專利名稱：以線粒體dna損傷作為冠狀動(dòng)脈粥樣硬化性心臟病的預(yù)報(bào)的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明主要涉及生理學(xué)和分子生物學(xué)。更具體地說，本發(fā)明涉及DNA損傷及其對(duì)于動(dòng)脈粥樣硬化的影響。
相關(guān)技術(shù)據(jù)信，反應(yīng)性氧物質(zhì)在動(dòng)脈粥樣硬化損傷的發(fā)病機(jī)理中起著重要作用(1-6)，但對(duì)于其內(nèi)在機(jī)制尚不清楚。例如，反應(yīng)性氧物質(zhì)介導(dǎo)的機(jī)制可能是LDL氧化(ox-LDL)的一個(gè)重要因素，是動(dòng)脈粥樣硬化形成的一個(gè)關(guān)鍵情節(jié)(3，7，8)。研究表明，超氧化物(O2-)和過氧亞硝酸鹽(由O2-與一氧化氮形成)能夠氧化LDL(9-11)。因此，據(jù)信，與一氧化氮和/或O2-相關(guān)的反應(yīng)在動(dòng)脈粥樣硬化損傷和血管功能損傷(即內(nèi)皮細(xì)胞機(jī)能失調(diào))的發(fā)病機(jī)理中起著重要作用，但對(duì)它們的氧化產(chǎn)物(H2O2，過氧亞硝酸鹽)的作用尚不完全清楚。
線粒體是細(xì)胞內(nèi)反應(yīng)性氧物質(zhì)(O2-)的主要來源之一，這些反應(yīng)性氧物質(zhì)形成于電子轉(zhuǎn)運(yùn)過程中(12-16)。這些反應(yīng)性氧物質(zhì)會(huì)優(yōu)先損傷線粒體膜和蛋白質(zhì)(17-19)，影響重要的細(xì)胞功能，包括線粒體的呼吸，這一功能的改變會(huì)導(dǎo)致反應(yīng)性氧物質(zhì)產(chǎn)生增加(20-22)，引起脂類過氧化(23，24)和DNA損傷(25，26)。由于線粒體的氧化磷酸化能力因線粒體DNA(mtDNA)損傷而降低，突變隨年齡累積(6，27-29)，所以，線粒體損傷和反應(yīng)性氧物質(zhì)的產(chǎn)生可能成為衰老相關(guān)性退行性疾病，例如冠狀動(dòng)脈疾病(CAD)的催化劑。據(jù)假設(shè)，內(nèi)皮細(xì)胞和平滑肌細(xì)胞內(nèi)產(chǎn)生的自由基引起這些細(xì)胞內(nèi)的線粒體損傷，形成一個(gè)反應(yīng)性氧物質(zhì)進(jìn)一步產(chǎn)生和線粒體損傷的惡性循環(huán)，導(dǎo)致血管細(xì)胞機(jī)能失調(diào)。
在西方，冠狀動(dòng)脈粥樣硬化心臟病是導(dǎo)致死亡的主要原因。雖然對(duì)于導(dǎo)致冠狀動(dòng)脈粥樣硬化心臟病原因的確切順序存在著相當(dāng)?shù)臓幷?，但越來越多的證據(jù)表明，動(dòng)脈粥樣硬化損傷是由反應(yīng)性氧物質(zhì)介導(dǎo)的因素引起的。巨噬細(xì)胞通過“清除者”受體識(shí)別并內(nèi)化ox-LDL形成泡沫細(xì)胞。這些泡沫細(xì)胞的積累關(guān)系到血管生理的長期變化，包括平滑肌細(xì)胞遷移和增殖，細(xì)胞外基質(zhì)蛋白的合成和進(jìn)一步的內(nèi)皮細(xì)胞機(jī)能失調(diào)，這些都是動(dòng)脈粥樣硬化損傷的主要構(gòu)成因素。同樣，冠狀動(dòng)脈粥樣硬化心臟病的許多危發(fā)因素都與反應(yīng)性氧物質(zhì)產(chǎn)生的增加相關(guān)(即，吸煙和高血膽固醇)。在動(dòng)脈內(nèi)，反應(yīng)性氧物質(zhì)可由代謝過程(線粒體的氧化磷酸化)產(chǎn)生，細(xì)胞因子或生長因子活化，巨噬細(xì)胞或嗜中性白細(xì)胞刺激(炎性反應(yīng))，和一氧化氮與超氧化物產(chǎn)生過氧亞硝酸鹽的反應(yīng)，這些都繼而產(chǎn)生單態(tài)氧和羥基自由基。因此，雖然有許多過程對(duì)于動(dòng)脈粥樣硬化很重要，但反應(yīng)性氧物質(zhì)介導(dǎo)的機(jī)制及其作用屬于最重要的。
大量研究顯示，線粒體很容易受反應(yīng)性氧物質(zhì)的作用。線粒體DNA與內(nèi)膜基質(zhì)側(cè)的結(jié)合使得它易受膜干擾的影響，并使它成為膜內(nèi)產(chǎn)生的親電體的潛在目標(biāo)。除了它與內(nèi)膜和OXPHOS的密切結(jié)合之外，造成線粒體DNA易于損傷的其他因素是缺乏保護(hù)性組蛋白和非組蛋白，及其有限的DNA修復(fù)能力。此前的研究表明，線粒體易受反應(yīng)性氧物質(zhì)介導(dǎo)的損傷，表現(xiàn)為廣泛的脂類過氧化和線粒體DNA損傷。具體地說，已有報(bào)道，以反應(yīng)性氧物質(zhì)處理內(nèi)皮細(xì)胞優(yōu)先造成線粒體DNA損傷，降低線粒體DNA轉(zhuǎn)錄，以及線粒體XOPHOS機(jī)能失調(diào)。
現(xiàn)有技術(shù)缺乏測(cè)定造成動(dòng)脈粥樣硬化的氧化應(yīng)力的方法。本發(fā)明滿足了本領(lǐng)域內(nèi)長期以來的這一需求。
發(fā)明概述本發(fā)明證明，在體外，反應(yīng)性氧物質(zhì)介導(dǎo)人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞(HUVEC)和人主動(dòng)脈平滑肌細(xì)胞(HASMC)內(nèi)的線粒體損傷和機(jī)能失調(diào)。本發(fā)明測(cè)定了以H2O2、過氧亞硝酸鹽和O2-處理的細(xì)胞內(nèi)的DNA損傷，基因表達(dá)和線粒體蛋白質(zhì)合成。兩種細(xì)胞內(nèi)的線粒體DNA都比核DNA更容易受微量反應(yīng)性氧物質(zhì)的影響，并與線粒體所編碼多肽的OXPHOS轉(zhuǎn)錄(ND2和細(xì)胞色素b)減少(40-60％)相關(guān)。氧化亞硝酸鹽處理抑制線粒體蛋白質(zhì)的合成，反應(yīng)性氧物質(zhì)處理的細(xì)胞其ATP水平和線粒體呼吸(復(fù)合物II)也顯著降低，這與反應(yīng)性氧物質(zhì)損害線粒體功能的觀點(diǎn)一致。本發(fā)明揭示了，在體外，氧化性線粒體DNA損傷，基因表達(dá)改變和線粒體機(jī)能失調(diào)之間的關(guān)聯(lián)，由此證明，氧化性細(xì)胞損傷和線粒體損傷在血管機(jī)能失調(diào)和動(dòng)脈粥樣硬化中起著重要作用。
因?yàn)榫€粒體更容易發(fā)生反應(yīng)性氧物質(zhì)介導(dǎo)的損傷，而且，氧化應(yīng)力的升高被認(rèn)為在動(dòng)脈粥樣硬化的早期起著重要作用，本發(fā)明證明，在最終發(fā)生動(dòng)脈粥樣硬化的主動(dòng)脈組織內(nèi)的線粒體DNA損傷增加。為此，將動(dòng)脈粥樣硬化研究用的高血膽固醇小鼠模型(無載脂蛋白E的小鼠)主動(dòng)脈組織內(nèi)恒定的線粒體DNA損傷水平與健康的同齡對(duì)照小鼠相比較。DNA損傷評(píng)估發(fā)現(xiàn)，apoE小鼠主動(dòng)脈組織的線粒體DNA損傷在形成病理學(xué)上可測(cè)的損傷之前和之后都顯著增加(與健康對(duì)照相比)。此外，所有小鼠的線粒體DNA損傷都隨年齡增加，但只有apoE小鼠具有與年齡相關(guān)的損傷水平的顯著增加(p＜0.05)。相反，只在10周齡的c57B1小鼠內(nèi)，飲食才與線粒體DNA損傷相關(guān)，表現(xiàn)為西式飲食與損傷增加相關(guān)。最后還發(fā)現(xiàn)，食物蛋白質(zhì)的減少與apoE和對(duì)照小鼠主動(dòng)脈內(nèi)線粒體DNA損傷減少都顯著相關(guān)(p＜0.05)。沒有發(fā)現(xiàn)明顯的與β球蛋白基因座(核DNA損傷的標(biāo)記)相關(guān)的損傷模式。對(duì)各動(dòng)物組的組織化學(xué)分析顯示，只在飼以中式飲食(4％脂肪)和西式飲食(21％脂肪)的衰老apoE小鼠中存在動(dòng)脈粥樣硬化損傷。如同預(yù)計(jì)的，與同齡c56B1對(duì)照相比，apoE小鼠的脂類過氧化物和膽固醇水平顯著升高(＜0.05)。然而，與飼以中式飲食的相比，飼以脂肪含量更高的西式飲食的apoE小鼠的脂類過氧化物水平并沒有顯著升高。所以，以上信息提示1)在動(dòng)脈粥樣硬化小鼠活體模型中，線粒體DNA損傷先于或與動(dòng)脈粥樣硬化損傷形成同時(shí)發(fā)生；2)在體內(nèi)，主動(dòng)脈線粒體DNA損傷隨年齡增加；3)與飲食相比，apoE基因型對(duì)于線粒體DNA損傷水平影響更大；以及4)飲食對(duì)于線粒體DNA損傷的影響在年幼的c57B1小鼠中似乎最顯著。因此，線粒體發(fā)生于動(dòng)脈粥樣硬化的早期，可能是動(dòng)脈粥樣硬化形成的引發(fā)事件。
本發(fā)明目的之一是提供預(yù)報(bào)冠狀動(dòng)脈粥樣硬化性心臟病以及其他氧化應(yīng)力所致疾病的方法，該方法以線粒體DNA損傷程度為基礎(chǔ)，或以相關(guān)的線粒體DNA損傷引起的線粒體機(jī)能失調(diào)有關(guān)測(cè)定(線粒體蛋白質(zhì)合成改變，線粒體氧化磷酸化改變或線粒體ATP產(chǎn)生改變等)為基礎(chǔ)。
本發(fā)明實(shí)施例之一中，提供了預(yù)報(bào)危發(fā)個(gè)體動(dòng)脈粥樣硬化的方法，其步驟包括(a)采集個(gè)體的有意義組織；(b)測(cè)定所述有意義組織中的線粒體DNA損傷量(mtDNA)；和(c)將所述危發(fā)個(gè)體有意義組織內(nèi)的線粒體DNA損傷量與無動(dòng)脈粥樣硬化對(duì)照個(gè)體的有意義組織內(nèi)的線粒體DNA損傷量比較，危發(fā)個(gè)體線粒體DNA損傷量高于所述對(duì)照個(gè)體表明該個(gè)體患有動(dòng)脈粥樣硬化危發(fā)性。
本發(fā)明另一實(shí)施例中，提供了一種測(cè)定個(gè)體內(nèi)氧化應(yīng)力的方法，包括(a)采集所述個(gè)體的有意義組織；(b)測(cè)定所述有意義組織內(nèi)的線粒體DNA損傷(mtDNA)；(c)測(cè)定所述有意義組織內(nèi)一核基因中的DNA損傷；和(d)比較線粒體DNA和核基因DNA之間單位長度上的DNA損傷量，線粒體DNA單位長度上的DNA損傷量高于核DNA表明所述個(gè)體內(nèi)氧化應(yīng)力升高。
本發(fā)明的再一實(shí)施例中，提供的方法測(cè)定降低個(gè)體發(fā)生冠狀動(dòng)脈疾病危險(xiǎn)性的處理方法的效果，其步驟包括(a)采集處理前所述個(gè)體的外周血白細(xì)胞；(b)采集個(gè)體經(jīng)處理后的有意義組織；和(c)測(cè)定處理前和處理后所采集有意義組織內(nèi)的線粒體DNA損傷(mtDNA)，處理后線粒體DNA損傷減少表明該處理可降低發(fā)生冠狀動(dòng)脈疾病的危險(xiǎn)性。
通過以下描述和優(yōu)選實(shí)施例，本發(fā)明的其他內(nèi)容，特征和優(yōu)點(diǎn)將展現(xiàn)得更為清楚。這些實(shí)施例僅用來說明。
附圖簡述參照本發(fā)明的實(shí)施例及其附圖可達(dá)到或更具體地理解以上概述的發(fā)明特征和優(yōu)點(diǎn)，并發(fā)現(xiàn)其他內(nèi)容。這些附圖屬于說明書的一部分。需要指出的是，附圖僅說明本發(fā)明的優(yōu)選實(shí)施方式，而不限定本發(fā)明的范圍。


圖1A顯示HUVEC細(xì)胞內(nèi)與過氧化氫處理相關(guān)的DNA損傷。細(xì)胞用0.2mM的H2O2處理60分鐘，收獲，進(jìn)行QPCR。對(duì)照僅用無血清培養(yǎng)基培養(yǎng)。產(chǎn)物減少表明模板損傷增加。
圖1B顯示對(duì)以H2O2處理的HASMC和HUVEC細(xì)胞的時(shí)間過程分析。細(xì)胞用0.2mM的H2O2處理0-60分鐘，抽提基因組DNA，通過與未處理對(duì)照(0級(jí))的比較，估算每10kb的損傷量。每次實(shí)驗(yàn)每個(gè)樣品至少進(jìn)行2次PCR。星號(hào)(*)表示，與未處理的對(duì)照相比，損傷顯著增加(p＜0.05)。標(biāo)記代表平均值(±SEM)。
圖2A顯示HUVEC和HASMC細(xì)胞內(nèi)與過氧亞硝酸鹽處理相關(guān)的DNA損傷。細(xì)胞用所示劑量的過氧亞硝酸鹽處理60分鐘，收獲，進(jìn)行QPCR。對(duì)照僅用無血清培養(yǎng)基培養(yǎng)。產(chǎn)物減少表明模板損傷增加。圖2B顯示用1mM SIN-1處理HUVEC和HASMC。SIN-1產(chǎn)生等摩爾量的一氧化氮和O2-。SOD/SIN-1樣品先用3單位/ml SOD處理，然后用SIN-1處理。產(chǎn)物減少表明模板損傷增加。
圖3顯示過氧亞硝酸鹽處理的細(xì)胞內(nèi)的線粒體DNA轉(zhuǎn)錄水平。柱形圖表示16S，rRNA，ND2和Cytb經(jīng)60分鐘處理(0.1mM和0.5mM，無血清培養(yǎng)基)后與未處理對(duì)照(無血清培養(yǎng)基)相比的相對(duì)轉(zhuǎn)錄水平。轉(zhuǎn)錄水平通過Northern分析法并與適當(dāng)?shù)姆派湫詷?biāo)記探針雜交來測(cè)定。星號(hào)(*)表示轉(zhuǎn)錄水平與未處理的對(duì)照顯著不同(p＜0.05)。
圖4顯示線粒體合成的蛋白質(zhì)內(nèi)35S-甲硫氨酸的摻入。圖4A顯示HASMC(左圖)內(nèi)過氧亞硝酸鹽處理后的蛋白質(zhì)標(biāo)記。細(xì)胞用0.1和0.5mM過氧亞硝酸鹽處理60分鐘，然后用35S-甲硫氨酸標(biāo)記約2小時(shí)，然后進(jìn)行SDS-PAGE電泳。右圖是用考馬斯亮藍(lán)染色的同一凝膠。圖4B匯總了反應(yīng)性氧物質(zhì)處理的HUVEC和HASMC內(nèi)與對(duì)照相比的35S-甲硫氨酸摻入百分比(對(duì)照以無血清培養(yǎng)基模擬處理)。縮寫ND-數(shù)據(jù)無。
圖5是表現(xiàn)線粒體呼吸(通過MTT還原分析)和總細(xì)胞ATP的柱形圖。HUVEC和HASMC與相應(yīng)濃度的過氧亞硝酸鹽37℃接觸1小時(shí)。圖5A柱形圖顯示MTT還原水平。接觸后，用PBS洗滌細(xì)胞，用含2.0μg/ml MTT的條件培養(yǎng)基培養(yǎng)1小時(shí)。然后，去除培養(yǎng)基，裂解細(xì)胞，在570nm測(cè)定吸光度。將與未處理對(duì)照內(nèi)測(cè)得還原相比的分?jǐn)?shù)記錄為MTT還原率(培養(yǎng)基±SEM)。圖5B顯示過氧亞硝酸鹽處理的HUVEC和HASMC內(nèi)的總ATP測(cè)定值。處理后，細(xì)胞用ATP釋放劑(Labsystems)處理，熒光法測(cè)定ATP水平(Molecular Probe)。表示為相比未處理細(xì)胞的百分比(100％)。
圖6顯示與年齡相當(dāng)小鼠相比，主動(dòng)脈和心臟組織內(nèi)線粒體DNA損傷顯著增加的apoE小鼠。圖6A顯示QPCR評(píng)估的apoE小鼠和對(duì)照小鼠主動(dòng)脈內(nèi)的線粒體DNA損傷，并測(cè)定了與10周齡對(duì)照組相比的相對(duì)擴(kuò)增。擴(kuò)增產(chǎn)物少對(duì)應(yīng)于線粒體DNA損傷增加。星號(hào)(*)表示對(duì)照與apoE主動(dòng)脈之間差異顯著。圖6B顯示apoE和對(duì)照小鼠左心室內(nèi)QPCR評(píng)估的線粒體DNA損傷，并測(cè)定了與10周齡對(duì)照組相比的相對(duì)擴(kuò)增。擴(kuò)增產(chǎn)物少對(duì)應(yīng)于線粒體DNA損傷增加。星號(hào)(*)表示對(duì)照與apoE主動(dòng)脈之間差異顯著。
圖7顯示食物蛋白質(zhì)攝入減少與對(duì)照和apoE小鼠內(nèi)線粒體DNA損傷減少的關(guān)聯(lián)。從第6周起，給對(duì)照和apoE小鼠飼以含16％或24％蛋白質(zhì)的食物，持續(xù)4周，用QPCR評(píng)估線粒體DNA損傷。圖7A表明，與24％蛋白質(zhì)飼養(yǎng)的對(duì)照組相比，對(duì)照和apoE主動(dòng)脈線粒體DNA的相對(duì)擴(kuò)增。擴(kuò)增產(chǎn)物少說明線粒體DNA損傷增加。星號(hào)表示飼以24％和16％蛋白質(zhì)的小鼠之間存在顯著區(qū)別。括弧內(nèi)是Studentt測(cè)驗(yàn)的P值。圖7B顯示與飼以24％蛋白質(zhì)的對(duì)照組相比，對(duì)照和apoE左心室線粒體DNA的相對(duì)擴(kuò)增。擴(kuò)增產(chǎn)物少說明線粒體DNA損傷增加。星號(hào)表示飼以24％和16％蛋白質(zhì)的小鼠之間存在顯著區(qū)別。括弧內(nèi)是Studentt測(cè)驗(yàn)的P值。
圖8顯示，與對(duì)照相比，3周齡apoE小鼠內(nèi)mtDNA損傷增加。16.0kb和0.08kb的產(chǎn)物分別代表長和短mtDNA QPCR產(chǎn)物。下方的表列出了3周齡對(duì)照(0級(jí)，A0)和apeE-/-主動(dòng)脈內(nèi)的相對(duì)損傷頻率(損傷量/10kb)。所示的是平均值和SEM。
圖9顯示，與對(duì)照相比，apoE內(nèi)的脂類過氧化顯著增強(qiáng)，但飼以西式飲食(21％脂肪)的對(duì)照小鼠內(nèi)的脂類過氧化也顯著增強(qiáng)。柱形圖顯示apoE小鼠和飼以中式飲食(4％脂肪)或西式飲食(21％脂肪)的對(duì)照小鼠的脂類過氧化水平。數(shù)值以相比中式飲食對(duì)照小鼠的相對(duì)值表示。雖然，apoE的脂類過氧化水平顯著高于任一種飲食的對(duì)照小鼠，但在飼以中式飲食或西式飲食的apoE小鼠之間，該水平卻沒有顯著差異。相反，飼以西式飲食的對(duì)照小鼠的脂類過氧化水平顯著高于(以“*”表示)飼以中式飲食的對(duì)照小鼠。
圖10A，10B和10C顯示apoE-/-，SOD2-/+雜交小鼠的動(dòng)脈粥樣硬化損傷和mtDNA損傷增加。圖10A中，將apoE-/-，SOD2-/+和同窩的apoE-/-小鼠的整個(gè)主動(dòng)脈用油-紅-O染色。左上圖顯示一只17周apoE-/-，SOD2-/+雄性小鼠(4％脂肪飲食)主動(dòng)脈的油-紅-O染色，右上圖顯示與之同窩的apoE-/-雄性小鼠(4％脂肪飲食)的結(jié)果。左下和右下圖分別顯示34周apoE-/-，SOD2-/+小鼠和同窩的apoE-/-雄性小鼠的主動(dòng)脈染色結(jié)果。黑色箭頭表示在apoE-/-，SOD2-/+和apoE-/-中存在著大的動(dòng)脈粥樣硬化損傷(同窩的17周apoE-/-中還沒有)，紅色箭頭指示一個(gè)形成于動(dòng)脈支內(nèi)的一個(gè)較小損傷的例子，這在apoE-/-，SOD2-/+小鼠中更常見，更具有特征性。圖10B柱形圖顯示利用油-紅-O染色觀察的apoE-/-，SOD2-/+和apoE-/-小鼠整個(gè)主動(dòng)脈內(nèi)的動(dòng)脈粥樣硬化頻率(n＝4)。圖10C顯示apoE-/-，SOD2-/+和apoE-/-同窩小鼠之間的相對(duì)主動(dòng)脈mtDNA損傷(n＝12)。在上述實(shí)驗(yàn)中，同窩的apoE-/-作為對(duì)照，將其損傷頻率定為“0級(jí)”(A0)。損傷頻率以平均值和SEM表示。
圖11顯示，在具有心肌梗塞危發(fā)因素的患者中，線粒體DNA損傷的發(fā)生率升高。在心臟插管時(shí)采取血樣，用QPCR測(cè)定線粒體DNA損傷。該圖中，線粒體損傷值高于“正常”人群的平均值視為升高。該柱形圖顯示各類患者中線粒體DNA損傷增加的百分比。在高血壓、吸煙、糖尿病和具有多種以上心肌梗塞危發(fā)因素的患者中，線粒體DNA損傷幾率升高。
圖12顯示20英里“訓(xùn)練跑”之前和之后的線粒體DNA損傷。采取血樣，獲得白細(xì)胞層，用QPCR測(cè)定線粒體DNA損傷。雖然剛跑烷后存在線粒體DNA損傷，但很快恢復(fù)到對(duì)照值。
圖13顯示，超長馬拉松者在進(jìn)食高脂肪飲食后的線粒體DNA損傷顯著少于對(duì)照。在所有例子中，都在剛進(jìn)食前，進(jìn)食后，和進(jìn)食后4-6小時(shí)評(píng)估線粒體DNA損傷。對(duì)照的線粒體DNA損傷反映脂肪和膽固醇形式食物攝入ROS的即時(shí)影響。馬拉松者中觀察到的相對(duì)“保護(hù)作用”可能與這些個(gè)體的抗氧化防御機(jī)制增強(qiáng)有關(guān)。
圖14顯示，超長馬拉松者在進(jìn)食高脂肪食物后的蛋白質(zhì)損傷顯著少于對(duì)照。
圖15A和15B顯示人正常的和動(dòng)脈粥樣硬化主動(dòng)脈的QPCR。圖15A顯示同齡“正?！焙蛣?dòng)脈粥樣硬化主動(dòng)脈的QPCR結(jié)果比較。16.2kb(上行)和0.22kb(下行)分別代表長和短人QPCR擴(kuò)增產(chǎn)物。人mtDNA的QPCR評(píng)估方法是現(xiàn)有技術(shù)(參見Ballinger，1996，1999；Yakes，1997)。圖15B顯示人的健康和動(dòng)脈粥樣硬化主動(dòng)脈的mtDNA損傷/10kb評(píng)估。動(dòng)脈粥樣硬化主動(dòng)脈的平均損傷頻率(±SEM)以比之正常組(定為0級(jí)，0.0±0.06損傷/10kb)的相對(duì)值表示。統(tǒng)計(jì)學(xué)分析(Studentt測(cè)驗(yàn))顯示，正常的和動(dòng)脈粥樣硬化主動(dòng)脈之間存在顯著差異。
本發(fā)明的詳細(xì)描述已知，反應(yīng)性氧物質(zhì)在動(dòng)脈粥樣硬化的病理中起著重要作用，但對(duì)其潛在機(jī)制尚不清楚。在血管環(huán)境中，超氧化物(O2-)與一氧化氮反應(yīng)，并以有限擴(kuò)散速度形成過氧亞硝酸鹽，或者被超氧化物歧化酶還原成過氧化氫(H2O2)。結(jié)果，不論H2O2還是過氧亞硝酸鹽都是血管系統(tǒng)研究中的反應(yīng)性氧物質(zhì)。本發(fā)明證明，過氧化氫和過氧亞硝酸鹽在人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞(HUVEC)和人主動(dòng)脈平滑肌細(xì)胞(HASMC)內(nèi)介導(dǎo)線粒體損傷和機(jī)能失調(diào)，因而參與動(dòng)脈粥樣硬化的引發(fā)。用H2O2和過氧亞硝酸鹽處理細(xì)胞，評(píng)估DNA損傷，基因表達(dá)和蛋白質(zhì)合成。與非轉(zhuǎn)錄活性的核基因β球蛋白基因簇相比，線粒體DNA(mtDNA)更易損傷，這種損傷與線粒體DNA編碼的OXPHOS基因轉(zhuǎn)錄的劑量依賴性減少(40％-60％)相關(guān)。線粒體蛋白質(zhì)合成受到0.1mM過氧亞硝酸鹽處理的輕微抑制，經(jīng)0.5mM過氧亞硝酸鹽處理后則顯著降低(55-70％)。反應(yīng)性氧物質(zhì)處理還引起細(xì)胞ATP水平和線粒體呼吸(復(fù)合物II，琥珀酸脫氫酶)降低，這與反應(yīng)性氧物質(zhì)引起線粒體機(jī)能失調(diào)的觀點(diǎn)一致。以上結(jié)果表明了線粒體DNA損傷，基因表達(dá)和線粒體機(jī)能失調(diào)之間的關(guān)聯(lián)，因此為研究血管細(xì)胞機(jī)能失調(diào)和動(dòng)脈粥樣硬化提供了一個(gè)范例。
還對(duì)10周齡和34周齡的動(dòng)脈粥樣硬化(apoE)和對(duì)照小鼠的主動(dòng)脈組織進(jìn)行了DNA損傷評(píng)估。ApoE小鼠沒有載脂蛋白E，這是脂蛋白受體的一種高親和力配體，對(duì)于攝取血液流中的LDL十分重要。因此，這些小鼠的血清膽固醇和甘油三酯水平顯著升高，在20周前就開始形成動(dòng)脈粥樣硬化斑。為了測(cè)定各組主動(dòng)脈的核DNA和線粒體DNA損傷水平，由近心端和遠(yuǎn)心端主動(dòng)脈采集基因組DNA進(jìn)行定量PCR(QPCR)。各組中apoE小鼠的線粒體DNA損傷的增加都高于c57B1對(duì)照小鼠主動(dòng)脈，只有10周齡西式飲食組例外。雖然所有小鼠的線粒體DNA損傷都隨年齡增加，只有apoE小鼠發(fā)生與年齡相關(guān)的線粒體DNA損傷水平顯著增加(p＜0.050)。只有在10周齡的c57B1小鼠中，西式飲食才與線粒體DNA損傷增加相關(guān)(與中式飲食相比)。相反，核DNA(β-球蛋白)則沒有顯著不同。此外，apoE小鼠的脂類過氧化物和膽固醇水平顯著高于同齡c57B1對(duì)照(p＜0.050)，對(duì)主動(dòng)脈的組織化學(xué)分析顯示在高齡中式和西式飲食apoE小鼠組中存在著動(dòng)脈粥樣硬化損傷。以上信息提示1)在動(dòng)脈粥樣硬化小鼠活體模型中，線粒體DNA損傷與動(dòng)脈粥樣硬化相關(guān)；2)在體內(nèi)，主動(dòng)脈線粒體DNA損傷隨年齡增加；3)與飲食相比，apoE基因型對(duì)于線粒體DNA損傷水平影響更大；以及4)飲食對(duì)于線粒體DNA損傷的影響在年幼的c57B1小鼠中最顯著。因此，線粒體發(fā)生損傷可能是動(dòng)脈粥樣硬化形成的引發(fā)事件。
本發(fā)明旨在提供根據(jù)線粒體DNA損傷水平預(yù)報(bào)冠狀動(dòng)脈粥樣硬化性心臟病的方法。更具體地說，本發(fā)明涉及評(píng)估個(gè)體動(dòng)脈粥樣硬化狀態(tài)的方法，其步驟包括(a)采集個(gè)體的有意義組織；(b)測(cè)定所述有意義組織中的線粒體DNA損傷量；和(c)將所述危發(fā)個(gè)體有意義組織內(nèi)的線粒體DNA損傷量與無動(dòng)脈粥樣硬化對(duì)照個(gè)體的有意義組織內(nèi)的線粒體DNA損傷量比較，危發(fā)個(gè)體線粒體DNA損傷量高于所述對(duì)照個(gè)體表明該個(gè)體患有動(dòng)脈粥樣硬化。線粒體DNA損傷可用本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的各種方法測(cè)定，其中之一是定量PCR。該方法可用來鑒定和定量各個(gè)體的線粒體DNA損傷水平。較好的是，被測(cè)個(gè)體具有至少一種與動(dòng)脈粥樣硬化相關(guān)的危發(fā)因素。這些因素是本領(lǐng)域所熟知的，例如吸煙或嚼煙，高血壓，糖尿病，肥胖，高血膽固醇和高血脂。
本發(fā)明還涉及一種測(cè)定個(gè)體內(nèi)氧化應(yīng)力的方法，包括(a)采集所述個(gè)體的有意義組織；(b)測(cè)定所述有意義組織內(nèi)的線粒體DNA損傷；(c)測(cè)定所述有意義組織內(nèi)一核基因中的DNA損傷；和(d)比較線粒體DNA和核基因DNA之間單位長度上的DNA損傷量，線粒體DNA單位長度上的DNA損傷量高于核DNA表明所述個(gè)體內(nèi)氧化應(yīng)力升高。核基因選自β-球蛋白基因座，轉(zhuǎn)錄活性或非轉(zhuǎn)錄活性基因，這取決于是否需要測(cè)定被轉(zhuǎn)錄基因或一組核基因中存在核DNA損傷?？捎枚縋CR測(cè)定線粒體DNA損傷和所述核基因的DNA損傷。通常，氧化應(yīng)力升高預(yù)示動(dòng)脈粥樣硬化，高血壓，糖尿病，高血膽固醇，吸煙，衰老性退行性疾病和癌癥。
本發(fā)明還涉及一種測(cè)定藥物降低個(gè)體動(dòng)脈粥樣硬化危發(fā)性的效力的方法，包括(a)在給藥前和給藥后采集所述個(gè)體的有意義組織；(b)測(cè)定所采集有意義組織內(nèi)的線粒體DNA損傷量，處理后線粒體DNA損傷量下降表明該處理可降低動(dòng)脈粥樣硬化危發(fā)性。
本文中，“動(dòng)脈粥樣硬化形成”或“動(dòng)脈粥樣硬化”指引起硬化斑形成，外周、冠狀或腦動(dòng)脈狹窄和阻塞，造成局部缺血、心肌梗塞、中風(fēng)繼而導(dǎo)致發(fā)病和死亡的生物學(xué)過程。
“有意義的組織”指各種生血細(xì)胞或組織的樣品。
“氧化應(yīng)力”指反應(yīng)性氧物質(zhì)，例如H2O2，超氧化物，過氧亞硝酸鹽以及它們和其他反應(yīng)性氧物質(zhì)的衍生物對(duì)于正常細(xì)胞技能的病理生理學(xué)作用。氧化應(yīng)力的目標(biāo)可以是蛋白質(zhì)，脂類，RNA，DNA或其他各種細(xì)胞成分。
“抗氧化劑處理”指各種能與反應(yīng)性氧物質(zhì)反應(yīng)從而抵消它們的病理生理學(xué)作用的有機(jī)物或無機(jī)物。
“低蛋白質(zhì)飲食”一般指蛋白質(zhì)含量低于16％的飲食，但可根據(jù)測(cè)試飲食所含蛋白質(zhì)量進(jìn)行調(diào)整。
“mtDNA損傷”一般指mtDNA的各種損傷(即，堿基改換，脫嘌呤核酸位點(diǎn)，斷鏈，形成加成產(chǎn)物等)或mtDNA長度突變(缺失，插入或復(fù)制)，這些可通過QPCR直接測(cè)定(通過抑制聚合酶，或產(chǎn)生大小不同于預(yù)計(jì)的QPCR產(chǎn)物，即mtDNA長度突變)，或結(jié)合酶活性(即，先用FAPY糖基化酶處理DNA，然后用QPCR測(cè)定8-氧-G)。
本領(lǐng)域一般技術(shù)人員可以看出，測(cè)定線粒體DNA損傷只是測(cè)定氧化應(yīng)力的方法之一。線粒體DNA損傷的“下游”或所致效應(yīng)都將反映同一疾病過程。例如，測(cè)定線粒體蛋白質(zhì)合成，線粒體氧化磷酸化改變或線粒體ATP產(chǎn)生改變都可實(shí)現(xiàn)相同的目的。
以下實(shí)施例描述了本發(fā)明的多種實(shí)施方式，并非對(duì)本發(fā)明的限定。
實(shí)施例1體外細(xì)胞和小鼠將人臍靜脈細(xì)胞(HUVEC)和人主動(dòng)脈平滑肌細(xì)胞(HASMC)維持在37℃，5％CO2/95％空氣，Dulbecco′s改進(jìn)的Eagles培養(yǎng)基(HASMC；細(xì)胞Gro)或M199(HUVEC；細(xì)胞Gro)中，其中添加了胎牛血清(Gibco/BRL)，HEPES緩沖液(10mM)，谷氨酰胺，青霉素和鏈霉素。培養(yǎng)瓶每隔3-4天進(jìn)行一次細(xì)胞剝離，并用胰蛋白酶-EDTA(Gibco/BRL)解脫細(xì)胞以用于實(shí)驗(yàn)。第5-7代細(xì)胞長至70-80％鋪滿時(shí)，用各種反應(yīng)性氧物質(zhì)處理(對(duì)照用無血清培養(yǎng)基處理)。
已證明，載脂蛋白E(apoE)敲除(-/-)的小鼠是發(fā)生動(dòng)脈粥樣硬化的可靠模型。ApoE(-/-)小鼠沒有載脂蛋白E，這是脂蛋白受體的一種高親和力配體，對(duì)于攝取血流中的LDL十分重要。因此，這些小鼠的血清膽固醇和甘油三酯水平顯著升高，飼以“西式”高脂肪飲食時(shí)，在20周前就開始形成動(dòng)脈粥樣硬化斑。作為動(dòng)脈粥樣硬化小鼠模型，apoE(-/-)模型與人動(dòng)脈粥樣硬化最近似。
從Jackson實(shí)驗(yàn)室，Bar Harbor購買5周齡的c57對(duì)照小鼠和apoE小鼠(c57B1背景)，讓它們對(duì)于UTMB動(dòng)物研究所適應(yīng)1周，然后飼以中式(4％脂肪HarlanTeklad飲食7001)或西式(21％脂肪Harlan Teklad飲食#88137)飲食，從6周齡時(shí)開始，持續(xù)4周(低齡，10周齡組)或28周(高齡，34周齡組)，然后采集組織。在蛋白質(zhì)飲食實(shí)驗(yàn)中，6周齡的小鼠飼以16％(16％蛋白質(zhì)，4％脂肪，NIH31#101034)或24％(24蛋白質(zhì)，4％脂肪，Harlan Teklad飲食#7001)蛋白質(zhì)飲食，持續(xù)4周(殺死時(shí)是10周齡)。各組有4只apoE小鼠和4只c57Bl對(duì)照小鼠。在腹膜內(nèi)注射ketaset/賽拉嗪(1mg/20g)后采集組織。各組取一段主動(dòng)脈用于組織化學(xué)分析，其余的近心端和遠(yuǎn)心端主動(dòng)脈、心臟、肝、肺和腦樣品摘取后立即冷凍在液氮中，使用前保存于-80℃。采集血漿樣品，用于測(cè)定總膽固醇(Boehringer Mannheim，Indianapolis，IN)和脂類過氧化水平(Calbiochem-Novabiochem，La Jolla，CA)。
實(shí)施例2反應(yīng)性氧物質(zhì)處理用磷酸鹽緩沖液(PBS)稀釋濃H2O2儲(chǔ)備液(30％，F(xiàn)isher)，根據(jù)230nm吸光度測(cè)定濃度(30)。從亞硝酸鈉和酸化的H2O2合成過氧亞硝酸鹽，并定量(31)。分別用黃嘌呤氧化酶/2，4-二氧四氫蝶啶和精胺NONO酸酯作為低劑量O2-和一氧化氮供體。用SIN-1(鹽酸3-morpholinosydnonimine，Molecular Probes)產(chǎn)生較高等摩爾水平的一氧化氮和O2-。60mm培養(yǎng)板內(nèi)的單層培養(yǎng)物(70-80％鋪滿)與特定濃度的反應(yīng)性氧物質(zhì)接觸，進(jìn)行劑量反應(yīng)，并在無血清，無酚紅基礎(chǔ)必需培養(yǎng)基(MEM)內(nèi)37℃進(jìn)行進(jìn)行時(shí)間實(shí)驗(yàn)。對(duì)照單層培養(yǎng)物則僅用無血清和無酚紅MEM作模擬處理。處理后，細(xì)胞用PBS洗滌一次，立即收獲。
實(shí)施例3定量PCR(QPCR)試驗(yàn)QPCR測(cè)定有意義基因組節(jié)段內(nèi)兩模板鏈的每鏈平均DNA損傷程度。QPCR測(cè)定DNA損傷的依據(jù)是1)前提是，各種含損傷的DNA模板都會(huì)直接終止熱穩(wěn)定性聚合酶鏈反應(yīng)，或在QPCR(即，先用FAPY糖基化酶處理樣品，從而可用QPCR檢測(cè)8-氧-G損傷)前經(jīng)酶的作用而終止；2)長度突變(缺失和插入)會(huì)改變預(yù)計(jì)QPCR產(chǎn)物的大小，造成預(yù)計(jì)QPCR產(chǎn)物得率下降(即，mtDNA缺失使得QPCR產(chǎn)物小于預(yù)計(jì))。所以，DAN損傷(即斷鏈，堿基改換，DNA加成，和脫嘌呤位點(diǎn))和長度突變(即mtDNA缺失)會(huì)阻滯聚合酶鏈反應(yīng)的進(jìn)行(即損傷)，或得到大小被改變的PCR產(chǎn)物(即mtDNA缺失)，造成靶序列(預(yù)計(jì)大小)擴(kuò)增減少。所以，只有不發(fā)生DNA長度突變和/或可測(cè)的DNA損傷的DNA模板才可能產(chǎn)生預(yù)計(jì)的擴(kuò)增產(chǎn)物。通過用線粒體DNA模板擴(kuò)增一段16.2kb的產(chǎn)物來評(píng)估線粒體基因組內(nèi)的損傷，通過擴(kuò)增β-球蛋白基因簇的一段17.7kb產(chǎn)物來評(píng)估核基因組內(nèi)的損傷。DNA損傷增加與擴(kuò)增產(chǎn)物減少相互關(guān)聯(lián)。因?yàn)椴煌蔚腝PCR擴(kuò)增會(huì)因模板拷貝數(shù)不同或因與體內(nèi)或體外介導(dǎo)的損傷無關(guān)的DNA質(zhì)量而不同，所以進(jìn)行一次小區(qū)域的定量擴(kuò)增，作為處理對(duì)照(32)。DNA內(nèi)的小靶區(qū)域不大會(huì)受到損傷，因此可作為相關(guān)拷貝數(shù)和基因組抽提物PCR質(zhì)量的指標(biāo)。
也可使用其他定量QPCR產(chǎn)物的方法，這包括熒光法，發(fā)光法，放射性同位素法和免疫學(xué)方法(抗體)。其實(shí)例是使用以猝滅劑和/或受體染料標(biāo)記的熒光探針，標(biāo)記的抗體或寡核苷酸探針，結(jié)合技術(shù)(即生物素化的探針)等。這種定量PCR試驗(yàn)不再需要進(jìn)行電泳和磷顯影。最后，用上述定量方法的單鏈Q(jìng)PCR還可用作定量特定DNA鏈上損傷的方法。
實(shí)施例4DNA分離和QPCR用Qiagen基因組20G吸頭試劑盒，按照生產(chǎn)商的說明分離出細(xì)胞的總DNA。如此得到的DNA是適合長鏈Q(jìng)PCR的基因組制備物。用溴乙錠熒光法測(cè)定細(xì)胞總DNA的濃度，用配有360nm激發(fā)光通過濾光器和600nm發(fā)射光截留濾光器的A4-濾光器熒光計(jì)(Optical Technology Device Elmsford，NY)進(jìn)行，以λ-Hind IIIDNA作為標(biāo)準(zhǔn)物。在QPCR前，先用脈沖場電泳測(cè)定DNA質(zhì)量。樣品質(zhì)量通過線粒體DNA內(nèi)一段222堿基對(duì)片段和β-球蛋白基因內(nèi)一段84堿基對(duì)片段的QPCR來測(cè)定(線粒體DNA的引物14619FOR；14841REV；β-球蛋白引物48550FOR；48634REV)，據(jù)預(yù)計(jì)，相同的模板濃度應(yīng)得到相近的QPCR產(chǎn)物(短鏈)濃度。在小鼠實(shí)驗(yàn)中，通過線粒體DNA內(nèi)一段80堿基對(duì)片段和β-球蛋白基因內(nèi)一段143堿基對(duì)片段的QPCR來測(cè)定樣品質(zhì)量(線粒體DNA的引物有義13281-13306，反義13335-1336l；β-球蛋白引物有義21582-21605，反義21704-21725)。
QPCR在GeneAmp PCR2400系統(tǒng)內(nèi)，用GeneAmp XLPCR試劑盒(Perkin-Elmer)進(jìn)行。反應(yīng)混合物含15ng基因組DNA作為模板。有關(guān)16.2kb線粒體DNA產(chǎn)物(有義引物位置15149-15174；反義引物位置14841-14816)和17.7kbβ-球蛋白產(chǎn)物(有義引物位置44330-44351；反義引物位置61989-61968)的QPCR的試劑條件是已知的(25，32)。各反應(yīng)包含1倍XL緩沖液II(Perkin-Elmer-Cetus)，1.1mM Mg(OAc)2，0.1mg/ml BSA，0.6mM引物，2mCiα32P-ATP(Dupont-NEN)和1單位rTth聚合酶(Perkin-Elmer-Cetus)。每次QPCR都以75℃熱起動(dòng)加入rTthDNA聚合酶開始。在小鼠實(shí)驗(yàn)中，每一PCR系列中都采用一半(7.5ng)對(duì)照基因組模板作為定量對(duì)照，從而確保定量測(cè)定條件。QPCR完成后，取15μl各QPCR產(chǎn)物在1％瓊脂糖凝膠(TBE)上，80-90伏下分離(垂直電泳)4小時(shí)。干燥凝膠，與磷屏接觸12-14小時(shí)，用IMAGEQUANT(Molecular Dynamics PhosphoImager425)定量。雖然描述了采用特定的引物位置和置換進(jìn)行QPCR，本領(lǐng)域技術(shù)人員可以據(jù)此設(shè)計(jì)出不同的引物序列和位置。
計(jì)算DNA損傷頻率(33)。簡而言之，將受損樣品(Ad)的擴(kuò)增用無損對(duì)照(A0)的擴(kuò)增量進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)化，得到相對(duì)擴(kuò)增比(10周齡和34周齡組的A0是10周齡對(duì)照組；3周齡小鼠的A0是3周齡C57小鼠；apoE-/-，SOD2-/+和apoE-/-小鼠的A0是apoE-/-小鼠)。假設(shè)損傷隨機(jī)分布，并對(duì)無損模板(即0級(jí)，x＝0)采用Poisson方程(f(x)＝eλλx/x！，其中的λ＝平均損傷頻率)，則可算得每DNA鏈的平均損傷頻率；λ＝lnAd/A0。用Studentt測(cè)驗(yàn)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。因?yàn)镼PCR測(cè)定沒有發(fā)現(xiàn)各apoE或c57B1對(duì)照小鼠組的近心端和遠(yuǎn)心端主動(dòng)脈節(jié)段的DNA損傷之間有顯著差異，所以將各組的兩個(gè)結(jié)果(近心端和遠(yuǎn)心端)合并，用于主動(dòng)脈組間比較。
實(shí)施例5轉(zhuǎn)錄的Northern分析用4M異硫氰酸胍收獲對(duì)照和過氧亞硝酸鹽處理的培養(yǎng)物，通過5.7M氯化銫離心分離細(xì)胞總RNA(34)。在轉(zhuǎn)錄穩(wěn)定性分析中，在加過氧亞硝酸鹽之前先加入2.5mg/ml放線菌素D。用polytron組織助溶劑將心臟組織溶解于4M異硫氰酸胍。然后離心勻漿15分鐘(3000×g)，收集上清液，通過5.7M氯化銫離心分離細(xì)胞總RNA(34)。通過瓊脂糖凝膠電泳分離總RNA，轉(zhuǎn)移到尼龍膜上，預(yù)雜交，并與合適的探針雜交(35)。線粒體DNA轉(zhuǎn)錄的探針由純化的線粒體DNA通過PCR制備(16S rRNA有義引物2005-2022，反義引物2982-3001；ND2有義引物4831-4847，反義引物5464-5481；Cyt b反義引物14730-14749，反義引物15845-15863)，凝膠純化(Qiagen)，然后進(jìn)行隨機(jī)32P-dCTP標(biāo)記(Stratagene)。在以抽提自小鼠組織的RNA進(jìn)行的實(shí)驗(yàn)中，凝膠純化的PCR產(chǎn)物含16S rRNA(有義引物nps 1330-1354，反義引物nps 2072-2097)，ND2(有義引物nps 4234-4259，反義引物nps 4916-4941)和Cytb(有義引物nps 14196-14220，反義引物nps14967-14992)基因，被作為隨機(jī)32P-dCTP標(biāo)記探針(Stratagene)的模板。濾膜在-80℃曝光Kodak XAR膠片。通過與市售β-肌動(dòng)蛋白探針(CLONTECH)的雜交將各樣品的RNA水平標(biāo)準(zhǔn)化。對(duì)放射性自顯影照片進(jìn)行光密度掃描(Molecular DynamicsDensitometer SI)，用IMAGEQUANT(Molecular Dynamics)定量。至于線粒體轉(zhuǎn)錄水平的定量，可采用各種定量mtRNA轉(zhuǎn)錄水平的方法。用獨(dú)立的Studentt測(cè)驗(yàn)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。
實(shí)施例6線粒體蛋白質(zhì)合成用現(xiàn)有技術(shù)分析線粒體蛋白質(zhì)合成(37)。簡而言之，用無甲硫氨酸的培養(yǎng)基洗滌對(duì)照和處理過的細(xì)胞，在100mg/ml吐根堿(核蛋白質(zhì)合成的抑制劑)存在下與400mCi/ml35S-甲硫氨酸一起孵育2小時(shí)，然后與0.1mM冷甲硫氨酸追加反應(yīng)20-30分鐘。用胰蛋白酶消化細(xì)胞，用PBS洗滌。收集細(xì)胞沉淀，重懸于溶液化緩沖液(4％SDS)中，超聲處理(30％滿循環(huán)6脈沖，輸出量5)，測(cè)定總蛋白質(zhì)。等量標(biāo)的記合產(chǎn)物(總蛋白)進(jìn)行10-20％梯度的PAGE-SDS。在Whatman濾紙上干燥凝膠，-80℃曝光Kodak XAR膠片。對(duì)所有的非處理和處理樣品條帶用光密度法檢測(cè)翻譯產(chǎn)物的標(biāo)記(Molecular Dynamics Densitometer SI)。用各樣品條帶的標(biāo)記總量來計(jì)算相對(duì)摻入水平。就線粒體蛋白質(zhì)水平的定量而言，可采用各種用來定量線粒體蛋白質(zhì)合成的方法。用獨(dú)立Studentt測(cè)驗(yàn)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。
實(shí)施例7MTT和ATP試驗(yàn)用復(fù)合物II(complex II)MTT還原來評(píng)估線粒體呼吸(38-42)。將細(xì)胞接種在96孔培養(yǎng)板上，密度為8,000個(gè)細(xì)胞/孔，37℃培養(yǎng)。48小時(shí)后，換以無血清含0.2Mm H2O2，0.1mM，0.5mM或1.0mM過氧亞硝酸鹽的培養(yǎng)基，培養(yǎng)1小時(shí)，MTT的終濃度達(dá)到2.0mg/ml的再在條件培養(yǎng)基中恢復(fù)1小時(shí)，裂解細(xì)胞，然后在570nm處測(cè)定吸光度(25)。用已知數(shù)量的活細(xì)胞產(chǎn)生的標(biāo)準(zhǔn)曲線將吸光度值轉(zhuǎn)化為MTT還原值。然后將處理后樣品的MTT還原值用未處理的對(duì)照樣品標(biāo)準(zhǔn)化，記錄與對(duì)照相比的分?jǐn)?shù)。用ATP測(cè)定試劑盒(Molecular Probes，A-6608)和MicroLumat Plus LB(EG&G Berthold)顯微注射器發(fā)光計(jì)測(cè)定總ATP水平。簡而言之，該試驗(yàn)是基于熒光素-熒光素酶在ATP存在下的生物發(fā)光(～560nm)。該試驗(yàn)十分敏感；大多數(shù)發(fā)光計(jì)可檢測(cè)出低至0.1pmol的已有ATP或動(dòng)態(tài)系統(tǒng)中正在形成的ATP。用獨(dú)立的Studentt測(cè)驗(yàn)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。
實(shí)施例8組織學(xué)分析，脂類過氧化和膽固醇水平取各組的一段主動(dòng)脈用4％低聚甲醛固定，包埋在石蠟中，切成5μm的切片，脫蠟，復(fù)水，并用蘇木精和伊紅染色，評(píng)估動(dòng)脈粥樣硬化損傷。用比色法(586nm，Calbiochem-Novabiochem，La Jolla，CA)測(cè)定血漿樣品中的脂類過氧化水平，該試驗(yàn)對(duì)丙二酰醛(malonaldehyde)(MDA)和4-羥基-2(E)-壬烯醛(4-HNE)具有特異性，它們是聚不飽和脂肪酸及相關(guān)酯過氧化的最終產(chǎn)物。對(duì)這些產(chǎn)物的測(cè)定提供了一個(gè)脂類過氧化的指數(shù)。將樣品與4-HNE和MDA標(biāo)準(zhǔn)曲線比較。用膽固醇測(cè)定試劑盒(Boehringer Mannheim，Indianapolis，IN)，按照生產(chǎn)商的說明，用小鼠血漿樣品和標(biāo)準(zhǔn)曲線測(cè)定總膽固醇。
實(shí)施例9體外實(shí)驗(yàn)結(jié)果在血管環(huán)境中，超氧化物(O2-)與一氧化氮反應(yīng)，并以有限擴(kuò)散速度形成過氧亞硝酸鹽，或者被超氧化物歧化酶還原成過氧化氫(H2O2)。因此，用H2O2，過氧亞硝酸鹽和O2-處理的HUVEC和HASMC都證明，過氧化氫和過氧亞硝酸鹽在體外介導(dǎo)線粒體損傷和機(jī)能失調(diào)，因而可能參與動(dòng)脈粥樣硬化的引發(fā)。
過氧化氫處理在兩細(xì)胞系中都提高線粒體DNA損傷，內(nèi)皮同時(shí)還有nDNA損傷。HUVEC和HASMC都用0.2mM過氧化氫處理1小時(shí)，然后分析線粒體DNA和核DNA(β-球蛋白)損傷，與未處理的對(duì)照比較(表1，圖1)。在HUVEC中，線粒體DNA和nDNA(β-球蛋白基因簇)損傷明顯(與未處理的對(duì)照相比，P＜0.005)，在HASMC中，只有線粒體DNA有明顯損傷(P＜0.005)。相反，HASMC與未處理的對(duì)照相比沒有表現(xiàn)出顯著的nDNA損害增加(P＝0.695)。
對(duì)過氧化氫處理的時(shí)間分析顯示，線粒體DNA損傷在兩細(xì)胞系內(nèi)的發(fā)生都很迅速。細(xì)胞用0.2mM過氧化氫處理0-60分鐘，在各時(shí)刻評(píng)估DNA損傷(圖1)。HUVEC中，10分鐘內(nèi)出現(xiàn)明顯的線粒體DNA損傷(P＝0.037)，HASMC則在15分鐘內(nèi)出現(xiàn)(P＝0.047)(與為處理對(duì)照比較)。相反，β-球蛋白基因座未表現(xiàn)出nDNA損傷的迅速積累(圖1)，在HUVEC中，需要處理60分鐘后才出現(xiàn)明顯的持續(xù)損傷(P＝0.005)。所以，在HUVEC和HSMAC細(xì)胞體外接觸反應(yīng)性氧物質(zhì)后，迅速發(fā)生線粒體DNA損傷。
過氧亞硝酸鹽處理在HUVEC和HSMAC細(xì)胞內(nèi)專性損傷線粒體DNA。為了測(cè)定過氧亞硝酸鹽的作用，細(xì)胞用0.1mM和0.5mM過氧亞硝酸鹽處理1小時(shí)(表1，圖2)。與所有未處理的對(duì)照相比，用0.1mM和0.5mM過氧亞硝酸鹽處理HUVEC引起線粒體DNA損傷顯著增加(P＜0.005)，0.5mM過氧亞硝酸鹽處理引起HSMAC內(nèi)線粒體DNA損傷顯著增加(P＜0.005)(表1)。
為了評(píng)估持續(xù)低劑量過氧亞硝酸鹽的體外作用，用O2-和一氧化氮(O2-與一氧化氮反應(yīng)生成過氧亞硝酸鹽)處理HUVEC和HSMAC。處理引起HUVEC內(nèi)線粒體DNA損傷顯著增加，但HSMAC對(duì)此具有耐受性(表1，圖2)。例如，精胺NONO酸酯持續(xù)產(chǎn)生一氧化氮(0.5mM/ml/min)不能引起DNA損傷，O2-(2mM/ml/min)處理則在HSMAC內(nèi)引起明顯的DNA損傷(P＜0.05)(表1)，但過氧化氫酶和SOD預(yù)處理可防止這種損傷，這說明O2-和O2-還原產(chǎn)生的過氧化氫都對(duì)介導(dǎo)線粒體DNA損傷負(fù)有部分責(zé)任。而且，與未處理的HUVEC相比，受持續(xù)一氧化氮和O2-生成(分別為0.5mM/ml和2mM/m1)作用的HUVEC其線粒體DNA損傷水平顯著升高(P＜0.05)(表1)。同樣，較高劑量等摩爾一氧化氮和O2-的產(chǎn)生(1mM SIN-1)對(duì)HUVEC造成顯著的線粒體DNA損傷(P＜0.001)，對(duì)HASMC則無效(表1，圖2)。SOD預(yù)處理可避免HASMC內(nèi)與SIN-1相關(guān)的線粒體DNA損傷(表1，圖2)。所以，持續(xù)低劑量和短時(shí)高劑量O2-和一氧化氮的產(chǎn)生可引起HUVEC內(nèi)的線粒體DNA損傷。
用過氧亞硝酸鹽處理HUVEC和HASMC顯著降低線粒體編碼基因的轉(zhuǎn)錄水平，所述基因包括NADH脫氫酶2(ND2)和細(xì)胞色素b(Cyt b)，但不包括16S rRNA。0.5mM過氧亞硝酸鹽使得HASMC內(nèi)ND2和Cyt b的轉(zhuǎn)錄水平降低55％，16SrRNA水平降低14％(圖3)。同樣，與未處理對(duì)照相比，0.5mM過氧亞硝酸鹽處理的HUVEC內(nèi)ND2和Cyt b轉(zhuǎn)錄水平降低45-50％，16S rRNA水平降低26％(圖3)。在使用較低劑量(0.1mM)的過氧亞硝酸鹽時(shí)，HUVEC內(nèi)16S rRNA，ND2和Cyt b轉(zhuǎn)錄水平降低25-30％，HASMC內(nèi)降低5-15％(圖3)。
用轉(zhuǎn)錄抑制劑放線菌素D預(yù)處理細(xì)胞發(fā)現(xiàn)，過氧亞硝酸鹽處理既造成轉(zhuǎn)錄抑制(ND2和Cyt b)，也可引起特定轉(zhuǎn)錄的降解(Cyt b)。相反，核內(nèi)β-球蛋白基因的轉(zhuǎn)錄水平則不受過氧亞硝酸鹽處理的影響。因此，過氧亞硝酸鹽能夠差異性地作用于線粒體基因的轉(zhuǎn)錄和轉(zhuǎn)錄穩(wěn)定性。
反應(yīng)性氧物質(zhì)還造成兩細(xì)胞系內(nèi)線粒體蛋白質(zhì)合成的降低。與未處理對(duì)照相比，用0.2mM H2O2處理HUVEC和HASMC使總線粒體蛋白質(zhì)合成降低23-33％，0.5mM過氧亞硝酸鹽處理則造成(HUVEC和HASMC)55-70％的降低(圖4)。低劑量過氧亞硝酸鹽(0.1mM)在HASMC內(nèi)使35S-甲硫氨酸摻入略降12％。因此，反應(yīng)性氧物質(zhì)也可能與線粒體蛋白質(zhì)合成降低相關(guān)。
過氧亞硝酸鹽處理引起HUVEC和HASMC內(nèi)總ATP水平和線粒體呼吸(復(fù)合物II)水平的降低(圖5)?？侫TP水平測(cè)定發(fā)現(xiàn)，0.1mM過氧亞硝酸鹽在兩細(xì)胞系內(nèi)都沒有引起總ATP顯著減少，0.5mM劑量則引起了顯著的ATP減少(HUVECP＝0.02；HASMC，P＝0.04)。同樣，0.1Mm沒有引起復(fù)合物II MTT還原(線粒體呼吸)的顯著降低，0.5mM劑量則引起了顯著的降低(HUVEC P＝0.02；HASMC，P＝0.008)。
MTT是OXPHOS復(fù)合物II的組成之一，琥珀酸脫氫酶還原MTT是線粒體功能的一個(gè)指標(biāo)，常用作細(xì)胞呼吸和氧化還原功能的一種評(píng)估手段。所以，MTT還原反映線粒體的氧化還原能力。在平行實(shí)驗(yàn)中，用臺(tái)盼藍(lán)染色細(xì)胞來測(cè)定與各種反應(yīng)性氧物質(zhì)處理相關(guān)的細(xì)胞死亡率。在進(jìn)行MTT和ATP試驗(yàn)的時(shí)候，兩細(xì)胞系都幾乎沒有細(xì)胞死亡(＜5％)。所以，反應(yīng)性氧物質(zhì)處理對(duì)HUVEC和HASMC內(nèi)的總ATP水平和呼吸有作用。
表I與反應(yīng)性氧物質(zhì)處理相關(guān)的每10kb上損傷估計(jì)A)未處理0.2mM0.1mM 0.5mM 降解的對(duì)照 H2O2過氧亞硝酸鹽 過氧亞硝酸鹽過氧亞硝酸鹽HASMCmtDNA 01.68(0.25)**0.16(0.05)1.42(0.35)**0nDNA 0-0.09(0.14) -0.08(0.05) -0.04(0.03) ndHUVECmtDNA 02.59(0.33)**0.19(0.03)**2.81(0.37)**0.07(0.03)nDNA 01.02(0.11)**0.07(0.10)1.05(0.40) 0.01(0.05)表I顯示，用過氧化氫和過氧亞硝酸鹽處理后，與未處理對(duì)照相比，線粒體DNA和nDNA(β-球蛋白基因簇)內(nèi)估計(jì)的(每10bk)損傷頻率。降解的過氧亞硝酸鹽指加給細(xì)胞培養(yǎng)物前先與培養(yǎng)基在室溫下孵育了1小時(shí)的過氧亞硝酸鹽。以上是平均值(±SEM)。
表II與反應(yīng)性氧物質(zhì)處理相關(guān)的每10kb上損傷估計(jì)A) 未處理0.2mM 0.1mM 0.5mM降解的對(duì)照 O2-O2-＋NO SIN-1 SOD＋SIN-1過氧亞硝酸鹽HASMCmtDNA 00 0 0.13(0.05) 0.05(0.15)nDNA 00 0 nd ndHUVECmtDNA 00.22(0.04)*0.41(0.04)**1.71(0.33)**-0.17(0.12)nDNA 00 0.08(0.11) nd nd表II顯示線粒體DNA和nDNA(β-球蛋白基因簇)內(nèi)估計(jì)的與超氧化物(O2-)和一氧化氮(NO)供體相關(guān)的(每10kb)損傷頻率。用黃嘌呤氧化酶加2，4-二氧四氫蝶啶產(chǎn)生O2-(2mM/ml/min)，用精胺NONO酸酯產(chǎn)生一氧化氮(0.5mM/ml/min)。SIN-1(1mM)用來產(chǎn)生等摩爾的一氧化氮和O2-。在SOD＋SIN-1處理中，細(xì)胞先以3單位/mlSOD預(yù)處理，然后加入SIN-1?？s寫*表示與對(duì)照差異顯著(P＜0.05)；**表示與對(duì)照差異顯著(P＜0.005)；nd＝無數(shù)據(jù)；負(fù)號(hào)(-)表示觀察到的損傷比對(duì)照更少。
實(shí)施例10小鼠內(nèi)的DNA損傷將高血膽固醇的apoE小鼠和“健康”小鼠分成2個(gè)年齡組(殺死時(shí)為10周齡和34周齡)，從第6周開始飼以中式(4％脂肪)和西式(21％脂肪)飲食。用QPCR評(píng)估主動(dòng)脈和心臟組織內(nèi)的DNA損傷，用血漿測(cè)定膽固醇和脂類過氧化(4-HNE和MDA)水平。保留每組的一段主動(dòng)脈，用于組織學(xué)研究。
飼以中式飲食的高血膽固醇apoE小鼠的主動(dòng)脈組織內(nèi)，線粒體DNA損傷水平明顯高于對(duì)照(P＜0.05，圖6A)。10周齡和34周齡的小鼠都存在這樣的差異，這清楚地表明，與“健康”小鼠相比，apoE主動(dòng)脈存在持續(xù)的、嚴(yán)重的線粒體DAN損傷。與0級(jí)對(duì)照相比，10周齡apoE主動(dòng)脈的擴(kuò)增量下降61％(擴(kuò)增量下降與DNA損傷增加有關(guān))，即0.582±0.123線粒體DNA損傷/10kb，10周齡對(duì)照小鼠則為0.0±0.198損傷/10kb(P＝0.018)。同樣，34周齡apoE組的估計(jì)線粒體DNA損傷比同齡對(duì)照組增加3倍(1.325±0.257損傷/10kb，與0.453±0.162損傷/10kb，P＝0.007)。心臟組織中也存在同樣情況(左心室，圖6B)。例如，10周齡apoE小鼠的擴(kuò)增量比0級(jí)對(duì)照下降67％(0.685±0.093損傷/10kb，0.0±0.048損傷/10kb，P＜0.001)，34周齡apoE小鼠的估計(jì)線粒體DNA損傷則比同齡對(duì)照高約4倍(0.918±0.151損傷/10kb，0.213±0.295損傷/10kb，P＝0.056)。
還對(duì)apoE小鼠和對(duì)照小鼠內(nèi)西式飲食的作用進(jìn)行了評(píng)估(圖6B)。在對(duì)照小鼠中，西式飲食的10周齡對(duì)照組主動(dòng)脈內(nèi)線粒體DNA損傷水平高于中式飲食對(duì)照(西式0.31±0.17損傷/10kb，中式0.0±0.20損傷/10kb)。這樣的差異在34周齡的對(duì)照小鼠間則不明顯(中式0.45±0.16損傷/10kb；西式0.49±0.25損傷/10kb；P＝0.90)。同樣，10周齡對(duì)照小鼠中，西式飲食小鼠心臟內(nèi)的估計(jì)線粒體DNA損傷也較高(圖6B；擴(kuò)增量下降58％，0.54±0.23損傷/10kb，中式飲食則為0.0±0.05損傷/10kb)，而且，與主動(dòng)脈的結(jié)果相似，34周齡對(duì)照小鼠之間則沒有明顯差異(中式0.21±0.29損傷/10kb，西式0.25±0.21損傷/10kb)。相反，西式飲食的apoE小鼠的主動(dòng)脈和心臟組織內(nèi)，線粒體DNA損傷都沒有明顯增加。因此，食物脂肪的增加似乎只在10周齡對(duì)照小鼠中與線粒體DNA損傷增加相關(guān)。
年齡還與apoE和對(duì)照小鼠主動(dòng)脈內(nèi)線粒體DNA損傷增加相關(guān)(表2)。34周齡apoE小鼠主動(dòng)脈內(nèi)的損傷是10周齡小鼠的2.3-5.8倍(中式飲食P＝0.013；西式飲食P＝0.011)，對(duì)照小鼠的損傷水平則沒有顯著提高，但有相當(dāng)?shù)脑黾?表2)?？磥恚挲g升高對(duì)中式飲食對(duì)照鼠有影響(10周齡0.0±0.20損傷/10kb，34周齡0.45±0.16損傷/10kb，P＝0.09)，而西式飲食小鼠年齡造成的差異則較小(10周齡0.31±0.17損傷/10kb，34周齡0.49±0.25損傷/10kb，P＝0.556)。相反，心臟內(nèi)沒有發(fā)現(xiàn)明顯關(guān)聯(lián)性。因此，年齡似乎與apoE小鼠主動(dòng)脈內(nèi)線粒體DNA損傷的增加顯著相關(guān)，并在中式飲食的對(duì)照鼠中存在著一種明顯的趨勢(shì)。
因?yàn)橥蛐屯g中式飲食和西式飲食小鼠之間，線粒體DNA損傷沒有顯著差異，所以對(duì)蛋白質(zhì)在10周齡小鼠中的效應(yīng)進(jìn)行了研究。從第6周開始，給apoE小鼠和c57B1小鼠都飼以4周16％或24％蛋白質(zhì)的飲食。兩種飲食使得apoE小鼠的線粒體DNA損傷水平仍高于對(duì)照(主動(dòng)脈P＝0.01 5，心臟P＝0.005)，但低蛋白飲食顯著降低兩種對(duì)照鼠(P＝0.007)和apoE鼠(P＜0.001)主動(dòng)脈內(nèi)的線粒體DNA損傷水平。ApoE心臟內(nèi)也存在同樣的趨勢(shì)(P＝0.002)。因此，低蛋白飲食與兩種小鼠內(nèi)的線粒體DNA損傷降低相關(guān)。
表III年齡對(duì)動(dòng)脈粥樣硬化(apoE)和對(duì)照(C57)小鼠內(nèi)mtDNA損傷(損傷/10bk)的影響
表III列出了與4％脂肪對(duì)照組(C57)相比的估計(jì)[平均(SE)]mtDNA損傷/10kb。各種飲食都從第6周開始，持續(xù)至第10周或34周。用Studentt測(cè)驗(yàn)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。
所示是與10周齡c57B1中式飲食對(duì)照鼠(0級(jí)損傷)相比的估計(jì)損傷頻率/10kb。所示的數(shù)據(jù)是平均值(±SEM)。Student t測(cè)驗(yàn)的P值是各基因型(apoE或c57)和各種飲食10周齡與34周齡之間的比較。星號(hào)(*)表示與10周齡的同類有顯著差異。
實(shí)施例113周齡apoE-/-和對(duì)照小鼠的主動(dòng)脈mtDNA損傷另對(duì)3周齡apoE-/-和對(duì)照小鼠的主動(dòng)脈mtDNA損傷進(jìn)行了評(píng)估。3周齡apoE-/-小鼠的mtDNA損傷顯著高于同齡對(duì)照鼠(圖8；P＝0.001)，證明mtDNA損傷在勢(shì)將形成動(dòng)脈粥樣硬化損傷的主動(dòng)脈內(nèi)較早發(fā)生。
實(shí)施例12小鼠內(nèi)的膽固醇水平如預(yù)計(jì)，與對(duì)照小鼠相比，所有apoE組的膽固醇水平都顯著升高(高約4至5倍；P＜0.001)。雖然西式飲食在所有小鼠中都與最高膽固醇水平相關(guān)，但這種升高(相對(duì)于中式飲食)只在apoE小鼠中具有顯著性(高約2.2倍；中式225.8±33.4mg/dl；西式490.2±56.7mg/dl；P＝0.0019)。相反，c57B1對(duì)照小鼠若飼以西式飲食，則膽固醇水平略高(高約1.6倍；中式53.4±15.1mg/dl；西式85.2±10.8mg/dl)，但不具備顯著性(P＝0.17)。因此，apoE小鼠的膽固醇水平顯著高于同齡c57B1對(duì)照鼠，最高膽固醇水平與西式飲食相關(guān)。
實(shí)施例13小鼠內(nèi)的脂類過氧化通過測(cè)定MDA和4-HNE水平來測(cè)定脂類過氧化。高血膽固醇的apoE小鼠的脂類過氧化水平顯著高于對(duì)照鼠(P＜0.05)。然而，與總膽固醇水平結(jié)果相反，apoE小鼠中，西式飲食與中式飲食相比并未顯著提高脂類過氧化水平(圖9)。相比之下，飼以西式飲食的對(duì)照鼠的脂類過氧化則持續(xù)高于中式飲食(P＜0.05)。因此，盡管apoE小鼠與對(duì)照鼠相比通常具有最高的脂類過氧化物水平，但在apoE小鼠中，飼以西式飲食與中式飲食相比并不提高脂類過氧化水平。
實(shí)施例14小鼠內(nèi)的組織學(xué)取各組的一段主動(dòng)脈包在石蠟中，切成5微米的切片，用蘇木精和伊紅染色。雖然在10周齡的各組(對(duì)照和apoE)中都沒有動(dòng)脈粥樣硬化損傷，但不論何種飲食，34周齡apoE組中都有動(dòng)脈粥樣硬化損傷，而34周齡對(duì)照鼠中則都沒有。定性地說，飼以西式飲食的apoE小鼠其損傷頻率和大小都高于飼以中式飲食的apoE小鼠。
實(shí)施例15apoE-/-，SOD2-/+小鼠動(dòng)脈粥樣硬化和mtDNA損傷的分析為了確定線粒體機(jī)能和抗氧化活性(MnSOD，SOD2)失代償對(duì)動(dòng)脈粥樣硬化是否有影響，培育了一種apoE-/-，SOD2-/+小鼠。此前的研究已證明，雜種SOD2小鼠的線粒體機(jī)能和SOD2活性低于野生型。雜種apoE-/-，SOD2-/+小鼠的SOD2活性是apoE-/-小鼠的40％。這些小鼠中的動(dòng)脈粥樣硬化損傷形成與同齡同窩的apoE-/-顯著不同(圖10A)，apoE-/-，SOD2-/+小鼠的動(dòng)脈粥樣硬化損傷數(shù)量比其提高了2.5倍(P＝0.02)(圖10B)。所以，apoE-/-，SOD2-/+小鼠的主動(dòng)脈mtDNA損傷高于同齡同窩的apoE-/-(圖10C，P＝0.006)。
實(shí)施例16體外實(shí)驗(yàn)的討論本發(fā)明研究是為了證明，過氧化氫和過氧亞硝酸鹽在體外介導(dǎo)HUVEC和HASMC的線粒體損傷和機(jī)能失調(diào)。在經(jīng)過氧化氫處理的兩種細(xì)胞中，線粒體DNA損傷都很明顯，而且，HUVEC具有明顯的nDNA損傷。同樣，在接觸短時(shí)高劑量過氧亞硝酸鹽時(shí)HUVEC(0.1mM和0.5mM)和HASMC(0.5mM)內(nèi)，線粒體DNA也明顯受損。而且，用低劑量持續(xù)水平的過氧亞硝酸鹽處理時(shí)，HUVEC內(nèi)可觀察到與對(duì)照相比明顯的線粒體DNA損傷，但對(duì)nDNA沒有作用。同樣，SIN-1處理顯著提高HUVEC的線粒體DNA損傷。相反，對(duì)HASMC的SIN-1處理沒有引起明顯的損傷，這似乎有違于過氧亞硝酸鹽處理的結(jié)果(表1)。以上差異可能是因?yàn)镠ASMC還原O2-和過氧化氫的能力與HUVEC不同。這與以XO/LZ處理HASMC的結(jié)果一致，該處理不造成明顯的損傷，但可對(duì)HUVEC造成明顯的線粒體DNA損傷(表1)。以上結(jié)果加上HUVEC一般對(duì)反應(yīng)性氧物質(zhì)處理更敏感的事實(shí)，與以上觀點(diǎn)一致。
過氧亞硝酸鹽處理后，兩種細(xì)胞內(nèi)的ND2和Cyt b轉(zhuǎn)錄都減少。雖然ND2和Cyt b轉(zhuǎn)錄水平都有相當(dāng)程度的降低，但僅Cyt b轉(zhuǎn)錄水平降低具有顯著行(HASMC，P＝0.033；HUVEC，P＝0.011)。ND2和Cyt b轉(zhuǎn)錄減少似乎是暫時(shí)的，因?yàn)樵谌コ磻?yīng)性氧物質(zhì)處理的培養(yǎng)基并在條件培養(yǎng)基中恢復(fù)2小時(shí)后，大多數(shù)細(xì)胞培養(yǎng)物都恢復(fù)到未處理對(duì)照的水平。所以，轉(zhuǎn)錄減少與反應(yīng)性氧物質(zhì)的短時(shí)接觸直接相關(guān)。因?yàn)镃yt b轉(zhuǎn)錄距離多順反子mtRNA轉(zhuǎn)錄(43-46)轉(zhuǎn)錄起始位點(diǎn)最遠(yuǎn)，距離轉(zhuǎn)錄起始位點(diǎn)越遠(yuǎn)的基因越易(在轉(zhuǎn)錄水平上)受隨機(jī)的線粒體DNA損傷的影響。反應(yīng)性氧物質(zhì)存在下轉(zhuǎn)錄的穩(wěn)定性也可能對(duì)RNA水平有一定作用。放線菌素D實(shí)驗(yàn)提示，在檢測(cè)Cyt b時(shí)，過氧亞硝酸鹽處理既引起轉(zhuǎn)錄抑制又造成轉(zhuǎn)錄不穩(wěn)定，而ND2則較少受過氧亞硝酸鹽造成不穩(wěn)定的影響。最后，線粒體rRNA的優(yōu)先表達(dá)(47，48)，潛在地使得它們不易受本研究中過氧亞硝酸鹽處理的影響。
與轉(zhuǎn)錄水平降低相一致，在經(jīng)短時(shí)高劑量反應(yīng)性氧物質(zhì)處理的HUVEC和HASMC中都可觀察到與之相伴的線粒體蛋白質(zhì)合成減少。0.2mM H2O2處理使得蛋白質(zhì)合成下降23-33％，0.5mM過氧亞硝酸鹽處理則引起蛋白質(zhì)標(biāo)記更大的下降(HASMC對(duì)照的30％；HUVEC對(duì)照的45％)。與以上發(fā)現(xiàn)一致的還有經(jīng)反應(yīng)性氧物質(zhì)處理后細(xì)胞ATP生成和呼吸降低。因此，這些體外結(jié)果提示，反應(yīng)性氧物質(zhì)可介導(dǎo)一系列與HUVEC和HASMC內(nèi)線粒體機(jī)能相關(guān)的事件，最終導(dǎo)致細(xì)胞機(jī)能失調(diào)。
線粒體是細(xì)胞ATP的主要生成者，它們同時(shí)還是反應(yīng)性氧的慢性發(fā)生器(12-16)，會(huì)在電子傳遞過程(代謝過程)中產(chǎn)生O2-。O2-隨即被線粒體的錳超氧化物歧化酶(MnSOD，SOD2)去除，但該反應(yīng)產(chǎn)生過氧化氫，后者會(huì)在線粒體內(nèi)累積?；蛘撸琌2-會(huì)以接近擴(kuò)散的速度(6.7×109M-1sec-1)與一氧化氮反應(yīng)形成過氧亞硝酸鹽(49)。
雖然已知一氧化氮主要具有抗動(dòng)脈粥樣硬化形成的作用，但在已形成動(dòng)脈粥樣硬化的血管內(nèi)，這些作用會(huì)因與O2-反應(yīng)形成過氧亞硝酸鹽而喪失。過氧亞硝酸鹽易于氧化LDL和清除數(shù)種抗氧化劑(10，11)。因此，動(dòng)脈壁內(nèi)產(chǎn)生的過氧亞硝酸鹽可能直接促進(jìn)ox-LDL的形成，后者繼而可引起線粒體機(jī)能失調(diào)(53)。例如，用ox-LDL處理成纖維細(xì)胞會(huì)造成線粒體機(jī)能失調(diào)(53)。同樣，臨床相關(guān)水平ox-LDL使得內(nèi)皮細(xì)胞內(nèi)的過氧化氫生產(chǎn)提高了4-12倍(54)?；铙w研究證實(shí)，人冠狀動(dòng)脈內(nèi)存在著由一氧化氮衍生的氧化劑(例如過氧亞硝酸鹽)，其聚集在動(dòng)脈粥樣沉積內(nèi)的泡沫細(xì)胞中，以及早期血管內(nèi)膜下脂肪痕紋內(nèi)(55，56)。此外，過氧亞硝酸鹽介導(dǎo)酪氨酸殘基上MnSOD(SOD的線粒體形式)的硝化，使之失活(57，58)。對(duì)重組人MnSOD的過氧亞硝酸鹽處理造成對(duì)酶活性的完全抑制，并形成硝基酪氨酸和二酪氨酸(57，58)。因此，由于發(fā)生動(dòng)脈粥樣硬化的血管存在內(nèi)皮一氧化氮生產(chǎn)缺陷(59)，而一氧化氮與O2-之比對(duì)于一氧化氮究竟起抗氧化還是促氧化作用至關(guān)重要(5，60)，這些細(xì)胞內(nèi)的一氧化氮生物活性可能更多地起著促氧化而不是抗氧化的作用，導(dǎo)致循環(huán)連續(xù)的內(nèi)皮細(xì)胞損傷。其他研究比較了有限數(shù)量同齡動(dòng)脈粥樣硬化動(dòng)脈和正常主動(dòng)脈的線粒體DNA損傷和nDNA損傷，研究顯示病患主動(dòng)脈的線粒體DNA損傷水平顯著升高(P＝0.0023)，與以上報(bào)道一致。所以，過氧亞硝酸鹽似乎介導(dǎo)著多種對(duì)細(xì)胞的有害作用，包括線粒體DNA損傷，轉(zhuǎn)錄和蛋白質(zhì)水平改變，以及線粒體抗氧化能力降低。
還檢測(cè)了一氧化氮清除人胎盤滋養(yǎng)層細(xì)胞(HPTC)線粒體產(chǎn)生的氧化劑的作用(61)。用L-NAME(一氧化氮合成抑制劑)降低人胎盤滋養(yǎng)層細(xì)胞內(nèi)一氧化氮時(shí)，如同預(yù)計(jì)，細(xì)胞氧化劑形成增加。用CuZnSOD和過氧化氫酶處理人胎盤滋養(yǎng)層細(xì)胞不減弱NOS抑制引起的氧化劑應(yīng)答。用黃嘌呤氧化酶，環(huán)加氧酶和線粒體OXPHOS等抑制劑的結(jié)果表明，只有線粒體OXPHOS抑制劑增強(qiáng)一氧化氮合成酶抑制所引起的氧化劑應(yīng)答，而XO和環(huán)加氧酶的抑制劑則無此效果。這表明，線粒體產(chǎn)生的反應(yīng)性氧物質(zhì)是細(xì)胞內(nèi)的主要損傷性物質(zhì)，一氧化氮酶合成的調(diào)節(jié)對(duì)線粒體產(chǎn)生反應(yīng)性氧物質(zhì)具有重要作用。
在動(dòng)脈的氧化性環(huán)境中，血管內(nèi)皮細(xì)胞和平滑肌細(xì)胞長期受到反應(yīng)性氧物質(zhì)應(yīng)力。結(jié)果，不再對(duì)氧化應(yīng)力做出正確應(yīng)答的細(xì)胞就更容易受反應(yīng)性氧物質(zhì)所介導(dǎo)損傷的傷害。本發(fā)明證明，HAMSC和HUVEC(尤其是HUVEC)在體外對(duì)于此類損傷十分敏感，因此，體內(nèi)反應(yīng)性氧物質(zhì)的慢性產(chǎn)生很可能通過引發(fā)線粒體衰變引起血管細(xì)胞機(jī)能失調(diào)，導(dǎo)致許多重要細(xì)胞功能的喪失。
實(shí)施例17小鼠實(shí)驗(yàn)討論本發(fā)明研究的主要目的是檢測(cè)同齡高血膽固醇apoE小鼠和對(duì)照鼠的主動(dòng)脈和心臟組織內(nèi)的DAN損傷程度。ApoE小鼠發(fā)生動(dòng)脈粥樣硬化的方式與人相似。與飼以中式飲食的相比，飼以西式飲食的apoE小鼠的動(dòng)脈粥樣硬化普遍加快。例如，早在第6周(西式飲食)或第8周(中式飲食)就出現(xiàn)單核細(xì)胞對(duì)內(nèi)皮細(xì)胞的粘附，然后，早在第8周(西式飲食)或第10周(中式飲食)就產(chǎn)生泡沫細(xì)胞，早在第15周(西式飲食)或第20周(中式飲食)就開始形成晚期損傷。有效量實(shí)驗(yàn)中所用apoE小鼠內(nèi)的動(dòng)脈粥樣硬化程度和進(jìn)程與先前的觀察結(jié)果一致。
飼以中式飲食的10周齡和34周齡高血膽固醇apoE小鼠動(dòng)脈中的線粒體DNA損傷顯著高于其同齡的c57B1對(duì)照。不良飲食，apoE小鼠中，年齡還與線粒體DNA損傷估計(jì)頻率的直接升高相關(guān)(P＜0.05)。其他比較實(shí)驗(yàn)顯示，apoE主動(dòng)脈近心端和遠(yuǎn)心端之間的線粒體DNA損傷水平?jīng)]有顯著差異，所以，在apoE主動(dòng)脈內(nèi)觀察到的線粒體DNA損傷不可能人為的近心端主動(dòng)脈特有的動(dòng)脈粥樣硬化形成因素。相反，整個(gè)apoE主動(dòng)脈內(nèi)都有線粒體DNA損傷增加，因此，這不是動(dòng)脈粥樣硬化損傷發(fā)展的結(jié)果，而可能是造成動(dòng)脈粥樣硬化的因素之一。
西式飲食的apoE小鼠與其中式飲食的同類相比，線粒體DNA損傷沒有顯著增加。就此，測(cè)定了各組小鼠的總膽固醇水平和脂類過氧化水平。在apoE小鼠中，西式飲食與顯著(P＜0.05)高于中式飲食的膽固醇水平相關(guān)，但與中式飲食相比未造成脂類過氧化水平顯著升高。所以，以上信息提示中式飲食apoE小鼠內(nèi)的脂類過氧化水平已經(jīng)達(dá)到最大(可能是因?yàn)樗鼈兊幕蛐蛢A向于高血膽固醇)。因此，脂肪含量較高的西式飲食未能提高apoE小鼠內(nèi)的脂類過氧化水平超過中式飲食，這與線粒體損傷的結(jié)果一致，后者在中式飲食和西式飲食的apoE小鼠間沒有差異。所以，在apoE小鼠內(nèi)，雖然西式飲食可使總膽固醇水平高于中式飲食，但不會(huì)顯著提高脂類過氧化總水平，可能反映為什么在apoE小鼠中，線粒體DNA損傷與基因型和年齡的關(guān)系更密切，而與飲食無關(guān)。正如預(yù)料的，高血膽固醇apoE小鼠的膽固醇和脂類過氧化水平顯著高于“健康”的同齡對(duì)照，分別高出4.2-5.7倍(P＜0.001)，1.9-2.7倍(P＜0.05)。雖然已證明，與同齡對(duì)照相比，apoE小鼠中存在著與年齡相關(guān)的脂類過氧化升高，但沒有中式和西式飲食之間脂類過氧化水平比較的報(bào)道。所以，本發(fā)明的結(jié)論表明，雖然西式飲食在apoE小鼠中提高膽固醇水平顯著高于中式飲食，但并不改變脂類過氧化產(chǎn)物的總體水平。
雖然，在c57B1小鼠中，年齡和高脂肪飲食與線粒體DNA損傷顯著增加沒有關(guān)聯(lián)，但是我們發(fā)現(xiàn)，中式飲食對(duì)照鼠的線粒體DNA損傷隨年齡有相當(dāng)程度的增加，而在10周齡小鼠中則發(fā)現(xiàn)損傷因西式飲食而增加的趨勢(shì)。年齡的增高似乎對(duì)中式飲食對(duì)照鼠有作用，但對(duì)西式飲食小鼠作用則較小。10周齡西式飲食對(duì)照鼠也與中式飲食小鼠相比估計(jì)也有較高的線粒體DNA損傷頻率，但在34周齡對(duì)照小鼠中則沒有發(fā)現(xiàn)飲食與線粒體DNA損傷之間的關(guān)聯(lián)，這提示飲食對(duì)于線粒體DNA損傷的作用在低齡對(duì)照小鼠中最顯著。與apoE小鼠中的結(jié)果相反，與中式飲食的對(duì)照鼠相比，西式飲食與脂類過氧化顯著升高(P＜0.05)相關(guān)，說明脂類過氧化在中式飲食“健康”小鼠中并未達(dá)到最大，對(duì)照鼠中脂類過氧化產(chǎn)物隨底物(西式飲食)水平的提高而提高，這與西式飲食對(duì)照鼠的線粒體DNA損傷增加是一致的。
熱量限制和低蛋白質(zhì)飲食曾被認(rèn)為對(duì)許多生物體有利，可延長壽命。因此，兩品系的小鼠在進(jìn)食低蛋白質(zhì)飲食后的線粒體DNA損傷都持續(xù)地顯著低于高蛋白質(zhì)飲食小鼠，這一事實(shí)應(yīng)符合以上觀點(diǎn)。為了更充分地闡述這一發(fā)現(xiàn)，需要對(duì)限制熱量飲食的apoE小鼠進(jìn)行縱向的研究。因?yàn)榈蜔崃匡嬍撑c低反應(yīng)性氧物質(zhì)水平相關(guān)，以上發(fā)現(xiàn)與這樣的觀點(diǎn)一致，即，反應(yīng)性氧物質(zhì)所介導(dǎo)損傷的減少可抑制動(dòng)脈粥樣硬化的形成。
近10年來，已積累了線粒體(損傷和機(jī)能失調(diào))在多種慢性、衰老性相關(guān)疾病中作用的證據(jù)。一個(gè)基本的例子是，線粒體損傷隨時(shí)間在組織內(nèi)積累，引起細(xì)胞OXPHOS電勢(shì)(勢(shì)能)下降，同時(shí)，OXPHOS介導(dǎo)的反應(yīng)性氧物質(zhì)產(chǎn)生增加，表現(xiàn)為細(xì)胞機(jī)能失調(diào)。雖然，已知體外內(nèi)皮細(xì)胞的線粒體易受反應(yīng)性氧物質(zhì)介導(dǎo)的損傷，但也有有關(guān)動(dòng)脈粥樣硬化患者心血管組織內(nèi)線粒體DNA病理性突變?cè)黾拥膱?bào)道，以及病理性線粒體DNA突變與心臟病危發(fā)因素(年齡，吸煙，糖尿病等)相關(guān)的報(bào)道。有意義的是，吸煙、高血壓、高血膽固醇等危發(fā)因素提高反應(yīng)性氧物質(zhì)的產(chǎn)生，此前的報(bào)道稱線粒體是易受損傷的目標(biāo)。雖然，動(dòng)脈粥樣硬化形成是一個(gè)涉及多種步驟的復(fù)雜過程，但本發(fā)明提出動(dòng)脈粥樣硬化損傷發(fā)生的基本機(jī)制之一是從血管組織線粒體損傷積累開始的，最后則造成OXPHOS機(jī)能失調(diào)，和勢(shì)能失代償。這些過程共同造成了反應(yīng)性氧物質(zhì)產(chǎn)生增加(在動(dòng)脈粥樣硬化組織中已提及過的特征)和血管細(xì)胞機(jī)能失調(diào)，在動(dòng)脈內(nèi)形成一個(gè)動(dòng)脈粥樣硬化形成性環(huán)境。
本發(fā)明首次報(bào)道了將動(dòng)脈粥樣硬化小鼠模型的主動(dòng)脈組織與同齡對(duì)照鼠相比所進(jìn)行的對(duì)線粒體DNA損傷水平的研究。結(jié)果顯示，線粒體DNA損傷的增加明顯地與動(dòng)脈粥樣硬化形成和年齡相關(guān)。由于10周齡apoE小鼠內(nèi)存在明顯的線粒體DNA損傷，所以，在該動(dòng)脈粥樣硬化活體模型中，該損傷似乎先于或與動(dòng)脈粥樣硬化損傷的發(fā)展同步。此外，主動(dòng)脈線粒體DNA在體內(nèi)隨年齡增加。而且，apoE基因型似乎對(duì)于線粒體DNA損傷水平的影響更強(qiáng)于飲食，雖然飲食可能在低齡“健康”c57B1小鼠中影響著線粒體DNA損傷。所以，apoE小鼠體內(nèi)的線粒體DNA損傷最后會(huì)導(dǎo)致OXPHOS過程失代償，因此導(dǎo)致內(nèi)皮細(xì)胞機(jī)能失調(diào)，后者是動(dòng)脈粥樣硬化形成的關(guān)鍵。
實(shí)施例18線粒體DNA損傷的活體檢測(cè)征集正在接受心臟導(dǎo)管治療的患者進(jìn)行線粒體DNA損傷活體研究。所有簽名人都同意在進(jìn)行心臟導(dǎo)管治療時(shí)多取一份血樣?？偣?5名患者。用標(biāo)準(zhǔn)技術(shù)分離出白細(xì)胞(“白細(xì)胞層”)，分離出DNA(核DNA和線粒體DNA)。通過定量PCR，用“短線粒體DNA片段”測(cè)定線粒體DNA損傷，以β-球蛋白基因內(nèi)的損傷為對(duì)照。圖11顯示，在具有心肌梗塞危發(fā)因素的患者中，線粒體DNA損傷的幾率升高。
根據(jù)最初的結(jié)果，制定一定水平的線粒體DNA損傷為正常。超出此水平認(rèn)定為高損傷。然后測(cè)定了與心臟病危發(fā)因素相關(guān)的具有線粒體DNA損傷的患者百分比。例如，在吸煙者中，約50％線粒體DNA損傷增加，而非吸煙者中，僅20％線粒體DNA損傷增加。有些情況下具有累加效應(yīng)，既吸煙又有糖尿病的患者中100％的線粒體DNA損傷增加。該分析中，有某種危發(fā)因素顯著不同于沒有該因素者(例如，吸煙(p＜0.05)；吸煙加糖尿病(p＜0.01)；吸煙加高血壓(p＜0.05))。本發(fā)明還根據(jù)線粒體DNA損傷程度檢測(cè)了發(fā)生冠狀動(dòng)脈粥樣硬化的趨勢(shì)。然而，要確定這種趨勢(shì)的顯著性需要更大規(guī)模的患者研究組。
為了進(jìn)一步測(cè)定多種體內(nèi)環(huán)境中線粒體DNA損傷的程度，對(duì)5名“超長馬拉松選手”和一組6名同齡且健康而活躍但不是馬拉松選手的人進(jìn)行了檢測(cè)。首先，在馬拉松選手進(jìn)行20英里“訓(xùn)練跑”之前和之后測(cè)定線粒體DNA損傷。采集血樣，獲得白細(xì)胞層，評(píng)估線粒體DNA損傷。圖12顯示剛跑完時(shí)，線粒體DNA損傷略有增加，但經(jīng)4小時(shí)后恢復(fù)正常。另一天，給予馬拉松選手和對(duì)照高脂肪食物。該高脂肪食物是當(dāng)?shù)匾患夷鞲绮蛷d的“EI Grande Platter”，含約3000卡熱量，其中約60-70％來自脂肪。餐后立即，餐后2小時(shí)和6小時(shí)采集血樣。制備白細(xì)胞層，分離DNA。用白細(xì)胞線粒體蛋白質(zhì)為來源，定量測(cè)定線粒體蛋白質(zhì)損傷。圖13和14顯示對(duì)照體內(nèi)，線粒體DNA損傷逐步略有升高，2小時(shí)時(shí)，線粒體蛋白質(zhì)損傷增加，4小時(shí)時(shí)下降。在馬拉松選手中，在2小時(shí)時(shí)，線粒體DNA損傷和蛋白質(zhì)損傷實(shí)際上已降至基線以下，至6小時(shí)開始返回基線。假設(shè)，馬拉松選手因奔跑時(shí)受到增高的氧化應(yīng)力，所以他們的抗氧化保護(hù)系統(tǒng)更有效。于是，在接觸DNA損傷的刺激時(shí)，他們的損傷比普通人更少。因此，他們的抗氧化系統(tǒng)被激活，使他們產(chǎn)生的氧化劑水平降至靜息水平以下。
實(shí)施例19動(dòng)脈粥樣硬化主動(dòng)脈和健康主動(dòng)脈內(nèi)的mtDNA損傷分析為了檢測(cè)人動(dòng)脈粥樣硬化組織內(nèi)的mtDNA損傷是否增加，對(duì)同齡人的動(dòng)脈粥樣硬化主動(dòng)脈和健康主動(dòng)脈進(jìn)行DNA損傷分析。將各組的主動(dòng)脈固定在4％低聚甲醛中，包在石蠟中，切成5微米的切片，脫蠟，復(fù)水，以蘇木精和伊紅染色，評(píng)估動(dòng)脈粥樣硬化損傷的發(fā)生情況。
QPCR分析顯示動(dòng)脈粥樣硬化組織內(nèi)的mtDNA損傷的增加顯著高于健康對(duì)照組的主動(dòng)脈(圖15A和15B)。相反，作為核DNA損傷的標(biāo)志，動(dòng)脈粥樣硬化主動(dòng)脈內(nèi)的β-球蛋白基因簇與對(duì)照相比，沒有明顯的持續(xù)損傷(P＝0.15)。因此，在人動(dòng)脈粥樣硬化主動(dòng)脈內(nèi)，mtDNA遭受持續(xù)顯著而且專性的損傷。
實(shí)施例20mtDNA損傷對(duì)動(dòng)脈粥樣硬化的影響動(dòng)脈粥樣硬化主動(dòng)脈組織的mtDNA損傷水平與同齡對(duì)照相比顯示，mtDNA損傷增加顯然與動(dòng)脈粥樣硬化形成相關(guān)。由于3周齡和10周齡apoE-/-小鼠內(nèi)有顯著的mtDNA損傷，所以，在體內(nèi)，損傷似乎先于或與動(dòng)脈粥樣硬化損傷同時(shí)發(fā)生。而且，在apoE-/-，SOD2-/+雜交鼠內(nèi)，動(dòng)脈粥樣硬化損傷頻率和主動(dòng)脈mtDNA損傷都高于同窩的apoE-/-鼠，顯然，線粒體的功能對(duì)于動(dòng)脈粥樣硬化形成十分重要。所以，以上信息提示1)在人和小時(shí)的動(dòng)脈粥樣硬化主動(dòng)脈內(nèi)，mtDNA損傷都顯著增加；2)主動(dòng)脈mtDNA損傷在活體內(nèi)隨年齡而增加；3)在體內(nèi)，mtDNA損傷先于或與動(dòng)脈粥樣硬化損傷產(chǎn)生同時(shí)發(fā)生；4)線粒體損傷是動(dòng)脈粥樣硬化的一個(gè)主要因素。
以下是本發(fā)明的參考文獻(xiàn)1.Carpenter等(1995)，動(dòng)脈粥樣硬化118，169-172。
2.Halliwell，B.等(1989)，英國實(shí)驗(yàn)病理學(xué)雜志70，737-757。
3.Berliner等(1996)，自由基生物醫(yī)學(xué)20，707-727。
4.Massaeli等(1995)，心血管研究29，597-603。
5.Freeman等(1995)，高級(jí)藥理學(xué)34，45-69。
6.Corral-Debrinski等(1992)，Mut.Res.275，169-180。
7.Parthasarathy等(1992)，脂類研究進(jìn)展31，127-143。
8.Berliner等(1995)，循環(huán)91，2499-2496。
9.Kimura等(1995)，動(dòng)脈粥樣硬化118，1-8。
10.Darley-Usmar等(1992)，自由基研究通訊17，9-20。
11.Graham等(1993)FEBS Lett 330，181-185。
12.Forman，H.J.(1982)自由基生物學(xué)，第V卷，Prior，W.A.編輯(AcademicPress，Orlando)，pp.65-90。
13.Turrens，J.(1980)，生物化學(xué)雜志191，421-427。
14.Bobreris，A.，Turrens，J.F.(1980)，超氧化物和超氧化物歧化酶的化學(xué)和生物化學(xué)，第I卷，Bannister，J.V.編輯(Elsevier，Amsterdam)pp.84-91。
15.Chance等(1979)，生理學(xué)回顧，59，527-604。
16.Breen等(1995)，自由基生物醫(yī)學(xué)18，1033-1077。
17.Chen等(1994)，美國科學(xué)院院報(bào)91，4130-4134。
18.Zhang等(1990)，生物化學(xué)雜志，265，16330-16336。
19.Bandy等(1990)，自由基生物醫(yī)學(xué)，8，523-539。
20.Ferrari等(1985)，分子細(xì)胞心臟病學(xué)雜志，17，937-45。
21.McCord，J.M.(1988)，自由基生物醫(yī)學(xué)，4，9-14。
22.Giulivi等(1995)，生物化學(xué)和生物物理學(xué)學(xué)報(bào)，316，909-916。
23.Bindoli，A.(1988)，自由基生物醫(yī)學(xué)，5，247-261。
24.Hruszkewyca，A.M.(1992)，突變研究，275，243-248。
25.Yakes，等(1997)，美國科學(xué)院院報(bào)，94，514-519。
26.Adachi等(1993)，生物化學(xué)生物物理學(xué)研究通訊，195，945-951。
27.Trounce等(1989)，柳葉刀，1，637-639。
28.Cortopassi等(1990)，核酸研究，18，6927-6933。
29.Sastre等(1996)，肝臟學(xué)，24，1199-1205。
30.Iyer等(1961)，自然，192，535-541。
31.Beckman等(1990)，美國科學(xué)院院報(bào)，87，1620-1624。
32.Balligner等(1996)，癌癥研究，56，5692-5697。
33.Yakes等(1996)，檢測(cè)DNA損傷和突變的技術(shù)，Pfeifer，G.P.編(Plenum，NY)，169-182。
34.Chirgwin等(1979)，生物化學(xué)，18，5294-5299。
35.Torroni等(1990)，生物化學(xué)雜志，265，20589-20593。
36.Bogenhagen等(1978)，分子生物學(xué)雜志，119，69-81。
37.Ballinger等(1992)，自然遺傳，1，11-15。
38.Slater等(1963)，生物化學(xué)和生物物理學(xué)學(xué)報(bào)，77，383-393。
39.Berg等(1990)，APMIS，98，152-162。
40.Lippold HJ.(1982)，組織化學(xué)，76，381-405。
41.Schanenstein等(1972)，Monatshefte fur Chemie，103，1271-1275。
42.Huet等(1992)，細(xì)胞計(jì)數(shù)，13，532-539。
43.Ojala等(1980)，細(xì)胞，22，393-403。
44.Ojala等(1981)，自然，290，470-474。
45.Attardi等(1985)，線粒體研究的成果與前景，Qkuagliarello等編(ElsevierScience，NY)，145-163。
46.Doerson等(1985)，生物化學(xué)雜志，260，5942-5949。
47.Christianson等(1986)，美國科學(xué)院院報(bào)，83，6277-6281。
48.Christianson等(1988)，分子細(xì)胞生物學(xué)，8，4502-4509。
49.Huie等(1993)，自由基研究通訊，18，195-199。
50.Plamer等(1988)，自然333，664-666。
51.Yao等(1992)，循環(huán)，86，1302-1309。
52.Garg，U.C.，Hassid，A.(1989)，臨床研究雜志，83，1774-1777。
53.Fossel等(1994)，癌癥研究，54，1240-1248。
54.Holland等(1996)，細(xì)胞物理學(xué)雜志，166，144-151。
55.Leeuwenburgh等(1997)，生物化學(xué)雜志，272，1433-1436。
56.Beckmann等(1994)，生物化學(xué)，375，81-88。
57.MacMillan-Crow等(1996)，美國科學(xué)院院報(bào)，93，11853-11858。
58.MacMillan-Crow等(1998)，生物化學(xué)，37，1613-1622。
59.Lloyd-Jones等(1996)，醫(yī)學(xué)評(píng)論年刊，47，365-375。
60.Darley-Usmar等(1995)，F(xiàn)EBS Letters 369，131-135。
61.Goda等(1996)，美國物理學(xué)雜志，271，H1893-1899。
所有本文中提到的專利和出版論文都反映了本領(lǐng)域技術(shù)人員的水平。而且，本發(fā)明對(duì)這些專利和出版論文進(jìn)行了同樣程度的引用，猶如本發(fā)明對(duì)各出版論文的具體單獨(dú)引用。
本領(lǐng)域技術(shù)人員不難看出，本發(fā)明能夠達(dá)到所述的目的和優(yōu)點(diǎn)，以及隱含于其中的固有目的和優(yōu)點(diǎn)。以上實(shí)施例，方法，過程，處理方法，分子以及具體的化合物代表著優(yōu)選實(shí)施方式，是舉例，而不是對(duì)本發(fā)明范圍的限定。本領(lǐng)域技術(shù)人員不難看出其他改變和用途都為本發(fā)明精神和范圍所涵蓋。
權(quán)利要求
1.一種評(píng)估個(gè)體動(dòng)脈粥樣硬化狀態(tài)的方法，包括(a)采集所述個(gè)體的有意義組織；(b)測(cè)定所述有意義組織中的線粒體DNA損傷量；(c)將所述個(gè)體有意義組織內(nèi)的線粒體DNA損傷量與無動(dòng)脈粥樣硬化對(duì)照個(gè)體的有意義組織內(nèi)的線粒體DNA損傷量比較，危發(fā)個(gè)體線粒體DNA損傷量高于所述對(duì)照個(gè)體表明該個(gè)體患有動(dòng)脈粥樣硬化。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其中通過定量PCR測(cè)定所述線粒體DNA損傷。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其中所述個(gè)體至少具有一個(gè)與動(dòng)脈粥樣硬化相關(guān)的危發(fā)因素。
4.根據(jù)權(quán)利要求3所述的方法，其中所述的危發(fā)因素選自吸煙，高血壓，糖尿病，肥胖，高血膽固醇和高血脂。
5.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其中通過以下測(cè)定來評(píng)估線粒體DNA損傷線粒體mRNA產(chǎn)生測(cè)定，線粒體蛋白質(zhì)產(chǎn)生測(cè)定，線粒體氧化磷酸化變化測(cè)定和線粒體ATP產(chǎn)生變化測(cè)定。
6.一種測(cè)定個(gè)體內(nèi)氧化應(yīng)力的方法，包括(a)采集所述個(gè)體的有意義組織；(b)測(cè)定所述有意義組織內(nèi)的線粒體DNA損傷；(c)測(cè)定所述有意義組織內(nèi)一核基因中的DNA損傷；(d)比較線粒體DNA和核基因DNA之間單位長度上的DNA損傷量，線粒體DNA單位長度上的DNA損傷量高于核DNA表明所述個(gè)體內(nèi)氧化應(yīng)力升高。
7.根據(jù)權(quán)利要求6所述的方法，其中所述的核基因選自β-球蛋白基因座，轉(zhuǎn)錄活性基因和非轉(zhuǎn)錄活性基因。
8.根據(jù)權(quán)利要求6所述的方法，其中通過定量PCR測(cè)定所述線粒體的DNA損傷和所述核基因的DNA損傷。
9.根據(jù)權(quán)利要求6所述的方法，其中氧化應(yīng)力的升高可預(yù)報(bào)動(dòng)脈粥樣硬化形成，高血壓，糖尿病，高血膽固醇，吸煙，衰老性退行性疾病和癌癥。
10.根據(jù)權(quán)利要求6所述的方法，其中通過以下測(cè)定來評(píng)估線粒體DNA損傷線粒體mRNA產(chǎn)生測(cè)定，線粒體蛋白質(zhì)產(chǎn)生測(cè)定，線粒體氧化磷酸化變化測(cè)定和線粒體ATP產(chǎn)生變化測(cè)定。
11.一種測(cè)定藥物降低個(gè)體動(dòng)脈粥樣硬化危發(fā)性的效力的方法，包括(a)采集所述個(gè)體的有意義組織，然后將藥物給予個(gè)體；(b)測(cè)定所采集有意義組織內(nèi)的線粒體DNA損傷量，處理后線粒體DNA損傷量下降表明該處理可降低動(dòng)脈粥樣硬化危發(fā)性。
12.根據(jù)權(quán)利要求11所述的方法，其中通過定量PCR測(cè)定所述線粒體DNA損傷。
13.根據(jù)權(quán)利要求11所述的方法，其中通過以下測(cè)定來評(píng)估線粒體DNA損傷線粒體mRNA產(chǎn)生測(cè)定，線粒體蛋白質(zhì)產(chǎn)生測(cè)定，線粒體氧化磷酸化變化測(cè)定和線粒體ATP產(chǎn)生變化測(cè)定。
全文摘要
本發(fā)明證明,線粒體DNA損傷的發(fā)生先于動(dòng)脈粥樣硬化損傷的發(fā)展,或與之同步;主動(dòng)脈線粒體DNA損傷隨年齡增加;而且,基因型和飲食都會(huì)影響線粒體DNA損傷程度。因此,本發(fā)明證明,線粒體DNA損傷發(fā)生于動(dòng)脈粥樣硬化的早期,可能是動(dòng)脈粥樣硬化形成的引發(fā)因素,并基于此提供了一種根據(jù)線粒體DNA損傷量來預(yù)報(bào)冠狀動(dòng)脈粥樣硬化性心臟病的方法。
文檔編號(hào)G01N33/48GK1341118SQ00804048
公開日2002年3月20日 申請(qǐng)日期2000年1月14日 優(yōu)先權(quán)日1999年1月14日
發(fā)明者M·S·朗格, S·W·巴林杰, B·范豪藤 申請(qǐng)人:研究發(fā)展基金會(huì)