專利名稱：分析方法和用于該方法中的比色杯的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種分析方法和用于執(zhí)行該分析的比色杯。具體地說，本發(fā)明涉及一種在未稀釋的全血樣本中測定血紅蛋白的方法，和可用于該測定中的一次性比色杯。
目前，根據(jù)這些專利研制的一次性比色杯正廣泛用于未稀釋全血中的血紅蛋白(Hb測定)的測定。出于這種目的的比色杯腔預(yù)先用試劑處理過，這樣當(dāng)抽取的血樣注入到杯中時(shí)，紅細(xì)胞的壁碎裂并觸發(fā)化學(xué)反應(yīng)。這種反應(yīng)的結(jié)果使得可以經(jīng)由直接通過比色杯的透明壁的吸光度的測定來確定Hb，其中比色杯的透明壁位于測定帶，又稱作光學(xué)窗，在比色杯的相對平面壁的內(nèi)表面之間具有預(yù)定的并準(zhǔn)確限定的距離。該測定方法是基于Vanzetti，G.，Am.J.Lab. & Clin.Med.67，116(1966)的改進(jìn)的疊氮高鐵血紅蛋白方法。
光譜光度計(jì)測定是在570-880nm進(jìn)行的。這種基于干式化學(xué)的定量測定方法獲得了極大的成功，這可以從例如由von Schenck等在《臨床化學(xué)》第32卷，第3期，1986年的一篇文章中看出，因?yàn)榕c用于測定Hb的標(biāo)準(zhǔn)的濕式方法相比，該方法獲得了相等甚至更優(yōu)的結(jié)果。所用的試劑由使紅細(xì)胞溶血的脫氧膽酸鈉、疊氮化鈉和亞硝酸鈉構(gòu)成，它將血紅蛋白轉(zhuǎn)化成疊氮高鐵血紅蛋白。
由于所用試劑的吸濕特性，儲藏期受到限制，并且需要比色杯在包含干燥劑的密封包裝內(nèi)儲藏。甚至更麻煩的是對于高濕性的氣候，必須在從包裝中取出后的幾分鐘內(nèi)使用比色杯，否則試劑將會被破壞，導(dǎo)致測定不準(zhǔn)確因此無效。
發(fā)明目的本發(fā)明的一個(gè)目的是提供一種在全血中測定血紅蛋白濃度的快速、準(zhǔn)確的方法。
本發(fā)明的第二個(gè)目的是提供一種可以在一次性微型比色杯中進(jìn)行的測定全血中血紅蛋白濃度的方法。
本發(fā)明第三個(gè)目的是提供一種用于測定未稀釋的全血樣本中血紅蛋白濃度的微型比色杯，這種方法克服了試劑的吸濕特性引起的問題。
從下面的描述和所附的權(quán)利要求中將會很容易理解本發(fā)明的其它目的。
如此，出人意料的發(fā)現(xiàn)在沒有上面提到的疊氮化鈉和亞硝酸鈉化學(xué)試劑存在的情況下可以定量測定血紅蛋白的濃度。更具體地說，發(fā)現(xiàn)在有適當(dāng)選定的溶血試劑或其混合物存在的條件下，可以直接在溶血的血樣上進(jìn)行血紅蛋白的定量測定。
根據(jù)本發(fā)明，還發(fā)現(xiàn)可因此省略吸濕性試劑。另外，可以縮短獲得分析結(jié)果的時(shí)間。在分析大量樣本，例如在醫(yī)院和血庫的情況下，這一時(shí)間特性顯得尤為重要。發(fā)明的詳細(xì)描述根據(jù)本發(fā)明所用的一次性微型比色杯可以是美國專利4 088 448中公開的那種類型或優(yōu)選是美國專利5 674 457中公開的那種類型，這些文獻(xiàn)并入此作為參考?？梢韵薅ㄟ@種比色杯為單一主體部分，它包括至少一個(gè)具有光學(xué)窗(測定帶)的腔，其中設(shè)置相對腔的兩個(gè)平面或彎曲的表面彼此間隔一定距離，從而限定一個(gè)預(yù)定的光程長度。在限定測定帶的兩個(gè)表面之間的這個(gè)距離在提供用于血紅蛋白測定的適宜光程長度方面是一個(gè)重要的參數(shù)，在一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方案中該距離介于0.05-0.2mm之間。在該腔的其余部分的內(nèi)表面之間的距離優(yōu)選在0.1-2mm級，這使得樣本能夠通過毛細(xì)作用力經(jīng)過腔的入口進(jìn)入到腔內(nèi)，所述入口與主體部分的外部相通。再者，該腔具有小于大約25微升的固定的預(yù)定體積。將干燥的溶血?jiǎng)┩糠笤谇坏膬?nèi)表面。優(yōu)選溶血?jiǎng)┐嬖诘牧砍^溶血反應(yīng)所需的量。根據(jù)本發(fā)明的方法進(jìn)行測定不再需要其它添加劑。
根據(jù)本發(fā)明的比色杯可以用任何適宜的材料構(gòu)成，它允許必要的致密容差水平的形成。優(yōu)選該比色杯由透明的聚合材料通過注模制造。
本發(fā)明的關(guān)鍵特征在于溶血?jiǎng)?。具體地說，這種溶血?jiǎng)?yīng)該基本上是不吸濕的并且容易溶于水或更準(zhǔn)確地說溶于未稀釋的全血中。再者，由于對于一個(gè)方法而言具有重現(xiàn)性結(jié)果是很重要的，因此該試劑應(yīng)該優(yōu)選具有定義明確的化學(xué)結(jié)構(gòu)。由于溶血?jiǎng)﹥?yōu)選作為溶液引入到比色杯的腔內(nèi)，接著優(yōu)選通過加熱很小心地使其干燥，因此合適的是該溶血?jiǎng)┖苋菀兹苡诓粫蛊淦茐牡挠袡C(jī)溶劑中，并且該有機(jī)溶劑在低溫下應(yīng)該很容易蒸發(fā)。因此優(yōu)選該溶血?jiǎng)?yīng)該很容易溶于醇類，例如甲醇。
在選擇溶血?jiǎng)r(shí)還有一個(gè)重要的特征是在該試劑以干燥形式存在于方便使用的微型比色杯中時(shí)，允許使全血快速并均勻地引入到比色杯中。特別是，將全血引入到微型比色杯中所用的時(shí)間應(yīng)該比這個(gè)血樣溶解比色杯中的溶血?jiǎng)┧玫臅r(shí)間要短。
溶血?jiǎng)┑奶貏e優(yōu)選的基團(tuán)是離子和非離子、具有溶血特性的表面活性物質(zhì)。這種物質(zhì)的例子是選自下組的季銨鹽烷基三乙銨鹽、烷基二甲基芐銨鹽和由以下物質(zhì)組成的烷基吡啶鹽十四烷基三甲基溴化銨(TTAB)、氯化十二烷基三甲銨、十六烷基三甲基溴化銨、溴化十六碳烷基三甲銨、氯化芐烷銨、十六烷基氯化吡啶鎓和其它季銨鹽類；十二烷基硫酸鈉、和脫氧膽酸鹽類?？捎糜诒景l(fā)明的特別適合的溶血?jiǎng)┦敲撗跄懰徕c、脫氧膽酸鉀、脫氧膽酸鈣、脫氧膽酸嗎啉(morfolin)、脫氧膽酸環(huán)己銨鹽和脫氧膽酸銨或它們的組合物。本發(fā)明最優(yōu)選的能滿足定量并快速測定血紅蛋白的要求的溶血?jiǎng)┦敲撗跄懰徕c和脫氧膽酸銨的組合物。在該組合中脫氧膽酸銨的量優(yōu)選占該組合物重量的20-80％。
在產(chǎn)生本發(fā)明的試驗(yàn)期間發(fā)現(xiàn)，可能血紅蛋白測定中最常用的試劑組，即皂角苷類，一種天然的廣泛分布于植物中的為不同化學(xué)結(jié)構(gòu)的混合物的產(chǎn)品，不能夠得到本發(fā)明方法中的重現(xiàn)性。即使是在非常低濃度的情況下，皂角苷也是強(qiáng)有力的溶血?jiǎng)?br> 與已知的和目前市售的用于在微型比色杯中測定Hb的方法相比，本發(fā)明方法的重要特征和顯著的不同在于該方法的吸光度測定是在另一波長下進(jìn)行的。因此，已經(jīng)發(fā)現(xiàn)在490-520nm，優(yōu)選在500-510nm的波長范圍內(nèi)測定吸光度。第二次的補(bǔ)償吸光度測定優(yōu)選在850-910，更優(yōu)選在860-900nm波長范圍內(nèi)進(jìn)行。
在美國專利5 064 282中公開了在這些波長范圍內(nèi)進(jìn)行血樣測定的方法。根據(jù)該專利，測定是在可重復(fù)使用的比色杯中進(jìn)行的，該比色杯中包含有預(yù)先用皂角苷溶血的血樣。具體地說，該方法包括以下步驟將一滴血置于載玻片上，用上面涂敷有皂角苷的攪棒攪動血樣直到透明，然后將這種溶血的血樣引入到比色杯中。
根據(jù)本發(fā)明的方法，由于存在高鐵血紅蛋白而導(dǎo)致可能出現(xiàn)的對測定的干擾問題，可以理解的是這種干擾將發(fā)生在帶有極罕見的先天性異常的酶的病人當(dāng)中，在一些罕見的正常血紅蛋白的變體當(dāng)中，和在暴露于某些藥物和化學(xué)品，如非那西汀、硝酸鹽、醌類和氯酸鹽之后。在這些情況下，血樣中可能存在高達(dá)10-20％的高鐵血紅蛋白，但是當(dāng)出現(xiàn)這種情況時(shí)，應(yīng)該會有非常明顯的臨床征兆以指示需要使用疊氮方法，即，目前用于微型比色杯中的方法，或用氰化血紅蛋白方法(稱作ICSH方法)來替代。如果需要的話，在本文中應(yīng)該加上這種問題還存在于傳統(tǒng)的和普遍接受的氧合血紅蛋白方法中。在煙癮很大的高濃度碳氧血紅蛋白患者和在高濃度硫血紅蛋白的患者中也可能出現(xiàn)干擾。
適用于這些測定中的光度計(jì)可以通過改進(jìn)現(xiàn)有的光度計(jì)使具有適宜的濾波器和發(fā)光二極管而獲得。根據(jù)本發(fā)明的一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方案，光度計(jì)測定在兩個(gè)波長處的吸光度，并且一個(gè)內(nèi)置的微處理器根據(jù)程序算法計(jì)算血樣中的血紅蛋白總濃度。
下面的非限制性實(shí)施例來具體說明本方法。
將由等分的脫氧膽酸鈉和脫氧膽酸銨組成的溶血?jiǎng)┤苡诩状疾⒁氲骄哂猩鲜鼋Y(jié)構(gòu)的一次性比色杯中。然后蒸發(fā)掉甲醇。
在將現(xiàn)有的、目前使用的包含硝酸鈉/疊氮化鈉以及脫氧膽酸鈉的HemoCue微型比色杯中進(jìn)行的血紅蛋白測定的方法，與本發(fā)明的在僅包含干燥的脫氧膽酸鈉和脫氧膽酸銨混合物的微型比色杯中進(jìn)行的方法相比，發(fā)現(xiàn)根據(jù)本發(fā)明的方法的優(yōu)選的溶血?jiǎng)┤芙馊臅r(shí)間要縮短15秒。特別是溶血存在于微型比色杯中的干燥的溶血試劑的時(shí)間小于40秒。這將使測定血紅蛋白的總時(shí)間進(jìn)一步減少25％，這一點(diǎn)在繁忙的醫(yī)院和其它進(jìn)行測定的地方顯得非常有利。
在關(guān)于濕度對穩(wěn)定性影響的方面的相應(yīng)比較中發(fā)現(xiàn)，包含上面提到的脫氧膽酸鹽混合物的微型比色杯在空氣中、45℃和80％相對濕度的條件下的穩(wěn)定性是24小時(shí)，可以比得上市售的HemoCue微型比色杯在相同條件下約2分鐘所得的結(jié)果。
在

圖1中顯示了使用這種溶血混合物(沒有其它任何化學(xué)物質(zhì))的新方法與標(biāo)準(zhǔn)的ICSH方法比較后的結(jié)果。該評估是在實(shí)驗(yàn)室條件下進(jìn)行的?？梢钥闯鲞@兩種方法之間的一致性非常好。
用光譜光度計(jì)的吸光度測定，已知方法是在約570nm，該新方法是在大約505nm波長處進(jìn)行的。這兩種方法的補(bǔ)償測定均是在880nm處進(jìn)行的。
前面已經(jīng)描述了本發(fā)明的某些優(yōu)選實(shí)施方案，但這絕不是要限制本發(fā)明。而且在本發(fā)明范圍內(nèi)的某些細(xì)節(jié)的修改、變化和改進(jìn)都是允許的。
權(quán)利要求
1.一種在未稀釋的全血中定量測定血紅蛋白濃度的方法，包括以下步驟將未稀釋的全血樣本通過毛細(xì)作用引入到具有至少一個(gè)用于接受樣本的腔的一次性微型比色杯中，該腔內(nèi)包含有干燥狀態(tài)的基本上非吸濕性的溶血?jiǎng)?；溶血?jiǎng)┍蝗芙?，從而溶解紅細(xì)胞并釋放包含于血細(xì)胞內(nèi)的血紅蛋白；直接在比色杯中溶血的樣本上于490-520nm波長范圍內(nèi)進(jìn)行第一次吸光度測定；和再進(jìn)行第二次吸光度測定以補(bǔ)償背景干擾。
2.根據(jù)權(quán)利要求1的方法，其中所述溶血?jiǎng)┛扇苡谟袡C(jī)溶劑。
3.根據(jù)權(quán)利要求2的方法，其中所述有機(jī)溶劑是諸如甲醇的醇類。
4.根據(jù)前述權(quán)利要求任一項(xiàng)的方法，其中所述溶血?jiǎng)┦且韵率龇绞竭x擇的該試劑以干燥狀態(tài)存在于待使用的微型比色杯中，允許快速將全血引入該比色杯中。
5.根據(jù)權(quán)利要求4的方法，其中用于將全血引入微型比色杯中所用的時(shí)間短于溶解溶血?jiǎng)┧玫臅r(shí)間。
6.根據(jù)權(quán)利要求1-5中任一項(xiàng)的方法，其中所述溶血?jiǎng)┻x自由離子和非離子、表面活性物質(zhì)組成的組。
7.根據(jù)權(quán)利要求1-6中任一項(xiàng)的方法，其中所述溶血?jiǎng)┻x自由脫氧膽酸鹽和季銨鹽組成的組。
8.根據(jù)前述任一項(xiàng)權(quán)利要求所述的方法，其中所述溶血?jiǎng)┻x自下組脫氧膽酸鈉、脫氧膽酸鉀、脫氧膽酸鈣、脫氧膽酸嗎啉、脫氧膽酸環(huán)己銨鹽和脫氧膽酸銨或它們的組合物。
9.根據(jù)前述任一項(xiàng)權(quán)利要求所述的方法，其中所述溶血?jiǎng)┗旧鲜怯擅撗跄懰徕c和脫氧膽酸銨的混合物構(gòu)成。
10.根據(jù)權(quán)利要求9所述的方法，其中所述脫氧膽酸銨的量占重量的20-80％。
11.根據(jù)前述任一項(xiàng)權(quán)利要求所述的方法，其中所述第一次吸光度測定是在490-520nm，優(yōu)選在500-510nm波長范圍內(nèi)進(jìn)行的。
12.根據(jù)前述任一項(xiàng)權(quán)利要求所述的方法，其中所述第二次吸光度測定是在850-910nm，優(yōu)選在860-900nm波長范圍內(nèi)進(jìn)行的。
13.用于光譜光度計(jì)在未稀釋的全血中測定血紅蛋白濃度的一次性比色杯，其特征在于在其腔內(nèi)包含有干燥的、非吸濕性的溶血?jiǎng)┗蛉苎獎(jiǎng)┑慕M合物，條件是腔內(nèi)基本上沒有疊氮化物和硝酸鹽。
14.根據(jù)權(quán)利要求13的微型比色杯，其特征在于所述溶血?jiǎng)┦侨鐧?quán)利要求2-10中任意一項(xiàng)所定義的那種。
全文摘要
本發(fā)明涉及一種血紅蛋白測定的方法，它包括以下步驟將未稀釋的全血樣本通過毛細(xì)作用引入到具有至少一個(gè)用于接受樣本的腔的一次性微型比色杯中，該腔內(nèi)包含有干燥狀態(tài)的基本上非吸濕性的溶血?jiǎng)?；溶血?jiǎng)┍谎喝芙?，從而溶解紅細(xì)胞并釋放包含于血細(xì)胞內(nèi)的血紅蛋白；直接在微型比色杯中溶血的樣本上于490－520nm波長范圍內(nèi)進(jìn)行第一次吸光度測定；和進(jìn)行第二次吸光度測定以補(bǔ)償背景干擾。
文檔編號G01N33/48GK1439095SQ0181195
公開日2003年8月27日 申請日期2001年6月25日 優(yōu)先權(quán)日2000年6月28日
發(fā)明者J·利爾雅, S-E·尼爾森, J·斯文森, A·艾里克森 申請人:米格拉塔英國有限公司