專利名稱：檢測腫瘤轉(zhuǎn)化性或非腫瘤轉(zhuǎn)化性細(xì)胞的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及在哺乳動物中定性和/或定量地監(jiān)視淋巴樣瘤形成進(jìn)程的方法，具體地說，是用分子篩選技術(shù)監(jiān)視淋巴樣瘤形成進(jìn)程的方法。本發(fā)明的方法適合于在一定的領(lǐng)域中應(yīng)用，其包括但不限于監(jiān)視腫瘤轉(zhuǎn)化性淋巴疾病病情的發(fā)展，監(jiān)視恢復(fù)過程中腫瘤轉(zhuǎn)化性淋巴細(xì)胞的水平，預(yù)測受試者由恢復(fù)狀態(tài)復(fù)發(fā)到疾病狀態(tài)的可能性，或估計現(xiàn)有的治療藥物和/或新的治療試劑的有效性。與此相關(guān)，本發(fā)明還提供在哺乳動物中定性和/或定量檢測克隆淋巴細(xì)胞群的方法，更具體地說，是在具有下述情況的受試者中檢測多克隆淋巴細(xì)胞群，即受試者中腫瘤轉(zhuǎn)化性淋巴細(xì)胞已進(jìn)行體細(xì)胞基因重排，由此形成新的遺傳上不同的克隆群，或所述受試者中一個或多個克隆淋巴細(xì)胞群對一種免疫應(yīng)答起作用。
淋巴細(xì)胞是在免疫應(yīng)答中起作用的細(xì)胞，其分為兩種類型—產(chǎn)生抗體的B淋巴細(xì)胞和參與細(xì)胞免疫的T淋巴細(xì)胞。在發(fā)育過程中，為形成特定的免疫應(yīng)答，每種淋巴細(xì)胞均通過獨(dú)特的方式對一個或一些特定基因進(jìn)行重排，對于B淋巴細(xì)胞來說涉及重排的是免疫球蛋白基因，對T淋巴細(xì)胞來說是T細(xì)胞受體基因。所有這些淋巴細(xì)胞的后代也進(jìn)行同樣的重排。
據(jù)認(rèn)為，腫瘤是由單一細(xì)胞中遺傳改變總和的結(jié)果所引起的。上述細(xì)胞接下來的增殖引起子代種群的形成。因此，由B或T淋巴細(xì)胞中的惡性變化形成的瘤(常稱為“癌”)主要包含這樣的細(xì)胞克隆，其中每一細(xì)胞均存在與生成細(xì)胞中相同的基因重排。所述的腫瘤克隆中也可能出現(xiàn)次級基因重排，形成遺傳上不同的亞克隆。
因此淋巴細(xì)胞瘤是克隆性病癥。它們在單一的細(xì)胞中出現(xiàn)一個或多個突變后產(chǎn)生，使所述細(xì)胞及其子代不斷地以指數(shù)形式增殖。例如當(dāng)淋巴細(xì)胞性白血病克隆數(shù)在體內(nèi)達(dá)1011到1012時則繼發(fā)臨床癥狀。若不進(jìn)行治療，所述克隆繼續(xù)擴(kuò)增，達(dá)1013白血病細(xì)胞時即導(dǎo)致死亡。但是，如果病人接受了細(xì)胞毒性治療，所述克隆大小上會減少，當(dāng)其所包含的細(xì)胞少于約1010時就不能再用常規(guī)的技術(shù)進(jìn)行鑒定了。此時，病人被判定為臨床和血液學(xué)上的緩解，盡管術(shù)語“緩解”事實上僅指向白血病細(xì)胞數(shù)連續(xù)體一端的某一任意點。由于在恢復(fù)期所保留的白血病細(xì)胞數(shù)是未知的，可以在0到1010之間的范圍，恢復(fù)期后的治療是經(jīng)驗性的，治療強(qiáng)度基于診斷或早期治療所確定的不同臨床或?qū)嶒烆A(yù)測因素。結(jié)果一些病人可能接受的治療不足，而另一些病人則可能接受了過多的治療。
目前的惡性淋巴細(xì)胞定量的方法包括使用克隆中所有細(xì)胞所共有的“標(biāo)識”。所述的標(biāo)識可以是表面抗原或幾種表面抗原的模式，或者是分子轉(zhuǎn)變。上述應(yīng)用的分子轉(zhuǎn)變可大致分為兩種類型—包括染色體易位或倒位的一類，和利用免疫球蛋白或T細(xì)胞受體基因重排的一類。
目前的方法在復(fù)雜性、操作簡便性、敏感性和適應(yīng)性方面各不相同。一般，復(fù)雜性和敏感性之間有著直接的關(guān)系，最敏感的方法通常非常復(fù)雜而且耗時。鑒于它們的復(fù)雜性，目前用基因重排作為分子標(biāo)識以測定腫瘤轉(zhuǎn)化性淋巴細(xì)胞數(shù)量的方法還僅適于作為研究工具，而不適合于進(jìn)行廣泛地臨床應(yīng)用。
關(guān)于最低限度的殘留疾病進(jìn)行檢測和定量，關(guān)鍵的問題是來源于異源的、正常多克隆淋巴細(xì)胞的異源標(biāo)識背景下，對腫瘤轉(zhuǎn)化性淋巴細(xì)胞克隆特定標(biāo)識所進(jìn)行的檢測和定量。大多數(shù)提高檢測水平的方法都是基于對直接、正面檢測所述腫瘤轉(zhuǎn)化性淋巴細(xì)胞標(biāo)識本身的方法的改進(jìn)。例如已經(jīng)采用了基于PCR的方法，其中用標(biāo)記的序列特異性探針探測，或是用腫瘤轉(zhuǎn)化性淋巴細(xì)胞序列特異性的PCR引物啟動擴(kuò)增。一種不同的方法依賴對所述腫瘤轉(zhuǎn)化性淋巴細(xì)胞表型的直接檢測。
目前所用到的大多數(shù)基于探測或擴(kuò)增所需DNA的分子技術(shù)的一個重要的缺點在于，需要預(yù)先了解核苷酸序列的信息以設(shè)計并合成特定的探針或引物。這一需要使得上述技術(shù)既復(fù)雜又昂貴。
因此，需要發(fā)展一種改進(jìn)的定性和/或定量檢測受試者中的腫瘤轉(zhuǎn)化性淋巴細(xì)胞水平的方法，這種方法需既靈敏又簡單易行。在得出本發(fā)明的工作中，本發(fā)明人提供了一種在哺乳動物中檢測淋巴樣瘤形成進(jìn)程的簡單且靈敏的方法。該方法的簡便性和易行性是緣于本發(fā)明人已研究出一種基于在分子水平上對生物樣品是否存在腫瘤轉(zhuǎn)化性淋巴細(xì)胞特異性標(biāo)識進(jìn)行篩選，而無需首先獲得與受試標(biāo)識相關(guān)的核苷酸序列信息的檢測方法，具體說來所述的分子標(biāo)記是指經(jīng)重排的編碼T細(xì)胞受體和免疫球蛋白區(qū)域的核酸分子。而且，本方法是高度靈敏的。
本發(fā)明人已確定通過減少非標(biāo)識的背景DNA，而非試圖從異源DNA群中特異性地探測或特異性地擴(kuò)增所需的DNA片段，可以形成一種高度靈敏且簡便地篩選腫瘤轉(zhuǎn)化性細(xì)胞的方法。具體地說，本發(fā)明人已經(jīng)確定將在診斷中獲得的腫瘤轉(zhuǎn)化性淋巴細(xì)胞DNA樣品與病人的檢測DNA雜交，將未雜交的檢測DNA或錯配雜交有效地去除，由此可以有效地富集腫瘤轉(zhuǎn)化性DNA標(biāo)識群。然后相對于降低的非標(biāo)識背景DNA水平進(jìn)行腫瘤轉(zhuǎn)化性信號的檢測。檢測包括一般性檢測系統(tǒng)，如PCR，熒光檢測，免疫檢測或酶學(xué)檢測。非腫瘤轉(zhuǎn)化性背景分子的去除提高了與檢測系統(tǒng)無關(guān)的檢測靈敏性度。
這一方法避免了通常情況下為利用分子篩選技術(shù)而對核苷酸序列信息的需要，由此大大簡化了操作技術(shù)，同時保持并在一定程度上提高應(yīng)用這些技術(shù)目前所能獲得的靈敏度上限水平。
在與此相關(guān)的方面，基于腫瘤轉(zhuǎn)化性淋巴細(xì)胞中T細(xì)胞受體(TCR)或免疫球蛋白可變基因的特定分子重排，本發(fā)明人還修改了二維凝膠電泳技術(shù)，提供了一種有效且靈敏的診斷淋巴細(xì)胞瘤的方法，具體地說是對在初次診斷后變得明顯的體腫瘤轉(zhuǎn)化性淋巴細(xì)胞重排(即，克隆演化)的診斷。
本發(fā)明的一個方面提供一種在哺乳動物中監(jiān)視淋巴腫瘤性轉(zhuǎn)化的方法，所述的方法包括將來自所述哺乳動物的樣品中所包含的核酸分子和與標(biāo)識核酸分子或其類似物互補(bǔ)的參照核酸分子或其衍生物或類似物相在足以使所述參照分子與所述標(biāo)識分子相互作用的條件下接觸一段時間，所述的標(biāo)識分子具有腫瘤轉(zhuǎn)化性細(xì)胞的特性，通過減少未雜交的核酸分子和雜交錯配核酸分子的濃度富集所述的標(biāo)識分子，再定性和/或定量地檢測所富集的標(biāo)識核酸分子。
本發(fā)明的另一方面提供一種在哺乳動物中監(jiān)測腫瘤轉(zhuǎn)化性淋巴疾病的方法，所述的方法包括將來自所述哺乳動物的樣品中所包含的核酸分子和與經(jīng)重排的TCR或免疫球蛋白可變區(qū)核酸分子的一部分或其衍生物或類似物互補(bǔ)的參照核酸分子或其衍生物或類似物在足以使所述參照分子與所述可變區(qū)域核酸分子相互作用的條件下相接觸一段時間，通過減少未雜交的核酸分子和雜交錯配核酸分子的濃度富集所述的可變區(qū)域核酸分子，再定性和/或定量地檢測所富集的可變區(qū)域核酸分子。
本發(fā)明的再一方面涉及監(jiān)視哺乳動物中淋巴惡性腫瘤的方法，所述的方法包括將來自所述哺乳動物的樣品中所包含的核酸分子和與經(jīng)重排的TCR或免疫球蛋白可變區(qū)核酸分子或其衍生物或類似物互補(bǔ)的參照核酸分子或其衍生物或類似物在足以使所述參照分子與所述可變區(qū)域核酸分子相互作用的條件下相接觸一段時間，通過減少未雜交的核酸分子和雜交錯配核酸分子的濃度富集所述的可變區(qū)域核酸分子，再定性和/或定量地檢測所富集的可變區(qū)域核酸分子。
本發(fā)明的又一方面涉及監(jiān)視人淋巴惡性腫瘤的方法，所述的方法包括將來自所述人樣品中所包含的核酸分子和與經(jīng)重排的TCR或免疫球蛋白可變區(qū)核酸分子或其衍生物或類似物互補(bǔ)的參照核酸分子或其衍生物或類似物在足以使所述參照分子與所述可變區(qū)域核酸分子相互作用的條件下相接觸一段時間，，通過減少未雜交的核酸分子和雜交錯配核酸分子的濃度富集所述的可變區(qū)域核酸分子，再定性和/或定量地檢測所富集的可變區(qū)域核酸分子。
本發(fā)明的另一方面提供一種在哺乳動物中檢測腫瘤轉(zhuǎn)化性淋巴疾病的方法，所述的方法包括將來自所述哺乳動物的測試樣品中所包含的核酸分子和與經(jīng)重排的TCR或免疫球蛋白可變區(qū)核酸分子或其衍生物或類似物互補(bǔ)的核酸驅(qū)動分子(nucleic driver molecule)或其衍生物或類似物在足以使所述驅(qū)動分子(driver moleculor)與所述可變區(qū)域核酸分子相互作用的條件下相接觸一段時間，通過減少未雜交的核酸分子和雜交錯配核酸分子的濃度富集所述的可變區(qū)域核酸分子，再定性和/或定量地檢測所富集的可變區(qū)域核酸分子。
本發(fā)明的又一方面涉及檢測和/或定量生物樣品中克隆細(xì)胞群的方法，所述的細(xì)胞以標(biāo)識核酸分子為特征，所述的標(biāo)識分子在所述細(xì)胞群內(nèi)電泳共遷移，所述的方法包括將包含于所述樣品中的核酸分子通過電泳分離，其中所述的分離基于核酸的長度和序列，再檢測所述的經(jīng)分離的核酸分子。
本發(fā)明的又一方面更具體地提供了一種檢測和/或定量生物樣品中的腫瘤轉(zhuǎn)化性淋巴細(xì)胞群的方法，所述的樣品以標(biāo)識核酸分子為特征，所述的標(biāo)識分子在所述細(xì)胞群內(nèi)電泳共遷移，所述的方法包括將包含于所述樣品中的核酸分子通過電泳分離，其中所述的分離是基于核酸的長度和序列，再檢測所述的經(jīng)分離的核酸分子。
本發(fā)明的又一方面提供一種檢測和/或定量生物樣品中的腫瘤轉(zhuǎn)化性淋巴細(xì)胞群的方法，所述的腫瘤轉(zhuǎn)化性細(xì)胞以標(biāo)識核酸分子為特征，所述的標(biāo)識分子在所述細(xì)胞群內(nèi)電泳共遷移，所述的方法包括將包含于所述樣品中的核酸分子通過電泳分離，其中所述的分離是二維變性梯度凝膠電泳、并且是基于核酸的長度和序列進(jìn)行的，再檢測所述的經(jīng)分離的核酸分子。
本發(fā)明的又一方面更具體地提供了一種檢測和/或定量哺乳動物中的腫瘤轉(zhuǎn)化性細(xì)胞的方法，所述的腫瘤轉(zhuǎn)化性細(xì)胞以標(biāo)識核酸分子為特征，所述的標(biāo)識分子在所述細(xì)胞群內(nèi)電泳共遷移，所述的方法包括將包含于所述來自所述哺乳動物的樣品中的核酸分子通過電泳分離，其中所述的分離是基于核酸的長度和序列，再檢測所述的經(jīng)分離的核酸分子。
本發(fā)明的又一方面更具體地提供了一種檢測和/或定量生物樣品中多重非腫瘤轉(zhuǎn)化性淋巴細(xì)胞的方法，所述的非腫瘤轉(zhuǎn)化性細(xì)胞以標(biāo)識核酸分子為特征，所述的標(biāo)識分子在所述細(xì)胞群內(nèi)電泳共遷移，所述的方法包括將包含于所述樣品中的核酸分子通過電泳分離，其中所述的分離是基于核酸的長度和序列，再檢測所述的經(jīng)分離的核酸分子。
優(yōu)選地，所述的分離是二維變性梯度凝膠電泳。


圖1是兩次實驗的圖示說明，其中，將不同量的未知的標(biāo)識白血病DNA添加到正常的DNA中，未知的量由實施例2中所述的方法進(jìn)行測定。
圖2是通過遺傳標(biāo)識的鑒定，對以不同的比例與來自外周血單核細(xì)胞的DNA相混合的細(xì)胞系DNA的檢測圖。免疫球蛋白重鏈基因的CDR3區(qū)作為克隆特異性標(biāo)識。將來自B細(xì)胞系的DNA以不同的比例與由外周血細(xì)胞抽提的DNA相混合，使細(xì)胞系細(xì)胞與血細(xì)胞的比例由1∶3到1∶3000。用GC夾持型引物(clamped-primer)通過PCR擴(kuò)增CDR3區(qū)域。所得產(chǎn)物通過6％的聚丙烯酰胺凝膠電泳。箭頭指示來自細(xì)胞系的兩個標(biāo)識產(chǎn)物，分別是130和120bp，它們的大小是細(xì)胞系特異性的。這可以在1比3，1比10，和1比30混合方式中觀察到，再高的稀釋度下就觀察不到了。
M標(biāo)識，其左側(cè)是其大小(bp)；C單獨(dú)的細(xì)胞系DNAP單獨(dú)的外周血細(xì)胞DNA；-ve陰性對照(無DNA)其它泳道每血細(xì)胞細(xì)胞系的細(xì)胞。
圖3是圖2中的產(chǎn)物經(jīng)二維變性梯度凝膠電泳分析的結(jié)果圖。上述產(chǎn)物首先經(jīng)標(biāo)準(zhǔn)的聚丙烯酰胺凝膠電泳分析。切下含有產(chǎn)物的膠條，置于變性梯度凝膠的頂部，所述的變性凝膠含按標(biāo)準(zhǔn)配方的尿素和甲酰胺濃度梯度，從頂部的0％飽和度到底部的80％。電泳過夜。
→第一次二維分離的方向通過大小，在標(biāo)準(zhǔn)的6％聚丙烯酰胺凝膠上；↓第二次二維分離的方向通過融解特性，在聚丙烯酰胺凝膠變性濃度梯度中。
A單獨(dú)的細(xì)胞系，給出一個主要產(chǎn)物(圈出)B經(jīng)稀釋的細(xì)胞系，以高分辨率在凝膠的相應(yīng)區(qū)域給出與細(xì)胞系產(chǎn)物相似的產(chǎn)物(圈出的)，其大小和融解特性均相似。
經(jīng)1/3到1/300稀釋的細(xì)胞系DNA也給出這一產(chǎn)物，但無論是單獨(dú)的血液DNA還是陰性對照(無DNA)均沒有給出這一產(chǎn)物。
結(jié)果，與一維分離相比，二維分離產(chǎn)生了近30倍的提高。發(fā)明詳述本發(fā)明部分地預(yù)言了通過參照核酸分子以鑒定腫瘤轉(zhuǎn)化性標(biāo)識核酸分子的用途，和提供一種減少存在于測試樣品中的非標(biāo)識背景核酸分子的方法。這促使行成了一種簡便且高靈敏度監(jiān)視腫瘤轉(zhuǎn)化性淋巴疾病的方法。與此相關(guān)，本發(fā)明開發(fā)了一種鑒定和/或監(jiān)視克隆細(xì)胞群，如腫瘤轉(zhuǎn)化性細(xì)胞的技術(shù)，所述技術(shù)基于核酸分子長度和序列的二維電泳分離的標(biāo)識核酸分子共遷移模式。
由此，本發(fā)明一方面提供一種在哺乳動物中監(jiān)視腫瘤轉(zhuǎn)化性淋巴疾病的方法，所述的方法包括將來自所述哺乳動物的樣品中所包含的核酸分子和與標(biāo)識核酸分子或其類似物互補(bǔ)的參照核酸分子或其衍生物或類似物在足以使所述參照分子與所述標(biāo)識分子相互作用的條件下相接觸一段時間，所述的標(biāo)識分子具有腫瘤轉(zhuǎn)化性細(xì)胞的特性，通過減少未雜交的核酸分子和雜交錯配核酸分子的濃度富集所述的標(biāo)識分子，再定性和/或定量地檢測所富集的標(biāo)識核酸分子。
關(guān)于具有受試腫瘤轉(zhuǎn)化性淋巴細(xì)胞“特征性”的“標(biāo)識核酸分子”應(yīng)理解為是一種分子參照，所述的分子可在腫瘤轉(zhuǎn)化性淋巴細(xì)胞中發(fā)現(xiàn)，但不能在非腫瘤轉(zhuǎn)化性細(xì)胞存在或明顯存在。所謂“明顯的”是指對受試標(biāo)記的檢測，對存在于受試哺乳動物中的腫瘤轉(zhuǎn)化性淋巴細(xì)胞水平的提供了一種有用指示。所述的標(biāo)識可以是編碼蛋白分子的核酸分子或其中的區(qū)域，所述的蛋白質(zhì)分子可以是胞內(nèi)的，分泌的或跨膜的分子。另外，其可包含具有受試腫瘤轉(zhuǎn)化性細(xì)胞特性的非編碼序列。所述的標(biāo)識分子可以是DNA或RNA，如mRNA。
當(dāng)所述的標(biāo)識分子是編碼蛋白質(zhì)分子的DNA分子時，其表達(dá)可以是組成型的，或需要通過腫瘤轉(zhuǎn)化性細(xì)胞接收刺激信號以誘導(dǎo)其轉(zhuǎn)錄和翻譯。由于本發(fā)明的方法針對篩選標(biāo)識分子本身，當(dāng)基因組DNA作為檢測目標(biāo)時，所述的標(biāo)識是否表達(dá)并不重要。但是當(dāng)受試方法涉及對mRNA的檢測且由所述標(biāo)識編碼的蛋白不是組成型表達(dá)，則需要在篩選前對受試腫瘤轉(zhuǎn)化性細(xì)胞進(jìn)行適當(dāng)?shù)拇碳?。這種刺激可以在從哺乳動物中獲得含受試腫瘤轉(zhuǎn)化性細(xì)胞的生物樣品后在體外進(jìn)行，或者在從哺乳動物獲取生物樣品前即對該哺乳動物進(jìn)行刺激。而且，所述的標(biāo)識核酸分子可以是轉(zhuǎn)化前正常存在于受試腫瘤轉(zhuǎn)化性細(xì)胞中的。另外所述的標(biāo)識核酸分子也可以是在轉(zhuǎn)化時被引入到受試腫瘤轉(zhuǎn)化性細(xì)胞中的。例如，當(dāng)用病毒感染非腫瘤轉(zhuǎn)化性細(xì)胞誘導(dǎo)轉(zhuǎn)化時，所述的標(biāo)識可以是病毒衍生的或病毒特異性的分子。
優(yōu)選地，所述的標(biāo)識是重排的基因組可變區(qū)核酸分子或T細(xì)胞受體(此處指“TCR”)鏈或免疫球蛋白鏈的衍生物。在不對本發(fā)明進(jìn)行任何形式的限制的情況下，每一淋巴細(xì)胞經(jīng)歷其種系可變區(qū)基因節(jié)段(V和J或者V，D和J節(jié)段)的體細(xì)胞重組，所述的重組依賴特定的基因重排，以產(chǎn)生約1016不同可變區(qū)結(jié)構(gòu)的總抗原多樣性。在任意給定的淋巴細(xì)胞中，如T細(xì)胞或B細(xì)胞，由于兩個或更多個含TCR或免疫球蛋白分子的雙鏈的重排，至少可以出現(xiàn)兩個不同的可變區(qū)基因節(jié)段重排。特別是TCR的α，β，γ或δ鏈和/或免疫球蛋白分子的重鏈和輕鏈。除對任意給定的免疫球蛋白或TCR基因的VJ或VDJ節(jié)段的重排外，核苷酸也隨機(jī)地去除和/或插入到節(jié)段的連接處。由此也形成了大量的多樣性。
因此，更具體地說，本發(fā)明提供了一種監(jiān)視哺乳動物中腫瘤轉(zhuǎn)化性淋巴疾病的方法，所述的方法包括將來自所述哺乳動物的樣品中所包含的核酸分子和與經(jīng)重排的TCR或免疫球蛋白可變區(qū)核酸分子、或其衍生物或類似物互補(bǔ)的參照核酸分子、或其衍生物或類似物在足以使所述參照分子與所述可變區(qū)域核酸分子相互作用的條件下接觸一段時間，通過減少未雜交的核酸分子和雜交錯配核酸分子的濃度富集所述的可變區(qū)域核酸分子，再定性和/或定量地檢測所富集的可變區(qū)域核酸分子。
優(yōu)選地，所述的可變區(qū)核酸分子是重排的可變區(qū)基因節(jié)段的基因組形式。
應(yīng)當(dāng)理解所述的“淋巴細(xì)胞”是指至少免疫球蛋白或TCR可變區(qū)基因節(jié)段的一個種系組發(fā)生重排的任何細(xì)胞?？赡馨l(fā)生重排的編碼基因組DNA的所述免疫球蛋白可變區(qū)包括與重鏈或κ或λ輕鏈相關(guān)的可變區(qū)，可能發(fā)生重排的所述TCR鏈可變區(qū)編碼基因組DNA的包括α，β，γ和δ鏈。在這方面，若所述的細(xì)胞中至少一個免疫球蛋白或TCR基因節(jié)段區(qū)域的編碼DNA的可變區(qū)域發(fā)生重排，則該細(xì)胞應(yīng)當(dāng)理解為包含在“淋巴細(xì)胞”定義的范圍內(nèi)。但上述細(xì)胞無需轉(zhuǎn)錄和翻譯經(jīng)重排的DNA。在這一方面“淋巴細(xì)胞”的范圍，包含但不限于，其中TCR或免疫球蛋白可變區(qū)基因節(jié)段經(jīng)過重排但經(jīng)過重排的鏈不表達(dá)的未成熟T和B淋巴細(xì)胞(如TCR-胸腺細(xì)胞)，或者TCR或免疫球蛋白可變區(qū)基因節(jié)段的鏈均未經(jīng)重排的未成熟T和B細(xì)胞。這一定義進(jìn)一步擴(kuò)展到淋巴樣細(xì)胞，所述的細(xì)胞中至少經(jīng)歷某些TCR或免疫球蛋白可變區(qū)的重排，但該細(xì)胞并不表現(xiàn)通常與成熟T細(xì)胞或B細(xì)胞相關(guān)的全部表型或功能特性。因此，本發(fā)明的方法可以用于監(jiān)視細(xì)胞瘤形成，所述的細(xì)胞包括但不限于任何發(fā)育分化階段的淋巴細(xì)胞、激活的淋巴細(xì)胞、非淋巴/淋巴樣細(xì)胞，條件是上述細(xì)胞中至少一部分可變區(qū)基因發(fā)生重排。
可以理解盡管優(yōu)選至少一個可變區(qū)基因區(qū)域已完成重排，本發(fā)明的方法適合于監(jiān)視表現(xiàn)僅部分重排的腫瘤轉(zhuǎn)化性。例如，僅經(jīng)歷DJ重組的B細(xì)胞就是僅經(jīng)歷部分重排的細(xì)胞。DJ重組節(jié)段進(jìn)一步與V節(jié)段重新組合后才能實現(xiàn)完全重排。本發(fā)明的方法可因此設(shè)計為檢測部分或全部的TCR或免疫球蛋白鏈可變區(qū)重排，所述的方法利用與上述標(biāo)識序列互補(bǔ)的參照分子；或者，例如當(dāng)需要特異性更高或腫瘤轉(zhuǎn)化性細(xì)胞中的TCR或免疫球蛋白鏈的可變區(qū)均發(fā)生重排時，可以使用同時針對兩種形式的重排之參照分子。
關(guān)于“腫瘤轉(zhuǎn)化性細(xì)胞”應(yīng)理解為指表現(xiàn)出非正?！吧L”的細(xì)胞。術(shù)語“生長”應(yīng)以其最廣義含義理解，其包括增殖。在這一方面，細(xì)胞增殖失控可作為一個非正常生長的例子。淋巴細(xì)胞增殖失控將導(dǎo)致以實體腫瘤或單細(xì)胞懸液(如在白血病病人血液中所觀察到的)形式存在的細(xì)胞群。腫瘤轉(zhuǎn)化性細(xì)胞可能是良性細(xì)胞或惡性細(xì)胞。在一個優(yōu)選的實施方案中，所述的腫瘤轉(zhuǎn)化性細(xì)胞是惡性細(xì)胞。在此方面，“腫瘤轉(zhuǎn)化性疾病”是指在受試哺乳動物中存在腫瘤轉(zhuǎn)化性細(xì)胞。盡管“腫瘤轉(zhuǎn)化性淋巴疾病”包括涉及以存在大量非正常腫瘤轉(zhuǎn)化性細(xì)胞為特征的疾病狀態(tài)，例如在白血病，淋巴瘤和骨髓瘤中出現(xiàn)的情況，此外，這一用語還應(yīng)理解為包括哺乳動物中的腫瘤轉(zhuǎn)化性細(xì)胞數(shù)在通常作為區(qū)分哺乳動物由明顯的疾病狀態(tài)到緩解狀態(tài)(或反之亦然)進(jìn)行轉(zhuǎn)換的閾值以下的情況。(在緩解過程中存在的細(xì)胞數(shù)通常是指所謂″最低限度殘余疾病″)。近一步，甚至當(dāng)存在于哺乳動物中的腫瘤轉(zhuǎn)化性細(xì)胞數(shù)低于可由在本發(fā)明的方法出現(xiàn)之前的篩選方法檢測到的閾值時，所述的哺乳動物也視為表現(xiàn)“腫瘤轉(zhuǎn)化性疾病”。
在一個優(yōu)選的實施方案中，本發(fā)明涉及哺乳動物中的淋巴惡性疾病的方法，所述的方法包括將來自所述哺乳動物的試驗樣品中所包含的核酸分子和與經(jīng)重排的TCR或免疫球蛋白可變區(qū)核酸分子或其衍生物或類似物互補(bǔ)的參照核酸分子或其衍生物或類似物在足以使所述參照分子與所述可變區(qū)域核酸分子相互作用的條件下相接觸一段時間，通過減少未雜交的核酸分子和雜交錯配核酸分子的濃度富集所述的可變區(qū)域核酸分子，再定性和/或定量地檢測所富集的可變區(qū)域核酸分子。
更優(yōu)選地，所述的監(jiān)視是對最低限度疾病狀態(tài)的監(jiān)視。
關(guān)于來自受試哺乳動物的“試驗樣品”應(yīng)按其最廣義理解，其包括來自哺乳動物的任何樣品材料。這既包括天然存在于哺乳動物體內(nèi)的樣品，如組織和體液(例如活組織檢查如淋巴樣本，血液，淋巴液，糞便或支氣管分泌物)和導(dǎo)入哺乳動物體內(nèi)后再將其去除的樣品，例如，在肺灌洗后從肺部(或經(jīng)灌腸后由結(jié)腸)抽提出的鹽溶液。依照本發(fā)明的方法檢測的生物樣品可以進(jìn)行直接檢測，也可能在檢測前需要經(jīng)過一定形式的處理。例如，活組織檢查樣品在檢測前可能需要勻漿化。當(dāng)所述的樣品包含細(xì)胞物質(zhì)時，可能需要抽提或使存在于細(xì)胞物質(zhì)中的核酸暴露出來，以便使其與參照的核酸分子相互作用。如上所述，如果所述的檢測是設(shè)計為檢測mRNA標(biāo)識序列，則所述的樣品在進(jìn)行檢測前可能需要一定形式的刺激。
選擇對于依照本發(fā)明的方法所進(jìn)行的檢測最適合的樣品類型需依被檢測的瘤形成疾病的性質(zhì)而定。例如，如果所述的腫瘤轉(zhuǎn)化性疾病是淋巴樣白血病，血液樣品，淋巴液樣品或骨髓抽出物可能作為合適的檢測樣品。當(dāng)腫瘤轉(zhuǎn)化性疾病是淋巴瘤時，淋巴結(jié)活組織檢查，或者血液或骨髓樣品可作為用于檢測的合適的組織來源。還需要考慮到是否檢測腫瘤轉(zhuǎn)化性細(xì)胞最初的來源，或是否將觀察由起點開始的瘤轉(zhuǎn)移或其他形式的瘤形成擴(kuò)散。對此種情況，可取的做法是收獲并檢測一定數(shù)量來自任一哺乳動物的不同樣品。對于任何給定的檢測方案選擇合適的樣品是本領(lǐng)域的普通技術(shù)人員所能夠做到的。
此處所用的術(shù)語“哺乳動物”包括人，靈長類，家畜動物(如馬、牛、羊、豬、驢)，實驗動物(如小鼠、大鼠、兔、豚鼠)，寵物(如狗、貓)和被俘獲的野生動物(如袋鼠、鹿、狐貍)。優(yōu)選地，所述哺乳動物是人或?qū)嶒瀯游?。更?yōu)選地，所述的哺乳動物是人。
根據(jù)這一優(yōu)選實施方案，本發(fā)明涉及監(jiān)視人淋巴惡性腫瘤的方法，所述的方法包括將來自所述人的樣品中所包含的核酸分子和與經(jīng)重排的TCR或免疫球蛋白可變區(qū)核酸分子或其衍生物或類似物互補(bǔ)的參照核酸分子或其衍生物或類似物在足以使所述參照分子與所述可變區(qū)域核酸分子相互作用的條件下相接觸一段時間，通過減少未雜交的核酸分子和雜交錯配核酸分子的濃度富集所述的可變區(qū)域核酸分子，再定性和/或定量地檢測所富集的可變區(qū)域核酸分子。
本發(fā)明的方法是基于應(yīng)用如上述定義的可與標(biāo)識核酸分子相互作用的參照核酸分子，監(jiān)視實際的或推定的腫瘤轉(zhuǎn)化性淋巴疾病。在此方面，所述的“監(jiān)視”應(yīng)理解為對有關(guān)受試者在腫瘤轉(zhuǎn)化性疾病初期診斷后受試腫瘤轉(zhuǎn)化性淋巴存在或水平的檢測。“檢測”包括進(jìn)行相關(guān)的某一項試驗以及在一定的天、周、月或年的時間段中進(jìn)行一系列的實驗。為在應(yīng)用治療方案之前或之后監(jiān)視腫瘤轉(zhuǎn)化性疾病的進(jìn)程，以有助于對合適的治療方案作出結(jié)論或試驗新的治療方案，所述的試驗可因許多原因而進(jìn)行，其包括但不限于預(yù)測處于恢復(fù)期的哺乳動物病癥復(fù)發(fā)的可能性，監(jiān)視某一治療方法的效果，檢查處于恢復(fù)期的病人的狀態(tài)。因此，本發(fā)明的方法作為臨床工具或研究工具都是有用的。
所述的“核酸”應(yīng)理解為脫氧核糖核酸和核糖核酸，或其衍生物或類似物。
所述的參照核酸分子可以是天然地，或經(jīng)重組或合成產(chǎn)生的。當(dāng)有關(guān)受試標(biāo)識分子的序列信息已知時，所述的參照核酸分子可以是經(jīng)重組或合成產(chǎn)生的。然而，在一個優(yōu)選的實施方案中，本發(fā)明適用于不可能和/或不需要獲得有關(guān)標(biāo)識分子的核苷酸序列信息的情況下。這對當(dāng)本發(fā)明的方法應(yīng)用于在臨床狀態(tài)下監(jiān)視許多腫瘤轉(zhuǎn)化性淋巴疾病患者的情況具有特別的意義。具體說來，由于所述的TCR或免疫球蛋白可變區(qū)域重排是腫瘤轉(zhuǎn)化性淋巴細(xì)胞的特別適合的標(biāo)識，很可能由給定病人的腫瘤轉(zhuǎn)化性淋巴細(xì)胞所表現(xiàn)的特定可變區(qū)重排是獨(dú)特性的。甚至當(dāng)一個病人表現(xiàn)兩次初級腫瘤轉(zhuǎn)化性淋巴疾病，可能來自第一初級腫瘤轉(zhuǎn)化性淋巴疾病的腫瘤轉(zhuǎn)化性細(xì)胞的可變區(qū)重排也不同于第二初級腫瘤轉(zhuǎn)化性淋巴疾病的腫瘤轉(zhuǎn)化性細(xì)胞的可變區(qū)重排。
在優(yōu)選的實施方案中，所述的參照核酸分子是天然存在的分子，如驅(qū)動核酸分子。所述的“驅(qū)動”核酸分子是指用本發(fā)明的方法監(jiān)視的、從哺乳動物中分離出的參照核酸分子。所述的分子需在開始施行本發(fā)明的方法前分離出來。盡管對本領(lǐng)域的技術(shù)人員來說，本發(fā)明中適用的定位、鑒定和分離驅(qū)動分子的方法是已知的，但在一個優(yōu)選的實施方案中，所述的驅(qū)動分子是經(jīng)重排的TCR或免疫球蛋白可變區(qū)基因組DNA，該DNA來自在診斷時由受試哺乳動物中獲得的腫瘤轉(zhuǎn)化性淋巴細(xì)胞樣品。適用于本發(fā)明的方法中的驅(qū)動分子可以通過如下制備例如，由診斷時獲得的細(xì)胞中抽提的DNA或RNA中存在的經(jīng)重排的TCR或免疫球蛋白基因的核酸擴(kuò)增。在不對本發(fā)明的操作做任何形式限定的前提下，腫瘤轉(zhuǎn)化性淋巴疾病的診斷作為呈現(xiàn)異常癥狀病人結(jié)果的而出現(xiàn)。這些癥狀經(jīng)常是由與存在高濃度的腫瘤轉(zhuǎn)化性淋巴細(xì)胞(在瘤形成骨髓，如B細(xì)胞白血病中，通常高于99％，在胸腺細(xì)胞白血病的胸腺中通常通常高于95％，在含實體淋巴腫瘤的細(xì)胞中通常高于99％)所導(dǎo)致的。因此，腫瘤轉(zhuǎn)化性細(xì)胞的樣品可以在診斷時或治療方案開始前的任何時候簡便、快速地分離出來?？梢詮娜我饨o定的病人獲得并貯存足夠的細(xì)胞或DNA或RNA或驅(qū)動核酸分子樣品，以便在需要或希望對該病人進(jìn)行腫瘤轉(zhuǎn)化性淋巴疾病進(jìn)行監(jiān)視時可持續(xù)進(jìn)行監(jiān)視。
由此，本發(fā)明的方法優(yōu)選提供一種在哺乳動物中監(jiān)視腫瘤轉(zhuǎn)化性淋巴疾病的方法，所述的方法包括將來自所述哺乳動物的檢測樣品中所包含的核酸分子和與經(jīng)重排的TCR或免疫球蛋白可變區(qū)核酸分子或其衍生物或類似物互補(bǔ)的驅(qū)動核酸分子或其衍生物或類似物在足以使所述驅(qū)動分子與所述可變區(qū)域核酸分子相互作用的條件下接觸一段時間，通過減少未雜交的核酸分子和雜交錯配核酸分子的濃度富集所述的可變區(qū)域核酸分子，再定性和/或定量地檢測所富集的可變區(qū)域核酸分子。
優(yōu)選地，所述的腫瘤轉(zhuǎn)化性疾病是惡性疾病，更優(yōu)選所述的哺乳動物是人。
所述的“衍生物”和“類似物”應(yīng)當(dāng)理解為包括天然的，合成的，或重組來源的片段、部分、部件、突變體、同系物、模擬物和類似物。所述核酸分子的衍生物包括具有所述核酸序列特定表位或部分的片段。例如，所述的參照分子可僅編碼足以作為標(biāo)識的部分可變區(qū)。類似地，僅僅可變區(qū)的一部分也可以提供充分地標(biāo)識，如僅僅免疫球蛋白重排或連接點的DJ區(qū)域。這一定義還包括與其他蛋白或非蛋白分子融合的核酸分子。受試的核酸分子可以與標(biāo)記物(tag)融合，例如其可以使所述核酸分子的分離和檢測易于進(jìn)行的標(biāo)記物。此處所包含的類似物包括但不限于對所述核酸序列的修飾，如對其化學(xué)組成或總體構(gòu)象的修飾。例如，所述的參照核酸分子可以帶有尿嘧啶核苷酸，它為接下來去除不需要的參照分子提供酶切的靶位點。還包括，例如對核酸序列與其他核酸序列在如主鏈形成和互補(bǔ)堿基對雜交水平的相互作用方式的修飾。核苷酸或核酸序列的生物素?；谴颂幩x的衍生物的例子。核酸序列的衍生物可以來自單或多核苷酸替換、缺失和/或添加。術(shù)語“衍生物”應(yīng)理解為包含表現(xiàn)任一或多個核酸序列活性的核酸分子，例如，由下述天然產(chǎn)物篩選所獲得的產(chǎn)物，也包含在不同主鏈上的核苷酸序列，如肽核酸。
將所述的參照核酸分子和所述的測試樣品核酸分子相接觸，以使與存在于測試樣品中的任何標(biāo)識分子的相互作用便于通過任意合適的方法進(jìn)行。這些方法對本領(lǐng)域的技術(shù)人員而言是已知的。在這一方面所述的“相互作用”應(yīng)當(dāng)理解為任何形式的相互作用，如互補(bǔ)的堿基對之間的雜交，或一些其他形式的相互作用，如在受試的核酸分子的核酸部分之間的成鍵作用。所述的相互作用可以通過鍵的形成出現(xiàn)，例如但不限于共價鍵、氫鍵、范德華力或其它的相互作用機(jī)制。此處所有涉及的兩核酸分子之間的“雜交”應(yīng)理解為包含所述分子之間的任何形式的相互作用。為使這一相互作用易于進(jìn)行，優(yōu)選在足以使單鏈的參照分子和單鏈的標(biāo)識分子雜交的條件下，使參照核酸分子和檢測樣品中的核酸分子的部分或全部單鏈化一段時間。應(yīng)當(dāng)理解所述的雜交可以出現(xiàn)在所述參照核酸分子的編碼鏈和與之互補(bǔ)的所述標(biāo)識核酸分子鏈之間，或所述參照核酸分子的非編碼鏈和與之互補(bǔ)的所述標(biāo)識核酸分子鏈之間。
上下文中與參照分子有關(guān)的術(shù)語“核酸分子”是指任何包含具有下述功能的核苷酸序列或其衍生物的分子，所述的功能包括所述核苷酸序列的至少一個區(qū)域與標(biāo)記核酸序列的雜交。因此，術(shù)語“標(biāo)識核酸分子”包括任何使該分子成為如上所述的腫瘤轉(zhuǎn)化性細(xì)胞所特有的分子的核酸序列，并可由此作為通過接觸步驟鑒定的主題。核酸參照分子和標(biāo)識核酸分子均可以包含非核酸組分，如使檢測和/或富集這些分子易于進(jìn)行的標(biāo)記物。所述的標(biāo)記物可以在實施本發(fā)明方法過程中的任意合適的時間點摻入。
在不對本發(fā)明的操作理論或模式作任何形式地限定的前提下，使測試樣品核酸分子和參照核酸分子在雜交條件下相接觸將導(dǎo)致同源雙鏈的形成參照標(biāo)識同源雙鏈、參照參照同源雙鏈、或標(biāo)識標(biāo)識同源雙鏈。當(dāng)參照分子以錯配的方式與非標(biāo)識分子雜交時，或者標(biāo)記或非標(biāo)識核酸分子與不同序列的核酸分子雜交時將形成異源雙鏈。形成標(biāo)識標(biāo)識同源雙鏈的濃度可通過使所述的測試樣品與過量的參照核酸分子相接觸以降到最低。
在不對本發(fā)明作任何限定的前提下，所述參照核酸分子與存在于測試樣品中的標(biāo)識核酸分子的雜交使以簡單且特異的方式富集標(biāo)識核酸分子易于進(jìn)行。特異性是通過下述的事實提供的標(biāo)識分子與參照分子雜交形成同源雙鏈，由此將標(biāo)識分子與其它非標(biāo)識分子、構(gòu)成所述測試樣品一部分的異源分子區(qū)分開。
關(guān)于“富集”應(yīng)當(dāng)理解為提高標(biāo)識核酸分子相對于測試樣品中所含的背景非標(biāo)識核酸分子的比例。這可以通過例如降低，去除或減少非標(biāo)識核酸分子達(dá)到。依照本發(fā)明的方法，所述的富集步驟是采取降低包含在樣品中的非標(biāo)識核酸分子的濃度的形式，而不是由擴(kuò)增所述的標(biāo)識分子提高測試樣品中的標(biāo)識核酸分子的濃度。在不以任何形式限制本發(fā)明的操作理論和模式的前提下，本發(fā)明人已發(fā)現(xiàn)通過利用預(yù)期以降低樣品中非標(biāo)識核酸分子濃度，而非試圖提高標(biāo)識分子群的富集步驟使所述的檢測方法成為一種沒有非特異性擴(kuò)增危險的高靈敏性檢測方法。而且，此處所用的富集類型的可行性在于使用靶向受試標(biāo)識核酸分子的參照核酸分子。類似地，這種分子篩選方法的總體簡便性也與有關(guān)參照分子的使用相關(guān)，這使得不需要對預(yù)期的標(biāo)識核酸分子進(jìn)行序列分析，由此簡化了對高特異性的探針和/或引物分子的設(shè)計。
應(yīng)當(dāng)理解此處所述的“富集”并不局限于從測試樣品中去除所有非標(biāo)識核酸分子的富集步驟。更確切地說，依照前述的定義，其涉及降低樣品中非標(biāo)識核酸分子的濃度。濃度的降低可以有多種程度。本發(fā)明的方法應(yīng)當(dāng)理解為進(jìn)行一個或多個連續(xù)的富集步驟，以改善標(biāo)識核酸分子群的純度。本領(lǐng)域的技術(shù)人員能夠確定基于不同的情況決定需要進(jìn)行一個還是多個富集步驟。當(dāng)腫瘤轉(zhuǎn)化性淋巴細(xì)胞的數(shù)量大時，例如在治療的早期階段，用單一的簡單富集步驟即足以檢測以高濃度存在的標(biāo)識核酸分子。但是，當(dāng)受試的是處于恢復(fù)階段的病人時，則需要通過兩種或多種不同的富集技術(shù)，以最大限度地純化受試的標(biāo)識核酸分子。
對標(biāo)識核酸分子的富集可以通過一種或多種合適的技術(shù)進(jìn)行，所述的技術(shù)包括但不限于(i)將標(biāo)記物摻入到參照核酸分子或來自測試樣品的核酸分子中?？墒褂脴?biāo)記物通過共價鍵(或非共價鍵)將分子偶聯(lián)到固相，以便于通過洗或其它方式將不需要的分子去除?？梢杂脴?biāo)記物在來自測試樣品的核酸分子或參照核酸分子中提供抗酶切的核酸序列。這些標(biāo)記物是本領(lǐng)域的技術(shù)人員已知的，常用的包括生物素、地高辛和熒光素。另一個常用的標(biāo)記包括抗酶作用的肽或硫代磷酸酯主鏈。適用的固相包括，塑料表面，凝膠基質(zhì)和包被的磁珠，其上可以附著捕獲分子如鏈霉抗生物素或抗體。
(ii)將雜交錯配的異源雙鏈與參照標(biāo)識同源雙鏈相分離是基于雙鏈在通過包含于設(shè)備(如柱或毛細(xì)管)中的凝膠或大小排阻或親和或其他基質(zhì)時的不同遷移率而進(jìn)行的。
(iii)通過將下述的異源雙鏈與錯配修復(fù)蛋白相締合，去除如那些部分與非標(biāo)識核酸分子雜交的參照核酸分子所形成的雜交錯配的異源雙鏈。所述的去除可以通過任何適宜的技術(shù)進(jìn)行，如所述的錯配蛋白與固相表面如柱或板相偶聯(lián)。在另一實施例中，可通過錯配修復(fù)蛋白有差別地改變異源雙鏈通過凝膠或基質(zhì)的遷移率。
(iv)用化學(xué)或酶切技術(shù)去除未配合的單鏈核酸分子和/或雜交錯配異源雙鏈。優(yōu)選地，所用的酶切技術(shù)是用例如S1核酸酶和/或T4內(nèi)切酶消化受試的核酸分子。
(v)將標(biāo)記的同源二聚體和異源二聚體偶聯(lián)到固相上，并去除未雜交的單鏈分子、異源二聚體或同源二聚體。這一去除步驟可以通過例如洗滌，而后加熱或?qū)λ嗪怂岱肿尤哼M(jìn)行化學(xué)處理，以去除單鏈的和以錯配方式與參照分子雜交的非標(biāo)識分子。在不對本發(fā)明做任何形式的限定的前提下，與完美地雜交的標(biāo)識分子相比，雜交錯配的非標(biāo)識分子在較低的溫度下解鏈。新的單鏈分子即可通過洗滌步驟去除。
可以理解所述的富集步驟可以通過一種或多種合適的技術(shù)進(jìn)行，如一種或多種如上述(i)-(v)中所概述的技術(shù)。所述的技術(shù)可以通過多種方式進(jìn)行，包括在溶液中，通過分離膠或柱，或者通過將參照核酸分子或測試核酸分子附著到固相上。確定最合適的富集方法是本領(lǐng)域的技術(shù)人員所能做到的。當(dāng)需要使用一種以上的富集技術(shù)時，優(yōu)選使所述的技術(shù)依次進(jìn)行。
除了應(yīng)用一種或多種以上詳細(xì)描述的富集技術(shù)外，優(yōu)選在檢測標(biāo)識分子前將所述的驅(qū)動分子去除。這進(jìn)一步富集了所述的標(biāo)識核酸分子。其可通過下述的任意一種技術(shù)實現(xiàn)(i)使分離的核酸分子雙螺旋成為單鏈，通過向所述分子中摻入的標(biāo)記物分離所述的參照核酸分子。例如以上所描述的生物素標(biāo)記或磁珠。
(ii)通過已摻入到參照核酸分子中的合適的鑒定標(biāo)記物特異性地降解參照核酸分子。例如，將尿嘧啶類似物摻入到參照分子DNA中，用所述的尿嘧啶N糖基化酶(UNG)特異性地降解參照核酸分子。在不對本發(fā)明做任何形式限定的前提下，到參照參照分子同源雙鏈已經(jīng)形成或驅(qū)動非標(biāo)記異源雙鏈未被富集步驟去除的程度，這一步驟可以去除這些多余的分子。
(iii)利用僅附著于來自測試樣品的核酸分子的酶-抗性標(biāo)記物使這些分子擴(kuò)增而不使參照分子擴(kuò)增。這極大地降低了參照分子的相對比例。
在最優(yōu)選的實施方案中，通過降低未雜交的核酸分子和雜交錯配核酸分子的濃度富集所述標(biāo)識分子的步驟進(jìn)一步包括降低參照分子濃度的步驟。
依照這一最優(yōu)選的實施方案，提供了一種在哺乳動物中監(jiān)視腫瘤轉(zhuǎn)化性淋巴疾病的方法，所述的方法包括將來自所述哺乳動物的樣品中所包含的核酸分子和與經(jīng)重排的TCR或免疫球蛋白可變區(qū)核酸分子、或其衍生物或類似物互補(bǔ)的驅(qū)動核酸分子、或其衍生物或類似物在足以使所述驅(qū)動分子與所述可變區(qū)域核酸分子相互作用的條件下接觸一段時間，通過減少未雜交的核酸分子、雜交錯配核酸分子和核酸驅(qū)動分子的濃度富集所述的可變區(qū)域核酸分子，再定性和/或定量地檢測所富集的可變區(qū)域核酸分子。
在最優(yōu)選的實施方案中，所述的富集步驟是通過下述方式進(jìn)行的去除未與所述的標(biāo)記物標(biāo)記的驅(qū)動核酸分子雜交的非標(biāo)識核酸分子，酶法切除錯配雜交核酸分子和去除驅(qū)動分子，如通過利用UNG。
對標(biāo)識核酸分子的“檢測”可以通過本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的任何合適的方法進(jìn)行。在此方面相關(guān)的“定性”檢測應(yīng)理解為對腫瘤轉(zhuǎn)化性淋巴細(xì)胞群在受試哺乳動物中存在與否的檢測。而“定量”檢測應(yīng)理解為檢測受試哺乳動物中腫瘤轉(zhuǎn)化性淋巴細(xì)胞的水平。適合應(yīng)用于本發(fā)明中的檢測技術(shù)包括但不限于(i)用可以發(fā)出信號的檢測標(biāo)記物(或者與可發(fā)出信號的檢測系統(tǒng)相偶聯(lián)的檢測標(biāo)記物)標(biāo)記所富集的標(biāo)識核酸分子，然后檢測所述的信號。這包括例如比色檢測，熒光檢測，酶檢測或放射性標(biāo)記物的檢測；或(ii)在檢測前擴(kuò)增所富集的標(biāo)識核酸分子。這在例如，當(dāng)標(biāo)識核酸分子的拷貝數(shù)低(例如病人已處于恢復(fù)期)時可能需要。由于標(biāo)識核酸分子群已被富集，則無需合成特異性針對受試標(biāo)識分子的擴(kuò)增引物。更確切地說，可以用通用引物擴(kuò)增受試標(biāo)識核酸分子群，所得的擴(kuò)增產(chǎn)物可以通過電泳檢測。
(iii)可以通過下述方法定量地檢測(未知)的標(biāo)識向起始測試樣品中加入已知量的標(biāo)準(zhǔn)的不同序列，用兩參照驅(qū)動分子，一個針對標(biāo)準(zhǔn)分子，一個針對標(biāo)識分子，進(jìn)行起始富集，確定最終獲得的未知標(biāo)識分子與所富集的標(biāo)準(zhǔn)分子的相對量。由此即可計算出起始的未知標(biāo)識分子的量。
(iv)可以用如下所述的2-維電泳分離。
在不以任何形式對本發(fā)明進(jìn)行限制的前提下，本發(fā)明人已展示出本發(fā)明的方法能檢測并定量在血液樣品中每總細(xì)胞數(shù)低至10-5水平、在骨髓樣品中每樣品總細(xì)胞數(shù)低至10-5到10-5水平的疾病。這一同樣操作簡便的技術(shù)比現(xiàn)有的技術(shù)有千倍以上的改進(jìn)(參見表1)。
在相關(guān)的方面，本發(fā)明人已確定上文中所定義的標(biāo)識核酸分子由于其大小和核苷酸序列上的差異表現(xiàn)獨(dú)特的電泳遷移模式。由此本發(fā)明人研究出一種定性或定量檢測生物樣品中是否存在標(biāo)識核酸分子群的方法，該方法是基于標(biāo)識群與測試樣品中所含的異源非標(biāo)識核酸分子通過電泳分離，以形成分離的且由此可檢測的群體。通過對存在的單獨(dú)標(biāo)識分子群進(jìn)行篩選可以確定是否克隆的細(xì)胞如在腫瘤轉(zhuǎn)化性的疾病中所觀察到的那樣出現(xiàn)擴(kuò)增。
因此本發(fā)明的另一方面涉及檢測和/或定量生物樣品中的克隆細(xì)胞群的方法，所述的細(xì)胞以標(biāo)識核酸分子為特征，所述的標(biāo)識核酸分子在所述的細(xì)胞群中是電泳共遷移的，該方法包括將包含在所述樣品中的核酸分子電泳分離，以及檢測經(jīng)分離的核酸分子，其中所述的分離基于核酸的長度和序列。
應(yīng)當(dāng)理解術(shù)語“以……為特征”是指受試的細(xì)胞表現(xiàn)所定義的特征，但其并不作為所述細(xì)胞是否表現(xiàn)其它特性的限定。還應(yīng)當(dāng)理解的是，所述的特征不必僅是由受試細(xì)胞所表現(xiàn)的獨(dú)特特性，但在優(yōu)選的實施方案中所述的特性是將所感興趣的細(xì)胞與樣品中的那些不感興趣的細(xì)胞鑒別開來的一個特性。
“克隆”是指受試的細(xì)胞群是由共同的細(xì)胞來源衍生而來。例如腫瘤轉(zhuǎn)化性細(xì)胞群是由已經(jīng)歷轉(zhuǎn)化的單細(xì)胞衍生而來的。在此方面，經(jīng)過進(jìn)一步核重排或突變以產(chǎn)生遺傳上不同的腫瘤轉(zhuǎn)化性細(xì)胞群的腫瘤轉(zhuǎn)化性細(xì)胞也是“克隆”細(xì)胞群。在另一個實施例中，對急性或慢性感染或免疫刺激應(yīng)答中擴(kuò)增的T或B細(xì)胞也落入此處所定義的“克隆”細(xì)胞群。優(yōu)選地，所述的克隆細(xì)胞群是腫瘤轉(zhuǎn)化性細(xì)胞群，更優(yōu)選地是腫瘤轉(zhuǎn)化性淋巴細(xì)胞。
由此，本發(fā)明更具體地說提供一種檢測和/或定量生物樣品中的腫瘤轉(zhuǎn)化性淋巴細(xì)胞群的方法，所述的細(xì)胞以標(biāo)識核酸分子為特征，所述的標(biāo)識核酸分子在所述的細(xì)胞群中是電泳共遷移的，該方法包括將包含在所述樣品中的核酸分子電泳分離以及檢測經(jīng)分離的核酸分子，其中所述的分離是基于核酸的長度和序列的。
所述的“腫瘤轉(zhuǎn)化性”和“淋巴的”的含義應(yīng)當(dāng)理解為與上文中的定義一致。
所述的“標(biāo)識核酸分子”的含義也與上文中所定義的相同。在所述的范圍內(nèi)受試的腫瘤轉(zhuǎn)化性細(xì)胞是淋巴細(xì)胞。受試的標(biāo)識分子優(yōu)選地是經(jīng)重排的TCR或免疫球蛋白可變區(qū)核酸分子。
根據(jù)這一優(yōu)選的實施方案，提供了一種檢測和/或定量生物樣品中的腫瘤轉(zhuǎn)化性淋巴細(xì)胞群的方法，所述的腫瘤轉(zhuǎn)化性細(xì)胞以標(biāo)識核酸分子為特征，所述的標(biāo)識核酸分子在所述的細(xì)胞群中是電泳共遷移的，該方法包括將包含在所述樣品中的核酸分子電泳分離，以及檢測經(jīng)分離的核酸分子，其中所述的分離基于核酸的長度和序列，所述的腫瘤轉(zhuǎn)化性淋巴細(xì)胞中的重排TCR或免疫球蛋白可變區(qū)核酸分子共遷移。
所述的“生物樣品”應(yīng)理解為，如上文中所定義的來自哺乳動物的測試樣品。在這一范圍內(nèi)，所述的樣品包括細(xì)胞物質(zhì)，其可能需要經(jīng)過提取或者分離或暴露于包含在所述樣品中的核酸材料。如上文中所詳細(xì)描述的，在此范圍內(nèi)受試的標(biāo)識核酸分子是mRNA分子，其可能需要在開始時對所述測試樣品施用某種刺激信號以上調(diào)這一轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物的產(chǎn)量。也可能需要在檢測前擴(kuò)增標(biāo)識核酸分子群，其間可以利用特異性引物，或者若為了提供大量的起始核酸分子群，要總體上擴(kuò)增測試樣品中的核酸群也可以使用通用引物。
在不將本發(fā)明限定到任何理論或作用模式的前提下，標(biāo)識核酸分子，如重排的TCR或免疫球蛋白可變區(qū)基因表現(xiàn)為編碼獨(dú)特的TCR或免疫球蛋白可變區(qū)的獨(dú)特核苷酸序列。本發(fā)明人已經(jīng)確定當(dāng)將這樣的核酸分子的核酸樣品進(jìn)行基于單獨(dú)分子的長度及核酸序列的電泳分離時，所述的標(biāo)識分子共遷移到凝膠上共同的端點。最終獲得的核酸遷移模式可以在進(jìn)行電泳時或電泳后凝膠上通過下述的技術(shù)進(jìn)行觀察，所述的技術(shù)例如放射自顯影、熒光顯影或?qū)σ咽孪葥饺氲剿鰷y試樣品中的核酸分子中的某種分子(如熒光素標(biāo)記物、或抗原)進(jìn)行觀察。
由于構(gòu)成測試樣品的大量核酸群中的每一種都將遷移到特定的長度/序列電泳位置，而且由于可以相對或絕對地確定出現(xiàn)在任意位置的核酸材料，因此可以根據(jù)相對于非標(biāo)識核酸分子群的水平的高濃度受試標(biāo)識核酸分子群的存在，迅速且簡便地確定在被測試的生物樣品中是否存在某種腫瘤轉(zhuǎn)化性淋巴細(xì)胞群。
在這一方面，在“所述的細(xì)胞群中共遷移的”標(biāo)識核酸分子是指所述的受試標(biāo)識核酸分子，在此范圍內(nèi)，它們是由相同的克隆群衍生的細(xì)胞所衍生的，當(dāng)所述的電泳分離是基于長度(即總的堿基對數(shù))和序列(即受試核酸分子的實際核苷酸序列)參數(shù)時，它們遷移到相同的端點。在不將本發(fā)明限定到任何理論或作用模式的前提下，本發(fā)明是建立在下述的基礎(chǔ)上的即利用腫瘤轉(zhuǎn)化性細(xì)胞群的標(biāo)識核酸分子和非腫瘤轉(zhuǎn)化性異源細(xì)胞群之間存在的序列差異，電泳分離克隆的核酸分子群。
基于長度和序列的分子電泳分離可以用任何合適的技術(shù)進(jìn)行。在優(yōu)選的實施方案中，所述的技術(shù)是兩維變性梯度凝膠電泳，其中所述的檢測核酸分子群首先按長度分離，然后將所述分子跑尿素梯度凝膠。因為尿素與核酸分子的氫鍵之間的差別相互作用是序列依賴性的，則由此提供了一種基于核酸序列不同分離核酸分子的合適的方法。溫度也可用作變性劑?？梢允褂煤愣ǖ幕蛱荻茸冃詶l件。
因此，本發(fā)明更具體地提供了一種檢測和/或定量生物樣品中的腫瘤轉(zhuǎn)化性淋巴細(xì)胞群的方法，所述的腫瘤轉(zhuǎn)化性細(xì)胞以標(biāo)識核酸分子為特征，所述的標(biāo)識核酸分子在所述的細(xì)胞群中是電泳共遷移的，該方法包括將包含在所述生物樣品中的核酸分子電泳分離以及檢測經(jīng)分離的核酸分子，其中所述的分離是基于核酸的長度和序列的二維變性梯度凝膠電泳。
優(yōu)選地，所述的腫瘤性轉(zhuǎn)移細(xì)胞是惡性的。
在不對本發(fā)明做任何形式限定的前提下，本發(fā)明人已確定二維電泳提高了在非標(biāo)識核酸分子群中檢測標(biāo)識核酸分子的靈敏度達(dá)到10-100因子。
本發(fā)明的這一方面提供了一種簡便且靈敏的在哺乳動物中檢測克隆細(xì)胞群存在的方法。通過如相對于在其它端點位置的比較檢測的核酸分子濃度或相對于定量標(biāo)準(zhǔn)，已共遷移到特定端點的高核酸分子濃度所證實的，所述的方法特別適合于篩選大的克隆群。盡管本發(fā)明的方法可以用作診斷工具，其就檢測哺乳動物中腫瘤轉(zhuǎn)化性細(xì)胞群大小的調(diào)整而言，對監(jiān)視腫瘤轉(zhuǎn)化性疾病或監(jiān)視腫瘤轉(zhuǎn)化性細(xì)胞的克隆演化發(fā)生率特別有用。
在不對本發(fā)明作任何形式限定的前提下，由于在細(xì)胞的早期分化階段，初始種系基因重排時并非需要將所有未使用的可變區(qū)節(jié)段剪接掉，所以腫瘤轉(zhuǎn)化性淋巴細(xì)胞可進(jìn)行可變區(qū)基因的進(jìn)一步重排。例如，進(jìn)入緩解期已恢復(fù)了2到5年的白血病人時而表現(xiàn)出新的TCR或免疫球蛋白重排。這通常是由于診斷前或診斷后起始的腫瘤轉(zhuǎn)化性細(xì)胞的克隆演化。用本發(fā)明的方法，可以在不需要核酸序列信息的情況下以靈敏的方式鑒定克隆群，如新的克隆群。當(dāng)該方法用作監(jiān)視工具一段時間，可以追蹤細(xì)胞群大小和來源的變化。例如，對于特定的腫瘤轉(zhuǎn)化性疾病，在骨髓中腫瘤轉(zhuǎn)化性細(xì)胞的存在可能與不良的預(yù)后相關(guān)。在另一實施例中，其可作為在治療腫瘤轉(zhuǎn)化性疾病過程中有用的預(yù)測工具。具體地說，治療5周后，仍表現(xiàn)出高水平腫瘤轉(zhuǎn)化性細(xì)胞的病人一般比腫瘤轉(zhuǎn)化性細(xì)胞已降低到低水平的病人具有更為不良的預(yù)后。
本發(fā)明這一方面所述的方法可用作除本發(fā)明的第一方面所述的檢測方法之外的方法，或替代本發(fā)明第一方面所述的方法。在不對本發(fā)明做任何形式限定的前提下，本發(fā)明的第一方面可能較后者提供更為靈敏的結(jié)果，這是由于利用檢測標(biāo)記分子的參照分子檢測腫瘤轉(zhuǎn)化性細(xì)胞，因而不需要為了獲得陽性的結(jié)果而要求相對于其他正常的克隆細(xì)胞群存在更多數(shù)量的腫瘤轉(zhuǎn)化性細(xì)胞。盡管兩種方法均無需獲得相對于腫瘤轉(zhuǎn)化性細(xì)胞的標(biāo)識核酸分子的序列信息，本發(fā)明的后一方面甚至不需要參照分子。由此，這對于檢測的主題在于克隆演化且相應(yīng)于新克隆的參照核酸分子尚未獲得的情況特別有用。在這一方面，本發(fā)明的后一方面提供了一種有效的監(jiān)視和診斷工具。
在與此相關(guān)的一個方面，本發(fā)明提供了一種檢測和/或定量哺乳動物中的腫瘤轉(zhuǎn)化性細(xì)胞的方法，所述的腫瘤轉(zhuǎn)化性細(xì)胞以標(biāo)識核酸分子為特征，所述的標(biāo)識核酸分子在所述的細(xì)胞群中是電泳共遷移的，該方法包括將包含在由所述哺乳動物中獲得的樣品中的核酸分子電泳分離以及檢測經(jīng)分離的核酸分子，其中，所述的分離基于核酸的長度和序列。
優(yōu)選地，所述的腫瘤轉(zhuǎn)化性疾病是腫瘤轉(zhuǎn)化性細(xì)胞的克隆演化。最優(yōu)選，所述的檢測是診斷。
更優(yōu)選地是，所述的電泳分離是二維變性梯度凝膠電泳。
另一方面本發(fā)明提供一種檢測和/或定量生物樣品中的多重非腫瘤轉(zhuǎn)化性淋巴細(xì)胞群的方法，所述的非腫瘤轉(zhuǎn)化性細(xì)胞以標(biāo)識核酸分子為特征，所述的標(biāo)識核酸分子在所述的細(xì)胞群中是電泳共遷移的，該方法包括將包含在所述樣品中的核酸分子電泳分離，以及檢測經(jīng)分離的核酸分子，其中，所述的分離基于核酸的長度和序列。
優(yōu)選地是，所述的電泳分離是二維變性梯度凝膠電泳。
本發(fā)明的進(jìn)一步的特征由下述非限定性的實施例做更為全面地描述。
實施例3這是基于利用白血病的和異源正常重排之間的序列差異的原理。序列差異可以通過變性梯度凝膠電泳檢測。在所述被測物中的白血病和正?；蛑嘏趴梢杂脦в蠫C夾子的引物通過聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)擴(kuò)增，然后用二維梯度凝膠電泳分離。靶重排和任何參照重排在二維凝膠上可以遷移到更特異的點上。為具有靈敏性，將凝膠上的DNA轉(zhuǎn)移到膜上然后通過放射性或化學(xué)方法檢測。
盡管二維變性梯度凝膠電泳不是一個新方法，并且一維DGGE已用于檢測克隆淋巴細(xì)胞重排，使用二維變性梯度凝膠電泳檢測惡性淋巴克隆，就其結(jié)果而言是一種新的用途。但是，在某種情況下，檢測PCR產(chǎn)物的簡單方法的靈敏性常常不夠。如果是這樣，則需要更靈敏的方法，如用標(biāo)記探針探測或應(yīng)用帶有靈敏的二級檢測的標(biāo)記引物。定量可以通過使用參照單克隆DNA實現(xiàn)。當(dāng)這一方法用于研究來自實施例1和/或2的材料，所述的PCR應(yīng)使用帶有GC夾子的引物而非上述實施例2中所提及的引物。
所述的驅(qū)動分子是診斷中獲得的白血病DNA。通過摻入尿嘧啶進(jìn)行修飾，由此可去除任何痕量的驅(qū)動分子以實現(xiàn)該方法。
2.使驅(qū)動分子和標(biāo)識分子變性、退火以形成異源雙鏈或同源雙鏈。
所述的驅(qū)動分子是過量的，以便于所有的標(biāo)識分子鏈與驅(qū)動分子鏈形成雙鏈。因此可能存在一些過量的單鏈驅(qū)動分子。
3.用S1核酸酶處理添加S1酶和10×S1緩沖液，溫育。
所述的S1核酸酶消化其中有大量錯配的異源雙鏈。這也去除過量的單鏈驅(qū)動分子。
4.結(jié)合樣品以制備結(jié)合或洗滌緩沖液(B & W)中的鏈霉抗生物素蛋白包被的小珠，在旋轉(zhuǎn)振蕩器上溫育，用B&W洗3次和H2O洗1次。
所述的標(biāo)識用生物素標(biāo)記的引物制備。因此，由標(biāo)識分子構(gòu)成其中一條鏈的異源和同源的雙鏈由于可與鏈霉抗生物素蛋白結(jié)合而結(jié)合到固相。
5.用T4內(nèi)切核酸酶處理加入T4酶，T4磷酸緩沖液，溫育，用B&W洗3次和H2O洗1次。這個酶消化異源雙鏈。
6.用Cel I核酸內(nèi)切酶處理加入Cel I酶，10×H緩沖液，Klenow和H2O，溫育，用B&W洗3次和H2O洗1次，和H2O在較高的溫度下洗3次。
這個酶消化異源雙鏈。
7.用S1核酸酶處理加入S1酶，10×S1緩沖液和H2O。溫育，用B&W洗3次和H2O洗1次。
這個酶消化異源雙鏈。
8.用λ外切核酸酶處理加入λ外切核酸酶，10×λ緩沖液和H2O，溫育，用B&W洗3次和H2O洗1次。
所述的外切核酸酶消化任何剩余的驅(qū)動分子。
9.用氫氧化鈉洗1次，B&W洗3次和水在較高的溫度下洗3次。
這一步驟的目的是去除與小珠結(jié)合的任何雙鏈的第二鏈。
10.用尿嘧啶DNA糖基化酶(UNG)處理加入UNG酶，UNG緩沖液和H2O，溫育。
用UNG處理的目的是消化任何摻入到尿嘧啶中的頑固的驅(qū)動分子。
11.對鏈霉抗生物素蛋白包被的小珠級分進(jìn)行PCR，將PCR產(chǎn)物跑丙烯酰胺凝膠。
在最后的階段，通過所述的方法應(yīng)獲得由于與驅(qū)動分子很好地匹配而在整個過程中存留下來的標(biāo)識DNA單鏈，也就是說，它們具有上述的白血病序列。
定量可以利用具有其自身的參照驅(qū)動的參照DNA分子進(jìn)行相同的過程。在上述程序的開始，將不同量的參照分子與標(biāo)識分子相混合，然后進(jìn)行上述程序。在上述程序的最后所進(jìn)行的PCR利用熒光標(biāo)記引物，白血病標(biāo)識分子和參照分子的相對量通過DNA片段分析定量而確定。
本領(lǐng)域的技術(shù)人員可以對本發(fā)明進(jìn)行改變和修飾，而非僅僅局限于此處對本發(fā)明的特定描述。應(yīng)當(dāng)理解為本發(fā)明包括了所有這些改變和修飾。本發(fā)明還包括在上述說明書中所單獨(dú)或共同參考或引用的所有步驟，特征，組分和化合物，以及上述兩種或更多步驟或特征的任意或全部結(jié)合。
表1現(xiàn)有的檢測和定量細(xì)胞群中腫瘤轉(zhuǎn)化性淋巴細(xì)胞的方法

權(quán)利要求
1.一種在哺乳動物中監(jiān)視淋巴腫瘤性轉(zhuǎn)化疾病的方法，所述的方法包括將來自所述哺乳動物樣品中所包含的核酸分子和與標(biāo)識核酸分子或其類似物互補(bǔ)的參照核酸分子、或其衍生物或類似物在足以使所述參照分子與所述標(biāo)識分子相互作用的條件下接觸一段時間，所述的標(biāo)識分子具有腫瘤性轉(zhuǎn)化細(xì)胞的特性，通過減少未雜交核酸分子和雜交錯配核酸分子的濃度富集所述的標(biāo)識分子，定性和/或定量地檢測所富集的標(biāo)識核酸分子。
2.如權(quán)利要求1所述的方法，其中，所述的參照核酸分子是驅(qū)動核酸分子。
3.如權(quán)利要求1或2所述的方法，其中，通過減少未雜交核酸分子和雜交錯配核酸分子的濃度富集所述的標(biāo)識分子的步驟進(jìn)一步包括降低參照核酸分子濃度的步驟。
4.如權(quán)利要求3所述的方法，其中，富集步驟是通過下述步驟進(jìn)行的去除未與經(jīng)標(biāo)記的驅(qū)動核酸分子雜交的非標(biāo)識核酸分子，酶法切除任何錯配雜交核酸分子，和去除驅(qū)動分子。
5.如權(quán)利要求3所述的方法，其中，富集步驟是通過下述步驟進(jìn)行的基于下述雙鏈通過凝膠或大小排阻或親和或其它基質(zhì)時的不同遷移率，從雜交和錯配的異源雙鏈中分離參照標(biāo)識同源雙鏈。
6.如權(quán)利要求5所述的方法，其中，所述的基質(zhì)包含在柱或毛細(xì)管中。
7.如權(quán)利要求4所述的方法，其中，所述的驅(qū)動分子是通過使用UNG去除的。
8.如權(quán)利要求1-7中任意一項中所述的方法，其中，所述的標(biāo)識是經(jīng)重排的TCR或免疫球蛋白可變區(qū)核酸分子或其衍生物或類似物。
9.如權(quán)利要求8所述的方法，其中，所述的可變區(qū)核酸分子是經(jīng)重排的可變區(qū)基因節(jié)段的基因組形式。
10.如權(quán)利要求9所述的方法，其中，所述的淋巴腫瘤性轉(zhuǎn)化疾病是淋巴惡性疾病。
11.如權(quán)利要求10所述的方法，其中，所述的監(jiān)視是對最低限殘留疾病狀況的監(jiān)視。
12.一種檢測和/或定量生物樣品中的克隆細(xì)胞群的方法，所述的細(xì)胞以標(biāo)識核酸分子為特征，所述的標(biāo)識核酸分子在所述的細(xì)胞群中是電泳共遷移的，該方法包括將包含在所述樣品中的核酸分子電泳分離、以及檢測經(jīng)分離的核酸分子，其中所述的分離基于核酸的長度和序列。
13.如權(quán)利要求12所述的方法，其中，所述的克隆細(xì)胞群是腫瘤轉(zhuǎn)化性細(xì)胞群。
14.如權(quán)利要求13所述的方法，其中，所述的腫瘤轉(zhuǎn)化性細(xì)胞是惡性的。
15.如權(quán)利要求13或14所述的方法，其中，所述的腫瘤轉(zhuǎn)化性細(xì)胞是腫瘤轉(zhuǎn)化性淋巴細(xì)胞。
16.如權(quán)利要求15所述的方法，其中，所述的標(biāo)識是經(jīng)重排的TCR或免疫球蛋白可變區(qū)核酸分子或其衍生物或類似物。
17.如權(quán)利要求16所述的方法，其中，所述的可變區(qū)核酸分子是經(jīng)重排的可變區(qū)基因節(jié)段的基因組形式。
18.如權(quán)利要求12-17中的任意一項中所述的方法，其中，所述的分離是二維變性梯度凝膠電泳。
19.如權(quán)利要求12-18中的任意一項中所述的方法，其中，所述的腫瘤轉(zhuǎn)化性疾病是腫瘤轉(zhuǎn)化性細(xì)胞的克隆演化。
20.一種檢測和/或定量生物樣品中的多重非腫瘤轉(zhuǎn)化性淋巴細(xì)胞的方法，所述的非腫瘤轉(zhuǎn)化性細(xì)胞以標(biāo)識核酸分子為特征，所述的標(biāo)識核酸分子在所述的細(xì)胞群中是電泳共遷移的，該方法包括將包含在所述樣品中的核酸分子電泳分離以及檢測經(jīng)分離的核酸分子，其中，所述的分離基于核酸的長度和序列。
21.如權(quán)利要求20中所述的方法，其中，所述的分離是二維變性梯度凝膠電泳。
22.如權(quán)利要求1-21中的任意一項中所述的方法，其基本上如上所述并參考附圖和/或?qū)嵤├?br> 全文摘要
本發(fā)明涉及在哺乳動物中定性和/或定量地監(jiān)視淋巴腫瘤轉(zhuǎn)化性進(jìn)程的方法，具體地說，是用分子篩選技術(shù)監(jiān)視淋巴腫瘤轉(zhuǎn)化性進(jìn)程的方法。本發(fā)明的方法適合于在一定的領(lǐng)域中應(yīng)用，其包括但不限于監(jiān)視腫瘤轉(zhuǎn)化性淋巴疾病病情的發(fā)展，監(jiān)視恢復(fù)過程中腫瘤轉(zhuǎn)化性淋巴細(xì)胞的水平，預(yù)測受試者由恢復(fù)狀態(tài)復(fù)發(fā)到疾病狀態(tài)的可能性，或估計現(xiàn)有的治療藥物和/或新的治療試劑的有效性。與此相關(guān)，本發(fā)明還提供在哺乳動物中定性和/或定量檢測克隆淋巴細(xì)胞群的方法，更具體地說，是在具有下述情況的受試者中檢測多克隆淋巴細(xì)胞群，即受試者中腫瘤轉(zhuǎn)化性淋巴細(xì)胞已進(jìn)行體細(xì)胞基因重排由此形成新的遺傳上不同的克隆群，或所述受試者中一個或多個克隆群對一種免疫應(yīng)答起作用。
文檔編號G01N30/88GK1434875SQ01810299
公開日2003年8月6日 申請日期2001年4月12日 優(yōu)先權(quán)日2000年4月13日
發(fā)明者A·A·莫利, P·J·賽克斯, M·J·布里斯科 申請人:莫諾昆特股份有限公司