯中加入50mL的溶液，在230℃的溫度下用高壓滅菌裝置滅菌12小時。用超聲波將上邊所形成的氧化鈦納米微粒分散，用40％的碳酸將其混合就可以獲得氧化鈦糊狀物。
實施例2、吸附了釕多吡啶的氧化鈦電極的制備用刮刀法在氧化銦錫導電玻璃上涂敷一層氧化鈦。干燥后，在450℃溫度下將薄膜加熱30分鐘，然后冷卻到80℃。立即將電極浸入1mM完全溶解在乙醇中的釕多吡啶溶液中，在黑暗中浸泡10小時。用乙醇沖洗掉多余的釕多吡啶。
實施例3、光電流測量在基于時間的模式下，在CHI 800電化學分析儀上測量光電流。光源包括一個500W的氙燈和一個單色儀。矩形光電化學池是用磨光的玻璃制成的，包括一個鉑對電極和一個Ag/AgCl參比電極。光束進入與池壁垂直的池中，在其背面作用于TiO2電極。手工撥動波長選擇器，使單色儀射出的波長在470和800nm之間變化。釕多吡啶在470nm吸收最大，而在800nm無吸收。
如圖1所示，吸附了釕三(4，4’-二羧基-2，2’-二吡啶)的氧化鈦薄膜電極被放置在含有10mM對苯二酚/磷酸鈉緩沖液的光電化學池中。在每個第20秒將單色儀選擇器轉(zhuǎn)到470nm，在每個第40秒將其轉(zhuǎn)到800nm。紅色跡線來自吸附了釕三(4，4’-二羧基-2，2’-二吡啶)的電極，然而黑色跡線來自未吸附的電極。
如圖2所示，吸附了釕三(4，4’-二羧基-2，2’-二吡啶)的氧化鈦薄膜電極被放置在含有10mM對苯二酚/磷酸鈉緩沖液的光電化學池中。單色儀選擇器轉(zhuǎn)到700nm和380nm之間，并且測量相應的光電流。這樣獲得的光譜看起來類似于釕三(4，4’-二羧基-2，2’-二吡啶)的吸附光譜，表明光電流是金屬絡合物產(chǎn)生的。
實施例4、生物素標記的牛血清白蛋白(生物素-BSA)的制備將4.9mg的生物素-NHS溶解在0.25mL的DMSO中，并且將其加入到溶解在100mM、pH值為7.5的磷酸鈉溶液中的5mL的2.5％的牛血清白蛋白中。在室溫下混合2小時。用一個10K截流管用離心法去除未反應的生物素-NHS。在280nm吸光率下確定BSA濃度。
實施例5、釕復合物標記的親和素(釕-親和素)的制備將N-羥基琥珀酰亞胺(23mg)和1-甲基-3-(3-二甲基氨基丙基)碳二亞胺(156mg)溶解在無水DMF中，并且在冰浴中攪拌2分鐘。加入釕二(2，2’-二吡啶)(4，4’-二羧基-2，2’-二吡啶)(9mg)，并且在冰浴中混合5小時。將0.5mL活化的釕絡合物加入溶解在5.3mL PBS(pH值為7.95)中的10mg親和素中。在室溫下輕輕地攪拌1小時。用10K截流管用離心法從標記蛋白中去除小分子。用紫外-可見分光光度計確定的標記比率是1∶1.2(釕親和素)。
實施例6、用光電化學檢測生物素-親和素的結(jié)合在室溫下通過將氧化鈦電極在蛋白質(zhì)溶液(1.4mg/mL，pH5.4)中浸泡2小時，用生物素-BSA或BSA來對其進行涂敷。將一個用BSA(沒有生物素)涂敷的電極放置在光電化學池中，在上述實施例3中描述的步驟之后測量光電流。該測量可以提供背景電流。然后在室溫下將其它用生物素-BSA或BSA涂敷的電極用釕-親和素溶液(1uM，0.1M磷酸鈉緩沖液，pH值為7.5)溫育1小時。正如上邊所描述的，在用磷酸鈉緩沖液沖洗后，電極被用于光電流測量。用BSA涂敷的電極提供從釕-親和素到電極的非專一性結(jié)合的光電流，而用生物素-BSA涂敷的電極不但提供從釕-親和素到電極的非專一性結(jié)合的電流，而且也提供專一性結(jié)合的電流。專一性信號比非專一性信號強大約6倍(如圖3所示，1是與標記過的親和素接觸的涂敷了生物素-BSA的電極；2是與標記過的親和素接觸的涂敷了BSA的電極)。
權利要求
1.光電化學標記物，具有如下的分子式M[(L1)m(L2)n(L3)o(P1)p(P2)q(P3-R-X)]其中，M是金屬離子；L1、L2、L3是M的單配位基配體；P1，、P2、P3是M的多配位基配體；R是間隔基；X是能夠?qū)⒐怆娀瘜W標記物連接到底物上的化學活性基團；m、n、o、p和q是零或正整數(shù)；所有配體提供的價鍵總數(shù)等于M的配位數(shù)。
2.根據(jù)權利要求1所述的標記物，其特征在于所述M為鋨、釕、鋅、鎂或鋁。
3.根據(jù)權利要求1或2所述的標記物，其特征在于所述L1、L2、L3是氰化物或硫氰化物。
4.根據(jù)權利要求1或2所述的標記物，其特征在于所述P1、P2、P3是含氮的芳香族雜環(huán)。
5.根據(jù)權利要求4所述的標記物，其特征在于所述含氮的芳香族雜環(huán)為聯(lián)吡啶、連吡嗪、聯(lián)三吡啶、菲酚、酞氰染料、取代的聯(lián)吡啶、取代的連吡嗪、取代的聯(lián)三吡啶或取代的菲酚。
6.根據(jù)權利要求5所述的標記物，其特征在于所述取代基團為烷基、芳基、芳烷基、羧酸酯、羧酸醛、羧酸酰胺、氰基、氨基、羥基羧基、羥基氨基、氨基羰基、脒、胍基、酰脲、含硫基團、含磷基團和N-羥基琥珀酰亞胺的羧酸酯。
7.根據(jù)權利要求1或2所述的標記物，其特征在于所述R是C2到C12烷基或聚乙二醇。
8.根據(jù)權利要求1或2所述的標記物，其特征在于所述X為N-羥基琥珀酰亞胺酯、巰基、環(huán)氧化物、乙醛、順丁烯二酸酐、亞氨基酯、氨基、羧基、異硫氰酸酯、順丁烯二酸亞胺、鹵乙?；Ⅴｋ禄蛄柞０坊衔?。
9.一種光電化學分析方法，包括a)將可能含有分析物的樣品與能和所述分析物在合適條件下結(jié)合和/或反應的反應物接觸；所述分析物、所述反應物或額外反應物或額外分析物或分析物類似物中的一種或幾種是用具有光電化學活性的分子標記的；b)評價所述分析物和所述反應物之間的結(jié)合和/或反應，確定在樣品中存在所述分析物和/或所述分析物的量；所述評價為在電極存在的情況下用光將具有光電化學活性的分子轉(zhuǎn)化成激發(fā)態(tài)，評價激發(fā)的具有光電化學活性的分子和電極之間電子轉(zhuǎn)移所產(chǎn)生的電流。
10.根據(jù)權利要求9所述的方法，其特征在于所述分析物為細胞、細胞器、病毒、分子及其集合體或復合物、來自哺乳動物的樣品或臨床樣品。
11.根據(jù)權利要求10所述的方法，其特征在于所述細胞為動物細胞、植物細胞、真菌細胞、細菌細胞、重組細胞或培養(yǎng)細胞；所述細胞器為細胞核、線粒體、葉綠體、核糖體、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)、高爾基體、溶酶體、蛋白酶體、分泌小泡、液泡或微粒體；所述分子為無機分子、有機分子或其復合物；所述哺乳動物為牛科、馬科、鼠科、貓科動物，山羊、綿羊、兔、豚鼠、人、猴子、狗或豬；所述臨床樣品為血清、血漿、全血、痰、腦脊液、羊水、尿、胃腸內(nèi)容物、頭發(fā)、唾液、汗、齒齦刮取物或活體解剖組織。
12.根據(jù)權利要求11所述的方法，其特征在于所述有機分子為氨基酸、肽、蛋白質(zhì)、核苷、核苷酸、寡核苷酸、核酸、維生素、單糖、寡糖、脂類、激素、癌標記、類固醇、固醇、藥物化合物、碳水化合物及其復合物。
13.根據(jù)權利要求9所述的方法，其特征在于所述評價分析物和反應物之間的結(jié)合和/或反應的方法是酶聯(lián)免疫吸附分析法(ELISA)、免疫印跡、免疫沉淀反應、放射性免疫測定(RIA)、免疫染色、乳膠凝集素、間接紅血球凝聚(IHA)、補體結(jié)合、間接熒光免疫分析(IFA)、用懸液計測量懸液法、流體細胞分析、化學發(fā)光分析、橫向流體免疫測定分析、μ-捕獲分析、抑制分析、能量轉(zhuǎn)移分析、親和力分析、濁度免疫分析或時間分辯放大穴狀化合物發(fā)射(TRACE)分析。
14.根據(jù)權利要求9所述的方法，其特征在于所述評價包括在電極和還原再生劑或氧化再生劑存在的情況下用光將具有光電化學活性的分子轉(zhuǎn)化成激發(fā)態(tài)，并且測定激發(fā)分子和電極之間的電子轉(zhuǎn)移所產(chǎn)生的電流。電子轉(zhuǎn)移后產(chǎn)生的處于基態(tài)的被氧化或還原的、具有光電化學活性的分子被再生劑還原或氧化成還原態(tài)或氧化態(tài)，可以用光再次激發(fā)。
15.根據(jù)權利要求14所述的方法，其特征在于所述再生劑是對苯二酚。
16.一種光電化學分析儀，包括a)在合適條件下可以與分析物結(jié)合或反應的反應物；b)附著在反應物、分析物或分析物類似物上的具有光電化學活性的分子；c)適合分析受激發(fā)的、具有光電化學活性的分子與電極之間的電子轉(zhuǎn)移所產(chǎn)生的電流的電極；d)將被氧化或還原的光電化學活性分子轉(zhuǎn)化到可以用光再次激發(fā)的基態(tài)的再生劑；e)電化學池，該池的壁可以讓能夠激發(fā)具有光電化學活性分子的光透過；f)發(fā)光裝置，該裝置具有能激發(fā)有光電化學活性分子的光源。
17.根據(jù)權利要求16所述的分析儀，其特征在于所述分析儀還包括分離所述發(fā)光裝置光譜的裝置。
18.根據(jù)權利要求17所述的分析儀，其特征在于所述分離光譜的裝置包括一個單色儀或一個濾光器。
19.根據(jù)權利要求16或17或18所述的分析儀，其特征在于所述光源為中空的陰極燈、氙弧燈、氙汞燈、金屬鹵化物燈、發(fā)光二極管或激光。
20.根據(jù)權利要求16或17或18所述的分析儀，其特征在于所述儀器還包括區(qū)分受激發(fā)的、具有光電化學活性分子的電子轉(zhuǎn)移和其它電子轉(zhuǎn)移的裝置。
21.根據(jù)權利要求20所述的分析儀，其特征在于所述區(qū)分受激發(fā)的、具有光電化學活性分子的電子轉(zhuǎn)移和其它電子轉(zhuǎn)移的裝置包括光束斷路器、過濾器、透鏡和內(nèi)置放大器。
22.根據(jù)權利要求20所述的分析儀，其特征在于所述區(qū)分受激的具有光電化學活性分子的電子轉(zhuǎn)移和其它電子轉(zhuǎn)移的裝置包括第一個暴露在光下的工作電極和第二個黑暗中的工作電極。
23.光電化學分析試劑盒，它包括a)在合適條件下可以與分析物結(jié)合或反應的反應物；所述分析物、所述反應物、額外反應物、額外分析物或分析物類似物中的一種或幾種是用具有光電化學活性分子標記的；b)評價分析物和反應物之間結(jié)合和/或反應的裝置；所述評價包括在電極存在的情況下用光將具有光電化學活性的分子轉(zhuǎn)化成激發(fā)態(tài)，并且測量受激發(fā)的、具有光電化學活性的分子與電極之間的電子轉(zhuǎn)移所產(chǎn)生的電流。
24.根據(jù)權利要求23所述的試劑盒，其特征在于所述試劑盒還包括再生劑。
全文摘要
本發(fā)明公開了光電化學標記物和用其進行光電化學分析的方法及儀器與試劑盒，本發(fā)明所提供的光電化學標記物，具有如下的分子式M[(L
文檔編號G01N33/58GK1502993SQ02148800
公開日2004年6月9日 申請日期2002年11月21日 優(yōu)先權日2002年11月21日
發(fā)明者郭良宏, 董棟, 鄭東, 王福泉, 楊夕強, 程京 申請人:北京博奧生物芯片有限責任公司, 清華大學