本發(fā)明涉及骨組織工程涂層材料，具體是指一種具有生物相容性和抗菌性能的二氧化鈦納米管結(jié)構(gòu)涂層的制備方法。
背景技術(shù)：
近幾十年來，由于生物合成新材料的不斷涌現(xiàn)和外科手術(shù)技術(shù)的不斷進步，顯著助推了各類新材料在外科領(lǐng)域中的應(yīng)用，并伴隨各類人工關(guān)節(jié)假體的顯著增長。與此同時，伴隨于關(guān)節(jié)假體的高感染率，以及由此產(chǎn)生的假體松動等并發(fā)癥也日益突出。以往的研究已經(jīng)證實，導(dǎo)致關(guān)節(jié)假體周圍感染的機制是，首先由漂浮細菌粘附到假體的表面，隨后形成生物膜。因此，如何及時抑制漂浮細菌在置入假體表面的定置，如何有效提高假體周圍的有效抗生素濃度，從而有效阻止細菌生物膜的形成，是當(dāng)前該領(lǐng)域的重要課題。因此，具有生物活性和抗菌性能的人工植入體表面的涂層材料具有廣闊的應(yīng)用前景。
陽極氧化能夠在純鈦表面形成一層高度有序垂直排列的納米管陣列，并且通過調(diào)整電壓、電流、氧化時間、電解液成分等可以改變納米管的規(guī)格，并且其特殊的結(jié)構(gòu)為納米顆粒的加載提供了優(yōu)良的條件。陽極氧化法以鈦基體作電解陽極，形成無定形二氧化鈦，然后進行熱處理，使無定形層轉(zhuǎn)化為銳鈦礦型二氧化鈦微晶層。二氧化鈦微晶層富含羥基，因此具備了生物活性。高壓靜電霧化具有霧滴粒徑細小、粒徑尺度單一、空間彌散程度廣等優(yōu)點，廣泛應(yīng)用于材料薄膜制備領(lǐng)域。高壓靜電減小了液體的表面張力和粘滯阻力，使液體容易破碎成更為細小的液滴，使霧滴尺寸分布更均勻。霧滴荷電后，帶電霧滴在高壓靜電場的作用下容易發(fā)生二次霧化，進一步減小霧滴粒徑；同時帶電霧滴在電荷之間斥力作用下，彌散程度加大，且能在目標(biāo)物感應(yīng)出與本身電荷極性相反的電荷，從而在極化力、引力等作用下更容易被目標(biāo)物所捕獲。
目前所研究的植入物表面抗菌涂料包括萬古霉素、慶大霉素、一氧化氮釋放凝膠、碘和銀(ag)等。在摻入鈦基質(zhì)復(fù)合涂層的活性因子中，以金屬元素具有與基質(zhì)鈦元素產(chǎn)生鍵性結(jié)合，使表面改性更為持久而備受重視。銀作為廣譜的抗菌劑已經(jīng)使用多年，是研究最為熱門的無機抗菌劑。文獻報道，銀對革蘭氏陽性菌、革蘭氏陰性菌及厭氧菌均有較強的殺菌能力。在目前所知的金屬離子中，其抗菌性能僅次于汞排在所有無機金屬的第二位(汞由于毒性巨大,不用于抗菌劑)。研究表明，銀對于原核細胞毒性遠遠大于其對于真核細胞的毒性，因此可在保證良好抗菌效能的同時，維持相對較低的細胞毒性。然而，傳統(tǒng)銀系抑菌劑存在銀離子釋放速度過快，抗菌持久性較差的缺點。隨著納米材料研究的迅速發(fā)展，人們開始將目光轉(zhuǎn)向納米銀抗菌材料。納米級銀粒子的抗菌效果是微米級銀粒子的200倍以上，銀離子的釋放動力學(xué)明顯減緩。相對于傳統(tǒng)銀粒子，納米尺度的銀粒子由于其高比表面積，表面原子數(shù)增多，和細菌的接觸概率隨之大幅增加。納米銀粒子具有很強的化學(xué)活性，其表面的原子易與其他化學(xué)基團發(fā)生鍵合反應(yīng)，從而可制備穩(wěn)定結(jié)構(gòu)的納米銀復(fù)合材料。因此，具有生物活性和抗菌性能的人工植入體表面的載納米銀二氧化鈦納米管涂層具有廣闊的應(yīng)用前景。
技術(shù)實現(xiàn)要素：
本發(fā)明的目的在于針對現(xiàn)有技術(shù)的不足，提供一種具有生物相容性和抗菌性能的二氧化鈦納米管結(jié)構(gòu)涂層的制備方法。
本發(fā)明的目的是通過以下技術(shù)方案實現(xiàn)的：一種具有生物相容性和抗菌性能的二氧化鈦納米管結(jié)構(gòu)涂層的制備方法，包括以下步驟：
1)先將蒸餾水和部分乙二醇混合，加入氟化銨和乙二醇的混合液，振蕩均勻后得到含0.5wt％氟化銨和5vol％蒸餾水的乙二醇溶液，作為電解液；
2)以清洗后的鈦片為陽極，鉑片為陰極，鈦片在70v的電壓下陽極氧化80分鐘；
3)將步驟2處理后的鈦片干燥后,放入坩堝在燒結(jié)爐中熱處理，以5℃/min升溫速率到450℃，保溫3～4h。
4)采用uv輔助靜電霧化成型系統(tǒng)對步驟3處理的鈦片進行霧化還原處理30分鐘，所述uv輔助靜電霧化成型系統(tǒng)包括箱體，所述箱體下端面開口，頂面安裝有靜電噴頭；所述箱體的四個側(cè)面均水平安裝有紫外燈。將載有0.1m硝酸銀溶液的溶液槽與靜電噴頭相連，將鈦片置于箱體內(nèi)，使得靜電噴頭正對鈦片，同時打開箱體內(nèi)紫外燈，其中，靜電噴頭與鈦片之間的霧化電壓值為5-6kv，硝酸銀溶液的霧化流速為6-8μl/min。
本發(fā)明的有益效果在于：
本發(fā)明通過uv輔助靜電噴霧的方法實現(xiàn)了銀納米顆粒在二氧化鈦納米管表面的均勻穩(wěn)定負載，使得銀納米顆粒在體液中緩慢釋放，在保證長時間的抗菌性能的同時，保證了材料的生物相容性，豐富了生物活性二氧化鈦納米結(jié)構(gòu)涂層在骨組織工程領(lǐng)域的應(yīng)用。
附圖說明
圖1uv輔助靜電霧化成型系統(tǒng)示意圖
圖2陽極氧化制備出的納米ag顆粒摻雜二氧化鈦納米管結(jié)構(gòu)涂層前后的sem照片。
圖3納米ag顆粒摻雜的二氧化鈦納米管結(jié)構(gòu)涂層的eds能譜圖。
圖4納米ag顆粒摻雜二氧化鈦納米管結(jié)構(gòu)涂層的xrd圖譜。
圖5制備出的納米ag顆粒摻雜二氧化鈦納米管結(jié)構(gòu)涂層的ag+釋放曲線
圖6制備出的納米ag顆粒摻雜二氧化鈦納米管結(jié)構(gòu)涂層的抗菌性能實驗結(jié)果。
圖7制備出的納米ag顆粒摻雜二氧化鈦納米管結(jié)構(gòu)涂層的細胞相容性mtt實驗結(jié)果。
具體實施方式
下面結(jié)合附圖和具體實施例來詳細說明本發(fā)明的技術(shù)方案，但本發(fā)明不局限于實施例，本領(lǐng)域技術(shù)人員可以根據(jù)實際情況進行調(diào)整。
實例1
1)先將蒸餾水和部分乙二醇混合，加入氟化銨和乙二醇的混合液，振蕩均勻后得到含0.5wt％氟化銨和5vol％蒸餾水的乙二醇溶液，作為電解液；
2)以清洗后的鈦片為陽極，鉑片為陰極，鈦片在70v的電壓下陽極氧化80分鐘；
3)將步驟2處理后的鈦片干燥后,放入坩堝在燒結(jié)爐中熱處理，以5℃/min升溫速率到450℃，保溫3h去除有機成分。
4)采用uv輔助靜電霧化成型系統(tǒng)對鈦片進行霧化處理，其中uv輔助靜電霧化成型系統(tǒng)包括箱體，所述箱體下端面開口，頂面安裝有靜電噴頭；所述箱體的四個側(cè)面均水平安裝有紫外燈，如圖1所示。將載有0.1m硝酸銀溶液的溶液槽與靜電噴頭相連，將鈦片置于箱體內(nèi)，使得靜電噴頭正對鈦片，同時打開箱體內(nèi)紫外燈，對步驟3處理的鈦片進行霧化還原處理30分鐘：其中，靜電噴頭與鈦片之間的霧化電壓值為5kv，硝酸銀溶液的霧化流速為6μl/min。
得到的涂層結(jié)構(gòu)如圖2所示，圖2(a)為陽極氧化制備出的二氧化鈦納米管結(jié)構(gòu)涂層，圖2(b)為納米ag顆粒摻雜的二氧化鈦納米管結(jié)構(gòu)涂層，如圖所示，銀納米顆粒在二氧化鈦納米管表面的均勻穩(wěn)定負載。將制備出的納米ag顆粒摻雜的陽極氧化二氧化鈦納米管結(jié)構(gòu)涂層用eds對二氧化鈦涂層材料的微觀區(qū)域的元素分布進行定性定量分析。如圖3所示，陽極氧化二氧化鈦納米管結(jié)構(gòu)涂層中元素ti,o,ag三種元素都有，(a)為銀元素、(b)為氧元素、(c)為ti元素，(d)為電子圖像；表明ag元素順利摻入陽極氧化二氧化鈦納米管結(jié)構(gòu)涂層。x射線衍射圖(圖4)表明，陽極氧化二氧化鈦納米管結(jié)構(gòu)涂層中含有銀單質(zhì)，表明ag元素是以銀納米粒子的形式順利摻入陽極氧化二氧化鈦納米管結(jié)構(gòu)涂層。實施例1的ag+釋放曲線圖如圖5所示，銀離子的釋放過程緩慢持久，也進一步證明了銀納米顆粒在二氧化鈦納米管表面的均勻穩(wěn)定負載。
圖6為得到的納米ag顆粒摻雜的二氧化鈦納米管結(jié)構(gòu)涂層的抗菌率。具體步驟如下：用金黃色葡萄球菌來評估抗菌性能，活化的時候用的是brainheartinfusion(bhi)培養(yǎng)基，養(yǎng)菌的時候用的是甘露醇氯化鈉瓊脂培養(yǎng)基。(1)活化細菌，取0.5ml菌液加入到9mlbhi培養(yǎng)基中,37℃下?lián)u床振蕩24h活化。(2)將活化后的菌，梯度稀釋測od值，od值為0.1?；罨蟮木喝?ml，加9mlbhi稀釋，分裝入離心管。鑷子夾取鈦片放入離心管中，37℃干燥箱中培養(yǎng)24h。(3)取出鈦片后的離心管中的菌液，混勻，梯度稀釋，考慮用量少(取10μl菌液+990μlpbs)直接稀釋為1/1000，再取稀釋后的同樣操作，得到106稀釋，涂板，37℃恒溫保存。即浮游細菌數(shù)量通過平板菌落計數(shù)法連續(xù)稀釋決定。使用上述方法，同樣在第7天和第14天測定浮游細菌的數(shù)目。在兩個隨后的時間點之間，將樣品保存在每天更新的3mlpbs中。
圖7為得到的納米ag顆粒摻雜的二氧化鈦納米管結(jié)構(gòu)涂層的細胞相容性mtt實驗結(jié)果。具體步驟如下：(1)取mg-63細胞，消化配制細胞懸液并調(diào)濃度為4x104/ml。(2)將pt、nt、nt-ag試樣置于24孔板內(nèi)，每孔加入上述濃度細胞懸液1ml并吹勻。(3)培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)24小時終止培養(yǎng)并使用pbs清洗3次，每孔加入200μlmtt液(5mg/ml)和800μl無酚紅dmem培養(yǎng)液繼續(xù)培養(yǎng)4h。(4)每孔加入1mldmso室溫微量震蕩溶解所形成的甲臜結(jié)晶(避光操作)，每孔取200μl該混合液加入96孔板中，490nm波長下使用酶標(biāo)儀測定od值并設(shè)調(diào)零孔。
實例2
1)先將蒸餾水和部分乙二醇混合，加入氟化銨和乙二醇的混合液，振蕩均勻后得到含0.5wt％氟化銨和5vol％蒸餾水的乙二醇溶液，作為電解液；
2)以清洗后的鈦片為陽極，鉑片為陰極，鈦片在70v的電壓下陽極氧化80分鐘；
3)將步驟2處理后的鈦片干燥后,放入坩堝在燒結(jié)爐中熱處理，以5℃/min升溫速率到450℃，保溫3h去除有機成分。
4)采用uv輔助靜電霧化成型系統(tǒng)對鈦片進行霧化處理，其中uv輔助靜電霧化成型系統(tǒng)包括箱體，所述箱體下端面開口，頂面安裝有靜電噴頭；所述箱體的四個側(cè)面均水平安裝有紫外燈，如圖1所示。將載有0.02m硝酸銀溶液的溶液槽與靜電噴頭相連，將鈦片置于箱體內(nèi)，使得靜電噴頭正對鈦片，同時打開箱體內(nèi)紫外燈，對步驟3處理的鈦片進行霧化還原處理30分鐘：其中，靜電噴頭與鈦片之間的霧化電壓值為5kv，硝酸銀溶液的霧化流速為6μl/min。
實例3
1)先將蒸餾水和部分乙二醇混合，加入氟化銨和乙二醇的混合液，振蕩均勻后得到含0.5wt％氟化銨和5vol％蒸餾水的乙二醇溶液，作為電解液；
2)以清洗后的鈦片為陽極，鉑片為陰極，鈦片在70v的電壓下陽極氧化80分鐘；
3)將步驟2處理后的鈦片干燥后,放入坩堝在燒結(jié)爐中熱處理，以5℃/min升溫速率到450℃，保溫3h去除有機成分。
4)采用uv輔助靜電霧化成型系統(tǒng)對鈦片進行霧化處理，其中uv輔助靜電霧化成型系統(tǒng)包括箱體，所述箱體下端面開口，頂面安裝有靜電噴頭；所述箱體的四個側(cè)面均水平安裝有紫外燈，如圖1所示。將載有0.5m硝酸銀溶液的溶液槽與靜電噴頭相連，將鈦片置于箱體內(nèi)，使得靜電噴頭正對鈦片，同時打開箱體內(nèi)紫外燈，對步驟3處理的鈦片進行霧化還原處理30分鐘：其中，靜電噴頭與鈦片之間的霧化電壓值為5kv，硝酸銀溶液的霧化流速為6μl/min。
將實施例1～3制備的三種材料進行同時進行抗菌實驗，15天后，實施例1和實施例3制備的含ag納米顆粒二氧化鈦納米管結(jié)構(gòu)涂層的抗菌效果良好，而實施例2制備的含ag納米顆粒二氧化鈦納米管結(jié)構(gòu)涂層的抗菌效率遠不如實施例1和3。將實施例1～3制備的三種材料進行同時進行細胞相容性mtt實驗，96小時，實施例1和實施例2制備的含ag納米顆粒二氧化鈦納米管結(jié)構(gòu)涂層的細胞相容性良好，而實施例3制備的含ag納米顆粒二氧化鈦納米管結(jié)構(gòu)涂層對細胞影響較大。因此，采用實施例1的硝酸銀溶液濃度較為合理，既保證所制得的含ag納米顆粒二氧化鈦納米管結(jié)構(gòu)涂層的抗菌效果良好，又保證了生物相容性。
實例4
一種具有生物相容性和抗菌性能的二氧化鈦納米管結(jié)構(gòu)涂層的制備方法，包括以下步驟：
1)先將蒸餾水和部分乙二醇混合，加入氟化銨和乙二醇的混合液，振蕩均勻后得到含0.5wt％氟化銨和5vol％蒸餾水的乙二醇溶液，作為電解液；
2)以清洗后的鈦片為陽極，鉑片為陰極，鈦片在70v的電壓下陽極氧化80分鐘；
3)將步驟2處理后的鈦片干燥后,放入坩堝在燒結(jié)爐中熱處理，以5℃/min升溫速率到450℃，保溫4h。
4)采用uv輔助靜電霧化成型系統(tǒng)對步驟3處理的鈦片進行霧化還原處理60分鐘，所述uv輔助靜電霧化成型系統(tǒng)包括箱體，所述箱體下端面開口，頂面安裝有靜電噴頭；所述箱體的四個側(cè)面均水平安裝有紫外燈。將載有0.1m硝酸銀溶液的溶液槽與靜電噴頭相連，將鈦片置于箱體內(nèi)，使得靜電噴頭正對鈦片，同時打開箱體內(nèi)紫外燈，其中，靜電噴頭與鈦片之間的霧化電壓值為6kv，硝酸銀溶液的霧化流速為8μl/min。
經(jīng)測試，所制得的含ag納米顆粒二氧化鈦納米管結(jié)構(gòu)涂層的抗菌效果良好，又具有良好的生物相容性。