專利名稱：一種多肽類物質及其制備方法和用途的制作方法
技術領域：
本發(fā)明涉及一種醫(yī)藥中間體化合物，特別是一種多肽類物質(I)的化學結構及其制備方法和用途。
一種多肽類物質(I)，其特征是由多種氨基酸聚合組成，其氨基酸的排列序列為NLQT*VTAIEKH**KDQAQLNSWGCAFE***VCHTTVPW其中*為氨基酸A(丙氨酸)或氨基酸R(精氨酸)**為氨基酸L(亮氨酸)或氨基酸T(蘇氨酸)或氨基酸S(絲氨酸)***為氨基酸Q(谷氨酰胺)或氨基酸K(賴氨酸)或氨基酸R(精氨酸)多肽類物質(I)的制備方法(一)化學合成法在自然界中每一種多肽或蛋白質都是由游離的氨基酸通過多肽鍵的形式聚合而成。在蛋白質的翻譯過程中，多肽鏈的延伸總是由氨基端(N-端)向羧基端(C-端)進行。在化學合成開始時，往往是先將羧基端的第一個氨基酸固定到活化的樹脂上，然后經過氨基基團的去保護，再將羧基端的第二個氨基酸加入到反應器中，二個氨基酸經過相互反應后即可形成肽鍵。然后依照多肽的氨基酸排列序列依次加入第三個、第四個氨基酸等等，直到最后一個氨基酸結合到肽鏈上為止。
在多肽類物質(I)的化學合成中，每個氨基酸的氨基可以由以下化學基團加以保護①芐酯基(Carbobenzoxyl)②叔-丁基羧基(t-Butyloxycarbonyl)③甲苯磺酰基(Tosyl)④9-亞芴基甲酯基(Fmoc9-Fluorenylmethoxycarbonyl)多肽類物質(I)的化學合成步驟，具體操作如下1、合成先用氯乙醚將樹脂活化，然后在樹脂中加入第一個氨基酸(氨基已被保護)，從而固定到樹脂上。經過二氯甲烷洗滌后，氨基的保護基團可以由六氫吡啶脫保護。與此同時，將第二個氨基酸經過活化后，加入到結合有第一個氨基酸的樹脂中，二個氨基酸反應后即形成肽鍵。然后按照多肽的氨基酸排序，依次加入相應的氨基酸，重復上述的洗滌，氨基去保護，氨基酸的活化等步驟，從而使多肽鏈不斷延長。直到最后第一個氨基酸結合到肽鏈上為止。
2、分離合成后的多肽仍然與樹脂結合在一起，因此分離的過程就是利用分離液將多肽類物質(I)從樹脂上游離下來。分離液可以采用苯酚，苯硫基甲烷以及三氟乙酸其中的一種或幾種的混合物，取適量的分離液浸泡上述結合有多肽類物質(I)的樹脂，在室溫下攪拌，然后經過過濾便可得到多肽類物質(I)。游離的多肽類物質(I)經過沉淀后，即可分離出來。
3、純化將分離出來的多肽類物質(I)溶解在水或適當濃度的堿溶液中(堿可以選用碳酸氫銨、碳酸銨、碳酸氫鈉、碳酸鈉)，然后用常規(guī)的色譜方法，即可將完整的多肽類物質(I)進行純化。
4、鑒定純化后的多肽類物質(I)，可以通過質譜分析重新核實所合成的多肽類物質(I)的氨基酸序列是否正確。(二)基因重組法將多肽類物質(I)的基因序列利用化學合成法合成之后，克隆到預先被內切酶(BamHI和EcoRI)處理過的PGEX-2載體中。重組的質粒再轉化到BL21受體菌中，然后在培養(yǎng)基中大量繁殖、誘導。最后將細菌離心收集，再依靠層析柱將多肽類物質(I)與GST(谷胱甘肽-S-轉移酶)的融合蛋白純化出來。
多肽類物質(I)可以通過凝血因子蛋白酶從GST融合蛋白上切割下來。最后再濃縮即可制得多肽類物質(I)的純品。
2、分離合成后的多肽仍然與樹脂結合在一起，因此分離的過程就是利用分離液將多肽類物質(I)從樹脂上游離下來。分離液可以采用苯酚，苯硫基甲烷以及三氟乙酸其中的一種或幾種的混合物，取10-80毫升的分離液浸泡上述結合有多肽類物質(I)的樹脂，在室溫下攪拌1-5小時，然后經過過濾便可得到多肽類物質(I)混合液。游離的多肽類物質(I)經過沉淀后，即可分離出來。
3、純化將分離出來的多肽類物質(I)溶解在水或10-40％的堿溶液中(堿可以選用碳酸氫銨、碳酸銨、碳酸氫鈉、碳酸鈉)，然后用常規(guī)的液相色譜法，即可將完整的多肽類物質(I)進行純化。
4、鑒定純化后的多肽類物質(I)，可以通過紫外分光光度法測得其濃度并可通過質譜分析重新核實所合成的多肽類物質(I)的氨基酸序列是否正確。多肽制備實施例二多肽的氨基酸序列為NLQTAVTAIEKHLKDQAQLNSWGCAFEKVCHTTVPW
根據上述氨基酸的序列參照下列方法制備。
1、合成首先將樹脂用氯乙醚活化(用量50-100毫升/克，并且用量可以變化±5％)，然后將羧基端的第一個氨基酸的氨基用氨基保護基團(芐酯基)保護起來后(用量10-80克/克)，再加入到樹脂中，從而使其固定到樹脂上。經過二氯甲烷洗滌后，氨基的保護基團可以用六氫吡啶(用量10-80％，最好20-40％)脫保護。與此同時，將第二個氨基酸的羧基經過HBTU活化和二異丙基乙胺中和后，加入到結合有第一個氨基酸的樹脂中，二個氨基酸反應后即可形成肽鍵。然后按照多肽類物質(I)的氨基酸排序，依次加入相應的氨基酸，重復上述的洗滌，氨基去保護，氨基酸羧基的活化等步驟，從而使多肽鏈不斷延長。直到最后一個氨基酸結合到肽鏈上為止。
2、分離合成后的多肽仍然與樹脂結合在一起，因此分離的過程就是利用分離液將多肽類物質(I)從樹脂上游離下來。分離液可以采用苯酚，苯硫基甲烷以及三氟乙酸其中的一種或幾種的混合物，取10-80毫升的分離液浸泡上述結合有多肽類物質(I)的樹脂，在室溫下攪拌1-5小時，然后經過過濾便可得到多肽類物質(I)混合液。游離的多肽類物質(I)經過沉淀后，即可分離出來。
3、純化將分離出來的多肽類物質(I)溶解在水或10-40％的堿溶液中(堿可以選用碳酸氫銨、碳酸銨、碳酸氫鈉、碳酸鈉)，然后用常規(guī)的液相色譜法，即可將完整的多肽類物質(I)進行純化。
4、鑒定純化后的多肽類物質(I)，可以通過紫外分光光度法測得其濃度并可通過質譜分析重新核實所合成的多肽類物質(I)的氨基酸序列是否正確。多肽制備實施例三多肽的氨基酸序列為NLQTAVTAIEKHLKDQAQLNSWGCAFERVCHTTVPW根據上述氨基酸的序列按下列方法制備。
1、合成首先將樹脂用氯乙醚活化(用量50-100毫升/克，并且用量可以變化±5％)，然后將羧基端的第一個氨基酸的氨基用氨基保護基團(叔-丁基羰基)保護起來后(用量10-100克/克)，再加入到樹脂中，從而使其固定到樹脂上。經過二氯甲烷洗滌后，氨基的保護基團可以用六氫吡啶(用量10-80％，最好20-40％)脫保護。與此同時，將第二個氨基酸的羧基經過HBTU活化和二異丙基乙胺中和后，加入到結合有第一個氨基酸的樹脂中，二個氨基酸反應后即可形成肽鍵。然后按照多肽類物質(I)的氨基酸排序，依次加入相應的氨基酸，重復上述的洗滌，氨基去保護，氨基酸羧基的活化等步驟，從而使多肽鏈不斷延長。直到最后一個氨基酸結合到肽鏈上為止。
2、分離合成后的多肽仍然與樹脂結合在一起，因此分離的過程就是利用分離液將多肽類物質(I)從樹脂上游離下來。分離液可以采用苯酚，苯硫基甲烷以及三氟乙酸其中的一種或幾種的混合物，取10-80毫升的分離液浸泡上述結合有多肽類物質(I)的樹脂，在室溫下攪拌1-5小時，然后經過過濾便可得到多肽類物質(I)混合液。游離的多肽類物質(I)經過沉淀后，即可分離出來。
3、純化將分離出來的多肽類物質(I)溶解在水或10-40％的堿溶液中(堿可以選用碳酸氫銨、碳酸銨、碳酸氫鈉、碳酸鈉)，然后用常規(guī)的液相色譜法，即可將完整的多肽類物質(I)進行純化。
4、鑒定純化后的多肽類物質(I)，可以通過紫外分光光度法測得其濃度并可通過質譜分析重新核實所合成的多肽類物質(I)的氨基酸序列是否正確。多肽制備實施例四多肽的氨基酸序列為NLQTAVTAIEKHTKDQAQLNSWGCAFEQVCHTTVPW根據上述氨基酸的序列按下列方法制備。
1、合成首先將樹脂用氯乙醚活化(用量50-100毫升/克，并且用量可以變化±5％)，然后將羧基端的第一個氨基酸的氨基用氨基保護基團(甲苯磺?；?保護起來后(用量20-50克/克)，再加入到樹脂中，從而使其固定到樹脂上。經過二氯甲烷洗滌后，氨基的保護基團可以用六氫吡啶(用量10-80％，最好20-40％)脫保護。與此同時，將第二個氨基酸的羧基經過HBTU活化和二異丙基乙胺中和后，加入到結合有第一個氨基酸的樹脂中，二個氨基酸反應后即可形成肽鍵。然后按照多肽類物質(I)的氨基酸排序，依次加入相應的氨基酸，重復上述的洗滌，氨基去保護，氨基酸羧基的活化等步驟，從而使多肽鏈不斷延長。直到最后一個氨基酸結合到肽鏈上為止。
2、分離合成后的多肽仍然與樹脂結合在一起，因此分離的過程就是利用分離液將多肽類物質(I)從樹脂上游離下來。分離液可以采用苯酚，苯硫基甲烷以及三氟乙酸其中的一種或幾種的混合物，取10-80毫升的分離液浸泡上述結合有多肽類物質(I)的樹脂，在室溫下攪拌1-5小時，然后經過過濾便可得到多肽類物質(I)混合液。游離的多肽類物質(I)經過沉淀后，即可分離出來。
3、純化將分離出來的多肽類物質(I)溶解在水或10-40％的堿溶液中(堿可以選用碳酸氫銨、碳酸銨、碳酸氫鈉、碳酸鈉)，然后用常規(guī)的液相色譜法，即可將完整的多肽類物質(I)進行純化。
4、鑒定純化后的多肽類物質(I)，可以通過紫外分光光度法測得其濃度并可通過質譜分析重新核實所合成的多肽類物質(I)的氨基酸序列是否正確。多肽制備實施例五多肽的氨基酸序列為NLQTAVTAIEKHTKDQAQLNSWGCAFEKVCHTTVPW根據上述氨基酸的序列按照“多肽制備實施例一”的方法制備得到。多肽制備實施例六多肽的氨基酸序列為NLQTAVTAIEKHTKDQAQLNSWGCAFERVCHTTVPW根據上述氨基酸的序列，按照“多肽制備實施例一”的方法制備得到。多肽制備實施例七多肽的氨基酸序列為NLQTAVTAIEKHSKDQAQLNSWGCAFEQVCHTTVPW根據上述氨基酸的序列，按照“多肽制備實施例二”的方法制備得到。多肽制備實施例八多肽的氨基酸序列為NLQTAVTAIEKHSKDQAQLNSWGCAFEKVCHTTVPW根據上述氨基酸的序列，按照“多肽制備實施例三”的方法制備得到。多肽制備實施例九多肽的氨基酸序列為NLQTAVTAIEKHSKDQAQLNSWGCAFERVCHTTVPW根據上述氨基酸的序列，按照“多肽制備實施例四”的方法制備得到。多肽制備實施例十多肽的氨基酸序列為NLQTAVTAIEKHLKDQAQLNSWGCAFEQVCHTTVPW根據上述氨基酸的序列，按照“多肽制備實施例五”的方法制備得到。多肽制備實施例十一多肽的氨基酸序列為NLQTRVTAIEKHLKDQAQLNSWGCAFEKVCHTTVPW根據上述氨基酸的序列，按照“多肽制備實施例一”的方法制備得到。多肽制備實施例十二多肽的氨基酸序列為NLQTRVTAIEKHLKDQAQLNSWGCAFERVCHTTVPW根據上述氨基酸的序列，按照“多肽制備實施例二”的方法制備得到。多肽制備實施例十三多肽的氨基酸序列為NLQTRVTAIEKHTKDQAQLNSWGCAFEQVCHTTVPW根據上述氨基酸的序列，按照“多肽制備實施例三”的方法制備得到。多肽制備實施例十四多肽的氨基酸序列為NLQTRVTAIEKHTKDQAQLNSWGCAFEKVCHTTVPW根據上述氨基酸的序列，按照“多肽制備實施例四”的方法制備得到。多肽制備實施例十五多肽的氨基酸序列為NLQTRVTAIEKHTKDQAQLNSWGCAFERVCHTTVPW
根據上述氨基酸的序列，按照“多肽制備實施例五”的方法制備得到。多肽制備實施例十六多肽的氨基酸序列為NLQTRVTAIEKHSKDQAQLNSWGCAFEQVCHTTVPW根據上述氨基酸的序列，按照“多肽制備實施例五”的方法制備得到。多肽制備實施例十七多肽的氨基酸序列為NLQTRVTAIEKHSKDQAQLNSWGCAFEKVCHTTVPW根據上述氨基酸的序列，按照“多肽制備實施例三”的方法制備得到。多肽制備實施例十八多肽的氨基酸序列為NLQTRVTAIEKHSKDQAQLNSWGCAFERVCHTTVPW根據上述氨基酸的序列，按照“多肽制備實施例二”的方法制備得到。多肽制備實施例十九分別按照“多肽制備實施例一”至“多肽制備實施例十八”的多肽氨基酸的排列序列，利用化學合成多肽類物質(I) 的基因序列之后，克隆到預先被內切酶處理過的PGEX-2載體中。重組的質粒再轉化到受體菌中，然后在培養(yǎng)基中大量繁殖、誘導。最后將細菌離心收集，再依靠層析柱將多肽類物質(I)和與其結合的蛋白質純化出來。
多肽類物質(I)可以通過蛋白酶從與其融合的GST(谷胱甘肽-S-轉移酶)的融合蛋白上切割下來。最后再濃縮即可制得多肽類物質(I)的純品。
上述制備的多肽類物質(I)在臨床上可以用于檢測、診斷病毒性疾病，特別是艾滋病等一些由病毒引起的疾病，也可以用作制備藥物制劑的原料。
權利要求
1.一種多肽類物質(I)，其特征是由多種氨基酸組成，其氨基酸的排列序列為NLQT*VTAIEKH**KDQAQLNSWGCAFE***VCHTTVPW其中*為氨基酸A(丙氨酸)或氨基酸R(精氨酸)**為氨基酸L(丙氨酸)或氨基酸T(蘇氨酸)或氨基酸S(絲氨酸)***為氨基酸Q(谷氨酰胺)或氨基酸K(賴氨酸)或氨基酸R(精氨酸)
2.根據權利要求1所述的多肽類物質(I)，其特征是用化學合成方法制備得到，合成的步驟為(1)、合成先用氯乙醚將樹脂活化，然后在樹脂中加入第一個氨基酸，并固定到樹脂上，用化學活性基團對氨基加以保護，經過洗滌后，氨基的保護基團采用由六氫吡啶脫保護，再將第二個氨基酸經過活化后，加入到結合有第一個氨基酸的樹脂中，二個氨基酸反應后即形成肽鍵，然后按照多肽的氨基酸排序，依次加入相應的氨基酸，重復上述的洗滌，氨基去保護，氨基酸的活化等步驟，從而使多肽鏈不斷延長，直到最后第一個氨基酸結合到肽鏈上為止。(2)、分離利用分離液將多肽類物質(I)從樹脂上游離下來，取適量的分離液浸泡上述結合有多肽類物質(I)的樹脂，在室溫下攪拌，然后經過濾便可得到多肽類物質(I)，游離的多肽類物質(I)經過沉淀后，即可分離出來。(3)、純化將分離出來的多肽類物質(I)溶解在水或適當濃度的堿溶液中，然后用常規(guī)的色譜方法，將完整的多肽類物質(I)進行純化。(4)、鑒定純化后的多肽類物質(I)，通過質譜分析重新核實所合成的多肽類物質(I)的氨基酸序列是否正確。
3.根據權利要求2所述的多肽類物質(I)的化學合成方法，其特征是氨基酸的氨基可以由以下化學活性基團加以保護①芐酯基(Carbobenzoxyl)②叔丁基羰基(t-Butyloxycarbonyl)③甲苯磺?；?Tosyl)④9-亞芴基甲酯基(Fmoc9-Fluorenylmethoxycarbonyl)
4.根據權利要求2所述的多肽類物質(I)的化學合成方法，其特征是在分離過程中使用的分離液可以采用苯酚，苯硫基甲烷以及三氟乙酸其中的一種或幾種的混合物。
5.根據權利要求2所述的多肽類物質(I)的化學合成方法，其特征是純化過程的堿溶液可以選用碳酸氫銨、碳酸銨、碳酸氫鈉、碳酸鈉的溶液。
6.根據權利要求1所述的多肽類物質(I)，其特征是用基因重組的方法制備得到，其制備的步驟為(1)將多肽類物質(I)的基因序列利用化學合成法合成之后，克隆到預先被內切酶(BamHI和EcoRI)處理過的PGEX-2載體中，重組的質粒再轉化到BL21受體菌中，然后在培養(yǎng)基中大量繁殖、誘導。最后將細菌離心收集，再依靠層析柱將多肽類物質(I)與GST(谷胱甘肽-S-轉移酶)的融合蛋白純化出來。(2)多肽類物質(I)可以通過凝血因子蛋白酶從GST融合蛋白上切割下來，最后再濃縮即可制得多肽類物質(I)的純品。
7.一種權利要求1所述的多肽類物質(I)，其用途是在臨床的檢測、診斷艾滋病病毒方面的應用，或者作為藥物制劑的生產原料。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種多肽類物質(I)的結構、用途和制備方法，這類多肽物質在臨床上用于檢測、診斷病毒性疾病，特別是艾滋病等一些由病毒引起的疾病，也可以用作制備藥物制劑的原料，多肽類物質(I)可以用人工合成的方法制備得到，也可以用基因重組的方法制備得到。
文檔編號G01N33/68GK1473844SQ02115479
公開日2004年2月11日 申請日期2002年1月26日 優(yōu)先權日2002年1月26日
發(fā)明者許衛(wèi)東, 魏勛斌, 潘勇 申請人:北海新升技術開發(fā)有限責任公司