專利名稱：:一種寬溫淀粉酶的生產(chǎn)方法一種寬溫淀粉酶的生產(chǎn)方法發(fā)明領(lǐng)域一種寬溫淀粉酶的生產(chǎn)方法，屬于生物工程
技術(shù)領(lǐng)域：
：。技術(shù)背景淀粉酶是最成功工業(yè)化應(yīng)用的酶制劑品種，由于酶促水解可在更大程度上控制淀粉水解、反應(yīng)特異性和產(chǎn)物的穩(wěn)定性。溫和的反應(yīng)條件包括較低的溫度，接近中性的PH等，由此減少生產(chǎn)中能源的消耗、降低生產(chǎn)成本和環(huán)境污染?？商岣弋a(chǎn)量并帶來(lái)有益經(jīng)濟(jì)效益、社會(huì)效益等多種優(yōu)勢(shì)。淀粉酶已被廣泛應(yīng)用于紡織行業(yè)的退漿、造紙行業(yè)淀粉漿的處理、食品行業(yè)如飴糖、啤酒、黃酒、葡萄糖、味精、抗生素等行業(yè)；酒精工業(yè)的原料處理，具有極廣泛的用途。目前商品生產(chǎn)的淀粉酶為中溫和高溫淀粉酶，中溫淀粉酶在60_90°C起作用，高溫淀粉酶在90-105°C起作用。酒精工業(yè)是淀粉酶的消費(fèi)大戶，淀粉酶用于酒精行業(yè)時(shí)，對(duì)其性能又有著一些特殊性。一般來(lái)講酒精行業(yè)主要使用的是粗原料，如干磨的玉米、小麥、木薯等。傳統(tǒng)工藝采用的是高溫蒸煮和液化，為了使原料能夠充分液化，往往在80°C左右有一個(gè)預(yù)糊化的過(guò)程，而這一區(qū)間也是淀粉糊化的溫度，黏度問(wèn)題是需要解決的首要問(wèn)題。以往主要使用中溫淀粉酶降低淀粉的黏度，隨后的液化主要采用高溫噴射液化。這就需要一種既可以在糊化溫度附近快速降低黏度，又可以在噴射液化時(shí)正常發(fā)揮作用的淀粉酶，也就是需要較寬范圍的作用溫度和很高的耐熱性。本菌種生產(chǎn)的寬溫淀粉酶就符合這一特性，其集合了中溫淀粉酶和高溫淀粉酶的優(yōu)點(diǎn)，具有很強(qiáng)的工藝適應(yīng)性。目前根據(jù)已報(bào)道的文獻(xiàn)和專利總結(jié)如下細(xì)菌菌株B-9545，最適酶解條件為50°C，pH9.0(聞浩林、張惠麗等堿性淀粉酶產(chǎn)生菌的篩選和產(chǎn)酶條件研究，微生物學(xué)雜志，1996，1:2630)。Bacillussubtilis14140&14141,最適酶解條件為6070°C、pH6.0(管斌、謝來(lái)蘇、丁友芳、隆言泉等枯草芽胞桿菌A-淀粉酶高產(chǎn)菌株的選育，浙江農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報(bào)1997，23(5):8892)。耐堿芽袍桿菌9-A2,最適酶解條件為50°C,pH8.0(賈士儒、趙樹(shù)欣、FrzncoGTevec耐堿芽袍桿菌堿性淀粉酶研究1_菌種的分離與篩選，天津輕紡工業(yè)學(xué)院學(xué)報(bào)1994,2:I6)。芽袍桿菌UaciBy1S)ZX99，最適酶解條件為60°C、pH6.0(張應(yīng)玖、朱學(xué)軍、關(guān)鍵、李吉平、薛雁一種新型淀粉酶的鑒定及其產(chǎn)酶菌株的篩選，微生物學(xué)通報(bào)2002，29(5):3841)。嗜堿芽袍桿菌SX212，最適酶解條件為55°C，pH9.0(馬曉軍、張曉君、楊玲、馮清平支鏈淀粉酶產(chǎn)生菌的篩選及發(fā)酵條件的研究，蘭州大學(xué)學(xué)報(bào)(自然科學(xué)版)2001，37(6):8085)。諾卡氏菌株Abcar7t/asp82,最適酶解條件為60°C,pH7.0(王銀定、楊秀琴、王建平諾卡氏菌胞外￠-淀粉酶的分離和鑒定，河北大學(xué)學(xué)報(bào)(自然科學(xué)版)1997，17(2)4145)。Asp.orTZaeFar.30103,最適酶解條件為60°C，pH5.0；Rhi.niveus4810,最適酶解條件為60°C，pH5.0(管斌、謝來(lái)蘇、丁友芳、隆言泉枯草芽胞桿菌A-淀粉酶高產(chǎn)菌株的選育，浙江農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報(bào)1997，23(5)8892)。地衣芽袍桿菌A.404，最適酶解溫度高于90°C;(楊傻豪、胡學(xué)智地農(nóng)芽袍桿菌A.4041耐高溫淀粉酶的研究，維普資訊1997:286289)。地衣芽袍桿菌licheni/ormis)Js_S,最適酶解條件為90°C;(李佑紅、吳衍庸地衣芽袍桿菌JS-5—淀粉酶的研究，微生物學(xué)報(bào)1998，29(4):314316)?？莶菅颗蹢U菌{Bacillussubtilise)8631,其最適酶解條件為65C,pH5.6(姜涌明、史永、隋德新枯草芽袍桿菌86315a一淀粉酶的研究II.分離提純、性質(zhì)及動(dòng)力學(xué)，江蘇農(nóng)學(xué)院學(xué)報(bào)1992，13(2):475)。米曲霉(Aspergillus突變株6-193,其最適酶解條件為60°C,pH5.06.0(孔顯良、王傻英、崔雅潔、姜面萍米曲霉6-193a-淀粉酶的純化和性質(zhì)的研究，微生物學(xué)報(bào)1991，31(4):274280)。嗜堿芽袍桿菌NT-3，其最適酶解條件為50°C，pH9.0(田小群嗜堿性芽袍桿菌{Bacillus577)NT-39及其所產(chǎn)堿性淀粉酶的初步研究，武漢大學(xué)學(xué)報(bào)(自然科學(xué)版)1992，2:105111)。嗜堿單胞菌N-10產(chǎn)生的a-淀粉酶,其最適酶解條件為50°C，pH10(馬延和、薛燕芬、竇岳坦一種堿性a-淀粉酶、其編碼基因及用途，專利公開(kāi)號(hào)CN1500870A)。古細(xì)菌芝田硫化葉茵B(yǎng)I，其最適酶解條件為60°C(劉莉、吳襟、陳煒、張樹(shù)政芝田硫化葉菌新型a-淀粉酶基因工程菌表達(dá)條件的優(yōu)化，中國(guó)生物工程雜志2003，23(I)7074)。古細(xì)菌(Pyrococcus,其最適酶解條件為95°C,pH5.0(沈微、王正祥古細(xì)菌(Pyrococcusfurious)嗜熱(a-淀粉酶基因在大腸桿菌中的表達(dá)，食品與發(fā)酵工業(yè)2002,29(3)1014)；Thermomucorindicaeseudaticae,最適酶解條件為60°C、pH7.0(SanjeevKumarandT.SatyanarayanaPurificationandKineticsofaRawStarch-Hydrolyzing,Thermostable,andNeutralClucoamylaseoftheThermophilicMoldThermomucorindicae-seudaticaeBiotechnol.Prog.2003,19,936944)。BacteroidesamylophiIus70,最適酶解條件為43°C>pH6.3(StevenJ.McwethyPaulA.HartmanPurificationandSomePropertiesofanExt-racellularAlpha-AmylasefromBacteroidesamylophiluslJournalofBacteriology,Mar.1977,p.15371544)。Thermomonosporacurvata,最適酶解條件為65°C,pH6.0(FredStutz—enbergerRickCarnelAmylaseProductionbyThermomonosporacurvataAppliedandEnyromentalMicrobiology,Aug.1977,p.234236)。B.stearothermophilusl518,最適酶解條件為60°C，B.coagulans43P最適酶解條件為70°C，BacillusstearothermophiIusATCC7954,最適酶解條件為90V(PaulA.HartmanRalphffellerson,JR.P.A.TetraultBacillusStearothermophilusl.-ThermalandpHStabilityoftheAmylaseJuly16，1954)。BcillussubtilisstrainW23&B.AmyloliquefaciensstrainF最適酶解條件為65DC(N.E.WELTER’ANDLLEONCAMPBELLComparisonoftheaAmylaseofthea-AmylaseofBacillussubtilisandBacillusamyIoIiquefaciensJOURNALOFBACTERIOLOGY，Oct.1967，p.11311135)。BacillusspeciesNRRLB-3881，最適酶解條件為5(TC，pH9.5(E.W.BO-YERANDM.B.INGLEExtracellularAlkalineAmylasefromaBacillusSpeciesJOURNALOFBACTERIOLOGY，June1972，p.9921000)。Thermomonosporate，最適酶解條件為65°C，pH6.0(J.L.GLYMPHAND.J.STUTZENBERGERProduction,Purification,andCharacterizat-ionofa-AmylasefromThermomonosporacurvataAPPLIEDANDENVIRONMENTALMICROBIOLOGY,Oct.1977，P.391397)。[0025]/&70如<^61/'/_^370況_,最適酶解條件為55°(1|，口116.6(WENDYA.GOODANDPAULA.HARTMANPropertiesoftheAmylasefromHalobacteriumha-lobiumJOURNALOFBACTERIOLOGY,Oct.1970,p.601603)。利用芽袍桿菌NCMB40916的淀粉酶基因構(gòu)建的基因工程生產(chǎn)菌，產(chǎn)生的堿性淀粉酶最適酶解條件為55°C，pH9.5(赫勒奧特拉普比賈恩R尼爾森堿性芽抱桿菌淀粉酶專利公開(kāi)號(hào)CN1399676A)。而能生產(chǎn)寬溫淀粉酶的菌種及寬溫淀粉酶的生產(chǎn)方法沒(méi)有報(bào)道。
發(fā)明內(nèi)容本發(fā)明的目的是提供一種產(chǎn)寬溫淀粉酶菌株及用其發(fā)酵生產(chǎn)寬溫淀粉酶的方法。本發(fā)明的技術(shù)方案一種寬溫淀粉酶的生產(chǎn)方法，采用地衣芽孢桿菌UaciJAz1Slicheniformis)BL-mut08為出發(fā)菌株,經(jīng)過(guò)種子培養(yǎng)和二級(jí)液體發(fā)酵培養(yǎng)，后處理以后得到寬溫淀粉酶，后處理過(guò)程為板框過(guò)濾，濾液用截留分子量為10000的中空纖維管式超濾膜濃縮至產(chǎn)品要求活力單位；該地衣芽孢桿菌(feci77心licheniformis^BL-mut08,巳保藏于中國(guó)典型培養(yǎng)物保藏中心，其保藏編號(hào)為CCTCCN0.M207193，并申請(qǐng)中國(guó)專利，公開(kāi)號(hào)CN101514327A，公開(kāi)日2009年8月26日。(I)斜面培養(yǎng)斜面培養(yǎng)基，以g/L計(jì)牛肉汁3-6，蛋白胨5-15，酵母粉或酵母膏1-5，NaCl1_5，淀粉5-15，葡萄糖20-80，瓊脂15-25，以去離子水配制；培養(yǎng)溫度30-40°C，培養(yǎng)時(shí)間20-40h；(2)搖瓶培養(yǎng)搖瓶培養(yǎng)基，以g/L計(jì)豆餅粉20-50，棉籽餅粉20-50，(NH4)2SO41-10,CaCl20.2-1.0，玉米漿15-40，乳糖100-200，檸檬酸鈉1-10，磷酸氫二鉀10-20，磷酸二氫鉀5-10，以去離子水配制；培養(yǎng)溫度30-42°C，培養(yǎng)時(shí)間20-40h；(3)種子罐培養(yǎng)種子罐培養(yǎng)基，以g/L計(jì)葡萄糖50-100，酵母粉10-50，棉籽餅粉5-20，硫酸銨2-6，檸檬酸鈉2-10，CaCl20.2-0.9，聚醚消泡劑P.P.E.0.2-0.8，磷酸氫二鉀4_10，磷酸二氫鉀1-10，以去離子水配制；發(fā)酵溫度30-400C，通風(fēng)量0.2-1.0V.V.M，罐壓0.2I.0kg/cm2,培養(yǎng)時(shí)間20-40小時(shí)；(4)生產(chǎn)罐發(fā)酵發(fā)酵培養(yǎng)基，以g/L計(jì)葡萄糖50-100，酵母粉10-50，棉籽餅粉5-20，硫酸銨2-6，檸檬酸鈉2-10，CaCl20.2-0.9，玉米漿15-50，聚醚消泡劑P.P.E.0.2-0.8，磷酸氫二鉀4-10，磷酸二氫鉀1-10，以去離子水配制；發(fā)酵溫度30-40°C，通風(fēng)量0.2-1.0V.V.M，罐壓0.21.0kg/cm2，發(fā)酵時(shí)間40-80小時(shí)；(5)后處理液態(tài)發(fā)酵后經(jīng)過(guò)絮凝，加入防腐劑，壓濾，濾液用截留分子量為10000的中空纖維管式超濾膜濃縮，收集濃縮液，即得寬溫淀粉酶溶液。液態(tài)發(fā)酵后加入放罐體積40%左右水，用含12%的NaOH和7%石灰水溶液調(diào)pH9.79.9，加入放罐體積8%CaCl2,同時(shí)加入12%的NaOH和7%石灰水溶液，使溶液pH保持9.79.9，加入50ppm陽(yáng)離子聚丙烯酰氨，加入I.5%放罐體積量的糊精，加熱到60°C，30min，板框過(guò)濾。濾液用截留分子量為10000的中空纖維管式超濾膜濃縮至產(chǎn)品要求活力單位。本發(fā)明的有益效果通過(guò)對(duì)原有地衣芽孢桿菌系統(tǒng)的的復(fù)合誘變，保藏、復(fù)壯，及選育方法，經(jīng)過(guò)培養(yǎng)基配方優(yōu)化及發(fā)酵工藝條件優(yōu)化，建立了生產(chǎn)寬溫淀粉酶的方法，生產(chǎn)出的淀粉酶具有較寬范圍的作用溫度和很高的耐熱性。圖1產(chǎn)品寬溫淀粉酶的反應(yīng)溫度與反應(yīng)效率的關(guān)系曲線。具體實(shí)施方式實(shí)施例1:斜面配方(以g/L計(jì)算)牛肉汁4、蛋白胨10、酵母粉(酵母膏)3、NaCl3、淀粉10、葡萄糖50、瓊脂15-25，培養(yǎng)溫度35°C，培養(yǎng)時(shí)間30h。搖瓶配方(以g/L計(jì)算)豆餅粉40、棉籽餅粉30、(NH4)2SO45,CaCl20.5、玉米漿30、乳糖150、檸檬酸鈉5、磷酸氫二鉀15、磷酸二氫鉀7、培養(yǎng)溫度40°C、培養(yǎng)時(shí)間30h。種子罐配方(以g/L計(jì)算)葡萄糖75、酵母粉30、棉籽餅粉15、硫酸銨5、檸檬酸鈉8、CaCl20.5、P.P.E.(聚醚消泡齊[J)0.5、磷酸氫二鉀7、磷酸二氫鉀7，發(fā)酵溫度35°C，通風(fēng)量0.8V.V.M，罐壓0.8kg/cm2,時(shí)間36小時(shí)，種子罐體積500L，60%裝料量。生產(chǎn)罐配方(以g/L計(jì)算)葡萄糖75、酵母粉30、棉籽餅粉15、硫酸銨4、檸檬酸鈉8、CaCl20.7、玉米漿40、P.P.E.(聚醚消泡劑)0.6、磷酸氫二鉀6、磷酸二氫鉀8，發(fā)酵溫度35°C，通風(fēng)量0.8V.V.M，罐壓0.8kg/cm2，時(shí)間60小時(shí)，使用5噸發(fā)酵罐進(jìn)行發(fā)酵，60%裝料量。液態(tài)發(fā)酵后加入放罐體積40.5%水，用含12%的NaOH和7%石灰水溶液調(diào)pH9.85，加入放罐體積8%CaCl2,同時(shí)加入12%的NaOH和7%石灰水溶液，使溶液pH保持pH9.70,加入50ppm陽(yáng)離子聚丙烯酰氨,加入I.5%放罐體積量的糊精,加熱到60°C,30min,板框過(guò)濾。濾液用截留分子量為10000的中空纖維管式超濾膜濃縮3.5倍，經(jīng)測(cè)定，酶活為19553u/mL，依據(jù)QB/T2306-97耐高溫a-淀粉酶制劑的測(cè)定方法。實(shí)施例2實(shí)施例I制得的寬溫淀粉酶，其反應(yīng)溫度與反應(yīng)效率的關(guān)系如圖I曲線所示。顯示該淀粉酶的作用溫度范圍可為30100°C。權(quán)利要求1.一種寬溫淀粉酶的生產(chǎn)方法，其特征在于，采用地衣芽孢桿菌JicAeaifbrffii1S)BL-mut08為出發(fā)菌株，地衣芽孢桿菌BL_mut08即CCTCCNO.M207193,經(jīng)過(guò)種子培養(yǎng)和二級(jí)液體發(fā)酵培養(yǎng)，后處理以后得到寬溫淀粉酶，后處理過(guò)程為板框過(guò)濾，濾液用截留分子量為10000的中空纖維管式超濾膜濃縮至產(chǎn)品要求活力單位；(1)斜面培養(yǎng)斜面培養(yǎng)基，以g/L計(jì)牛肉汁3-6，蛋白胨5-15，酵母粉或酵母膏1-5，NaCl1_5，淀粉5-15，葡萄糖20-80，瓊脂15-25，以去離子水配制；培養(yǎng)溫度30-40°C，培養(yǎng)時(shí)間20-40h；(2)搖瓶培養(yǎng)搖瓶培養(yǎng)基，以g/L計(jì)豆餅粉20-50，棉籽餅粉20-50，(NH4)2SO41-10,CaCl20.2-1.0，玉米漿15-40，乳糖100-200，檸檬酸鈉1-10，磷酸氫二鉀10-20，磷酸二氫鉀5-10，以去離子水配制；培養(yǎng)溫度30-42°C，培養(yǎng)時(shí)間20-40h;(3)種子罐培養(yǎng)種子罐培養(yǎng)基，以g/L計(jì)葡萄糖50-100，酵母粉10-50，棉籽餅粉5-20，硫酸銨2_6，檸檬酸鈉2-10，CaCl20.2-0.9，聚醚消泡劑P.P.E.0.2-0.8，磷酸氫二鉀4_10，磷酸二氫鉀1-10，以去離子水配制；發(fā)酵溫度30-400C，通風(fēng)量0.2-1.0V.V.M，罐壓0.2I.0kg/cm2,培養(yǎng)時(shí)間20-40小時(shí)；(4)生產(chǎn)罐發(fā)酵發(fā)酵培養(yǎng)基，以g/L計(jì)葡萄糖50-100，酵母粉10-50，棉籽餅粉5-20，硫酸銨2-6，檸檬酸鈉2-10，CaCl20.2-0.9，玉米漿15-50，聚醚消泡劑P.P.E.0.2-0.8，磷酸氫二鉀4-10,磷酸二氫鉀1-10，以去離子水配制；發(fā)酵溫度30°C-40°C，通風(fēng)量0.2-1.0V.V.M，罐壓0.21.0kg/cm2，發(fā)酵時(shí)間40-80小時(shí)；(5)后處理液態(tài)發(fā)酵后經(jīng)過(guò)絮凝，加入防腐劑，壓濾，濾液用截留分子量為10000的中空纖維管式超濾膜濃縮，收集濃縮液，即得寬溫淀粉酶溶液。專利摘要一種寬溫淀粉酶的生產(chǎn)方法，屬于生物工程
技術(shù)領(lǐng)域：
：。本發(fā)明菌種為地衣芽孢桿菌(Bacilluslicheniformis)BL-mut08，已保藏于中國(guó)典型培養(yǎng)物保藏中心，保藏編號(hào)CCTCCNO.M207193，在中國(guó)專利200810020635.2已公開(kāi)。通過(guò)對(duì)原有地衣芽孢桿菌系統(tǒng)的復(fù)合誘變，保藏、復(fù)壯，及選育方法，經(jīng)過(guò)培養(yǎng)基配方優(yōu)化及發(fā)酵工藝條件優(yōu)化，建立了生產(chǎn)寬溫淀粉酶的方法，生產(chǎn)出淀粉酶具有較寬范圍的作用溫度和很高的耐熱性。該菌株于37℃、培養(yǎng)72小時(shí)左右達(dá)到產(chǎn)酶高峰。發(fā)酵液經(jīng)絮凝處理，壓濾，超濾濃縮得到濃縮酶液或通過(guò)其他后加工方式得到不同的淀粉酶制劑，如微丸，顆?；蚍蹌?。該酶制劑可廣泛用于食品、醫(yī)藥行業(yè)，特別如酒精發(fā)酵、味精、抗生素等行業(yè)以及紡織、造紙工業(yè)。文檔編號(hào)C12R1/10GKCN102618518SQ201210077325公開(kāi)日2012年8月1日申請(qǐng)日期2012年3月22日發(fā)明者鄒聯(lián),郁磊,陶丁偉申請(qǐng)人:無(wú)錫德冠生物科技有限公司導(dǎo)出引文BiBTeX,EndNote,RefMan