專利名稱：用莖葉表皮細(xì)胞質(zhì)壁分離比率快速鑒定番茄耐鹽植株方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于生物技術(shù)的植物、農(nóng)作物檢測,特別涉及一種用莖葉表皮細(xì)胞質(zhì)壁分離比 率快速鑒定番茄耐鹽植株方法。
背景技術(shù)：
隨著世界人口的增長和人們生活水平的提高，土地和淡水資源越來越匱乏，土地鹽堿
化成為日益嚴(yán)重的環(huán)境問題之一。利用植物的耐鹽特性是改良和利用鹽堿地以及微咸水資
源的一條重要途徑。栽培番茄(丄Kope^/cow escw/e加wn Miller)的一些近緣種如醋栗番茄(丄.
/7/ ^>2e//e/z/o//ww (jusl) Mill)、契斯曼尼番茄c/ze^附a"http:// Riley)耐鹽能力非常強(qiáng)，用
50%~70%的海水灌溉幾乎不影響其正常的生長發(fā)育過程。通過遠(yuǎn)緣雜交技術(shù)和后代耐鹽性
鑒定，這些近緣種的耐鹽基因已經(jīng)成功地轉(zhuǎn)移到了普通番茄中。但在雜交和自交過程中，
各種基因之間不斷地進(jìn)行重組和分離，如何準(zhǔn)確地鑒別和篩選耐鹽且高產(chǎn)優(yōu)質(zhì)的優(yōu)良基因
型，成為科學(xué)家苦苦探索的關(guān)鍵技術(shù)。
最早人們用含鹽培養(yǎng)基上的種子萌發(fā)試驗(yàn)來挑選耐鹽種子。大量的試驗(yàn)證明，鹽脅迫
通常只是延遲了種子的萌發(fā)時(shí)間，種子萌發(fā)過程中的耐鹽能力與植株生長階段的耐鹽能力 相關(guān)性不高；許多耐鹽植物的種子萌發(fā)階段和幼苗階段并不耐鹽。后來有人提出用種子根 在含鹽培養(yǎng)基上的生長速度來鑒別耐鹽植株，這種方法在擬南芥上得到成功應(yīng)用，但在番 茄上實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，種乎根在鹽脅迫條件下的生長速度與成珠期的耐鹽能力沒有相關(guān)性。 目前大家公認(rèn)的耐鹽潛力鑒定方法是溶液培養(yǎng)法，即把相同苗齡的植株放在含鹽量不同的 營養(yǎng)液中，根據(jù)植株的生長量、生根量、死亡率等判斷它們的耐鹽潛力。用這種方法鑒定 出來的耐鹽性與生產(chǎn)實(shí)踐中的耐鹽表現(xiàn)基本一致。溶液培養(yǎng)法一般需要3-5周，試驗(yàn)材料 生長勢的一致性、溶液培養(yǎng)過程中的溫度和通氣狀況是影響實(shí)驗(yàn)結(jié)果的主要因素，材料容 量有限、試驗(yàn)時(shí)間較長是溶液培養(yǎng)法的主要缺點(diǎn)。
在高滲環(huán)境中，植物細(xì)胞由于液泡失水而使原生質(zhì)層與細(xì)胞壁分離的現(xiàn)象，叫做質(zhì)壁 分離。質(zhì)壁分離是植物生活細(xì)胞所具有的一種特性?？梢杂脕韰^(qū)別細(xì)胞的死活；也可用來 測定細(xì)胞液的滲透壓，以及原生質(zhì)的透性、彈性、粘滯性等。造成質(zhì)壁分離的原因是細(xì) 胞壁是全透性的膜，而質(zhì)膜和液泡膜均是選擇透過性的膜，當(dāng)外界溶液的濃度比細(xì)胞液的 濃度高時(shí)，細(xì)胞液的水分就會(huì)向外滲出，液泡的體積縮小，由于細(xì)胞壁的伸縮性有限，而原生質(zhì)的伸縮性較大，所以在細(xì)胞壁停止收縮后，原生質(zhì)繼續(xù)在收縮，這樣原生質(zhì)層與細(xì) 胞壁就逐漸分開，原生質(zhì)層與細(xì)胞壁之間的空隙里就充滿了外界濃度較高的溶液。如果把 發(fā)生了質(zhì)壁分離現(xiàn)象的細(xì)胞再浸入濃度很低的溶液或清水中，外面的水就進(jìn)入細(xì)胞，液泡 變大，整個(gè)原生質(zhì)層又慢慢恢復(fù)到原來的狀態(tài)，這種現(xiàn)象叫做質(zhì)壁分離的復(fù)原。對番茄而 言，鹽脅迫首先是通過滲透勢的改變引起細(xì)胞內(nèi)容物的外流，從理論上講也會(huì)出現(xiàn)質(zhì)壁分 離。在相同的鹽脅迫環(huán)境中，耐鹽基因型的質(zhì)壁分離情況和不耐鹽的基因型應(yīng)該有明顯的 區(qū)別。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明所要解決的技術(shù)問題是提供一種用莖葉表皮細(xì)胞質(zhì)壁分離比率快速鑒定番茄
耐鹽植株方法。只需20-30分鐘就能準(zhǔn)確判斷基因型的耐鹽潛力，省工省時(shí)，工作效率極高。
本發(fā)明的技術(shù)方案是
一種用莖葉表皮細(xì)胞質(zhì)壁分離比率快速鑒定番茄耐鹽植株方法，其特征在于
1) 以對植物無害的活體染料中性紅為指示劑，對番茄植株的莖葉表皮細(xì)胞進(jìn)行染色， 活細(xì)胞的液泡被染成櫻桃紅色，原生質(zhì)和細(xì)胞壁一般不著色；死細(xì)胞由于原生質(zhì)變性凝固， 胞液不能維持在液泡內(nèi)，用中性紅染色后，不產(chǎn)生液泡著色現(xiàn)象；
2) 耐鹽能力不同的番茄基因型，其莖葉表皮細(xì)胞在鹽溶液中的存活率有很大的差異； 在高鹽溶液中處理一定的時(shí)間，莖葉表皮細(xì)胞的質(zhì)壁分離比率，即細(xì)胞存活率，能快速準(zhǔn) 確地反映基因型的耐鹽能力。
所述的用莖葉表皮細(xì)胞質(zhì)壁分離比率快速鑒定番茄耐鹽植株方法選擇對植物無害 的中性紅染料，染液濃度以0.03%為宜，染色時(shí)間不超過10分鐘，不少于5分鐘；莖葉表 皮厚度應(yīng)均勻一致，否則影響染色效果。
所述的用莖葉表皮細(xì)胞質(zhì)壁分離比率快速鑒定番茄耐鹽植株方法選擇化學(xué)純的 NaCl，溶液濃度一般以1.5M為宜，處理時(shí)間15-20分鐘；降低鹽溶液濃度需要延長處理時(shí) 間，增加鹽溶液濃度需要縮短處理時(shí)間；番茄莖葉表皮細(xì)胞對鹽脅迫的靈敏度在基因型間 有明顯差異。
本發(fā)明效果是
實(shí)驗(yàn)結(jié)果充分地證實(shí)了這個(gè)理論推導(dǎo)。利用質(zhì)壁分離鑒定技術(shù)，只需20-30分鐘就能 準(zhǔn)確判斷基因型的耐鹽潛力，省工省時(shí)，工作效率極高，具有非常廣闊的應(yīng)用前景。對其 他植物耐鹽潛力的快速鑒定具有重要參考價(jià)值。本發(fā)明具有以下優(yōu)點(diǎn)和特點(diǎn)l.該技術(shù)體系以植物細(xì)胞的質(zhì)壁分離現(xiàn)象和中性紅染料的著色原理為依據(jù)，只需少量的番茄葉片或 莖桿表皮細(xì)胞，就能迅速地鑒定出植株的耐鹽能力，具有效率高、重復(fù)性好、費(fèi)用低廉等 優(yōu)點(diǎn)。2.根據(jù)水培試驗(yàn)和質(zhì)壁分離試驗(yàn)的相關(guān)性，確定各種植物的耐鹽臨界值，然后根據(jù) 質(zhì)壁分離試驗(yàn)淘汰大量不耐鹽的基因型，可以有效地壓縮田間試驗(yàn)的規(guī)模，節(jié)約時(shí)間和人 力，大幅度提高優(yōu)良耐鹽基因型的篩選效率，加速耐鹽植物育種的步伐。


圖1. 1番茄莖表皮細(xì)胞經(jīng)0. 5M NaCl處理后的質(zhì)壁分離情況 圖1. 2番茄莖表皮細(xì)胞經(jīng)1. 0M NaCl處理后的質(zhì)壁分離情況 圖2.1 1. 5M NaCl溶液處理普通品種葉表皮細(xì)胞的質(zhì)壁分離情況 圖2. 2 1. 5M NaCl溶液處理耐鹽品種葉表皮細(xì)胞的質(zhì)壁分離情況 圖3番茄不同品種在鹽溶液中的生長情況
質(zhì)壁分離試驗(yàn)的結(jié)果表明，在1.5M NaCl溶液中放置15-20分鐘，耐鹽品種Edkawi 的莖葉表皮細(xì)胞出現(xiàn)明顯的質(zhì)壁分離現(xiàn)象，鹽脅迫引起的細(xì)胞死亡率在20%以內(nèi)；普通番 茄品種的莖葉表皮細(xì)胞大部分喪失活力，細(xì)胞死亡率在80%以上。說明番茄植株的耐鹽能 力和莖葉表皮細(xì)胞的耐鹽能力高度相關(guān)，用1. 5M NaCl溶液進(jìn)行質(zhì)壁分離試驗(yàn)，能快速、 準(zhǔn)確地篩選出耐100mM以上NaCl溶液的番茄植株。
具體實(shí)施例方式
針對傳統(tǒng)技術(shù)鑒定植物耐鹽潛力所需時(shí)間長、所需材料多、工作效率低的問題，發(fā) 明人進(jìn)行了大量的研究工作，最終建立了利用細(xì)胞質(zhì)壁分離技術(shù)快速鑒定番茄耐鹽潛力的 新方法。以發(fā)生質(zhì)壁分離的細(xì)胞在被觀察細(xì)胞中所占的比率為依據(jù)，可以快速、準(zhǔn)確地確 定不同基因型的耐鹽潛力，從而篩選耐鹽潛力高的優(yōu)良基因型，在短時(shí)間內(nèi)淘汰大量的無 用材料，進(jìn)而選育出耐鹽的優(yōu)良番茄新品種。
本發(fā)明旨在提供一種科學(xué)高效的耐鹽潛力快速鑒定方法，通過該方法淘汰大量不耐 鹽的基因型，實(shí)現(xiàn)耐鹽基因和高產(chǎn)優(yōu)質(zhì)基因的結(jié)合，加速耐鹽番茄新品種的選育。
本發(fā)明之目的通過如下的技術(shù)方案來實(shí)現(xiàn)-
番茄細(xì)胞質(zhì)染色技術(shù)的研究
中性紅是對植物無害的常用活體染料之一，它是一種弱堿性PH指示劑，變色范圍 在p朋.4 8.0之間(由紅變黃)。在中性或微堿性環(huán)境中，植物的活細(xì)胞能大量吸收中性紅 并向液泡中排泌，由于液泡在一般情況下呈酸性反應(yīng)，因此，進(jìn)入液泡的中性紅便解離出大量陽離子而呈現(xiàn)櫻桃紅色，在這種情況下，原生質(zhì)和細(xì)胞壁一般不著色。死細(xì)胞由于原 生質(zhì)變性凝固，胞液不能維持在液泡內(nèi)，用中性紅染色后，不產(chǎn)生液泡著色現(xiàn)象。
把經(jīng)過中性紅染色的番茄莖葉表皮細(xì)胞放在鹽溶液中，經(jīng)過一定的時(shí)間后，原生質(zhì) 出現(xiàn)明顯的質(zhì)壁分離現(xiàn)象。隨著鹽濃度的提高或鹽溶液浸泡時(shí)間的延長，液泡濃縮成圓球 狀。當(dāng)鹽濃度過高或在鹽溶液中浸泡時(shí)間過長時(shí)，細(xì)胞膜破損，細(xì)胞內(nèi)外成一體，染色淺， 觀察不到紅色球團(tuán)。在蓋玻片的一端滴加清水，另一端用吸水紙吸收水分，清水能使?jié)饪s 成團(tuán)狀的細(xì)胞質(zhì)重新彭大。質(zhì)壁分離復(fù)原后的細(xì)胞呈粉紅色，不能復(fù)原的細(xì)胞能觀察到玻 璃膠狀的細(xì)胞質(zhì)。
番茄莖葉表皮細(xì)胞質(zhì)壁分離臨界鹽濃度的確定
把從活體上剝離下來的葉和莖表皮細(xì)胞放在0.03%中性紅溶液中，染色10分鐘，細(xì) 胞質(zhì)完全著色，然后把染色后的表皮細(xì)胞分別放在0.5M、 l.OM、 1.5M和2.0M的NaCl 溶液中處理15分鐘，在10X10倍的光學(xué)顯微鏡下觀察，發(fā)現(xiàn)都有不同程度的質(zhì)壁分離。 0.5M NaCl溶液處理的表皮細(xì)胞質(zhì)壁分離程度較輕，.很容易用蒸餾水復(fù)原；鹽濃度越高， 相同處理時(shí)間內(nèi)的細(xì)胞質(zhì)壁分離越嚴(yán)重(圖1.1、圖1.2)。 1.5M和2.0MNaCl溶液處理的 表皮細(xì)胞出現(xiàn)大量的死亡，死亡細(xì)胞因膜喪失選擇透性而無法被中性紅染色，耐鹽品種的 表皮細(xì)胞死亡率明顯較低(圖2.1、圖2.2)。 1.5MNaCl處理時(shí)，細(xì)胞死亡率對時(shí)間長短的 靈敏性較低，可重復(fù)性較好。因此，我們把1.5M作為NaCl脅迫的臨界鹽濃度。
質(zhì)壁分離比率與耐鹽潛力的相關(guān)性研究
為了鑒定不同番茄品種的耐鹽能力，用公認(rèn)的耐鹽品種Edkawi (LA2711)做對照， 和一系列普通番茄品種一起進(jìn)行水培試驗(yàn)。水溶液由自來水加不同重量的NaCl配制而成。 在lOOmM的NaCl溶液中培養(yǎng)3周后，商業(yè)品種津雜202 (試驗(yàn)材料順序號為6030)和其 他普通番茄品種全部表現(xiàn)出葉片枯萎、根系停止生長的癥狀(圖3左)，而耐鹽品種Edkawi (試驗(yàn)材料順序號9-11)葉色嫩綠、根系生長正常(圖3右)，與在自來水中的生長狀況 相似。
質(zhì)壁分離試驗(yàn)的結(jié)果表明，在1.5M NaCl溶液中放置15-20分鐘，耐鹽品種Edkawi 的莖葉表皮細(xì)胞出現(xiàn)明顯的質(zhì)壁分離現(xiàn)象，鹽脅迫引起的細(xì)胞死亡率在20%以內(nèi)；普通番 茄品種的莖葉表皮細(xì)胞大部分喪失活力，細(xì)胞死亡率在80%以上。說明番茄植株的耐鹽能 力和莖葉表皮細(xì)胞的耐鹽能力高度相關(guān)，用1. 5M NaCl溶液進(jìn)行質(zhì)壁分離試驗(yàn)，能快速、 準(zhǔn)確地篩選出耐100mM以上NaCl溶液的番茄植株。
施例l從美國加州大學(xué)番茄遺傳資源研究中心(TGRC)引進(jìn)耐鹽番茄Edkawi(LA2711)，和我們選育的番茄新品種津雜202進(jìn)行雜交試驗(yàn)，獲得耐鹽基因和其他優(yōu)良基因重組的雜 交后代種子1000粒。把這些種子和親本Edkawi、津雜202的種子同時(shí)放在育苗盤上發(fā)芽， 等長到4葉1心時(shí)，用第3片葉進(jìn)行質(zhì)壁分離試驗(yàn)。首先從Edkawi和津雜202的葉片和 莖桿上輕輕剝下表皮細(xì)胞，放在0. 03%的中性紅溶液中處理10分鐘，然后轉(zhuǎn)移到1. 5MNaCl 溶液中處理15分鐘。在10X10的光學(xué)顯微鏡下，觀察到Edkawi的表皮細(xì)胞中，大部分 呈現(xiàn)出粉紅色的團(tuán)狀細(xì)胞質(zhì)，而津雜202的表皮細(xì)胞中，只有極少數(shù)細(xì)胞含有粉紅色的團(tuán) 狀細(xì)胞質(zhì)。說明1.5M的NaCl溶液能夠把耐鹽基因型鑒別出來。
IOOO粒雜交種子發(fā)芽后，共獲得860株番茄植株，在4葉1心階段，用第3片葉子 和葉柄上的表皮細(xì)胞，進(jìn)行質(zhì)壁分離試驗(yàn)。各單株的莖葉表皮細(xì)胞在中性紅中染色10分 鐘后，轉(zhuǎn)移到1.5M NaCl溶液中處理15分鐘，然后進(jìn)行顯微觀察計(jì)數(shù)，凡是表皮細(xì)胞的 質(zhì)壁分離率低于50%的基因型， 一律淘汰。質(zhì)壁分離率高于80%的基因型，直接移栽到試 驗(yàn)田中進(jìn)行農(nóng)藝性狀的鑒定。質(zhì)壁分離率介于50%和80%之間的基因型，放在100mM的鹽 溶液繼續(xù)進(jìn)行耐鹽性鑒定。從860個(gè)單株中總共鑒別出36株耐鹽基因型，使得田間試驗(yàn) 的規(guī)模大幅度縮小，工作效率大幅度提高。
權(quán)利要求
1、一種用莖葉表皮細(xì)胞質(zhì)壁分離比率快速鑒定番茄耐鹽植株方法，其特征在于1)以對植物無害的活體染料中性紅為指示劑，對番茄植株的莖葉表皮細(xì)胞進(jìn)行染色，活細(xì)胞的液泡被染成櫻桃紅色，原生質(zhì)和細(xì)胞壁一般不著色；死細(xì)胞由于原生質(zhì)變性凝固，胞液不能維持在液泡內(nèi)，用中性紅染色后，不產(chǎn)生液泡著色現(xiàn)象；2)耐鹽能力不同的番茄基因型，其莖葉表皮細(xì)胞在鹽溶液中的存活率有很大的差異；在高鹽溶液中處理一定的時(shí)間，莖葉表皮細(xì)胞的質(zhì)壁分離比率，即細(xì)胞存活率，能快速準(zhǔn)確地反映基因型的耐鹽能力。
2、 根據(jù)權(quán)利要求1所述的用莖葉表皮細(xì)胞質(zhì)壁分離比率快速鑒定番茄耐鹽植株方法，其 特征在于選擇對植物無害的中性紅染料，染液濃度以0.03%為宜，染色時(shí)間不超過10 分鐘，不少于5分鐘；莖葉表皮厚度應(yīng)均勻一致，否則影響染色效果。
3、 根據(jù)權(quán)利要求1所述的用莖葉表皮細(xì)胞質(zhì)壁分離比率快速鑒定番茄耐鹽植株方法，其 特征在于選擇化學(xué)純的NaCl，溶液濃度一般以1.5M為宜，處理時(shí)間15-20分鐘；降低鹽 溶液濃度需要延長處理時(shí)間，增加鹽溶液濃度需要縮短處理時(shí)間；番茄莖葉表皮細(xì)胞對鹽 脅迫的靈敏度在基因型間有明顯差異。
全文摘要
一種用莖葉表皮細(xì)胞質(zhì)壁分離比率快速鑒定番茄耐鹽植株方法，以活體染料中性紅為指示劑，對番茄植株的莖葉表皮細(xì)胞進(jìn)行染色，活細(xì)胞、死細(xì)胞的著色不同，從而判斷耐鹽能力不同的番茄基因型，在高鹽溶液中處理一定的時(shí)間，莖葉表皮細(xì)胞的質(zhì)壁分離比率，即細(xì)胞存活率，能快速準(zhǔn)確地反映基因型的耐鹽能力。利用質(zhì)壁分離鑒定技術(shù)，只需20-30分鐘就能準(zhǔn)確判斷基因型的耐鹽潛力，省工省時(shí)，工作效率極高，具有非常廣闊的應(yīng)用前景。
文檔編號G01N21/88GK101576507SQ200810052999
公開日2009年11月11日 申請日期2008年5月5日 優(yōu)先權(quán)日2008年5月5日
發(fā)明者劉仲齊, 劉俠妤, 郟艷紅 申請人:天津市農(nóng)業(yè)生物技術(shù)研究中心