專利名稱：超高靈敏度熒光顯微探測與處理系統(tǒng)的制作方法
技術(shù)領域：
本發(fā)明屬于熒光顯微成像探測與處理技術(shù)。
目前在生物醫(yī)學領域中已經(jīng)有很多發(fā)展成熟的用于各種發(fā)光現(xiàn)象的檢測儀器，為推動生物發(fā)光的研究發(fā)揮了重要作用。同時，在應用過程中又不斷提出新問題，對探測儀器提出新的要求，也促進了探測儀器的發(fā)展，僅熒光顯微成像系統(tǒng)近年來又有了長足進步。
所謂熒光顯微成像技術(shù)包含兩方面的含義。首先，顯微技術(shù)研究的對象是以細胞為代表的微觀對象，細胞作為有機體結(jié)構(gòu)與生命活動的基本單位，具有獨立的、有序的自控代謝體系，在生命科學研究中具有不可替代的位置，對細胞生命活動基本規(guī)律的研究是一切生命科學的重要基礎。對細胞形態(tài)結(jié)構(gòu)的觀察主要有光學顯微鏡技術(shù)，電子顯微鏡技術(shù)和掃描隧道顯微鏡；盡管光學顯微鏡的分辨率不及后兩者，但是由于電子顯微鏡和掃描隧道顯微鏡只能觀察死細胞，而且對實驗條件和操作條件的要求都非常嚴格，儀器的價格也非常昂貴，在細胞學研究中光學顯微鏡仍然是最重要的觀察工具。
熒光顯微成像技術(shù)的另一方面是熒光成像。熒光顯微鏡依據(jù)受激熒光的原理，利用一定波長的光使樣品受到激發(fā)，產(chǎn)生不同顏色的熒光，以用來觀察和分辨樣品中某些物質(zhì)及其性質(zhì)，在生物學和醫(yī)學中有著廣泛的用途。當細胞中某些固有物質(zhì)(如蛋白質(zhì)、DNA等)或細胞中有外部引進的熒光物質(zhì)如熒光標記物、光敏化劑等在受到外部短波長光的激發(fā)時，會發(fā)出比激發(fā)波長略長的另一種波長的熒光。用熒光顯微鏡觀察吸收了熒光物質(zhì)的細胞，就能夠觀察到熒光物質(zhì)在細胞內(nèi)部的分布情況，如果能夠通過圖象采集系統(tǒng)得到分布圖象，就成為熒光顯微成像技術(shù)。它與常規(guī)的顯微鏡所得到的細胞染色圖象不同，從另一個側(cè)面反映了細胞內(nèi)部物質(zhì)的分布和組成。盡管光學顯微鏡的分辨極限一般只能達到微米量級，熒光顯微鏡借助于熒光標記物對不同細胞器的特異性結(jié)合，可以觀察到一些較小的亞細胞結(jié)構(gòu)。
80年代以來，光電技術(shù)和計算機技術(shù)的飛速發(fā)展，為熒光顯微技術(shù)的進步創(chuàng)造了良好的條件，許多新型熒光顯微鏡應運而生，其中具有代表性的有激光共聚焦熒光顯微鏡，時間分辨熒光顯微鏡，偏振熒光顯微鏡，三維成像熒光顯微鏡和快速多光譜熒光顯微鏡等。這些熒光顯微鏡的出現(xiàn)為生物醫(yī)學的發(fā)展提供了新的手段和方法。
進入90年代以后，由于科學研究的需要又使熒光顯微成像技術(shù)面臨新的問題。第一，由于生物學中對細胞的研究趨向于近真實條件，為盡量減少外界環(huán)境對細胞正常生理狀態(tài)的影響，這就要求采用更低濃度的熒光標記物，減弱激發(fā)光的強度等；但是普通熒光顯微鏡的靈敏度不高，很難獲得微弱的熒光圖像。第二，盡管細胞是生物體的基本單位，其內(nèi)部結(jié)構(gòu)仍然可分為許多細微結(jié)構(gòu)；如果需要進一步分析這些結(jié)構(gòu)，層析技術(shù)是必需的；目前能夠?qū)崿F(xiàn)細胞層析技術(shù)的只有激光共聚焦熒光顯微鏡。但由于第三，一般的熒光顯微鏡無法定量地給出圖像發(fā)光的強度數(shù)值，而大量的科學研究，如細胞第二信使(如Ca2+)實驗機理的分析，需要定量顯示。第四，由于熒光圖像是由暗背景上分布的亮斑組成，現(xiàn)有熒光顯微鏡不能準確判斷熒光在細胞中的發(fā)光位置；第五，需要研究細胞熒光圖像的動力學特征，以及適合熒光圖像特點的圖像處理軟件。
針對這些問題，使得熒光顯微鏡的發(fā)展向快速采集，高分辨率，高靈敏度，寬動態(tài)范圍，多功能化的方向發(fā)展。除了前面提到的激光共聚焦熒光顯微鏡得到進一步的完善外，一些著名的顯微鏡生產(chǎn)廠家，如Olympus，Zeiss等都先后推出了以光電倍增管為探測器的高靈敏度的熒光顯微鏡，我國自行研制的同類產(chǎn)品至今沒有推向市場。此類高精度儀器不僅價格昂貴，而且維持運轉(zhuǎn)的費用也相當可觀，非一般的用戶所能承受。因此，研制適用于科研和一般觀察需要，充分利用現(xiàn)有實驗基礎的新型微弱光信息探測儀器，就成了一個急待解決的問題。
為此，將圖象融合技術(shù)引入顯微圖象的探測與處理，提供了一種具有圖象融合處理功能的超高靈敏度熒光顯微探測與處理系統(tǒng)。該系統(tǒng)運用了信號檢測與評估的方法對小樣本光子圖像進行統(tǒng)計處理，得到信噪比改善的光子圖像。該系統(tǒng)中還增加了對光子圖象進行計算機模擬的功能。
本發(fā)明為實現(xiàn)上述目的提出如下技術(shù)方案該系統(tǒng)包括高靈敏度熒光顯微鏡和圖象處理軟件兩部分熒光顯微鏡中的顯微鏡由同軸的超高壓汞燈、聚光鏡、濾色片、可調(diào)光孔、暗視野集光器、物鏡、半反射鏡、耦合透鏡及目鏡組成，其耦合透鏡與可移動反射鏡相連，與光軸成45°角的可移動反射鏡與像增強器相連，像增強器陰極面入射面附近設置有可插入干涉濾色片或擋光板的多功能插孔，可移動反射鏡分別與像增強器和CCD相連，像增強器和CCD相連，像增強器與CCD之間設置有耦合透鏡，CCD與圖象采集板相連，圖象采集板與計算機相連；顯微鏡中的暗視野集光器的焦距為3mm～30mm；像增強器上設置有保護裝置，該保護裝置包括磁鐵、干簧繼電器及電源，干簧繼電器固定于顯微鏡上，暗視野集光器上裝磁鐵，電源與像增強器、干簧繼電器串聯(lián)；本系統(tǒng)的光源由超高壓汞燈、循環(huán)水冷卻器、金屬遮光盒、出水管、入水管、循環(huán)水泵及聚光鏡組成，金屬遮光盒底部開有透光孔，孔內(nèi)裝一聚光鏡，聚光鏡上方是超高壓汞燈，金屬遮光盒上設置有循環(huán)水冷卻器，循環(huán)水冷卻器頂部裝有出水管和入水管，出水管和入水管又與循環(huán)水泵相連；圖象處理軟件包括圖象融合、光子圖象處理及光子圖象模擬；計算機對光子圖象的圖象處理式為K>(λs-λn)/ln(λsλn)]]>λs＝E(P1) λn＝E(P0)其中，K為光子個數(shù)，λs及λn為信號區(qū)和噪聲區(qū)光子數(shù)量的期望值，P1和P0為光子樣本x在信號區(qū)和噪聲區(qū)的概率密度函數(shù)；計算機對光子圖象以及光子圖象處理過程模擬采用的方法為通過對要模擬的圖像[IMG]的分析，生成一矩陣[P]，其元素值正比于圖象[IMG]相應元素的灰度值。矩陣[P]的每一元素代表該象素在一幀光子圖象中出現(xiàn)光子的幾率[P]＝[IMG]/(K×GRAY)其中[IMG]為n×n圖像矩陣；GRAY為灰度等級，通常為256級；K用于根據(jù)要模擬的發(fā)光水平來控制光子圖象的光子總數(shù)；[P]即為圖像對應的概率分布函數(shù)矩陣，矩陣中每一元素值對應相應象素點在一幀光子圖象中出現(xiàn)光子的分布函數(shù)。由計算機模擬一泊松分布，使該分布大于閾值TH(i，j)的概率為P(i，j)，于是可以推出TH(i，j)的值，這樣遍歷了矩陣[P]后，可以得到對應的閾值矩陣[TH]。然后生成一隨機矩陣[RND]，其對應元素RND[i，j]的值隨機出現(xiàn)并服泊松分布。當RND(i，j)＞TH(i，j)時，認為點X(i，j)出現(xiàn)光子，否則認為該點沒有出現(xiàn)光子，比較后得到一個新的2值矩陣[X]，矩陣元素中1表示對應象素出現(xiàn)光子，0表示對應象素沒有光子。由其生成的過程可知，X(i，j)出現(xiàn)1的概率為P(i，j)，矩陣[X]即為模擬的光子圖象。
超高靈敏度熒光顯微探測與處理系統(tǒng)具有以下主要性能和特點1.靈敏度高，對樣品可實現(xiàn)小樣本光子圖象探測；2.運用圖像融合技術(shù)，實現(xiàn)熒光的準確定位；3.可研究細胞熒光圖像的動力學特征；4.樣品適用范圍廣，適合于觀察切片和活細胞；5.圖像處理軟件功能完善，操作方便；可實現(xiàn)對小樣本光子圖象的處理，提高圖象的分辨率；6.可實現(xiàn)生物超微弱發(fā)光的計算機模擬，降低成本，提高效率，對實驗具有指導作用。
本發(fā)明的具體結(jié)構(gòu)由附

圖1～5.5給出。
圖1為超高靈敏度熒光顯微探測與處理系統(tǒng)原理框2為像增強器保護電路3為系統(tǒng)光源結(jié)構(gòu)示意4.1為處理前2129個光子的圖象圖4.2a為背景噪聲分布4.2b為背景噪聲概率分布4.3為圖4.1的概率分布4.4a為圖4.1處理后圖象圖4.4b為C14輻射光源外形5.1a為計算機模擬的單幀光子圖像，圖5.1b為計算機模擬的200幀光子圖像的疊加圖5.1c為計算機模擬的5000幀光子圖像疊加圖5.1d為實際的Hela細胞的熒光圖像(原圖)圖5.2為累積光子圖象的積分數(shù)目與原圖象5.1d的均方根差rms關系圖5.3為均方根差rms與積分光子圖象總數(shù)m的m-1/2的關系曲線圖5.4為計算機模擬的信噪比為1的光子圖象圖5.5為計算機模擬的1000幅信噪比為1的光子圖象積分中主要結(jié)構(gòu)為超高壓汞燈1、循環(huán)水冷卻器1a、金屬遮光盒1b、出水管1c、入水管1d、循環(huán)水泵1e、聚光鏡2、濾色片3、可調(diào)光孔4、暗視野集光器5、樣品6、物鏡7、半反射鏡8、目鏡9、耦合透鏡10、濾色片11、可移動反射鏡12、CCD13、多功能插孔14、像增強器15、耦合透鏡16、CCD17、圖象采集板18、計算機19、磁鐵20、干簧繼電器21、電源22。
下面結(jié)合附圖對本發(fā)明加以詳細說明。
在同一系統(tǒng)上獲得細胞的熒光圖像和普通透射圖像必須考慮許多因素，如透射圖像與熒光圖象的測試條件不同，熒光圖象的獲得需要暗視野集光器和合適的激發(fā)波長，當熒光較弱時，為了得到高質(zhì)量的熒光圖象，還要使用像增強器對圖像進行增強；而在透射圖像的獲得過程中，所用光源僅僅用于照明，未染色的活細胞本身呈半透明狀態(tài)，對比度較低，因此必須有充足的光線照明，才能得到較高的圖像對比度。為了使兩種圖像都獲得較好的視覺效果，圖像的采集必須通過兩條光路。光源中的超高壓汞燈(1)出射的光經(jīng)聚光鏡(2)后成為平行光，此平行光通過濾色片(3)后成為單色激發(fā)光后經(jīng)過可調(diào)光孔(4)和暗視野集光器(5)照射到生物樣品(6)上。生物樣品所激發(fā)的熒光通過物鏡(7)后分為兩路一路被半反射鏡(8)反射經(jīng)過目鏡(9)進入人眼，另一路透過半反射鏡后通過耦合透鏡(10)進入采集系統(tǒng)。如采集的是熒光圖象，此時裝在反射鏡抽插裝置中的且與光軸成45°角的可移動反射鏡(12)被移出光路，抽出反射鏡，使出射光全部通過像增強器。裝在多功能插孔(14)中的濾色片(11)濾除激發(fā)光而僅通過被激發(fā)的熒光，該熒光再進入像增強器(15)被放大，增益可達106。被增強的圖象通過耦合透鏡(16)后進入CCD(17)成為圖象信號被圖象采集板(18)采集后送入計算機(19)進行處理。當采集透射圖像時，去掉暗視野集光器(5)，以便獲得充分的照明，將可移動反射鏡(12)推到與光軸成45°角的指定位置，使出射光束全部反射到另一光路，光線從耦合透鏡(10)出射后，經(jīng)反射鏡(12)后進入CCD(13)成為圖象信號被圖象采集板(18)采集后送入計算機(19)進行處理。此方案的突出優(yōu)點是利用顯微鏡的出射光效率較高，熒光圖像無光能損失，采集透射圖像時光能損失僅取決于反射鏡的反射率，而一般反射鏡的反射率都較高，能滿足要求。
本系統(tǒng)采用C2166-01型微通道板像增強器作為光強放大裝置，其光子能量放大裝置是兩級微通道板(microchannel plate，MCP)，當光子入射到像增強器光陰極上時，經(jīng)兩級MCP被放大106數(shù)量級。光子在放大過程中保持空間信息不丟失；熒光屏上光斑用通常的光電成像裝置CCD(MINTRON MTV-1801CB或1802CB)即可接收，從而實現(xiàn)對單個光子時間和空間信息的記錄。C2166-01微通道板像增強器的基本參數(shù)如表1所示。以微通道板像增強器為核心，與CCD耦合構(gòu)成超高靈敏度熒光顯微鏡系統(tǒng)的圖像采集部分，使該系統(tǒng)不僅具有極高的放大能力，還具有較好的空間和時間分辨率。
表1 C2166-01微通道板像增強器基本參數(shù)在實驗過程中，通過循環(huán)水致冷減小微通道板像增強器和光陰極的噪聲，同時盡可能排除外界雜散光的影響，在-15℃時儀器的暗噪聲小于0.5cps/mm2，可實現(xiàn)光子計數(shù)成像，完全滿足研究極微弱熒光的條件。因此可以減少熒光標記物的用量，使樣品在近真實條件下觀察；在熒光圖像的采集光路中，由于像增強器陰極面承受的最大照度極為有限，超過規(guī)定值會損害儀器；為了防止像增強器受損，首先在像增強器陰極面入射面附近設置一個多功能插孔(14)，當采集熒光圖像時，可插入干涉濾色片(11)，選擇透過一定波長的熒光；當采集透射圖像時，可插入特制的擋光板，使激發(fā)光和雜散光完全被阻擋，起到保護像增強器(15)的作用且在像增強器上裝有保護裝置，保護裝置如圖2所示，該保護裝置包括磁鐵(20)、干簧繼電器(21)及電源(22)，將干簧繼電器(21)固定于顯微鏡上，在暗視野集光器上裝磁鐵(20)，當暗視野集光器在顯微鏡上時，干簧繼電器吸合，像增強器電源接通可以工作。當暗視野集光器被取下時，像增強器的電源(22)自動被切斷，使其停止工作，不會因為過強光線的進入而受到損傷。
為了實現(xiàn)對樣品動態(tài)特征的觀察，必須采用具有快速采集功能的圖象采集卡。本系統(tǒng)采用中科院自動化所科技嘉公司生產(chǎn)的CA-MPE-1000圖像采集卡，可實現(xiàn)三路視頻切換輸入，保證了熒光圖像和透射圖像能夠切換采集；圖像采集菜單還包括單幀采集，實時采集，序列采集，循環(huán)采集，采集漫游等功能，采集速率最高為25幀/秒，基本滿足對樣品動態(tài)特征的觀察需要。
通常熒光顯微鏡所采用的暗視野集光器，工作距離很小，只能觀察樣品的切片，特別是放大倍數(shù)較大時操作比較困難。本發(fā)明改進了暗視野集光器的焦距使其工作距離為3mm～30mm，這樣不僅可觀察樣品的切片，而且可用于研究培養(yǎng)皿中活細胞的形態(tài)變化和生理反應，拓寬了觀察樣品的范圍。
改進后的系統(tǒng)激發(fā)光源由于成像系統(tǒng)工作所要求的暗室條件，因此將超高壓汞燈(1)密封在一金屬遮光盒(1b)中，遮光盒底部開有直徑5厘米的透光孔，孔內(nèi)裝一聚光鏡(2)，聚光鏡上方是100瓦超高壓汞燈(1)，汞燈的出射光經(jīng)聚光鏡后成為平行光。由于超高壓汞燈工作于密閉環(huán)境而容易使工作溫度上升而影響發(fā)光的穩(wěn)定性，因此在金屬遮光盒的上方裝入了循環(huán)水冷卻器(1a)，冷卻器內(nèi)的水經(jīng)出水管(1c)和入水管(1d)通過循環(huán)水泵(1e)進行循環(huán)冷卻，將汞燈多余的熱量帶走而達到使光源工作穩(wěn)定。本系統(tǒng)采用100W超高壓汞燈作為激發(fā)光源，而通常的熒光顯微鏡則需要200W，進一步降低了激發(fā)光源的能量。
在保證對樣品的熒光圖象和透射圖象都可以方便地觀察的基礎上，采用圖象融合技術(shù)，將熒光圖象和對應的透射圖象合成一幅圖象，就可以實現(xiàn)在透射圖象的背景上顯示熒光圖象的目的，從而準確判斷熒光圖象的發(fā)光位置，這對于分析樣品的發(fā)光機理是非常重要的。實現(xiàn)圖象融合要求被融合的兩幅或多幅圖象必須嚴格配準，因此為了保證熒光圖像和透射圖像的完全配準，可移動反射鏡(12)的前后位置、左右、俯仰角均可自由微調(diào)，實驗前對系統(tǒng)進行配準校驗；此外進行圖像獲取的兩個CCD位置可調(diào)，且采用同樣型號(敏通MTV-1801CB或1802CB)，保證兩幅圖像的分辨率、文件格式和圖像比例一致，從硬件上基本實現(xiàn)兩幅圖像的粗配準。在此基礎上，再通過軟件的后期圖像處理實現(xiàn)更精確的圖像配準，利用圖像任意角度旋轉(zhuǎn)、實數(shù)倍縮放、鏡像變換等處理，達到兩幅圖像完全匹配(象素級細配準)，為圖像融合作好準備。
圖象處理軟件圖象處理軟件是對獲取的樣品信息的后期處理，對于混雜有系統(tǒng)噪聲的光學圖象來說是必不可少的。本系統(tǒng)所配備的軟件能夠?qū)崿F(xiàn)基于Windows環(huán)境操作，支持多文檔窗口的編輯，可以同時打開多個窗口；具有量化顯示圖像信息及研究圖像動力學特征的功能。對微弱圖像可采用序列累加，增強圖像及多種算法消除噪聲。同時，該軟件還可以實現(xiàn)圖象融合，對小樣本光子圖象的統(tǒng)計處理以及小樣本光子的圖象的計算機仿真。現(xiàn)簡要介紹這三項功能。
圖象融合處理圖像融合技術(shù)是近年來在遙感，計算機視覺和醫(yī)學等領域中廣泛研究的“數(shù)據(jù)融合”中以圖像為研究對象的技術(shù)，它把對同一目標或場景用不同傳感器所獲得的圖象或用同一傳感器用不同方式所獲得的多重圖象合成一幅圖象，在這幅圖象中能反映多重原始圖象中的信息，以達到對目標和場景更精確、更全面的分析和判斷。
生物圖像，特別是細胞的熒光圖像，具有信號弱，信噪比低，信息量小的特點，而且許多重要信息反映在圖象的一些細微變化上；細胞的熒光圖像主要反映了細胞內(nèi)某些熒光物質(zhì)的分布，缺乏細胞形態(tài)方面的信息，尤其當熒光較弱時，進行判斷和分析就更為困難，需要借助于其它生化手段。為了準確判斷熒光的發(fā)光位置，我們將遙感等領域中已經(jīng)運用得較為成熟的圖像融合技術(shù)引入到生物圖像處理中，將熒光圖像與其對應的透射圖像進行融合，使融合圖象充分顯示源圖像的信息，既體現(xiàn)了細胞中熒光物質(zhì)的分布，又有細胞的形態(tài)特征，實現(xiàn)了細胞的熒光定位。圖像清晰、直觀，信息量增加，具有改善圖像置信度，降低模糊度，提高了檢測性能和空間分辨能力的優(yōu)點，最大限度地發(fā)掘細胞圖像的信息資源，更有利于分析和判斷其生物機理和含義。這項操作方便、快捷、準確，比一般的生化手段大大提高了實驗效率，且也減少了實驗的費用，在生物學上具有重要意義。
我們針對生物圖象的特點，采用圖象處理中的多種融合算法，包括基于小波變換的算法有取系數(shù)絕對值較大值算法，改進取系數(shù)絕對值較大值算法的突出主題圖象法，加權(quán)平均法，改進的消除高頻噪聲法，以及針對生物顯微圖象特點提出的一種新算法——雙閾值法；其它類型的三種算法直接映射法，邏輯OR算法，Toet算法等融合算法對圖象進行處理，利用灰度、偽彩色兩種顯示方式，從而實現(xiàn)了在透射圖象背景上顯示熒光圖象的目的，可以準確判斷熒光的發(fā)光位置，對進一步分析發(fā)光機理非常有利。
對小樣本光子圖象的統(tǒng)計處理在微弱光探測中，對極微弱光輻射(100--104Photons/cm2·s)的探測已作為一種重要探測手段運用于生物醫(yī)學，天文等領域。由于發(fā)光物體的發(fā)光強度極弱，大致為0～100光子計數(shù)/平方厘米·秒，因此必須使用靈敏度極高的光子成像系統(tǒng)才能探測到如此低水平的光子發(fā)射。光子圖象極大地區(qū)別于傳統(tǒng)的灰度圖象，光子圖象表現(xiàn)為二值分布，即對像面上的一點，只存在有無光子兩種可能。因此對光子圖象的處理也有別于傳統(tǒng)的圖象處理方式。當光子總計數(shù)遠小于像素數(shù)時，我們稱此光子圖像為小樣本光子圖像。在小樣本光子圖像的處理中，由于光子的量子性，光子并不遵循幾何光學中的預定軌道傳送，而是服從于統(tǒng)計分布，因而通常用統(tǒng)計理論來研究少數(shù)光子在時間和空間上的分布。
超微弱發(fā)光圖像受背景暗噪聲及探測系統(tǒng)暗計數(shù)的影響，在光子圖像上疊加隨機分布的噪聲點，在信號較弱的情況下，光子圖象的信噪比極低，信號湮沒于噪聲光子中而難以區(qū)分。在圖像信號和背景噪聲都較弱的條件下，信號和噪聲都服從泊松分布。因而可用統(tǒng)計檢驗來對小樣本光子圖像進行處理，剔除噪聲光子，以提高光子圖象的信噪比。
采用超高靈敏度熒光顯微探測與處理系統(tǒng)實現(xiàn)光子圖像探測，探測對象由照相物鏡成像在微通道板像增強器的多堿光陰極上，透過輸入窗口落在像增強器光陰極上的光子由于光電效應轉(zhuǎn)換成電子圖像，電子透鏡將電子圖像耦合到微通道板上，從微通道板出射的電子撞擊熒光屏重新激發(fā)出光子圖像。微通道板像增強器的光子放大能力為(103～107)，每一落在像增強器上的光子經(jīng)過放大后，在像增強器的出射熒光屏的光斑直徑為60μm，延遲時間為30ms～100ms(增益為106時)。整個成像系統(tǒng)的空間分辨率為15line pairs/mm(線對/毫米)(在104photons/(mm2·s)以下的單光子成像條件下)。熒光屏上的圖像由中繼透鏡投射在CCD攝像系統(tǒng)的像面上，經(jīng)圖像采集板進入計算機，成像系統(tǒng)的陰極靈敏度(等效背景噪音)為0.5[counts/mm2·s]。
為了便于對統(tǒng)計處理前后的光子圖像進行分析比較，需要一個穩(wěn)定的光子源。我們采用了裝C14的一端開口的圓形金屬小盒，當C14衰變時產(chǎn)生穩(wěn)定的微弱光子輻射。
利用上述光子源及成像系統(tǒng)，我們得到圖4.1含噪聲光子圖像，圖4.1有2129個光子記數(shù)。
由于探測系統(tǒng)本身的背景噪聲，使圖像信號和噪聲難以直接區(qū)分，必須用統(tǒng)計理論對光子圖像進行圖像處理，去除噪聲，提高光子圖像的信噪比。
探測系統(tǒng)的本底噪聲表現(xiàn)為光子圖像上的服從泊松分布分布的噪聲點。為方便對光子圖像進行處理，將圖像分割為N×N個區(qū)域，其中信號區(qū)Ss含Ns個小區(qū)域，無信號的噪聲區(qū)Sn含N2-Ns個小區(qū)域，每一小區(qū)域中有k個光子。我們作如下假設H0K(t)＝n(t)H1K(t)＝s(t)+n(t)H0表示接收到的信號K(t)為噪聲，H1表示接收到的信號K(t)為信號與噪聲的疊加，t為時間。
n(t)表示小區(qū)域內(nèi)出現(xiàn)記數(shù)點的是噪聲光子或暗記數(shù)，s(t)表示小區(qū)域內(nèi)出現(xiàn)的光子是信號光子。
P(H0/x)為給定樣本x下H0為真的概率，P(H1/x)為給定樣本x下H1為真的概率。根據(jù)最大后驗概率的判決規(guī)則若P(H1/x)≥P(H0/x)則判定H1為真，否則H0為真。對隨機的光子圖像，P(H1/x)＝P(H0/x)的概率極小，可視為零。于是有P(H1/x)P(H0/x)>1.........(1)]]>若(1)成立，則P(H1/x)為真，否則P(H0/x)為真。
設P(H1)和P(H0)分別為假設H1和H0為真的先驗概率，即光子圖像任一小區(qū)域中有信號和無信號的先驗概率，P(x/H1)和P(x/H0)分別為假設H1和H0為真，光子樣本x的概率密度函數(shù)。令 ξ＝P(H0)，則1-ξ＝P(H1)，P1(x)＝P(x/H1)，P0(x)＝P(x/H0)，則(1)式左端由先驗概率表示為P(H1/x)P(H0/x)=(1-ξ)P1(x)ξP0(x).........(2)]]>(1)式進一步化簡為P1(x)P0(x)>ξ1-ξ........(3)]]>若(3)成立，則P(H1/x)為真，即判定其區(qū)域中有信號光子；否則P(H0/x)為真，即判定區(qū)域內(nèi)光子為噪聲光子。在光子圖像中，噪聲表現(xiàn)為加性噪聲，因此信號區(qū)光子分布的密度函數(shù)為P1(U=k)=λskK!e-λs+λnkK!e-λn......(4)]]>噪聲區(qū)光子分布的密度函數(shù)為P0(U=k)=λnkK!e-λn......(5)]]>即信號光子和噪聲光子分別服從于參數(shù)為λs和λn的泊松分布。P1(U＝k)表示在信號區(qū)內(nèi)出現(xiàn)k個光子的幾率，P0(U＝k)表示在噪聲區(qū)內(nèi)出現(xiàn)k個光子的幾率。圖4.2a和4.2b為背景噪聲及其概率分布圖。將光子圖分割為若干相同大小的區(qū)域，統(tǒng)計含有相同光子數(shù)的小區(qū)域，縱軸表示含有相同光子數(shù)的小區(qū)域的數(shù)量，橫軸表示小區(qū)域中的光子數(shù)。
圖4.3為圖4.1的概率密度的概率分布。為方便討論，我們假定信號光子服從同一分布。即圖4.1中只存在兩種分布，即信號分布和噪聲分布。取兩峰值之間的最小值為信號分布和噪聲分布的交點，對λs和λn分別作出估計λs＝E(P1)， λn＝E(P0)E(P1)和E(P0)表示求P1和P0的數(shù)學期望。條件(2)變?yōu)镵>[ln2ξ-11-ξ+(λs-λn)]/ln(λsλn).....(6)]]>當上式成立時，判定區(qū)域內(nèi)含有信號光子，否則為噪聲光子。
假定ξ＝2/3，(6)式簡化為K>(λs-λn)/ln(λsλn).......(7)]]>以上討論給出了一個簡明的判據(jù)當小區(qū)域內(nèi)的光子數(shù)大于k時，判定區(qū)域內(nèi)含有信號光子，否則為噪聲光子或暗記數(shù)，k的大小由λs和λn決定。圖像處理時剔除只含噪聲光子或暗記數(shù)的區(qū)域，保留含信號光子的區(qū)域，得到信噪比改善的圖像。
由公式(6)可看出，當ξ在一較大范圍內(nèi)變動時，K的取值保持不變(K只可取整數(shù))。
另外，當給出假定ξ＝2/3時，我們同時也得到信號分布和噪聲分布交點的假定。在概率分布圖4.3中，曲線下的面積就是含有信號光子和噪聲光子的小區(qū)域的總和。假定ξ＝2/3，即假定只含有噪聲光子的小區(qū)域數(shù)占了小區(qū)域總數(shù)的2/3，信號分布和噪聲分布的交點就是曲線下總面積的2/3處，由此可得λs和λn的估計。取得信號分布和噪聲分布的交點，對λs和λn分別作出估計λs＝E(P1) λn＝E(P0)E(P1)和E(P0)表示求P1和P0的數(shù)學期望。
和前一種對λs和λn估計相比，此方法具有更廣泛的適用性。對照圖4.1，用此方法可得λs＝2.032，λ0＝13.08，K的取值仍然不變。在大多數(shù)情況下，兩種λs和λn的估計方法都可得到相同的結(jié)果，當概率分布圖中信號分布和噪聲分布交點不明顯時，可用此方法估計λs和λn。
由公式(7)對圖4.1進行處理，得到圖4.4a。和圖4.1相比，圖4.4a極大地提高了圖像的信噪比。處理后的光子圖像和光源外形圖4.4b較好地吻和，說明對光子圖象的處理是成功的。
本統(tǒng)計方法適用于小樣本光子圖像的處理，能較大地提高光子圖像的信噪比，可以較好地從噪聲背景中提取有用的光子信號，對研究生物超微弱發(fā)光有很大的意義。本方法還適用于其他超微弱發(fā)光的研究，對噪聲背景下的生物細胞超微弱光子輻射，也可提取出相應的信號圖像。
光子圖象的計算機模擬光子圖象是由單個的光子組成，由于光子的波粒二象性，圖象表現(xiàn)為空間不連續(xù)的離散光子，光子到達某一區(qū)域的概率由光子的統(tǒng)計規(guī)律決定，只有探測、積累足夠長的時間后，才會形成通常意義上的空間連續(xù)分布的圖象。光子圖象采集時易受到背景噪聲和成像系統(tǒng)背景暗噪聲的影響，表現(xiàn)為光子圖象上疊加的隨機分布的噪聲點。在信噪比不高的情況下，光子圖象很容易湮沒于噪聲中，使圖象信號和噪聲難以區(qū)分。因此，通過對樣品發(fā)光規(guī)律進行分析，利用計算機模擬，并結(jié)合小樣本光子圖象的統(tǒng)計處理，在獲取單幀或少數(shù)幀圖象的基礎上，即可判斷其積累足夠長時間后的結(jié)果，必然將節(jié)省大量時間，提高實驗效率。超微弱發(fā)光的強度極其微弱，信噪比低，采集條件要求較高，因此，利用計算機仿真研究光子圖象的處理方法，有助于了解細胞的微弱自發(fā)發(fā)光的發(fā)光規(guī)律，減少實驗時間，降低實驗條件及實驗儀器、藥品的費用。利用該方法對某些微弱發(fā)光目標進行模擬仿真，可以在獲取小樣本光子圖象的情況下，與先驗知識結(jié)合對目標加以判斷識別，從而縮短操作時間，提高工作效率。
由于光子圖象的累積涉及數(shù)量極大的光子圖象數(shù)量及數(shù)據(jù)處理量，因此有必要用計算機對光子圖象以及光子圖象的處理過程進行模擬，以驗證光子圖象積分的有效性。
理論指出光子圖象的光子密度分布和物函數(shù)的光子輻射水平成正比，在極弱光條件下，由于光子輻射的隨機性，光子密度分布實際是光子密度分布的期望值。這樣就為光子圖象的模擬提供了依據(jù)。
如果認為樣品中不同部位的自發(fā)發(fā)光是相互獨立的，可以采用蒙特卡洛方法在平面上不同區(qū)域不同的光子密度分布來模擬樣品的光子圖像，通過控制光子圖象的光子密度來模擬不同強度的光子輻射。光子圖像的光子分布是隨機的，其期望和灰度圖象相應區(qū)域的灰度成正比。
通過對要模擬的圖像[IMG](本文要模擬的對象為Hela細胞的熒光圖象)的分析，生成一矩陣[P]，其元素值正比于圖象[IMG]相應元素的灰度值。矩陣[P]的每一元素代表該象素在一幀光子圖象中出現(xiàn)光子的幾率[P]＝[IMG]/(K×GRAY) (8)其中[IMG]為n×n圖像矩陣；GRAY為灰度等級，通常為256級；K用于根據(jù)要模擬的發(fā)光水平來控制光子圖象的光子總數(shù)；[P]即為圖像對應的概率分布函數(shù)矩陣，矩陣中每一元素值對應相應象素點在一幀光子圖象中出現(xiàn)光子的分布函數(shù)。由計算機模擬一泊松分布，使該分布大于閾值TH(i，j)的概率為P(i，j)，于是可以推出TH(i，j)的值，這樣遍歷了矩陣[P]后，可以得到對應的閾值矩陣[TH]。然后生成一隨機矩陣[RND]，其對應元素RND[i，j]的值隨機出現(xiàn)并服泊松分布。當RND(i，j)＞TH(i，j)時，認為點X(i，j)出現(xiàn)光子，否則認為該點沒有出現(xiàn)光子，比較后得到一個新的2值矩陣[X]，矩陣元素中1表示對應象素出現(xiàn)光子，0表示對應象素沒有光子。由其生成的過程可知，X(i，j)出現(xiàn)1的概率為P(i，j)，矩陣[X]即為模擬的光子圖象。
由于成像系統(tǒng)固有的系統(tǒng)噪聲，在實際采集的光子圖像中存在噪聲光子分布，噪聲光子在像平面服從于參數(shù)為λn的泊松分布，表現(xiàn)為加性噪聲。
噪聲分布Pn(k)=λnkK!e-λn......(9)]]>Pn(k)表示在某區(qū)域內(nèi)出現(xiàn)k個噪聲光子的幾率。
因此在模擬光子圖像中，需要加入成像系統(tǒng)的噪聲，噪聲光子矩陣[Noise]由隨機泊松分布矩陣產(chǎn)生，噪聲水平根據(jù)成像系統(tǒng)的實際噪聲水平通過改變泊松分布參數(shù)λn來控制。在同一幀光子圖像光子分布極為疏散，我們認為同一象素出現(xiàn)2個或2個以上光子的概率可視為零。
噪聲矩陣[Noise]和模擬光子圖象矩陣[X]相加，就得到含噪聲的模擬光子圖像[Simu]，即[Simu]＝[Noise]+[X] (10)大量光子圖像的圖像矩陣相應象素的值進行相加，最后得到的矩陣進行灰度化處理，最大值設為灰度最高等級，就可以得到疊加后的光子圖象[SUM]。
下面是對一Hela細胞的熒光圖像進行的光子圖像模擬。圖5.1a為單幀光子圖像，圖5.1b為200幀光子圖像的疊加，圖5.1c為5000幀光子圖像疊加，圖5.1d為實際的Hela細胞的熒光圖像(原圖)。從圖中可以看出隨著累積次數(shù)的增加，所得到的灰度圖象越來越近似于實際的細胞熒光圖象圖5.1d。圖5.1c和圖5.1d的差別已經(jīng)很小，圖5.1c的灰度層次尚不足圖5.1d，但可以預料，隨著積累次數(shù)的增加，累積得到的灰度圖象可以很好地再現(xiàn)物函數(shù)的實際光子發(fā)射水平。
圖5.2是累積光子圖象的積分數(shù)目與原圖象圖5.1d的均方根差rms關系，其中rms=Σi=1kΣj=1l[SUMm(i,j)-Cell(i,j)]2k×l........(11)]]>可見，隨著積分數(shù)目的增加，均方根差值逐漸減少，均方根值rms是累積光子圖象總數(shù)m的函數(shù)。
圖象的大小為K×L，rms代表了積分圖象SUM和原圖象Cell之間的差別。如果將原圖Cell視為標準圖象，則均方根差代表了積分圖象SUM的噪聲水平。由相關積分器的分析可知，噪聲水平和積分光子圖象總數(shù)m的平方根成反比且當m趨于無窮時，rms趨于零。圖5.3是rms和m-1/2的關系曲線，曲線表現(xiàn)出較好的線性與理論分析極好地吻合。
如果我們將信號區(qū)(光子圖象中有信號的區(qū)域)信號光子平均分布密度和噪聲區(qū)(信號區(qū)以外的區(qū)域)光子平均分布密度之比稱為光子圖象的信噪比，通過調(diào)節(jié)噪聲水平可以很容易地改變模擬光子圖象的信噪比。為便于比較，我們?nèi)匀挥蒙蠄D5.1d作為模擬對象。圖5.4即為信噪比為1的光子圖象，從圖中很難用統(tǒng)計的方法區(qū)分信號和噪聲光子，但如果運用同步積分(累加)的原理，將若干幅光子圖象進行累加，噪聲被衰減，就可以從信噪比極低的光子圖象中得到所需的信號。運用此方法，甚至可以從信噪比大大低于1的光子圖象中提取到有用信號，但所需的累積數(shù)目也相應增大。
圖5.5為1000幅信噪比為1的光子圖象積分的結(jié)果，按照先前的推導，信噪比將有約15dB的改善，對比圖5.4信噪比有了極大的提高。參考圖5.1d，圖5.5的灰度級真實地反映了物函數(shù)的光子發(fā)射幾率，因為圖5.5是信噪比為1光子圖象累積得到的，所以此圖的灰度等級也直接表明了圖象各區(qū)域的光子相關水平。
在微弱發(fā)光領域的研究中，對光子圖象的處理是解決光子圖象信噪比低的有效辦法，但眾多的處理方法中，對信噪比小于或接近于1的光子圖象的處理難以得到令人滿意的結(jié)果。而受生物的低自發(fā)發(fā)光水平和成像系統(tǒng)的影響，實際采集到的光子圖象很多情況下都得不到高的信噪比。本發(fā)明介紹的方法有助于對低信噪比光子圖象的檢測，根據(jù)計算機模擬的結(jié)果，該方法對低信噪比光子圖象處理的結(jié)果能滿足對光子圖象探測的要求，是對低水平光子發(fā)射探測處理的有效方法。通過對光子圖象的積分處理，將光子圖象和傳統(tǒng)灰度圖象建立了聯(lián)系?？梢灾庇^地觀測微弱發(fā)光體的光子出射水平。
本發(fā)明介紹的光子圖象的計算機仿真方法在實際工作中也有較大意義，由于可以容易的調(diào)節(jié)模擬圖象的噪聲水平，所以我們可以根據(jù)成像系統(tǒng)的實際噪聲水平進行計算機仿真，這樣在實際的采集積分系統(tǒng)中，我們可以預期積分時間以及圖象質(zhì)量。光子圖象的計算機仿真還可以大大減少貴重實驗設備的損耗，避免了大量光子圖象的實際采集與存儲，也為光子圖象的研究及處理提供了得到光子圖象的簡捷途徑。
權(quán)利要求
1.一種超高靈敏度熒光顯微探測與處理系統(tǒng)，包括顯微鏡，該顯微鏡由同軸的超高壓汞燈(1)、聚光鏡(2)、濾色片(3)、可調(diào)光孔(4)、暗視野集光器(5)、物鏡(7)、半反射鏡(8)、耦合透鏡(10)及目鏡(9)組成，其特征在于該系統(tǒng)包括高靈敏度熒光顯微鏡和圖象處理軟件兩部分；顯微鏡中的耦合透鏡(10)與可移動反射鏡(12)相連，與光軸成45°角的可移動反射鏡(12)與像增強器(15)相連，像增強器(15)陰極面入射面附近設置有可插入干涉濾色片(11)或擋光板的多功能插孔(14)，可移動反射鏡(12)分別與像增強器(15)和CCD(13)相連，像增強器(15)和CCD(17)相連，像增強器(15)與CCD(17)之間設置有耦合透鏡(16)，CCD(17)和CCD(13)同時與圖象采集板(18)相連，圖象采集板(18)與計算機(19)相連；顯微鏡中的暗視野集光器(5)的焦距為3mm～30mm，像增強器(15)上設置有保護裝置，該保護裝置包括磁鐵(20)、干簧繼電器(21)及電源(22)，干簧繼電器(21)固定于顯微鏡上，暗視野集光器(5)上裝磁鐵(20)，電源(22)與像增強器(15)、干簧繼電器(21)串聯(lián)；本系統(tǒng)的光源由超高壓汞燈(1)、循環(huán)水冷卻器(1a)、金屬遮光盒(1b)、出水管(1c)、入水管(1d)、循環(huán)水泵(1e)及聚光鏡(2)組成，金屬遮光盒(1b)底部開有透光孔，孔內(nèi)裝一聚光鏡(2)，聚光鏡(2)上方是超高壓汞燈(1)，金屬遮光盒(1b)上設置有循環(huán)水冷卻器(1a)，循環(huán)水冷卻器(1a)頂部裝有出水管(1c)和入水管(1d)，出水管(1c)和入水管(1d)又與循環(huán)水泵(1e)相連；圖象處理軟件包括圖象融合、光子圖象處理及光子圖象模擬；計算機(19)對光子圖象的圖象處理式為K>(λs-λn)/ln(λsλn)]]>λs＝E(P1) λn＝E(P0)其中，K為光子個數(shù)，λs及λn為信號區(qū)和噪聲區(qū)光子數(shù)量的期望值，P1和P0為光子樣本x在信號區(qū)和噪聲區(qū)的概率密度函數(shù)；計算機對光子圖象以及光子圖象處理過程模擬采用的方法為通過對要模擬的圖像[IMG]的分析，生成一矩陣[P]，其元素值正比于圖象[IMG]相應元素的灰度值。矩陣[P]的每一元素代表該象素在一幀光子圖象中出現(xiàn)光子的幾率[P]＝[IMG]/(K×GRAY)其中[IMG]為n×n圖像矩陣；GRAY為灰度等級，通常為256級；K用于根據(jù)要模擬的發(fā)光水平來控制光子圖象的光子總數(shù)；[P]即為圖像對應的概率分布函數(shù)矩陣，矩陣中每一元素值對應相應象素點在一幀光子圖象中出現(xiàn)光子的分布函數(shù)；由計算機模擬一泊松分布，使該分布大于閾值TH(i，j)的概率為P(i，j)，于是可以推出TH(i，j)的值，這樣遍歷了矩陣[P]后，可以得到對應的閾值矩陣[TH]；然后生成一隨機矩陣[RND]，其對應元素RND[i，j]的值隨機出現(xiàn)并服泊松分布；當RND(i，j)＞TH(i，j)時，認為點X(i，j)出現(xiàn)光子，否則認為該點沒有出現(xiàn)光子，比較后得到一個新的2值矩陣[X]，矩陣元素中1表示對應象素出現(xiàn)光子，0表示對應象素沒有光子；由其生成的過程可知，X(i，j)出現(xiàn)1的概率為P(i，j)，矩陣[X]即為模擬的光子圖象。
全文摘要
一種超高靈敏度熒光顯微探測與處理系統(tǒng),包括高靈敏度熒光顯微鏡和軟件處理兩部分,高靈敏度熒光顯微鏡包括圖像采集光路,圖像配準,像增強器及其保護裝置。本發(fā)明靈敏度高,結(jié)合處理軟件可對樣品實現(xiàn)小樣本光子圖象探測;運用圖像融合技術(shù),實現(xiàn)熒光的準確定位;可研究細胞熒光圖像的動力學特征;樣品適用范圍廣,適合于觀察切片和活細胞;可實現(xiàn)對小樣本光子圖象的處理,提高圖象的分辨率;可實現(xiàn)生物超微弱發(fā)光的計算機模擬,對實驗具有指導作用。
文檔編號G01N21/64GK1353305SQ0013354
公開日2002年6月12日 申請日期2000年11月10日 優(yōu)先權(quán)日2000年11月10日
發(fā)明者李勤, 俞信, 馬瑜, 胡新奇 申請人:北京理工大學