專利名稱：辨別人乳頭瘤病毒的免疫學(xué)方法
發(fā)明
背景技術(shù)：
領(lǐng)域總的來說，本發(fā)明涉及與直接針對HPV的抗體反應(yīng)的肽。有人將這種類型的肽稱作抗原性或免疫原性的。更具體地說，本發(fā)明涉及來源于人乳頭瘤病毒[HPV]E2，E6，和E7癌基因蛋白的早期編碼區(qū)的肽，和利用上述肽通過免疫測定診斷與HPV相關(guān)的上皮細(xì)胞異常的方法。
現(xiàn)有技術(shù)人乳頭瘤病毒(HPV)，因某些類型的該種病毒誘導(dǎo)疣或乳頭瘤，進(jìn)而引起全部子宮頸癌而得名(Nobbenhuis等，″Relation of humanpapillomavirus status to cervical lesion and consequences for cervical-cancerscreeninga prospective study″，The Lancet，35420-25，1999；Cuzick等，″Asystematic review of the role of human papilloma virus(HPV)testing within acervical screening programmesummary and conclusions″，British Journal ofCancer，83561-565，2000)。這不僅包括鱗狀上皮細(xì)胞癌(Nobbenhuis等，1999)還包括腺癌(Pirog等，″Prevalence of human papillomavirus DNA indifferent histological subtypes of cervical adenocarcinoma，″American Journalof Pathology，1571055-1062，2000)。這些病毒還與外陰和陰道癌(Frisch等，″Human papillomavirusassociated carcinomas in Hawaii and the mainlandUS″，Cancer 881464-1469，2000；Sugase等，″Distinct manisfestations ofhuman papillomaviruses in the vagina″，International Journal of Cancer，72412-415，1997)，以及肛門癌(Frisch等，2000)和陰莖癌(Gregoire等，″Preferential association of human papillomavirus with high-gradehistologic variants of penile-invasiVe squamous cell carcinoma″，Journal ofthe National Cancer Institute，871705-1709，1995)極為相關(guān)。而且，HPV還可能是引起腦和頸部特定癌癥(Mellin等，″Human papillomavirus(HPV)DNA in tonsillar cancerclinical correlates，risk of relapse，and survival″，International Journal of Cancer，89300-304，2000；Zumbach等，″Antibodiesagainst oncoproteins E6 and E7 of human papillomavirus types 16 and 18 inpatients with head-and-neck squamous-cell carcinoma″，International Journalof Cancer，85815-818，2000)的原因，似與致命性更強(qiáng)的黑素瘤相關(guān)(Dreau等，″Human papilloma virus in melanoma biopsy specimens and itsrelations to melanoma progression″，Annals of Surgery，231664-671，2000)，還可能在肺癌(Soini等，″Presence of human papillomavirus DNA andabnormal p53 protein accumulation in lung carcinoma″，Thorax 51887-893，1996)等癌癥中起作用。HPV存在以數(shù)字命名的不同的基因型，其中只有某個(gè)亞型是致瘤或引起癌癥的。目前已經(jīng)鑒定了100多個(gè)HPV基因型。癌主要分布在HPV 16和18，同時(shí)也出自31，33，35，45，51，52，56和58。病毒感染可以支持病毒繁殖的子宮頸和其它細(xì)胞，在其中病毒可以引起異常的細(xì)胞改變，進(jìn)而導(dǎo)致威脅生命的惡性腫瘤。世界上，子宮頸癌是婦女中第二大普遍的癌癥。每年，約450,000名婦女被診斷為子宮頸癌，并有約300,000名婦女死于這種疾病。由于50年前通過細(xì)胞學(xué)篩分子宮頸癌，這種癌癥在發(fā)達(dá)國家的死亡率已大大降低。事實(shí)上，子宮頸癌被認(rèn)為是可以預(yù)防的。預(yù)防的關(guān)鍵在于及時(shí)地通過易于操作和普及的篩分程序鑒別和處理癌癥前期的損害。目前，子宮頸HPV感染占全球婦女癌癥發(fā)生率的11.8％。與此一致的是致癌HPV檢測是鑒別癌癥患者或極有可能患該種疾病的人的一種有效的方法。明顯地，當(dāng)癌癥處于較易治愈的的階段時(shí)，HPV檢測有助于早期的檢測。
HPV感染需要細(xì)胞能夠復(fù)制它們的DNA，特別是那些處于基礎(chǔ)表皮層的細(xì)胞。侵入的出現(xiàn)是由于微小損傷，這使基礎(chǔ)增生細(xì)胞暴露于表面。病毒附著于細(xì)胞表面受體，進(jìn)而侵入到胞質(zhì)液中。感染病毒顆粒包含由7000到8000個(gè)堿基對構(gòu)成的閉合環(huán)狀雙鏈DNA基因組，其包括在HPV基因型中不規(guī)則出現(xiàn)的8個(gè)早期轉(zhuǎn)錄的開放閱讀框E1到E8，2個(gè)晚期開放閱讀框和非編碼的長控制區(qū)域。
有關(guān)HPV DNA如何整合到宿主染色體中，以及E1和E2癌基因蛋白如何在這一過程中起作用的情況已有很多發(fā)現(xiàn)。其與免疫學(xué)診斷的關(guān)聯(lián)在于，抗E1和E2基因產(chǎn)物的抗體構(gòu)成了出現(xiàn)HPV感染的證據(jù)。
HPV感染的方式導(dǎo)致癌癥集中于E6和E7基因產(chǎn)物。在宿主細(xì)胞中，它們和細(xì)胞的p53和調(diào)節(jié)細(xì)胞分裂的成視網(wǎng)膜細(xì)胞瘤腫瘤清除蛋白形成復(fù)合物。通過功能性地中和或滅活這些蛋白，細(xì)胞進(jìn)入細(xì)胞周期中的S期。E7癌基因蛋白通過其與依賴于細(xì)胞周期蛋白的蛋白激酶p21的相互作用進(jìn)一步動(dòng)搖細(xì)胞控制。這些相互作用調(diào)整了控制宿主細(xì)胞增殖和分化(也就是轉(zhuǎn)化)的階段，使正常細(xì)胞轉(zhuǎn)化為腫瘤發(fā)生前的細(xì)胞并最終完全表達(dá)惡性腫瘤的第一步驟。
E6和E7癌基因蛋白在腫瘤細(xì)胞中是組成型表達(dá)的，使這些基因沉默可使惡性表型回復(fù)。因而，所述的E6和E7基因產(chǎn)物似乎是腫瘤特異性的抗原，可能靶定或探測免疫學(xué)癌試驗(yàn)中的抗體和控制HPV誘導(dǎo)的腫瘤的疫苗中的抗原。
事實(shí)上，由于所述的E6和E7癌基因蛋白一貫在子宮頸癌細(xì)胞中表達(dá)，它們似乎是抗體產(chǎn)生的天然靶位。在早期的研究中，針對E7癌基因蛋白的應(yīng)答僅有中等程度的疾病特異性，但現(xiàn)在已經(jīng)證明E7 IgG和IgA表現(xiàn)強(qiáng)烈的疾病相關(guān)性。與非癌對照相比，在子宮頸癌病人的血清中表現(xiàn)出高水平的抗E6和E7癌基因蛋白抗體。而且，即使這些抗體以較少量存在時(shí)，似乎也可以通過免疫學(xué)的方法檢測。鑒定HPV感染和可能的癌癥的靈敏度可因結(jié)合多病毒蛋白的血清學(xué)試驗(yàn)而提高。因此，用來自子宮頸癌患者的樣品由兩種癌基因蛋白可獲得陽性的結(jié)果。
到目前巴氏涂片(Papanicolaou smear)是用于子宮頸癌的公眾健康篩分的主要方法。由于多種原因，巴氏涂片(Papanicolaou smear)遠(yuǎn)非理想的篩分試驗(yàn)。缺點(diǎn)包括獲得樣品困難，假陰性率高(達(dá)20％)，需要配備了經(jīng)過嚴(yán)格訓(xùn)練的人員的專業(yè)實(shí)驗(yàn)室。已經(jīng)發(fā)展了核酸方法，但是也不理想，這主要是由于其花費(fèi)高并同樣需要受過嚴(yán)格訓(xùn)練的人員。另一種試驗(yàn)即，所謂“DNA雜交捕獲”。這一方法受限于高花費(fèi)和取樣困難。所需要的是低花費(fèi)，簡單，靈敏并特異的試驗(yàn)，其可在易于獲得的身體樣品中進(jìn)行。
本發(fā)明的一個(gè)目的在于研制一種來自HPV E2蛋白和HPV 16和18、E6和E7癌基因蛋白的抗體反應(yīng)肽。進(jìn)一步的目的在于以化學(xué)純的形式提供上述肽。再進(jìn)一步的目的在于提供簡單、快速、花費(fèi)低且更靈敏的試驗(yàn)，以診斷不僅僅是HPV感染，還包括大多數(shù)的，即使不是全部，HPV相關(guān)的腫瘤。另一目的是提供在HPV接種物中使用的抗原，該抗原可誘導(dǎo)抗體產(chǎn)生和殺傷性T細(xì)胞的活性。
發(fā)明簡述本發(fā)明的上述目的和其他目的是通過新肽來實(shí)現(xiàn)的，所述肽的序列是由發(fā)明人通過仔細(xì)分析HPV 16和18的E2，E6，和E7癌基因蛋白的早期編碼區(qū)而得到的。這些肽本身形成了一種高度靈敏和特異性的診斷免疫測定。經(jīng)HPV感染后發(fā)現(xiàn)了針對E2致癌蛋白的抗體。在與HPV相關(guān)的腫瘤中發(fā)現(xiàn)了針對E6和E7癌基因蛋白的抗體。本發(fā)明的肽的大小在約19個(gè)氨基酸殘基到約30個(gè)氨基酸殘基之間，其易于通過化學(xué)方法合成，所獲得的產(chǎn)物純度可高于99％。盡管所述的肽也可以通過其他方式獲得，但以純化的形式，其與隨機(jī)抗體發(fā)生非期望的交叉反應(yīng)的可能性大大降低。因此，本發(fā)明的純化的肽使其自身成為一種高特異性的診斷的免疫學(xué)測定。所述的診斷的免疫學(xué)測定方法包括采集可能含有抗體的體液或組織樣品，若存在即與本發(fā)明的一種或多種肽反應(yīng)，然后測定抗體-肽反應(yīng)的存在。免疫測定所采用的來自E2區(qū)域的肽作為HPV感染與否的可靠指標(biāo)。
免疫測定所采用的來自E6和E7癌基因蛋白的肽作為HPV相關(guān)的惡性或惡變前細(xì)胞發(fā)生的可靠指標(biāo)。本發(fā)明最有用的方面之一是在對子宮頸癌，鱗狀上皮細(xì)胞和腺癌及與致癌HPV感染相關(guān)的任何上皮細(xì)胞異常的診斷中的應(yīng)用，所述的致癌HPV感染包括中空細(xì)胞病；角化過度癥；包括上皮內(nèi)瘤形成或上皮內(nèi)病變的癌前期病癥；高度發(fā)育不良；和侵染性或惡性癌癥。除子宮頸癌外，對針對來自HPV E6和E7癌基因蛋白的肽的抗體的檢測對檢測頭和頸癌，小細(xì)胞肺癌和陰莖及肛門鱗狀上皮細(xì)胞癌，和黑色素瘤也是有用的。
附圖簡述結(jié)合下述的附圖對本發(fā)明進(jìn)行更為詳細(xì)地描述，其中

圖1是相應(yīng)于在圖2-4中使用的氨基酸的單字母密碼子；圖2是E2癌基因蛋白的早期編碼區(qū)的編碼描述，其中本發(fā)明的SEQNO 1和SEQ NO 2加了下劃線；圖3是E6癌基因蛋白的早期編碼區(qū)的編碼描述，其中本發(fā)明的SEQNO 3加了下劃線；圖4 HPV 18的E7癌基因蛋白的早期編碼區(qū)的編碼描述，其中本發(fā)明的SEQ NO 5加了下劃線；圖5和6是表示對對照和經(jīng)HPV感染及患HPV相關(guān)腫瘤的病人所做的診斷免疫測定的結(jié)果。
優(yōu)選實(shí)施方案詳述本發(fā)明的肽來自HPV 16和18的E2，E6和E7癌基因蛋白的早期編碼區(qū)。本發(fā)明的肽的推導(dǎo)是基于其預(yù)測的與在經(jīng)致癌HPV感染的宿主中形成的抗體發(fā)生相互作用的能力。在所用的特異因子中用于篩選的是在水溶液中可溶的或具有親水性能的。據(jù)估計(jì)，致癌基因產(chǎn)物蛋白的親水區(qū)域更有可能是朝向在天然狀態(tài)下完全蛋白表面的方向，由此形成抗原區(qū)域，最可能出現(xiàn)針對該區(qū)域的抗體反應(yīng)性。
所包含的另一因子具有靠近N-末端的單個(gè)賴氨酸或半胱氨酸。所述的靠近是指在末端或距末端不超過兩個(gè)殘基。所述的單個(gè)，應(yīng)理解為另外的賴氨酸或半胱氨酸殘基距N-末端至少8個(gè)殘基。當(dāng)所述殘基不位于N-末端或靠近N-末端時(shí)，優(yōu)選地將賴氨酸或半胱氨酸添加到反應(yīng)肽的N-末端。還優(yōu)選總的看來，色氨酸和甲硫氨酸殘基占少數(shù)而甘氨酸和天冬酰胺殘基相對豐富。所述的占少數(shù)是指盡可能少地出現(xiàn)，而所述的豐富是指在序列中對出現(xiàn)的此類氨基酸數(shù)量沒有限定。所述肽組合物的更優(yōu)選實(shí)施例中包括在羧基端添加多達(dá)6個(gè)附加的氨基酸殘基，這些殘基是甘氨酸和天冬酰胺的任意組合。附加的甘氨酸和天冬酰胺以促進(jìn)抗體結(jié)合的方式在含水的反應(yīng)培養(yǎng)基中確定所述肽的方向。
圖2-4公開了含16到30個(gè)殘基的5個(gè)特異的肽序列。在圖2-4中編碼序列的說明在圖1中給出。如圖2中所描述的SEQ NO.1和NO.2是由HPV16的E2區(qū)域衍生的，解碼并按標(biāo)準(zhǔn)的三字符縮寫的序列1和2如下Asp Ile Cys Asn Thr Met His Tyr Thr Asn Trp Thr His Ile Tyr Ile1 5 10 15Cys Glu Glu(SEQ NO.1)；His Lys Ser Ala Ile Val Thr Leu Thr Tyr Asp Ser Glu Trp Gln Arg1 5 10 15(SEQ.NO.2)如圖3所描述的序列3和4是由HPV16的E7的早期編碼區(qū)域衍生的。解碼并按標(biāo)準(zhǔn)的三字符縮寫的序列3如下Pro Thr Leu His Glu Tyr Met Leu Asp Leu Gln Pro Glu Thr Thr Asp1 5 10 15Leu Tyr Cys Tyr Glu Gln Leu Asn Asp Ser Ser Glu Glu Glu(SEQ.NO.3)20 25 30Cys Asp Ser Thr Leu Arg Leu Cys Val Gln Ser Thr His Val Asp Ile1 5 10 15Arg Thr Leu Glu(SEQ.NO.4)20如圖3所描述的序列3和4是由HPV18的E2的早期編碼區(qū)域衍生的。解碼并按標(biāo)準(zhǔn)的三字符縮寫的序列5如下Glu Lys Thr Gly Ile Leu Thr Val Thr Tyr His Ser Glu Thr Gln Arg1 5 10 15Thr Lys Phe(SEQ.NO.5)在診斷方法中應(yīng)用所述的肽是基于下述的事實(shí)，即多個(gè)與HPV相關(guān)的上皮細(xì)胞異常的對象中發(fā)現(xiàn)了針對HPV16和18的E2，E6和E7癌基因蛋白的天然表位的抗體，上述的異常范圍從單純的感染到惡性腫瘤。更具體地說，這種HPV相關(guān)的細(xì)胞異常可以包括但不限于中空細(xì)胞?。唤腔^度癥；包括上皮內(nèi)瘤形成或上皮內(nèi)病變的癌前期病癥；高度發(fā)育不良；和侵染性或惡性癌癥。上文已經(jīng)討論了與HPV相關(guān)的惡性腫瘤。所述的方法包括采集可能包含抗體的體液或組織的樣品。這種樣品優(yōu)選易于獲取的來自靜脈血樣品的血清或血漿。但是，可能本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的可能含有抗體的子宮頸分泌物，子宮組織，或來源于身體其他部分的組織，其他體液也可以作為采集病人樣品的來源。當(dāng)使肽抗原和樣品抗體在合適的培養(yǎng)基中反應(yīng)時(shí)，則可進(jìn)行分析確定是否存在抗體-肽反應(yīng)。
肽序列的合成雖然本發(fā)明的肽可以由多種現(xiàn)有技術(shù)中的方法獲得，但其中重組方式和化學(xué)合成是優(yōu)選的方法，這是由于它們便于積累大量的以基本純化的形式存在的肽，在本實(shí)施例中可占重量的99％。所述的肽以0.25的比例合成，使用9-芴甲氧羰基(FMOC)-保護(hù)的L-氨基酸，超級(jí)酸不穩(wěn)定的2-氯三苯甲基樹脂(Novabiochem，Nottingham，UK)作為固相支持物。預(yù)加到反應(yīng)容器中的樹脂用二甲基甲酰胺洗，然后完全排空。向上述樹脂中加入10ml含20％哌啶的二甲基甲酰胺。將所述混合物振蕩5分鐘后排空。加入另外10ml含20％哌啶的二甲基甲酰胺，將所述混合物振蕩30分鐘。排空后所述的樹脂用二甲基甲酰胺洗4次，用二氯甲烷洗一次。用標(biāo)準(zhǔn)的水合茚三酮檢測，若上述樹脂珠變藍(lán)則認(rèn)為其已制備好了。
對于每個(gè)氨基酸，偶聯(lián)溶液的配置如下1mmol選擇的Fmoc氨基酸；2.1ml 0.45 M 2-(1H-苯并三唑-1-基)-1，1，3，3-四甲基尿鎓-六氟磷酸/水合苯并三唑[1mmol]；348μl的N.N-二異丙基乙胺[2mmol]。將混合物振蕩至少30分鐘。將反應(yīng)容器排空。將所述的樹脂用二甲基甲酰胺洗4次，最后用二氯甲烷洗。用標(biāo)準(zhǔn)的茚三酮試驗(yàn)確定偶聯(lián)的氨基酸。對于每個(gè)氨基酸，以合適的順序?qū)⑴悸?lián)溶液加入到所述的樹脂中，重復(fù)上述偶聯(lián)反應(yīng)直到每個(gè)氨基酸均處于所述肽的適當(dāng)位置。
通過在下述溶液中進(jìn)行2小時(shí)的反應(yīng)將完成的肽從樹脂上切割下來，所述的溶液包括5％ H2O，5％苯酚，3％苯硫基甲烷，3％乙烷二硫醇，3％三異丙基硅烷，81％三氟乙酸。切割后，所述的樹脂混合物濾過到冷的甲基-叔丁基-醚中。將沉淀的肽用冷的甲基-叔丁基-醚洗2次，在氮?dú)鈼l件下干燥。肽的分子量用Matrix-Assisted laser Desorption Time-Flight質(zhì)譜核對，用18300A 5μm柱的高壓液相色譜確定純度。合成的肽的純度達(dá)99％的水平，但是需強(qiáng)調(diào)的是為達(dá)到分析的目的較低的純度水平也可能是合適的。
氨基酸序列的保存人造的氨基酸序列以1mg/ml的濃度懸浮于pH 7.0的PBS中。所述的序列溶液分裝成500μl肽/管保存在-20℃。
馬來酸酐結(jié)合所述的氨基酸序列至滴定板中用REACTI-BINDTM馬來酸酐激活的聚苯乙烯板(Pierce，Rockford，IL)。用包被緩沖液(100mM碳酸氫鈉緩沖液pH 9.4)將每一氨基酸稀釋至12.5μg/ml。每一滴定孔中添加100μl(1.25μg)經(jīng)稀釋的序列溶液。將上述滴定板在室溫下?lián)u動(dòng)溫育1小時(shí)。將上述的板倒空，然后將剩余的液體輕敲到干凈的紙巾上。每孔用100μl洗滌緩沖液(含0.1％牛血清白蛋白0.05％吐溫-20的磷酸鹽緩沖液，pH 7.0)洗滌?？偣仓貜?fù)3遍。每一遍均需將板倒空并將剩余的液體輕敲到干凈的紙巾上。向每孔中加入200μl封閉緩沖液(含3％牛血清白蛋白和0.05％吐溫-20的磷酸鹽緩沖液，pH 7.0)。封閉溶液在每孔中停留1分鐘。將上述滴定板倒置排空。加填封閉溶液再排空反復(fù)三次。處理完的滴定板在室溫下干燥，可在4℃下保存4個(gè)月。
樣品采集所有的樣品均由女性病人在其預(yù)定的婦科檢查過程中采集。用棉簽采集子宮頸內(nèi)細(xì)胞。用于ThinPrep Pap涂片(Cytyc Corporation，Stamford，CT)的細(xì)胞分散于ThinPrep防腐溶液中。HPV DNA雜合體捕獲試驗(yàn)(DigeneCorporation，Silver Spring，MD)的細(xì)胞懸浮于相同的介質(zhì)中。ThinPrep Pap涂片和HPV DNA雜合體捕獲試驗(yàn)將在下面進(jìn)一步闡述。
用普通的靜脈切開術(shù)方法獲得靜脈血，用21-或22-號(hào)的兩頭針至瓊脂阻隔的管中。從每個(gè)受試者總共取7-9ml血。在室溫下15分鐘以形成凝結(jié)，將所述的血漿離心15分鐘，用一次性移液管從細(xì)胞中抽吸出血清，以0.25-ml每小份分裝到Eppendorf管中，于-80℃下貯存。
免疫測定得自14到15歲的處女的血清作為陰性對照，用洗滌緩沖液(含0.1％牛血清白蛋白和0.5％吐溫-20的磷酸鹽緩沖液pH 7.0)將受試和對照血清以1∶25倍稀釋。每孔添加100μl稀釋血清，試驗(yàn)用板在室溫下?lián)u動(dòng)溫育1小時(shí)。每孔每次用200μl洗滌緩沖液漂洗，共三次。每次漂洗5分鐘。將板倒空并將剩余的液體輕敲到干凈的紙巾上。
每孔添加100μl用洗滌緩沖液1∶8000倍稀釋的辣根過氧化物酶偶聯(lián)的小鼠抗人IgG，將所述的測試板在室溫下溫育1小時(shí)。每孔以多功能移液管每次用200μl洗滌緩沖液漂洗，共4次。每次漂洗5分鐘。每次漂洗前，將板倒空并將剩余的液體輕敲到干凈的紙巾上。
向每孔添加100μl 3，3’，5，5’-四甲基聯(lián)苯胺，辣根過氧化物酶的底物。在室溫下溫育直到可以見到變?yōu)槊黠@的藍(lán)綠色，5-30分鐘，然后向每孔中加入5M H2SO4150μl以終止反應(yīng)。
ThinPrep Pap試驗(yàn)和HPV DNA雜合體捕獲的比較試驗(yàn)ThinPrep Pap試驗(yàn)—清楚地替代常規(guī)的Pap涂片，ThinPrep Pap試驗(yàn)克服了常規(guī)方法的限制。通過改進(jìn)樣品玻片的制備方式，ThinPrep Pap實(shí)際上改進(jìn)了樣品的質(zhì)量。在臨床試驗(yàn)中，所述的ThinPrep Pap試驗(yàn)低級(jí)和更嚴(yán)重?fù)p害的檢測對總體人群的篩選改進(jìn)了65％，對高危人群的篩選改進(jìn)了6％。其也將亞適當(dāng)樣品的數(shù)量降低了50％多。因此，此處所用的ThinPrep Pap用于優(yōu)化子宮頸細(xì)胞學(xué)的結(jié)果。
試驗(yàn)中將子宮頸拭子在管形瓶的防腐液中漂洗，而并非象常規(guī)的Pap涂片那樣將子宮頸的樣品涂在玻片上。所述的樣品送往經(jīng)檢測合格的臨床實(shí)驗(yàn)室，在那里用ThinPrep 2000處理機(jī)分散、過濾樣品中的內(nèi)容物以壓縮血液，粘液，和炎癥。薄的甚至層狀的子宮頸細(xì)胞機(jī)械地沉淀到玻片上，結(jié)果形成易于進(jìn)行精確顯微檢測的制備得很好的均勻制品。所述的玻片經(jīng)婦科細(xì)胞學(xué)家委員會(huì)檢測并作出結(jié)論。
雜合捕獲II HPV DNA試驗(yàn)—雜合捕獲II HPV DNA試驗(yàn)(HC II，DigeneCorporation，Silver Springs，MD)是用作與應(yīng)用本發(fā)明的肽的ELISA試驗(yàn)的對照。其經(jīng)美國食品和藥品管理局批準(zhǔn)用于檢測致癌HPV DNA，作為ASCUS(意義未定的非典型鱗狀細(xì)胞)或其它異常Pap結(jié)果的反饋。所述的雜合捕獲包括用非放射性探針的分子雜交，以及用于化學(xué)放射的雜合體檢測的擴(kuò)增。用于分析的材料是經(jīng)變性且與特異的基因探針反應(yīng)形成可被覆蓋于管壁的抗體捕獲的雜合RNA/DNA。雜交固定后，它們與針對RNA/DNA且與堿性磷酸酶偶聯(lián)的特異抗體反應(yīng)。形成穩(wěn)定的基層，所述的雜合體通過分光光度法由化學(xué)放射檢測。
所述的試驗(yàn)依制造商的建議用微量滴定板形式和針對“高致癌危險(xiǎn)性”的HPV探針。這是在與進(jìn)行ThinPrep Pap涂片的同一個(gè)經(jīng)檢測合格的臨床實(shí)驗(yàn)室中進(jìn)行的。人乳頭瘤病毒檢測是定量的，所述樣品進(jìn)行一次或多次讀數(shù)，所認(rèn)定的陽性對照含有病毒DNA(每次試驗(yàn)1 pg/mL HPVDNA或5000 HPV基因組拷貝)。
完全ELISA試驗(yàn)的可見性/解釋滴定板的底部用70％的乙醇清洗，將滴定板置于讀數(shù)器。
在450nm下讀取吸光度，以添加了100ml 2N HCl的100mlTMB溶液作空白對照。標(biāo)記了A1 & A2的孔用于估計(jì)背景(A1，A2)。
結(jié)果將所述的結(jié)果與Pap涂片，Digene HPV DNA試驗(yàn)的比較，以及本發(fā)明的免疫分析結(jié)果列于表1，并如圖5和6所示。檢測了31個(gè)樣品。樣品19到31來自由于性史和/或在先的Pap涂片而具有低先期測驗(yàn)概率的婦女，其結(jié)果在用于全部試驗(yàn)的所有樣品中都是陰性。這表明了低假陽性率和高陰性預(yù)測率。
樣品1到18來自由于已證明的臨床/病理史或多伙伴性史而具有高先期測驗(yàn)概率的婦女。在所有這些樣品中至少一個(gè)依照本發(fā)明的免疫學(xué)實(shí)驗(yàn)顯示陽性。這表明了高的陽性預(yù)測率。由于在一些情況下三種免疫分析中只有一種是陽性，即顯示出肽結(jié)合體的價(jià)值。低的假陽性率和高的真陽性率體現(xiàn)了試驗(yàn)的高靈敏性和高特異性。
另外值得注意的是，病人1具有經(jīng)病理證實(shí)的子宮頸腺癌。病人2具有子宮頸鱗狀細(xì)胞癌。
本發(fā)明參考目前認(rèn)為是實(shí)踐中的最佳方式的實(shí)施例進(jìn)行介紹和描述，但應(yīng)當(dāng)理解的是在不脫離本發(fā)明目前所公開的內(nèi)容的前提下，可以通過多種變換以不同的實(shí)施方案改寫本發(fā)明，而這均包含在本發(fā)明下述權(quán)利要求的范圍內(nèi)。
更具體地說，可能作出的多種變換總結(jié)于授予Dillner等人的美國專利5,629,146中通過表明某種肽是免疫原性的，發(fā)明人已定義了其包含與人血清反應(yīng)的表位。包含在所述肽序列中的該表位不僅僅依賴于所述的確定肽序列，也可以包含于對起始肽進(jìn)行了多種微小修飾的序列中。所述的修飾包括延伸、截短、環(huán)化以及氨基酸的取代。當(dāng)經(jīng)上述修飾的肽應(yīng)看作是含有新表位的新肽時(shí)將會(huì)出現(xiàn)一些問題。通過原始肽與經(jīng)修飾肽的競爭免疫試驗(yàn)可以作出直接地判斷即，如果經(jīng)修飾的肽與針對原始肽的抗體有基本相同的免疫反應(yīng)性則說明其包含相同的表位。需要強(qiáng)調(diào)的是肽可以由多種方式產(chǎn)生。本文中的肽采用有機(jī)化學(xué)方法合成，但相同的肽也可以通過其他方式如重組DNA表達(dá)系統(tǒng)產(chǎn)生。
應(yīng)當(dāng)理解此處對本發(fā)明的方法所進(jìn)行的描述僅是示例性，而不是對本發(fā)明的限制?？梢酝ㄟ^多種不同的方式進(jìn)行免疫學(xué)試驗(yàn)。對與特異抗原結(jié)合的抗體的檢測可以通過多種針對抗體的抗體(抗-抗體)，或其它與抗體有親和性的化合物，如蛋白A或蛋白G實(shí)現(xiàn)。這些試劑可用多種不同的方式進(jìn)行標(biāo)記，例如放射性(放射免疫分析)，熒光(熒光免疫分析)酶促地(酶聯(lián)免疫分析，ELISA或EIA)。一種特定的酶促免疫分析的情況是在組織切片上檢測抗原抗體復(fù)合物。這種過程是指免疫染色或免疫組織化學(xué)，雖然其原理與ELISA相似。
ELISA也可以多種形式進(jìn)行。用幾層抗-抗體，抗生物素蛋白復(fù)合物和酶-抗-酶抗體復(fù)合物來增強(qiáng)ELISA的靈敏性的方法是本領(lǐng)域技術(shù)人員所公知的。如本文所述固定抗原的固體支持物通常是塑料，但也可以是其它的固體支持物如乳膠或瓊脂糖。并不需要將抗原直接固定到固相支持物上。通常使用的ELISA形式是將特異抗原通過針對該抗原的固相固定的抗體固定到固體支持物上，所謂的捕獲抗體ELISA或夾心ELISA。免疫分析的一種特定的形式包括將抗原印跡(轉(zhuǎn)移)到薄片狀的固體支持物上，此稱之為免疫印跡。典型的，這種固體支持物是硝酸纖維素膜或尼龍膜，但也可以使用其他的支持物。該方法的一個(gè)顯著的特點(diǎn)，在印跡前根據(jù)抗原的大小將其通過凝膠電泳或類似的方法分離?？梢杂门c其他免疫學(xué)試驗(yàn)中類似的方法檢測在薄層上與特異抗原結(jié)合的抗體。此處所述的用抗-抗體，抗生物素蛋白復(fù)合物增強(qiáng)步驟和酶促標(biāo)記所進(jìn)行的檢測只是這種檢測的一個(gè)實(shí)例。
對于一般的診斷方法，已知由幾種診斷方法結(jié)合可以產(chǎn)生一種比包含在所述結(jié)合中的各個(gè)單獨(dú)的試驗(yàn)更靈敏和/或特異性更強(qiáng)的試驗(yàn)方法。顯然，此處所述的任何抗體試驗(yàn)均可以彼此結(jié)合或與其他實(shí)驗(yàn)相結(jié)合，以產(chǎn)生具有優(yōu)化的靈敏性和特異性的結(jié)合診斷方法。
序列表<110>沖擊診斷公司(Impact Diagnostics，Inc.)Y.X.胡(Hu，Yao Xiong)<120>辨別人乳頭瘤病毒的免疫學(xué)方法<130>146-3-001<140>PCT/US01/11233<141>2001-04-05<150>US 60/194,796<151>2000-04-05<160>8<170>PatentIn version 3.1<210>1<211>19<212>PRT<213>人工序列<220><223>來自HPV-16 E2早期區(qū)域<400>1Asp Ile Cys Asn Thr Met His Tyr Thr Asn Trp Thr His Ile Tyr Ile1 5 10 15Cys Glu Glu<210>2<211>16<212>PRT<213>人工序列<220><223>來自HPV-16 E2早期區(qū)域<400>2His Lys Ser Ala Ile Val Thr Leu Thr Tyr Asp Ser Glu Trp Gln Arg1 5 10 15<210>3<211>30<212>PRT<213>人工序列<220><223>來自HPV-16 E2早期區(qū)域<400>3Pro Thr Leu His Glu Tyr Met Leu Asp Leu Gln Pro Glu Thr Thr Asp1 5 10 15Leu Tyr Cys Tyr Glu Gln Leu Asn Asp Ser Ser Glu Glu Glu20 25 30<210>4<211>20<212>PRT<213>人工序列<220><223>來自HPV-16 E2早期區(qū)域<400>4Cys Asp Ser Thr Leu Arg Leu Cys Val Gln Ser Thr His Val Asp Ile1 5 10 15Arg Thr Leu Glu20<210>5<211>19<212>PRT<213>人工序列<220><223>來自HPV-16 E2早期區(qū)域<400>5Glu Lys Thr Gly Ile Leu Thr Val Thr Tyr His Ser Glu Thr Gln Arg1 5 10 15Thr Lys phe<210>6<211>19<212>PRT<213>人工序列<220><223>來自HPV-16 E2早期區(qū)域<220><221>MISC_FEATURE<222>(3)..(3)<223>Xaa＝L-羧甲基半胱氨酸<220><221>MISC_FEATURE<222>(17)..(17)<223>Xaa＝L-羧甲基半胱氨酸<400>6Asp Ile Xaa Asn Thr Met His Tyr Thr Asn Trp Thr His Ile Tyr Ile1 5 10 15Xaa Glu Glu<210>7<211>30<212>PRT<213>人工序列<220><223>來自HPV-16 E2早期區(qū)域<220><221>misc_feature<222>(19)..(19)<223>Xaa＝L-羧甲基半胱氨酸<400>7Pro Thr Leu His Glu Tyr Met Leu Asp Leu Gln Pro Glu Thr Thr Asp1 5 10 15Leu Tyr Xaa Tyr Glu Gln Leu Asn Asp Ser Ser Glu Glu Glu20 25 30<210>8<211>20<212>PRT<213>人工序列<220><223>來自HPV-16 E2早期區(qū)域<220><221>misc_feature<222>(1)..(1)<223>Xaa＝L-羧甲基半胱氨酸<220><221>misc_feature<222>(8)..(8)<223>Xaa＝L-羧甲基半胱氨酸<400>8Xaa Asp Ser Thr Leu Arg Leu Xaa Val Gln Ser Thr His Val Asp Ile1 5 10 15Arg Thr Leu Glu20
權(quán)利要求
1.一種化學(xué)組合物，其包含來自人乳頭瘤病毒16和18的E2，E6，或E7早期編碼區(qū)域的肽，其在水溶液中是可溶的，且進(jìn)一步具有下述的一種或多種特性，即賴氨酸或半胱氨酸殘基靠近氨基末端，色氨酸和甲硫氨酸和半胱氨酸殘基占少數(shù)而甘氨酸和天冬酰胺殘基相對豐富。
2.如權(quán)利要求1所述的化學(xué)組合物，其中，所述的肽選自Asp Ile Cys Asn Thr Met His Tyr Thr Asn Trp Thr His Ile Tyr Ile Cys GluGlu(SEQ ID NO1)；His Lys Ser Ala Ile Val Thr Leu Thr Tyr Asp Ser Glu Trp Gln Arg AspGln Phe(SEQ ID NO2)；Pro Thr Leu His Glu Tyr Met Leu Asp Leu Gln Pro Glu Thr Thr Asp LeuTyr Cys Tyr Glu Gln Leu Asn Asp Ser Ser Glu Glu Glu(SEQ ID NO3)；Cys Asp Ser Thr Leu Arg Leu Cys Val Gln Ser Thr His Val Asp Ile ArgThr Leu Glu(SEQ ID NO4)；Glu Lys Thr Gly Ile Leu Tlu Val Thr Tyr His Ser Glu Thr Gln Arg ThrLys Phe(SEQ ID NO5).
3.一種如權(quán)利要求1所述的化學(xué)組合物，其羧基末端具有至少1個(gè)但不多于6個(gè)附加的甘氨酸殘基。
4.一種如權(quán)利要求2所述的化學(xué)組合物，其羧基端具有多達(dá)6個(gè)附加的氨基酸殘基，這6個(gè)殘基是甘氨酸和天冬酰胺的任意組合。
5.一種如權(quán)利要求2所述的化學(xué)組合物，其羧基端具有至少1個(gè)但不多于6個(gè)附加的天冬酰胺殘基。
6.如權(quán)利要求2所述的化學(xué)組合物，其中的半胱氨酸被羧基甲基半胱氨酸取代。
7.一種診斷方法，其包括下述步驟a)將可能含有抗體的體液或組織樣品與一個(gè)或多個(gè)來自人乳頭瘤病毒16和18的E2，E6，或E7早期編碼區(qū)域的肽反應(yīng)；b)所述的人乳頭瘤病毒衍生的肽和樣品中的抗體形成復(fù)合物；其中，抗體-肽復(fù)合物的形成證明存在抗人乳頭瘤病毒抗體；c)檢測所述的抗體-肽復(fù)合物。
8.如權(quán)利要求7所述的診斷方法，其中的一個(gè)或多個(gè)肽序列選自Asp Ile Cys Asn Thr Met His Tyr Thr Asn Trp Thr His Ile Tyr Ile Cys GluGlu(SEQ ID NO1)；His Lys Ser Ala Ile Val Thr Leu Thr Tyr Asp Ser Glu Trp Gln Arg AspGln Phe(SEQ ID NO2)；Pro Thr Leu His Glu Tyr Met Leu Asp Leu Gln Pro Glu Thr Thr Asp LeuTyr Cys Tyr Glu Gln Leu Asn Asp Ser Ser Glu Glu Glu(SEQ ID NO3)；Cys Asp Ser Thr Leu Arg Leu Cys Val Gln Ser Thr His Val Asp Ile ArgThr Leu Glu(SEQ ID NO4)；Glu Lys Thr Gly Ile Leu Thr Val Thr Tyr His Ser Glu Thr Gln Arg ThrLys Phe(SEQ ID NO5)
9.如權(quán)利要求8所述的診斷方法，其中，在所述的序列中半胱氨酸被羧基甲基半胱氨酸取代。
10.如權(quán)利要求8所述的診斷方法，其中，所述的診斷是HPV感染的診斷。
11.如權(quán)利要求8所述的診斷方法，其中，所述的診斷是對HPV相關(guān)的上皮細(xì)胞異常的診斷。
12.如權(quán)利要求8所述的診斷方法，其中，其中所述的診斷是對子宮頸癌的診斷。
13.如權(quán)利要求8所述的診斷方法，其中，所述的診斷是對子宮頸腺癌的診斷。
14.如權(quán)利要求7所述的診斷方法，其中，所應(yīng)用的肽來源于E2編碼區(qū)，所述的診斷是對致癌HPV感染的診斷。
15.如權(quán)利要求7所述的診斷方法，其中，所應(yīng)用的肽來源于E6編碼區(qū)，所述的診斷是對癌的診斷。
16.如權(quán)利要求7所述的診斷方法，其中，所應(yīng)用的肽來源于E7編碼區(qū)，所述的診斷是對癌的診斷。
17.如權(quán)利要求7所述的方法，其中的檢測步驟是通過可見的顏色改變檢測完成的。
18.如權(quán)利要求7所述的方法，其中的檢測步驟是通過分光光度計(jì)完成的。
全文摘要
本發(fā)明涉及肽，其與來自致癌HPV感染的病人的抗體具有高度反應(yīng)性。此外還公開了，本發(fā)明的肽用于檢測HPV感染和HPV相關(guān)的上皮細(xì)胞異常，尤其是與癌癥前期和惡性上皮細(xì)胞損傷相關(guān)的上皮細(xì)胞異常，的免疫測定方法。所述的肽和方法在對子宮頸癌或其前期的診斷，或?qū)ζ渌哂邪┌Y演變危險(xiǎn)的診斷中特別有用。所述的檢測可以在血液樣品，或其它體液或組織上，通過檢查是否存在抗HPV16和/或18的IgA或IgG抗體而進(jìn)行。
文檔編號(hào)G01N33/569GK1433428SQ01810709
公開日2003年7月30日 申請日期2001年4月5日 優(yōu)先權(quán)日2000年4月5日
發(fā)明者Y·X·胡 申請人:沖擊診斷公司