利用兩種粒子的多功能生物材料接合體的制備方法及從中制得的多功能生物材料接合體的制作方法
【專(zhuān)利摘要】本發(fā)明涉及多功能生物材料接合體的制備方法及利用該制備方法制備的多功能生物材料接合體，更詳細(xì)地涉及，用作用于檢測(cè)微生物等的生物傳感器的多功能生物材料接合體的制備方法及利用該制備方法制備的多功能生物材料接合體。上述多功能生物材料接合體的制備方法包括：步驟（a），將蛋白質(zhì)涂敷于具有磁性或熒光特性的第一納米粒子；步驟（b），將具有金屬特性的第二納米粒子吸附于涂敷有蛋白質(zhì)的上述第一納米粒子來(lái)制備接合體；以及步驟（c），將生物材料吸附于上述接合體來(lái)制備多功能生物材料接合體。在本發(fā)明中，根據(jù)本發(fā)明的多功能生物材料接合體的制備方法利用兩種粒子來(lái)能夠防止納米粒子沉淀并容易固定生物材料，且能夠制備具有多功能的生物材料接合體。并且，利用上述方法制備的多功能生物材料接合體可用于檢測(cè)微生物，可檢測(cè)至101cfu濃度的微生物。
【專(zhuān)利說(shuō)明】利用兩種粒子的多功能生物材料接合體的制備方法及從中制得的多功能生物材料接合體
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001 ] 本發(fā)明涉及多功能生物材料接合體的制備方法及利用該制備方法制備的多功能生物材料接合體，更詳細(xì)地涉及，用作用于檢測(cè)微生物等的生物傳感器的多功能生物材料接合體的制備方法及利用該制備方法制備的多功能生物材料接合體。
【背景技術(shù)】
[0002]結(jié)合有生物材料的納米及微米粒子廣泛使用于如食品、醫(yī)療、診斷、生命科學(xué)的各種領(lǐng)域中的生物感測(cè)、生物成像、分離等。舉例說(shuō)，在免疫傳感領(lǐng)域中，為了實(shí)現(xiàn)基于抗原一抗體間的結(jié)合的對(duì)象物質(zhì)檢測(cè)，利用抗體磁性納米粒子結(jié)合體及抗體一金納米粒子(Yu-Hui Ba1.et al., Anal.135:1672-1679，2010)。
[0003]作為最影響抗原一抗體反應(yīng)結(jié)合體形成的因素中一個(gè)是抗體固定化方法，已開(kāi)發(fā)了各種固定化技術(shù)，且用于結(jié)合蛋白質(zhì)的方法有多種。舉例說(shuō)，利用化學(xué)吸附與物理吸附的方法、利用作為與金進(jìn)行特異性結(jié)合的氨基酸的半胱氨酸(cysteine)來(lái)使金納米粒子與蛋白質(zhì)相結(jié)合的方法、使在金納米粒子生成組裝單分子膜后利用單分子膜的官能團(tuán)來(lái)與蛋白質(zhì)以共價(jià)鍵合方式接合的方法、將抗生物素蛋白(avidin)吸附于金納米粒子的表面后，與結(jié)合有生物素(biotin)的蛋白質(zhì)相結(jié)合的方法(ZHANG zhiFeng et al., Sci china serB-Chem.50 (I): 127-134，2007)等。
[0004]但是，以往開(kāi)發(fā)的固定化技術(shù)根據(jù)蛋白質(zhì)的特性，如pH的固定化反應(yīng)條件不同，納米粒子的情況下存在不能均勻地分散而凝聚在一起的問(wèn)題。
[0005]韓國(guó)登陸特許第0962286號(hào)公開(kāi)用于檢測(cè)食物中毒菌的磁芯金納米粒子及其制備方法，以及利用上述納米粒子的食物中毒檢測(cè)方法，其特征在于，包括，制備包含磁性物質(zhì)的磁芯的步驟；利用胺(amine)官能團(tuán)來(lái)使上述磁芯的表面改性的步驟；以及在用上述胺(amine)官能團(tuán)來(lái)表面改性的磁芯表面上形成金粒子層的步驟。
[0006]然而，其中存在如下的缺點(diǎn)，用胺官能團(tuán)使磁芯的表面改性時(shí)發(fā)生的化學(xué)反應(yīng)的再現(xiàn)性或有效性下降，且在溶液中發(fā)生凝聚現(xiàn)象。并且存在如下麻煩，用于形成金粒子層的反應(yīng)時(shí)間長(zhǎng)，且只有另行利用表面等離子體共振(SPR, Surface plasmon resonance)設(shè)備才能檢測(cè)到食物中毒菌。
[0007]據(jù)此，本發(fā)明人為了解決上述問(wèn)題而精心努力的結(jié)果確認(rèn)到，將蛋白質(zhì)涂敷于具有磁性或熒光特性的第一納米粒子之后，將具有金屬特性的第二納米粒子吸附于上述第一納米粒子來(lái)制備接合體，將生物材料吸附于接合體的情況下，不經(jīng)過(guò)繁雜的改性過(guò)程也能夠防止納米粒子的沉淀并容易固定生物材料，并且利用涂敷于第一納米粒子的蛋白質(zhì)的特性和吸附于第二納米粒子的生物材料的特性來(lái)多功能地檢測(cè)或分離目的物質(zhì)，由此完成了本發(fā)明。

【發(fā)明內(nèi)容】
[0008]本發(fā)明的目的在于，提供能夠多功能地檢測(cè)或分離目的物質(zhì)的生物材料接合體及其制備方法。
[0009]本發(fā)明的另一目的在于，提供能夠在現(xiàn)場(chǎng)利用簡(jiǎn)單的方法來(lái)檢測(cè)微生物的檢測(cè)方法。
[0010]用于達(dá)成上述目的，本發(fā)明提供多功能生物材料接合體的制備方法，上述方法包括:步驟(a)，將蛋白質(zhì)涂敷于具有磁性或熒光特性的第一納米粒子；步驟(b)，將具有金屬特性的第二納米粒子吸附于涂敷有蛋白質(zhì)的上述第一納米粒子來(lái)制備接合體；以及步驟(C)，將生物材料吸附于上述接合體來(lái)制備多功能生物材料接合體。
[0011]并且，本發(fā)明提供多功能生物材料接合體，其特征在于，在具有磁性或熒光特性的第一納米粒子涂敷有蛋白質(zhì)，在上述蛋白質(zhì)吸附有具有金屬特性的第二納米粒子，且在上述第二納米粒子吸附有生物材料。
[0012]并且，本發(fā)明提供生物傳感器，其特征在于，包含多功能生物材料接合體。
[0013]并且，本發(fā)明提供利用多功能生物材料接合體的微生物的高速檢測(cè)方法，上述方法包括:步驟(a)，將多功能生物材料接合體及含有檢測(cè)對(duì)象微生物的試樣混合而反應(yīng)，上述多功能生物材料接合體中，在具有磁性或熒光特性的第一納米粒子涂敷有蛋白質(zhì)，在上述蛋白質(zhì)吸附有具有金屬特性的第二納米粒子，且在上述第二納米粒子吸附有與檢測(cè)對(duì)象微生物進(jìn)行特異性結(jié)合的抗體；步驟(b)，使上述反應(yīng)液依次通過(guò)微生物凝聚用膜及微生物捕獲用過(guò)濾膜，來(lái)使未與微生物反應(yīng)的多功能生物材料接合體透過(guò)，并選擇性地分離出多功能生物材料接合體一微生物復(fù)合體；以及步驟(C)，測(cè)定在上述微生物捕獲用過(guò)濾膜中捕獲的多功能生物材料接合體一微生物復(fù)合體的有無(wú)或多功能生物材料接合體一微生物復(fù)合體的濃度。
【專(zhuān)利附圖】

【附圖說(shuō)明】
[0014]圖1為示出在制備根據(jù)本發(fā)明的磁性納米粒子與金納米粒子的復(fù)合體后，在上述復(fù)合體上固定抗體的方法的簡(jiǎn)圖。
[0015]圖2為使用以下兩種抗體來(lái)分離IO5Cfu的金黃色釀膿葡萄球菌(Staphylococcusaureus)的分離效率及測(cè)定上清液的活菌數(shù)的圖表，上述兩種抗體為不利用金納米粒子來(lái)對(duì)抗體進(jìn)行固定化的磁性納米粒子(頭孢甲肟)一抗一金黃色釀膿葡萄球菌單克隆抗體(MNP (CMX) -ant1-Staphylococcus aureus mAb)及利用金納米粒子來(lái)對(duì)抗體進(jìn)行固定化的磁性納米粒子(頭孢甲肟)一金納米粒子一抗一金黃色釀膿葡萄球菌單克隆抗體(MNP(CMX)-AuNP-ant1-Staphylococcusaureus mAb)(對(duì)照組(A)、磁性納米粒子一牛血清白蛋白(MNP-BSA) (B)、磁性納米粒子一抗一金黃色釀膿葡萄球菌單克隆抗體(MNP-ant1-Staphylococcus aureus mAb) 10 μ g/ml (C)、涂敷有牛血清白蛋白的磁性納米粒子一 5X金納米粒子一抗一金黃色釀膿葡萄球菌單克隆抗體(MNP-5X AuNP-ant1-Staphylococcus aureus mAb) 10 μ g/ml (D) + 105cfu 金黃色釀胺葡萄球菌)。
[0016]圖3為使用根據(jù)本發(fā)明一實(shí)施例的涂敷有牛血清白蛋白的磁性納米粒子(頭孢甲肟)-5X金納米粒子一抗一金黃色釀膿葡萄球菌單克隆抗體來(lái)確認(rèn)不同濃度的金黃色釀膿葡萄球菌對(duì)于接合體的固定化狀態(tài)的結(jié)果(10°cfu (A)、5X IO4Cfu⑶、5X IO5Cfu(C)、5X IO6Cfu⑶+涂敷有牛血清白蛋白的磁性納米粒子一5X金納米粒子一抗一金黃色釀膿葡萄球菌單克隆抗體(MNP(CMX)-5XAuNP-ant1-Staphylococcus aureus mAb))。
[0017]圖4為使用利用根據(jù)本發(fā)明的固定化方法來(lái)制備的接合體，通過(guò)接合體的金納米粒子的擴(kuò)增處理，確認(rèn)不同濃度(圖3)的金黃色釀膿葡萄球菌的固定化狀態(tài)的結(jié)果(IO0Cfu(A)、5X IO4Cfu(B)、5X 105cfu(C)、5X IO6Cfu(D) + 涂敷有牛血清白蛋白的磁性納米粒子一 5X金納米粒子一抗一金黃色釀膿葡萄球菌單克隆抗體(MNP(CMX)-5XAuNP-ant1-Staphy lococcus aureus mAb))。
[0018]圖5為使用根據(jù)本發(fā)明的一實(shí)施例的涂敷有牛血清白蛋白的磁性納米粒子(對(duì)氨基水楊酸)-5X金納米粒子一抗一金黃色釀膿葡萄球菌單克隆抗體(MNP(PAS)-5XAuNP-ant 1-Staphy lococcus aureus Ab)來(lái)以不同濃度測(cè)定金黃色釀膿葡萄球菌的結(jié)果(IO0Cfu (A) ,5 X IO4Cfu (B)、I X 105cfu (C) ,5 X 106cfu (D) ,5 X 106cfu (E) +涂敷有牛血清白蛋白的磁性納米粒子(對(duì)氨基水楊酸)一 5 X金納米粒子一抗一金黃色釀膿葡萄球菌單克隆抗體(MNP(PAS)-5XAuNP-ant1-Staphylococcus aureus mAb))。
[0019]圖6為通過(guò)對(duì)圖5進(jìn)行銀納米粒子的擴(kuò)增處理來(lái)以不同濃度測(cè)定金黃色釀膿葡萄球菌的結(jié)果(IO0Cfu (A) ,5 X IO4Cfu (B)、IxlO5Cfu (C) ,5 X 105cfu (D) ,5 X 106cfu (E) + 涂敷有牛血清白蛋白的磁性納米粒子(對(duì)氨基水楊酸)一 5X金納米粒子一抗一金黃色釀膿葡萄球菌單克隆抗體(MNP(PAS)-5XAuNP-ant1-Staphylococcus aureus mAb))。
[0020]圖7為針對(duì)涂敷有牛血清白蛋白的磁性納米粒子一 5X金納米粒子一抗一金黃色釀胺葡萄球菌單克隆抗體(MNP(PAS)-5XAuNP-ant1-Staphylococcu saureus mAb),確認(rèn)是否與其他菌類(lèi)發(fā)生交叉反應(yīng)的結(jié)果(10°細(xì)胞(A)、5X IO5Cfu沙門(mén)氏菌細(xì)胞(Salmonellacells) (B)、5X IO5Cfu 單核細(xì)胞增多性李司戎氏菌(Listeria monocytogenes cells) (C)、5X IO5Cfu金黃色葡萄球菌細(xì)胞(S.aureus cells) (D)、5X 105cfu大腸桿菌細(xì)胞(E.colicells) (E) +磁性納米粒子(對(duì)氨基水楊酸)—5X金納米粒子一抗一金黃色釀膿葡萄球菌單克隆抗體(MNP(PAS)-5XAuNP-ant1-Staphylococcus aureus mAb))。
[0021]圖8為使用以下兩種抗體來(lái)以不同濃度測(cè)定金黃色釀膿葡萄球菌的結(jié)果，上述兩種抗體為不利用金納米粒子來(lái)對(duì)抗體進(jìn)行固定化的磁性納米粒子(對(duì)氨基水楊酸)一抗一金黃色釀膿葡萄球菌單克隆抗體(MNP(PAS)-ant1-Staphylococcus aureus mAb)及利用金納米粒子來(lái)對(duì)抗體進(jìn)行固定化的涂敷有牛血清白蛋白的磁性納米粒子(對(duì)氨基水楊酸)-金納米粒子一抗一金黃色釀膿葡萄球菌單克隆抗體
[0022](MNP(PAS)-AuNP-ant1-Staphylococcus aureus mAb) (10°cfu (A、D)、5X 105cfu(B、E)、5X IO6Cfu (C、F) +磁性納米粒子(對(duì)氨基水楊酸)一抗一金黃色釀膿葡萄球菌單克隆抗體(MNP(PAS)-ant1-Staphylococcus aureus mAb)、涂敷有牛血清白蛋白的磁性納米粒子(對(duì)氨基水楊酸)-5X金納米粒子一抗一金黃色釀膿葡萄球菌單克隆抗體(MNP(PAS)-5XAuNP-ant1-Staphylococcus aureus mAb))。
[0023]圖9為通過(guò)對(duì)圖8進(jìn)行金納米粒子的擴(kuò)增處理來(lái)以不同濃度測(cè)定金黃色釀膿葡萄球菌的結(jié)果(10°cfu (A、D)、5X IO5Cfu (B、E)、5X 106cfu (C、F) +磁性納米粒子(對(duì)氨基水楊酸)一抗一金黃色釀膿葡萄球菌單克隆抗體(MNP(PAS)-ant1-Staphylococcus aureusmAb)、涂敷有牛血清白蛋白的磁性納米粒子(對(duì)氨基水楊酸)-5X金納米粒子一抗一金黃色釀胺葡萄球菌單克隆抗體(MNP (PAS) -5x AuNP-ant 1-Staphy lococcus aureus mAb))。[0024]圖10為根據(jù)本發(fā)明一實(shí)施例的使用以下兩種抗體并通過(guò)熒光信號(hào)來(lái)測(cè)定不同濃度的C反應(yīng)蛋白(CRP)的結(jié)果，上述兩種抗體為涂敷有牛血清白蛋白的熒光乳膠微球一 5X銀納米粒子一抗一 C 一反應(yīng)蛋白多克隆抗體(fluorescent latexbead-5 XAgNP-ant1-C-reactive protein pAb)及涂敷有牛血清白蛋白的突光乳膠微球一 5X金納米粒子一抗一 C 一反應(yīng)蛋白多克隆抗體(fluorescent latexbead_5x AuNP-ant1-C-reactive protein pAb)(涂敷有牛血清白蛋白的突光乳膠微球一 5X銀納米粒子一抗一 C 一反應(yīng)蛋白多克隆抗體(fluorescent latex bead_5xAuNP-ant 1-C-reactive protein pAb)、涂敷有牛血清白蛋白的涂敷有牛血清白蛋白的突光乳膠微球一 5X金納米粒子一抗一 C 一反應(yīng)蛋白多克隆抗體(fluorescent latexbead-5XAuNP-ant1-C-reactive protein pAb) + 0 μ g/ml (A、D、A，、D，)、I μ g/ml (B、E、B’、E’)、10 μ g/ml (C、F、C’、F’)+金納米粒子一抗一C —反應(yīng)蛋白單克隆抗體(AuNP-ant1-C-reactive protein mAb)、銀金納米粒子一抗一 C 一反應(yīng)蛋白多克隆抗體(AgNP-ant1-C-reactive protein mAb))。
[0025]圖11為使用根據(jù)本發(fā)明一實(shí)施例的涂敷有牛血清白蛋白的熒光乳膠微球一 5X銀納米粒子一抗一 C 一反應(yīng)蛋白多克隆抗體(fluorescent latex bead_5xAgNP-ant1-C-reactive protein pAb)來(lái)以不同濃度測(cè)定C反應(yīng)蛋白的結(jié)果(涂敷有牛血清白蛋白的突光乳膠微球一 5X銀納米粒子一抗一 C 一反應(yīng)蛋白多克隆抗體(fluorescentlatex bead-5 XAgNP-ant1-C-reactive protein pAb)+ 0 μ g/ml (A)、I μ g/ml (B)、10 μ g/ml (C) +金納米粒子一抗一 C 一反應(yīng)蛋白單克隆抗體(AuNP-ant1-C-reactive proteinmAb))。
[0026]圖12為分別使用以下兩種抗體來(lái)以不同濃度測(cè)定C反應(yīng)蛋白的結(jié)果，上述兩種抗體為利用根據(jù)本發(fā)明的固定化方法制備的涂敷有牛血清白蛋白的SOnm及90nm的磁性納米粒子(Fe304、Fe304-Si02)—5X金納米粒子一抗一C —反應(yīng)蛋白單克隆抗體(MNP (Fe3O4, Fe3O4-Si02)-5XAuNP-ant1-C-reactive protein mAb) (0 (A、E)、lOng/ml (B、F)、lOOng/ml (C、G)、l μ g/ml (D、H)C反應(yīng)蛋白+涂敷有牛血清白蛋白的80nm、90nm的磁性納米粒子(Fe304、Fe3O4-SiO2)-5 X金納米粒子一抗一C—反應(yīng)蛋白單克隆抗體(MNP (Fe3O4, Fe3O4-SiO2) -5 XAuNP-ant1-C-reactive protein mAb)。
[0027]圖13為使用以下抗體來(lái)對(duì)不同濃度HlNl菌進(jìn)行熒光測(cè)定的結(jié)果，上述抗體為利用根據(jù)本發(fā)明的固定化方法來(lái)制備的涂敷有牛血清白蛋白的熒光乳膠微球一 5X銀納米粒子一抗一 Hl 單克隆抗體(fluorescent latex bead-5XAgNP-ant1-HlmAb)(涂敷有牛血清白蛋白的突光乳膠微球一 5X銀納米粒子一抗一 Hl單克隆抗體(fluorescent latexbead-5XAgNP-ant1-HlmAb) + 10°pfu (A)>IO1Pfu (B)> 102pfu (C)、103pfu (D) + 104pfu(E) +磁性納米粒子(對(duì)氨基水楊酸)-Hl單克隆抗體(MNP (CMX)-HlmAb))。
[0028]圖14為針對(duì)涂敷有牛血清白蛋白的熒光乳膠微球一 5X銀納米粒子一抗一 Hl單克隆抗體(fluorescent latex bead-5XAgNP-ant1-HlmAb),確認(rèn)是否與相互不同的亞型病毒發(fā)生交叉反應(yīng)的結(jié)果(涂敷有牛血清白蛋白的熒光乳膠微球一 5X銀納米粒子一抗一 Hl單克隆抗體(fluorescent latex bead-5XAgNP-ant1-HlmAb) + 10°pfu (A)> 103pfuHlNl(B)UO3pfuH3N2 (C)U03pfuH5N2 (D) +磁性納米粒子(頭孢甲肟)一 Hl單克隆抗體(MNP(CMX)-HlmAb))。[0029]圖15為針對(duì)涂敷有牛血清白蛋白的熒光乳膠微球一 5X銀納米粒子一抗一 H5單克隆抗體(fluorescent latex bead-5XAgNP-anti_H5mAb),確認(rèn)是否與相互不同的亞型病毒發(fā)生交叉反應(yīng)的結(jié)果(涂敷有牛血清白蛋白的熒光乳膠微球一 5X銀納米粒子一抗一 Hl單克隆抗體(fluorescent latex bead-5XAgNP-ant1-HlmAb) + 10°pfu (A)> 103pfuHlNl(B)UO3pfuH3N2 (C)U03pfuH5N2 (D) +磁性納米粒子(頭孢甲肟)一 H5單克隆抗體(MNP(CMX)-H5mAb))。
[0030]圖16為使用以下兩種抗體來(lái)確認(rèn)在血液的單核細(xì)胞(mononuclear cell)中的T細(xì)胞(T cell)的分離率的結(jié)果，上述兩種抗體為不使用銀納米粒子來(lái)對(duì)抗體進(jìn)行固定化的未染色乳膠微球一抗一人體⑶3抗體(undyed latex bead-ant1-human Q)3Ab)及使用銀納米粒子來(lái)對(duì)抗體進(jìn)行固定化的天然乳膠微球一 5X銀納米粒子一抗一人體CD3抗體(undyed latex bead-5XAgNP-ant1-human CD3Ab)(對(duì)照組(A)、未染色乳膠微球一抗一人體⑶3 單抗體(undyed latex bead-ant1-human Q)3Ab) (B)、對(duì)照組(C)、涂敷有牛血清白蛋白的未染色乳膠微球一 5X銀納米粒子一抗一人體⑶3單抗體(undyed latexbead-5XAgNP-ant1-human CD3Ab) (D) +血液))。
[0031]圖17為利用涂敷有辣根過(guò)氧化物酶(HRP)的金納米粒子一金納米粒子抗體接合體，結(jié)合橫向流動(dòng)分析(later-flow assay)條與化學(xué)發(fā)光法來(lái)分析肌I丐蛋白I (TroponinI)的結(jié)果。
【具體實(shí)施方式】
[0032]在本發(fā)明中，要確認(rèn)能夠制備如下的多功能生物材料接合體，在具有磁性或熒光特性的第一納米粒子涂敷蛋白質(zhì)后，吸附具有金屬特性的第二納米粒子來(lái)制備接合體，在該接合體重新吸附生物材料的情況下，生物材料不凝聚，固定效果好，并應(yīng)用涂敷于第一納米粒子的蛋白質(zhì)及生物材料的特性來(lái)提高檢測(cè)或分析能力。
[0033]在本發(fā)明中，在具有磁性或熒光特性的第一納米粒子涂敷蛋白質(zhì)后，在涂敷有蛋白質(zhì)的第一納米粒子吸附具有金屬特性的第二納米粒子來(lái)制備接合體之后，在接合體吸附生物材料，由此制備多功能生物材料接合體。
[0034]即，在本發(fā)明的一實(shí)施例中，制備涂敷有牛血清白蛋白的磁性納米粒子(MNP)-金納米粒子(gold nanoparticle, AuNP) 一抗體及涂敷有牛血清白蛋白的突光乳膠微球(fluorescent latex beads, LB) 一銀納米粒子(silver nanoparticle, AgNP)或金納米粒子(gold nanoparticle, AuNP)一抗體的結(jié)果,確認(rèn)到不僅抗體的固定化效率優(yōu)秀，而且利用該物質(zhì)的情況下，能夠以優(yōu)秀的靈敏度檢測(cè)金黃色釀膿葡萄球菌(Staphylococcu saureus)。
[0035]因此，一觀點(diǎn)上，本發(fā)明涉及多功能生物材料接合體的制備方法，包括:步驟(a)，在具有磁性或熒光特性的第一納米粒子涂敷蛋白質(zhì)；步驟(b)，在涂敷有蛋白質(zhì)的上述第一納米粒子吸附具有金屬特性的第二納米粒子來(lái)制備接合體；以及步驟(C)，在上述接合體吸附生物材料來(lái)制備多功能生物材料接合體。
[0036]并且，在另一觀點(diǎn)上，本發(fā)明涉及多功能生物材料接合體，在具有磁性或熒光特性的第一納米粒子涂敷有蛋白質(zhì)，在上述蛋白質(zhì)吸附有具有金屬特性的第二納米粒子，且在上述第二納米粒子吸附有生物材料。
[0037]在本發(fā)明中，上述第一納米粒子可利用具有磁性或熒光特性的物質(zhì)，可舉例乳膠、磁、二氧化娃、量子點(diǎn)，金屬納米粒子等。
[0038]在本發(fā)明中，上述第二納米粒子可利用具有金屬特性的物質(zhì)，可舉例金、銀、銅、鉬等。優(yōu)選地，上述第二納米粒子利用易于吸附蛋白質(zhì)的物質(zhì)。
[0039]在此，“納米粒子”是指大小為Inm至IOOnm左右的超微粒子。特別小的納米粒子相對(duì)于一般的塊狀物質(zhì)具有不同的特性。相對(duì)于以往的物質(zhì)，納米粒子具有顯著增加的比表面積。由于這種高的比表面積，具有與以往物質(zhì)不同的表面效果，粒子的大小越小，位于表面的分子數(shù)越增加。粒子的粒徑成5nm，則構(gòu)成粒子的分子中的50%將位于表面，粒子的大小成2nm，則其比例到達(dá)90%。由于位于表面的分子的比例相對(duì)高，因此與以往物質(zhì)相比，納米粒子表面能量對(duì)于結(jié)合能量比率更大。粒子的大小從20nm變小至Inm,表面能量對(duì)于結(jié)合能量比例則從5%增加至約30%。構(gòu)成粒子的原子借助周邊原子間的相互作用處于引力與反彈力形成平衡的能量穩(wěn)定狀態(tài)。但是位于表面的原子只存在借助內(nèi)部原子的引力，因此處于高能量狀態(tài)。因這種表面效果，納米粒子具有在催化劑或催化劑的表面反應(yīng)中出現(xiàn)的表面活性、熔點(diǎn)下降、低溫?zé)Y(jié)性等性質(zhì)。
[0040]在本發(fā)明中，優(yōu)選地，上述第一納米粒子的粒子大小大于第二納米粒子的粒子大小。
[0041]例如，上述第一納米粒子大小為20?500nm,上述第二納米粒子的大小為5?IOOnm0
[0042]第一納米粒子的粒子大小大于第二納米粒子的大小的的情況下，存在能夠容易吸附納米粒子的效果。
[0043]在本發(fā)明中，涂敷上述第一納米粒子的蛋白質(zhì)是利用吸附特性，無(wú)需經(jīng)過(guò)改性過(guò)程地容易對(duì)要固定的生物材料進(jìn)行固定化，可利用牛血清白蛋白(BSA)、過(guò)氧化物酶(peroxidase)、喊性憐酸酶(alkaline phosphatase)、葡糖氧化酶(glucose oxidase)、膽堿氧化酶(choline oxidase)、鏈霉親和素(Streptavidin)、脫脂乳(skim milk)、血清、肽(peptide)等。
[0044]S卩，具有如下效果，如上所述，用蛋白質(zhì)涂敷第一納米粒子的情況下，利用能夠易于吸附蛋白質(zhì)的第二納米粒子，只利用吸附方法使多功能生物材料接合。
[0045]本發(fā)明的特征在于，上述生物材料選自包含抗體、酶、脫氧核糖核酸(DNA)、適配體(aptamer)、妝核酸(PNA, peptide nucleic acids)及配體(ligand)的組。
[0046]在另一觀點(diǎn)上，本發(fā)明涉及一種生物傳感器，其特征在于，包含上述多功能生物材料接合體。
[0047]在本發(fā)明的另一實(shí)施例中，確認(rèn)到將與微生物進(jìn)行特異性結(jié)合的抗體用作生物物質(zhì)來(lái)制備多功能生物材料接合體后，將其與微生物進(jìn)行反應(yīng)的情況下，能夠高速檢測(cè)微生物。
[0048]因此，在另一觀點(diǎn)上，本發(fā)明涉及利用多功能生物材料接合體的微生物的高速檢測(cè)方法，包括:步驟(a)，將多功能生物材料接合體及含有檢測(cè)對(duì)象微生物的試樣混合而反應(yīng)，上述多功能生物材料接合體中，在具有磁性或熒光特性的第一納米粒子涂敷有蛋白質(zhì)，在上述蛋白質(zhì)吸附有具有金屬特性的第二納米粒子，且在上述第二納米粒子吸附有與檢測(cè)對(duì)象微生物進(jìn)行特異性結(jié)合的抗體；步驟(b)，使上述反應(yīng)液依次通過(guò)微生物凝聚用膜及微生物捕獲用過(guò)濾膜，來(lái)使未與微生物反應(yīng)的多功能生物材料接合體透過(guò)，并選擇性地分離出多功能生物材料接合體一微生物復(fù)合體；以及步驟(C)，測(cè)定在上述微生物捕獲用過(guò)濾膜中捕獲的多功能生物材料接合體一微生物復(fù)合體的有無(wú)或多功能生物材料接合體一微生物復(fù)合體的濃度。
[0049]在上述微生物高速檢測(cè)方法中利用的凝聚用膜及微生物捕獲用過(guò)濾膜、分離方法及測(cè)定方法，可利用本申請(qǐng)的發(fā)明人在先申請(qǐng)的公開(kāi)特許10-2011-0058711中記載的膜及方法。
[0050]例如，上述微生物凝聚用膜的特征在于，選自包含聚二甲硅氧烷(P DMS，polydimethylsi 1xane )、具有粘結(jié)性的高分子及招膠、橡膠及乳膠以及絲網(wǎng)印刷用楽;料的組。優(yōu)選地，上述微生物凝聚用膜可以是將如銀漿或碳漿的絲網(wǎng)印刷用漿料以規(guī)定大小的孔的形狀，并利用絲網(wǎng)印刷方法來(lái)涂敷于上述捕獲用過(guò)濾膜來(lái)制備的膜。由此能夠以一體型構(gòu)成凝聚用膜和捕獲用過(guò)濾膜，絲網(wǎng)印刷方法可利用本領(lǐng)域公知的方法。
[0051]作為一例，絲網(wǎng)印刷方法可為如下的方法，將由尼龍(Nylon)、聚酯(Polyester)或不銹鋼等編織的絲網(wǎng)固定于木或鋁等的框，并利用手工或光化學(xué)方法來(lái)在其上面制備板膜來(lái)遮蓋除了必要的圖像以外的部分，并在其里面放絲網(wǎng)印刷用漿料，利用稱(chēng)作橡膠滾軸(Squeegee)的勺子加壓絲網(wǎng)內(nèi)面地移動(dòng)，則漿料通過(guò)沒(méi)有板膜的部分的網(wǎng)來(lái)印刷于位于板下面的被印刷體上。
[0052]本發(fā)明的特征在于，上述捕獲用過(guò)濾膜的細(xì)孔大小為IOOnm?10 μ m。固定有未與微生物結(jié)合的抗體的納米粒子通過(guò)捕獲用過(guò)濾膜，未與固定有抗體的納米粒子結(jié)合的微生物即使被捕獲用過(guò)濾膜過(guò)濾也不發(fā)送信號(hào)。因此，只有與固定有抗體的納米粒子相結(jié)合的微生物呈現(xiàn)在捕獲用過(guò)濾膜上固定有抗體的納米粒子具有的固有顏色、熒光等。
[0053]在本發(fā)明的一實(shí)施例中使用了細(xì)孔大小為1.2μπι的捕獲用過(guò)濾膜，但對(duì)于本領(lǐng)域的普通技術(shù)人員來(lái)說(shuō)，細(xì)孔大小不局限于此是顯而易見(jiàn)的，優(yōu)選地，與固定有抗體的納米粒子進(jìn)行反應(yīng)的微生物的捕獲用過(guò)濾膜可使用選自IOOnm至10 μ m的細(xì)孔大小的捕獲用過(guò)濾膜。
[0054]在本發(fā)明中，上述捕獲用過(guò)濾膜可使用選自包含硝酸纖維素(nitiOcellulose)、聚碳酸酯(polycarbonate)、尼龍(nylon)、聚酯(polyester)、醋酸纖維素(celluloseacetate)、聚砜(poly sulfone)及聚乙燒砜(poly ethane sulfone)的組中的捕獲用過(guò)濾膜。
[0055]本發(fā)明的特征在于，上述步驟(b)的選擇性地進(jìn)行分離的步驟利用真空、離心分離或吸收法。
[0056]換句話說(shuō)，納米粒子一抗體一微生物復(fù)合體經(jīng)過(guò)凝聚用膜而被捕獲用過(guò)濾膜過(guò)濾時(shí)，可利用真空，或者離心分離或者吸收于過(guò)濾膜的原理來(lái)進(jìn)行選擇性的分離。
[0057]在本發(fā)明中，上述步驟(C)的測(cè)定可利用電荷稱(chēng)合器件攝相機(jī)((XD camera)或吸光度來(lái)進(jìn)行測(cè)定。
[0058]實(shí)施例
[0059]以下，通過(guò)實(shí)施例對(duì)本發(fā)明進(jìn)行更詳細(xì)地說(shuō)明。但是這些實(shí)施例只是用于例示本發(fā)明，本發(fā)明的范圍不局限于此，這對(duì)于本領(lǐng)域普通技術(shù)人員而言是顯而見(jiàn)的。
[0060]實(shí)施例1:磁性納米粒子的抗體接合體及熒光微球的抗體接合體的制備
[0061]實(shí)施例1-1:磁性納米粒子(MNP) —牛血清白蛋白(bovine serum albumin,BSA) —涂敷有蛋白質(zhì)的磁性納米粒子(MNP) —金納米粒子(gold nanoparticle, AuNP) —抗體
[0062]磁性納米粒子(magnetic nanoparticle, MNP)溶液中添加牛血清白蛋白(BSA, bovine serum albumin)溶液(ρΗ7.4,溶解于 IOmM 的憐酸鹽(Phosphate)緩沖溶液)，使得最終體積達(dá)到Iml來(lái)進(jìn)行混合后，添加IOmM的N-羥基琥珀酰亞胺(NHS，N-hydroxysuccinnimide ;生物核心有限公司(Biacore Inc))與 2mM 的 二氯乙燒(EDC,ethylene dichloride ;生物核心有限公司(Biacore Inc)),放置30分鐘。在上述溶液添加IOOmM的甘氨酸(glycin)溶液(pH7.4,溶解于IOmM的磷酸鹽(Phosphate)緩沖溶液)0.1ml并放置30分鐘后，各分注200 μ 1，在4°C溫度下，以6000rpm轉(zhuǎn)速進(jìn)行20分鐘離心分離后，去除上清液。接著，添加硼酸鹽(borate)緩沖溶液(10mM，pH8.5) 0.2ml來(lái)混合之后，以6000rpm轉(zhuǎn)速進(jìn)行20分鐘離心分離后，再次去除上清液。將上述過(guò)程再反復(fù)一次后，最終將0.1%的牛血清白蛋白(pH8.8,溶解于IOmM的碳酸氫鈉(sodium bicarbonate)緩沖溶液)溶液添加到IOOnm的磁性納米粒子一牛血清白蛋白0.4ml來(lái)制備涂敷有牛血清白蛋白的磁性納米粒子。
[0063]上述磁性納米粒子溶液使用基質(zhì)(matrix)為羧甲基葡聚糖(Carboxymethyl-dextran)的IOOnm磁性納米粒子溶液(頭孢甲廂(CMX), 25mg/ml,凱米歇爾公司(Chemicell)) 100 μ 1、由聚丙烯酸(polyac rylic
[0064]acid)形成的IOOnm磁性納米粒子溶液(對(duì)氨基水楊酸(PAS), 50mg/ml,凱米歇爾公司(Chemicell)) 60 μ l、80nm的磁性納米粒子(Fe3O4，韓國(guó)浦項(xiàng)工科大學(xué)全尙敏教授提供)180μ g及90nm的磁性納米粒子(Fe3O4-SiO2，韓國(guó)浦項(xiàng)工科大學(xué)全尙敏教授提供)430 μ go
[0065]進(jìn)行上述離心分離后，在去除上清液的涂敷有牛血清白蛋白的磁性納米粒子中添加濃縮5倍的IOnm金納米粒子溶液(BB國(guó)際公司(BB International),硼酸鹽(borate)緩沖溶液10mM，pH8.5) Iml來(lái)進(jìn)行30分鐘的吸附。
[0066]吸附有金納米粒子的頭孢甲肟與對(duì)氨基水楊酸的IOOnm磁性納米粒子溶液中分別添加抗金黃色釀膿葡萄球菌單克隆抗體(ant1-S.aureus mAb, Abeam) 10 μ g,并在80nm的磁性納米粒子(Fe3O4)與90nm磁性納米粒子(Fe3O4-SiO2)溶液中添加抗C反應(yīng)蛋白單克隆抗體(ant1-CRP mAb, Abeam) 10 μ g。
[0067]30分鐘后，添加10%牛血清白蛋白(bovine serum albumin)溶液(ρΗ8.8,溶解于IOmM的碳酸氫鈉(sodium bicarbonate)緩沖溶液)0.1ml,并放置30分鐘。各分注200 μ I的上述溶液，在4°C溫度下，以5500rpm轉(zhuǎn)速進(jìn)行20分鐘離心分離后，去除上清液，再次添加0.1%牛血清白蛋白溶液0.2ml來(lái)混合后，以5000rpm轉(zhuǎn)速進(jìn)行20分鐘離心分離后去除上清液。將上述過(guò)程再反復(fù)一次后，最終在IOOnm的磁性納米粒子(頭孢甲肟、對(duì)氨基水楊酸)一金納米粒子一抗金黃色釀膿葡萄球菌單克隆抗體中添加0.4ml的0.1%的牛血清白蛋白(ρΗ8.8,溶解于IOmM的碳酸氫鈉(sodium bicarbonate)緩沖溶液)溶液,在80nm和90nm的磁性納米粒子(Fe3O4,Fe3O4-SiO2)-金納米粒子-抗C反應(yīng)蛋白單克隆抗體中添加0.1ml并混合后，利用0.45 μ m注射器式過(guò)濾器進(jìn)行過(guò)濾后，放到冰箱保管。
[0068]實(shí)施例1-2:涂敷有蛋白質(zhì)的突光或未染色乳膠微球(fluorescent latex beads,LB) 一銀納米粒子(silver nanoparticle, AgNP)或金納米粒子(gold nanoparticle,AuNP ) 一抗體[0069]在4°C溫度下，對(duì)用羥基進(jìn)行表面改性的乳膠微球50 μ I以5000rpm的轉(zhuǎn)速進(jìn)行3分鐘離心分離后，去除上清液。以與實(shí)施例1-1相同的方法對(duì)上述乳膠微球涂敷牛血清白蛋白。乳膠微球溶液使用2 μ m的突光乳膠微球(西格瑪(sigma))和0.9 μ m乳膠微球(未染色，西格瑪(sigma))。
[0070]在涂敷有上述牛血清白蛋白的2 μ m的熒光乳膠微球中分別添加Iml的濃縮5倍的20nm銀納米粒子溶液(BB國(guó)際公司，硼酸鹽緩沖溶液IOmM, pH8.5)及IOnm金納米粒子溶液(BB國(guó)際公司，硼酸鹽緩沖溶液10mM，pH8.5)，進(jìn)行30分鐘吸附，并添加抗C反應(yīng)蛋白多克隆抗體(ant1-CRP pAb，Abeam) 10 μ g，放置30分鐘。將10 μ g的抗Hl單克隆抗體(ant1-HlmAb, LS-生物(LS-B10))和抗 H5 單克隆抗體(anti_H5mAb,艾博抗(Abcam))只添加到涂敷有上述銀納米粒子的熒光乳膠微球，并放置30分鐘。
[0071]以與實(shí)施例1-1相同的方法制備借助上述牛血清白蛋白吸附有銀或金納米粒子的熒光乳膠微球溶液，在制備過(guò)程中，離心分離機(jī)以5000rpm的轉(zhuǎn)速旋轉(zhuǎn)10分鐘，不用注射器式過(guò)濾器進(jìn)行過(guò)濾，最終添加0.4ml的0.1%牛血清白蛋白(pH8.8，溶解于IOmM碳酸氫鈉緩沖溶液)溶液，并放到冰箱保管。
[0072]實(shí)施例1-3:涂敷有辣根過(guò)氧化物酶(HRP, horeradish peroxidase)的金納米粒子-金納米粒子抗體接合體的制備
[0073]20nm金納米粒子溶液(BB國(guó)際公司)Iml中添加硼酸鹽緩沖溶液(0.1M，pH8.5)0.1ml及抗乙醒活性辣根過(guò)氧化物酶(aldehyde activated HRP,賽默(Thermo)) 10 μ g。經(jīng)過(guò)30分鐘后，在4°C溫度下，以12000rpm轉(zhuǎn)速進(jìn)行15分鐘離心分離后，去除上清液。重新進(jìn)行上述離心分離后，添加15nm金納米粒子溶液(BB國(guó)際公司)lml后,添加緩沖溶液(0.1M,pH8.5)0.1ml和肌I丐蛋白I (Troponin I)單克隆抗體(艾博康，檢測(cè)抗體)10 μ g。經(jīng)過(guò)I小時(shí)后，添加0.2ml的0.1%牛血清白蛋白(pH7.4，溶解于IOmM磷酸鹽緩沖溶液)溶液并進(jìn)行混合(5X),將金納米粒子(gold nanoparticle, AuNP) 一抗體放到冰箱保管。
[0074]實(shí)施例2:金屬納米粒子的抗體接合體的制備
[0075]實(shí)施例2-1:金納米粒子(gold nanoparticle, AuNP)-抗體的制備
[0076]在20nm金納米粒子溶液(BB國(guó)際公司)lml中添加硼酸鹽緩沖溶液(0.1Μ，ρΗ8.5)0.1ml和抗C反應(yīng)蛋白單克隆抗體(作為稀釋抗體的ant1-CRP mAb,艾博康)10 μ g。
[0077]經(jīng)過(guò)30分鐘后，添加10%牛血清白蛋白(bovine serum albumin)溶液(ρΗ8.8,溶解于IOmM碳酸氫鈉緩沖溶液)0.1ml，放置30分鐘。在4°C溫度下，以IOOOOrpm轉(zhuǎn)速對(duì)上述溶液進(jìn)行20分鐘離心分離后，去除上清液。添加0.2ml的0.1%牛血清白蛋白(pH8.8，溶解于IOmM碳酸氫鈉緩沖溶液)溶液并混合后，以IOOOOrpm轉(zhuǎn)速進(jìn)行15分鐘離心分離后，去除上清液。將上述過(guò)程再反復(fù)一次后,最終添加0.2ml的0.1%牛血清白蛋白(pH8.8，溶解于IOmM碳酸氫鈉緩沖溶液)溶液并混合，將金納米粒子(gold nanoparticle, AuNP)-抗體放到冰箱保管。
[0078]實(shí)施例2-2:銀納米粒子(silver nanoparticle, AgNP) 一抗體的制備
[0079]在20nm的銀納米粒子溶液(BB國(guó)際公司)Iml中添加硼酸鹽緩沖溶液(0.1M，pH8.5) 0.1ml和抗C反應(yīng)蛋白單克隆抗體(作為稀釋抗體的ant1-CRP mAb,艾博康)10 μ g,并放置30分鐘。
[0080]以與實(shí)施例2-1相同的方法制備固定有上述抗體的銀納米粒子溶液，并將銀納米粒子(silver nanoparticle, AgNP)-抗體放到冰箱保管。
[0081]實(shí)施例3:具有孔的聚二甲娃氧燒(PDMS, polydimethyl si 1xane)膜的制備
[0082]以10:1的比例混合聚二甲硅氧烷溶液(硅酮樹(shù)脂(Sylgard) 184A，道康寧公司(Dow Corning),美國(guó))和固化劑(娃酮樹(shù)脂(Sylgard) 184B,道康寧公司Dow Corning),美國(guó))，并倒入直徑為150mm的平平的陪替氏培養(yǎng)皿(petri dish)。并利用真空泵來(lái)去除混合液中的氣泡，并在60°C溫度下固化24小時(shí)。之后，在常溫下冷卻固化的聚二甲硅氧烷膜后，利用直徑為15m的穿孔器來(lái)穿六個(gè)孔。結(jié)果，確認(rèn)到制造了具有孔的聚二甲硅氧烷膜。
[0083]比較例1:磁性納米粒子(magnetic nanoparticle, MNP)-抗體接合體的制備
[0084]在用羥基進(jìn)行表面改性的磁性納米粒子溶液中添加IOmM磷酸鹽緩沖溶液(磷酸鹽緩沖溶液(PB, Phosphate buffer), pH7.4),使得最終體積達(dá)到Iml,并進(jìn)行混合后,添加IOmM的N-輕基玻拍酸亞胺(NHS, N-hydroxy succinnimide ;生物核心有限公司(BiacoreInc))和2mM的二氯乙烷(EDC，生物核心有限公司)、10 μ g的抗體，并放置約2個(gè)小時(shí)。
[0085]上述磁性納米粒子溶液使用基質(zhì)(matrix)為羧甲基葡聚糖(CarboxymethyΙ-dextran)的IOOnm磁性納米粒子溶液(頭孢甲廂(CMX), 25mg/ml,凱米歇爾公司(Chemicell)) 100 μ 1、由聚丙烯酸(polyacrylic acid)形成的IOOnm磁性納米粒子溶液(對(duì)氨基水楊酸(PAS), 50mg/ml,凱米歇爾公司(Chemicell)) 60 μ I,作為抗體添加抗金黃色釀膿葡萄球菌單克隆抗體(ant1-S.aureus mAb,艾博康)?？笻l單克隆抗體(ant1-HlmAb，隆生生物科技有限公司(LS-BIO))和抗H5單克隆抗體(anti_H5mAb，艾博康)只添加到由羧甲基葡聚糖(Carboxymethyl-dextran)形成的IOOnm的磁性納米粒子溶液中。
[0086]以與實(shí)施例1-1相同的方法制備固定有上述抗體的磁性納米粒子溶液。
[0087]比較例2:未染色乳膠微球(latex beads, LB)-抗體接合體的制備
[0088]在4°C溫度下，以5000rpm轉(zhuǎn)速對(duì)用羥基進(jìn)行表面改性的0.9 μ m乳膠微球(西格瑪(sigma))50yl進(jìn)行3分鐘離心分離后，去除上清液。對(duì)上述乳膠微球添加IOmM的磷酸鹽緩沖溶液(Phosphate buffer,PB,pH7.4),使得最終體積達(dá)到Iml,并進(jìn)行混合后,添加IOmM的N-輕基琥拍酰亞胺(NHS, N-hydroxysuccinnimide ;生物核心有限公司(Biacore Inc))、2mM的二氯乙燒(EDC,生物核心有限公司)及10 μ g的抗人體⑶3抗體(ant1-human⑶3Ab,BD公司)，并放置2個(gè)小時(shí)。
[0089]利用與實(shí)施例1-2相同的方法制備固定有上述抗人體CD3抗體的乳膠微球溶液
[0090]實(shí)驗(yàn)例1:利用涂敷有牛血清白蛋白的磁性納米粒子(MNP，基質(zhì):頭孢甲肟)_金納米粒子(AuNP)-抗體的金黃色釀膿葡萄球菌分析
[0091]實(shí)驗(yàn)例1-1:利用活菌數(shù)確認(rèn)抗體的固定化效率
[0092]分別混合以下溶液并輕輕搖晃30分鐘，上述溶液包含:利用實(shí)施例1-1的方法制備的磁性納米粒子(頭孢甲肟)-牛血清白蛋白、涂敷有牛血清白蛋白的磁性納米粒子(頭孢甲肟)-金納米粒子-抗-金黃色釀膿葡萄球菌單克隆抗體(MNP (CMX) -AuNP-ant1-S.aureus mAb) 10 μ g/ml、利用比較例I的方法制備的磁性納米粒子(頭孢甲I虧)_抗-金黃色釀膿葡萄球菌單克隆抗體(MNP (CMX)-ant1-S.aureus mAb)接合體等各溶液40 μ I ;使金黃色釀膿葡萄球菌(S.Aureus)懸浮于磷酸鹽緩沖溶液(PBS)的溶液10 μ I (105cfu);磷酸鹽緩沖溶液(PBS)IOO μ I。經(jīng)過(guò)30分鐘后，添加磷酸鹽緩沖溶液(PBS)IOO μ 1，并在常溫下利用磁鐵來(lái)從上述溶液分離磁性納米粒子，如此分離約3分鐘后，回收上清液及與各磁性納米粒子接合體進(jìn)行反應(yīng)的金黃色釀膿葡萄球菌復(fù)合體。
[0093]回收的上清液和磁性納米粒子接合體-金黃色釀膿葡萄球菌混合液按每100 μ I的量涂抹于陪替氏培養(yǎng)皿(petri dish)中的瓊脂培養(yǎng)基(大豆胰蛋白胨肉湯(Trypticasesoy broth) (BD211825) 3%，瓊脂粉末2%)，并在37°C溫度下培養(yǎng)16?24小時(shí)。進(jìn)行上述培養(yǎng)后，通過(guò)測(cè)定在培養(yǎng)基上形成的活菌數(shù)，確認(rèn)磁性納米粒子中利用金納米粒子的抗體固定化方法的效果。
[0094]如圖2所示，與將抗體直接固定到磁性納米粒子的方法相比，利用涂敷有牛血清白蛋白的磁性納米粒子(MNP)-金納米粒子(gold nanoparticle, AuNP)-抗體接合體的情況下，確認(rèn)到抗體固定化效率增加了約30%左右。
[0095]實(shí)驗(yàn)例1-2:金黃色釀膿葡萄球菌(Staphylococcu saureus)分析
[0096]確認(rèn)利用根據(jù)本發(fā)明的固定化方法來(lái)制備的磁性納米粒子接合體的抗體被金納米粒子而固定的狀態(tài)。分別混合以下溶液并輕輕搖晃30分鐘，上述溶液包含:使金黃色釀膿葡萄球菌(S.Aureus)懸浮于磷酸鹽緩沖溶液(PBS)的溶液10 μ I (10°-5xl06cfu);利用實(shí)施例1-1的方法制備的涂敷有牛血清白蛋白的磁性納米粒子(頭孢甲肟)-金納米粒子-抗-金黃色釀膿葡萄球菌單克隆抗體(MNP (CMX) -AuNP-ant1-S.aureus mAb)接合體溶液40 μ I以及磷酸鹽緩沖溶液(PBS) 50 μ I。
[0097]上述溶液中添加磷酸鹽緩沖溶液(PBS) 100 μ 1，并在常溫下利用磁鐵來(lái)分離磁性納米粒子，如此分離約3分鐘后，去除上清液，回收與涂敷有牛血清白蛋白的磁性納米粒子(頭孢甲肟)_金納米粒子-抗-金黃色釀膿葡萄球菌單克隆抗體(MNP(CMX)-AuNP-ant1-S.aureus mAb)接合體進(jìn)行反應(yīng)的金黃色釀膿葡萄球菌(S.aureus)。
[0098]作為捕獲用過(guò)濾膜使用了在孔的大小為1.2μπι的硝酸纖維素(NC，nitrocelluolose)膜(微孔過(guò)濾器，Millipore)上涂敷1%牛血清白蛋白溶液(溶解于磷酸鹽緩沖溶液(PBS))后進(jìn)行干燥而得的過(guò)濾膜。在具有支管的IOOml三角燒瓶安裝的過(guò)濾器上置有上述硝酸纖維素膜，在硝酸纖維素膜上遮蓋在實(shí)施例3中制備的聚二甲硅氧烷(PDMS)膜。通過(guò)燒瓶的支管，將真空狀態(tài)破壞，并將與上述回收的涂敷有牛血清白蛋白的磁性納米粒子(頭孢甲肟)_金納米粒子-抗-金黃色釀膿葡萄球菌單克隆抗體接合體進(jìn)行反應(yīng)的金黃色釀膿葡萄球菌混合溶液通過(guò)聚二甲硅氧烷膜的孔，來(lái)確認(rèn)金黃色釀膿葡萄球菌的濃度。
[0099]其結(jié)果，如圖3所示，確認(rèn)到在IOtlCfu的金黃色釀膿葡萄球菌中，過(guò)濾用膜上未殘留磁性納米粒子(頭孢甲肟)-金納米粒子-抗-金黃色釀膿葡萄球菌單克隆抗體(MNP(CMX) -AuNP-ant1-S.aureus mAb)接合體,金黃色釀膿葡萄球菌的濃度越增加,殘留在過(guò)濾用膜的涂敷有牛血清白蛋白的磁性納米粒子(頭孢甲肟)_金納米粒子-抗-金黃色釀膿葡萄球菌單克隆抗體接合體的量增加。由此，只有與借助金納米粒子固定抗體的磁性納米粒子相結(jié)合的微生物殘留在捕獲用過(guò)濾膜，由此因納米粒子具有的固有顏色，可通過(guò)肉眼測(cè)定菌的有無(wú)，且按不同濃度進(jìn)行測(cè)定。
[0100]實(shí)驗(yàn)例1-3:通過(guò)金納米粒子擴(kuò)增處理的金黃色釀膿葡萄球菌(Staphylococcusaureus)分析
[0101]使與實(shí)驗(yàn)例1-2的涂敷有牛血清白蛋白的磁性納米粒子(頭孢甲肟)-金納米粒子-抗-金黃色釀膿葡萄球菌單克隆抗體(MNP (CMX) -AuNP-ant1-S.aureus
[0102]mAb)接合體進(jìn)行反應(yīng)的金黃色釀膿葡萄球菌復(fù)合體過(guò)濾的上述捕獲用過(guò)濾膜中，滴入含有 5mM輕胺(hydroxyl amine)、25mM 四氯金酸(hydrogen tetrachloroaurateC III))的IOmM朽1檬酸緩沖溶液(citrate buffer, pH3.0),在常溫下反應(yīng)約15分鐘。
[0103]其結(jié)果，如圖4所示，確認(rèn)到利用金還原溶液來(lái)還原金，因殘留留在過(guò)濾膜的涂敷有牛血清白蛋白的磁性納米粒子(頭孢甲肟)_金納米粒子-抗-金黃色釀膿葡萄球菌單克隆抗體接合體的深色化，能夠提高測(cè)定不同濃度菌的靈敏度。
[0104]實(shí)驗(yàn)例2:利用涂敷有牛血清白蛋白的磁性納米粒子(MNP, matrix:對(duì)氨基水楊酸)-金納米粒子(AuNP)-抗體的金黃色釀膿葡萄球菌分析及與其他菌的交叉反應(yīng)的確認(rèn)
[0105]實(shí)驗(yàn)例2-1:金黃色釀膿葡萄球菌分析
[0106]使用通過(guò)實(shí)施例1-1的方法制備的基質(zhì)為聚丙烯酸的涂敷有牛血清白蛋白的磁性納米粒子(對(duì)氨基水楊酸)-金納米粒子-抗-金黃色釀膿葡萄球菌單克隆抗體(MNP(PAS)-AuNP-ant1-S.aureus mAb)接合體，以與上述實(shí)驗(yàn)例1_2相同的步驟確認(rèn)金黃色釀膿葡萄球菌的濃度。
[0107]其結(jié)果，如圖5所示，在使用由聚丙烯酸形成的磁性納米粒子(對(duì)氨基水楊酸)_金納米粒子-抗-金黃色釀膿葡萄球菌單克隆抗體(MNP (PAS)-AuNP-ant1-S.aureus mAb)接合體的情況下，也表現(xiàn)與圖3類(lèi)似的傾向性，可根據(jù)固定有抗體的納米粒子具有的固有的顏色而測(cè)定菌的有無(wú)，且按不同濃度進(jìn)行測(cè)定。
[0108]實(shí)驗(yàn)例2-2:通過(guò)銀納米粒子擴(kuò)增處理的金黃色釀膿葡萄球菌分析
[0109]以1:1的比例混合用于擴(kuò)增銀納米粒子的溶液A (銀鹽，silver salt)和溶液B(氫醌引發(fā)劑，hydroquinone initiator)來(lái)制備混合溶液,將上述混合溶液滴至實(shí)驗(yàn)例2_1的捕獲用過(guò)濾膜，在常溫下反應(yīng)約10分鐘。其結(jié)果，如圖6所示，通過(guò)銀納米粒子擴(kuò)增處理，金黃色釀膿葡萄球菌的濃度越增加，因殘留在過(guò)濾膜的涂敷有牛血清白蛋白的磁性納米粒子(對(duì)氨基水楊酸)-金納米粒子-抗-金黃色釀膿葡萄球菌單克隆抗體接合體的深色化，能夠提高測(cè)定不同濃度菌的靈敏度。
[0110]實(shí)驗(yàn)例2-3:確認(rèn)與其他菌的交叉反應(yīng)
[0111]為了確認(rèn)根據(jù)本發(fā)明的多功能生物材料接合體是否能夠選擇性地檢測(cè)微生物，使用涂敷牛血清白蛋白的磁性納米粒子(對(duì)氨基水楊酸)-金納米粒子-抗-金黃色釀膿葡萄球菌單克隆抗體，并根據(jù)與上述實(shí)驗(yàn)例2-1相同的步驟，只改變菌的種類(lèi)來(lái)進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。將總共為4種菌的沙門(mén)氏菌細(xì)胞(Salmonella typimurium)、單核細(xì)胞增多性李司戎氏菌(Listeria monocytogenes)、金黃色葡萄球菌細(xì)胞(Staphylococcus aureus)及大腸桿菌細(xì)胞(Escherichia coli)與磁性納米粒子(對(duì)氨基水楊酸)-金納米粒子-抗-金黃色釀膿葡萄球菌單克隆抗體接合體反應(yīng)后進(jìn)行分析。
[0112]其結(jié)果,如圖7所示,確認(rèn)到在沙門(mén)氏菌細(xì)胞(Salmonella typimurium)、單核細(xì)胞增多性李司戎氏菌(Listeria monocytogenes)及大腸桿菌細(xì)胞(Escherichia coli)中沒(méi)有出現(xiàn)涂敷有牛血清白蛋白的磁性納米粒子(對(duì)氨基水楊酸)_金納米粒子(MNP(PAS)-AuNP)，在金黃色葡萄球菌細(xì)胞(Staphylococcus aureus)中選擇性地出現(xiàn)涂敷有牛血清白蛋白的磁性納米粒子(對(duì)氨基水楊酸)-金納米粒子(MNP (PAS) -AuNP)ο
[0113]實(shí)驗(yàn)例2-4:利用金黃色釀膿葡萄球菌比較抗體的固定化容量[0114]使用將抗金黃色釀膿葡萄球菌單克隆抗體(ant1-S.aureus mAb)直接固定到磁性納米粒子(對(duì)氨基水楊酸)的接合體與在涂敷有牛血清白蛋白的磁性納米粒子(磁性納米粒子、對(duì)氨基水楊酸)-金納米粒子(goldnanoparticle,AuNP)固定抗金黃色釀膿葡萄球菌單克隆抗體的接合體，并根據(jù)與上述實(shí)驗(yàn)例2-1相同的步驟，肉眼比較菌的不同濃度的測(cè)定。
[0115]如圖8所示，與將抗體直接固定到磁性納米粒子(對(duì)氨基水楊酸)的接合體相比，借助涂敷有牛血清白蛋白的磁性納米粒子(磁性納米粒子、對(duì)氨基水楊酸)_金納米粒子(goldnanopart icle, AuNP )固定抗體的接合體，因金納米粒子的紅色而增加信號(hào)，如圖9所示,能夠通過(guò)銀納米粒子擴(kuò)增處理得到更大的信號(hào)。
[0116]實(shí)驗(yàn)例3:利用涂敷有牛血清白蛋白的突光乳膠微球(latex beads, fluorescentyellow-green, LB)-銀納米粒子(silver nanoparticle, AgNP)或金納米粒子(goldnanoparticle, AuNP)-抗體的C反應(yīng)蛋白(CRP)測(cè)定
[0117]實(shí)施例3-1:通過(guò)熒光信號(hào)的C反應(yīng)蛋白(CRP)測(cè)定
[0118]在利用實(shí)施例1-2的方法制備的涂敷有牛血清白蛋白的熒光乳膠微球(latexbeads 突光黃-突光綠，2 μ m LB)-銀納米粒子(silver nanoparticle, 20nm AgNP)-抗 C 反應(yīng)蛋白多克隆抗體(ant1-CRP pAb)接合體和涂敷有牛血清白蛋白的突光乳膠微球(latexbeads, fluorescent yellow-green, 2 μ m LB)-金納米粒子(gold nanoparticle, 20nmAuNP)-抗C反應(yīng)蛋白多克隆抗體(ant1-CRP pAb)接合體I μ I中分別添加不同濃度Oyg/ml、I μ g/ml、10 μ g/ml的C反應(yīng)蛋白和利用實(shí)施例2_1的方法制備的金納米粒子(goldnanoparticle, 20nm AuNP)-抗C反應(yīng)蛋白單克隆抗體(ant1-CRP mAb)接合體10 μ I或利用實(shí)施例2-2的方法制備的銀納米粒子(silver nanoparticle, 20nm AgNP)-抗C反應(yīng)蛋白單克隆抗體接合體10μ I,用磷酸鹽緩沖溶液(Phosphate buffered Saline, PBS, pH7.4)將最終體積達(dá)到200 μ 1，反應(yīng)30分鐘。
[0119]利用與實(shí)驗(yàn)例1-2相同的方法，將上述反應(yīng)液依次通過(guò)凝聚用膜(PDMS)及
0.8 μ mm非對(duì)稱(chēng)超微米(MMM, asymetric super-micron membrane)過(guò)濾膜,并捕獲在膜中，比較突光信號(hào)。
[0120]如圖10所示，確認(rèn)到，借助金納米粒子-抗-C反應(yīng)蛋白單克隆抗體(AuNP-ant1-CRP mAb)接合體，熒光信號(hào)的強(qiáng)度增加，尤其，與涂敷有牛血清白蛋白的乳膠微球(LB，2 μ m)-銀納米粒子-抗-C反應(yīng)蛋白多克隆抗體接合體進(jìn)行反應(yīng)時(shí)，熒光信號(hào)的強(qiáng)度更高。由此，根據(jù)本發(fā)明的利用金納米粒子或銀納米粒子的抗體固定化方法能夠與粒子的種類(lèi)無(wú)關(guān)地進(jìn)行固定。
[0121]實(shí)驗(yàn)例3-2:利用流通孔(FTH, f1w-through-hoIe)膜的C反應(yīng)蛋白測(cè)定
[0122]準(zhǔn)備以正四角形模樣剪切的吸收墊和具有三個(gè)孔的兩面膠，在吸收墊上置有
0.8 μ mm非對(duì)稱(chēng)超微米(MMM, asymetric super-micron membrane)過(guò)濾膜，在其上面粘貼具有孔的兩面膠，各孔中滴入涂敷有牛血清白蛋白的熒光乳膠微球(2 μ m)_銀納米粒子-抗-C反應(yīng)蛋白多克隆抗體接合體各1μ I。上述孔中分別依次滴入0μ g/ml>l μ g/ml、10 μ g/ml的C反應(yīng)蛋白抗原各10 μ I及金納米粒子-抗_C反應(yīng)蛋白單克隆抗體各5 μ I后，測(cè)定C反應(yīng)蛋白的濃度。
[0123]如圖11所示，確認(rèn)到C反應(yīng)蛋白的濃度越增加，殘留在過(guò)濾膜的涂敷有牛血清白蛋白的熒光乳膠微球(2 μ m)_銀納米粒子-抗-C反應(yīng)蛋白多克隆抗體接合體和-C反應(yīng)蛋白金納米粒子-抗-c反應(yīng)蛋白單克隆抗體的復(fù)合體的量增加，由此，可根據(jù)熒光乳膠微球和金納米粒子的固有顏色來(lái)測(cè)定不同濃度的C反應(yīng)蛋白。
[0124]實(shí)驗(yàn)例3-3:利用免疫條(lateral flow assay,橫向流動(dòng)分析)的C反應(yīng)蛋白測(cè)定
[0125]180sec 硝酸纖維素(NC, nitrocelluolose)膜上分別點(diǎn)滴(spotting)作為第二抗體(2nd Ab)的抗-小鼠免疫球蛋白G抗體(ant1-mouse IgG Ab,對(duì)照組,lmg/ml) 0.3 μ I及抗-C反應(yīng)蛋白多克隆抗體(ant1-CRP pAb，lmg/ml) 0.3 μ 1，并在常溫下干燥約20分鐘。利用實(shí)施例1-1的方法制備的涂敷有牛血清白蛋白的80nm及90nm磁性納米粒子(Fe3O4,Fe3O4-SiO2)-金納米粒子-抗C反應(yīng)蛋白單克隆抗體接合體10 μ I和相互不同濃度Ong/ml、10ng/ml、100ng/ml、l μ g/ml的C反應(yīng)蛋白抗原以及1%的聚乙烯卩比咯燒酮(PVP)和表面活性劑(surfactantlOG),用無(wú)血清C反應(yīng)蛋白(高純)將最終體積達(dá)到100 μ I,在此混合液中浸泡上述條(strip),以使上述條(strip)的末端與混合液稍微接觸。
[0126]混合液沿著條上升而發(fā)生免疫反應(yīng)時(shí)，觀察是否出現(xiàn)信號(hào)，由此能夠確認(rèn)磁性納米粒子-金納米粒子-抗體接合體的固定化狀態(tài)。反應(yīng)結(jié)束后，用磷酸鹽緩沖溶液(Phosphate buffered Saline, PBS, pH7.4)清洗硝酸纖維素(NC, nitrocelluolose)。
[0127]如圖12所示，在免疫條上，固定于硝酸纖維素(NC，nitix)Cellu0l0Se)膜的抗體和涂敷有抗原和蛋白質(zhì)的磁性納米粒子-金納米粒子-抗體接合體進(jìn)行免疫反應(yīng)，由此能夠與納米粒子的種類(lèi)無(wú)關(guān)地，根據(jù)接合體的納米粒子的顏色確認(rèn)是否出現(xiàn)紅色信號(hào)。
[0128]實(shí)驗(yàn)例4:利用涂敷有牛血清白蛋白的熒光乳膠微球(latex beads,熒光紅，LB)-銀納米粒子(silver nanoparticle,AgNP)-抗體的HlNl病毒分析及與其他亞型病毒的交叉反應(yīng)確認(rèn)
[0129]實(shí)驗(yàn)例4-1:通過(guò)熒光測(cè)定的HlNl分析
[0130]對(duì)利用實(shí)施例1-2的方法制備的涂敷有牛血清白蛋白的熒光乳膠微球(latexbeads,突光紅,2 μ m LB)-銀納米粒子(silver nanoparticle, 20nm AgNP)-抗 Hl 病毒單克隆抗體(ant1-HlmAb)接合體I μ I和10°、IO1UO2'ΙΟ3、104、105pfu的HlNl病毒，用磷酸鹽緩沖溶液將最終體積達(dá)到100μ 1，并進(jìn)行20分鐘的反應(yīng)后，添加利用比較例I的方法制備的磁性納米粒子(MNP,頭孢甲廂)_抗Hl病毒單克隆抗體(ant1-HlmAb)接合體I μ I,進(jìn)行20分鐘反應(yīng)。
[0131]在上述反應(yīng)液中添加磷酸鹽緩沖溶液100 μ 1，并在常溫下利用磁鐵來(lái)分離磁性納米粒子,如此分離約3分鐘后，去除上清液，并添加磷酸鹽緩沖溶液100 μ 1，由此回收涂敷有牛血清白蛋白的熒光乳膠微球(2 μ m)-銀納米粒子-抗-Hl單克隆抗體接合體-HlNl病毒-MNP (CMX)-Hl單克隆抗體的復(fù)合體。上述過(guò)程再反復(fù)一次后，利用與實(shí)驗(yàn)例1-2相同的方法，使上述溶液通過(guò)0.8 μ mm非對(duì)稱(chēng)超微米(MMM, asymetric super-micron membrane)過(guò)濾膜，并捕獲在膜中，確認(rèn)熒光信號(hào)。
[0132]圖13的(A)為示出病毒和不同濃度熒光信號(hào)的圖像，(B)為將測(cè)定熒光信號(hào)強(qiáng)度的結(jié)果數(shù)值化的圖表。
[0133]如圖13所示，隨著HlNl的濃度增加，熒光信號(hào)的強(qiáng)度增加，能夠測(cè)定至最小lOpfu?？芍?，這是因?yàn)榻柚c病毒進(jìn)行反應(yīng)的銀納米粒子固定有抗體的熒光乳膠微球殘留在捕獲用過(guò)濾膜，由此能夠通過(guò)微球的熒光來(lái)進(jìn)行測(cè)定。
[0134]實(shí)驗(yàn)例4-2:確認(rèn)相互不同的亞型病毒與涂敷有牛血清白蛋白的熒光乳膠微球(latex beads,突光紅，2 μ m LB)-銀納米粒子(silver nanoparticle, 20nm
[0135]AgNP)-抗Hl病毒單克隆抗體(抗-Hl單克隆抗體)接合體進(jìn)行交叉反應(yīng)
[0136]為了確認(rèn)根據(jù)本發(fā)明的多功能生物材料接合體是否能夠選擇性地檢測(cè)病毒，對(duì)使用通過(guò)比較例I的方法制備的磁性納米粒子(MNP，頭孢甲肟)-抗Hl單克隆抗體(抗-Hl單克隆抗體)接合體I μ I和作為相互不同的亞型病毒的Η1Ν1、Η3Ν2、Η5Ν2的各103pfu病毒，分別利用磷酸鹽緩沖溶液將最終體積達(dá)到100 μ 1，反應(yīng)20分鐘。在常溫下利用磁鐵來(lái)從上述反應(yīng)液分離磁性納米粒子，如此分離約3分鐘后，去除上清液，并添加磷酸鹽緩沖溶液100 μ I來(lái)使溶液懸浮。
[0137]各上述溶液中分別添加利用實(shí)施例1-2的方法制備的涂敷有牛血清白蛋白的熒光乳膠微球(latex beads,突光紅,2 μ m LB)-銀納米粒子(silver nanoparticle, 20nmAgNP)-抗Hl病毒單克隆抗體(抗-Hl單克隆抗體)接合體I μ I,反應(yīng)20分鐘。在常溫下利用磁鐵來(lái)從上述反應(yīng)液分離磁性納米粒子，如此分離約3分鐘后，去除上清液，并添加磷酸鹽緩沖溶液100 μ 1，由此回收各個(gè)磁性納米粒子(頭孢甲肟)-Hl單克隆抗體接合體-病毒-涂敷有牛血清白蛋白的熒光乳膠微球(2 μ m)-銀納米粒子-抗-Hl單克隆抗體的復(fù)合體。上述過(guò)程再反復(fù)一次后，利用與實(shí)驗(yàn)例4-1相同的方法，使上述溶液通過(guò)0.8 μ m纖維素醋酸膜(Cellulo se Acetatemembrane)過(guò)濾膜,捕獲在膜中，確認(rèn)突光信號(hào)。
[0138]其結(jié)果，如圖14所示，確認(rèn)到在作為相互不同的亞型病毒的H3N2、H5N2中沒(méi)有出現(xiàn)基于涂敷有牛血清白蛋白的熒光乳膠微球(2 μ m)-銀納米粒子-抗-Hl單克隆抗體的熒光信號(hào)，只在HlNl中選擇性地出現(xiàn)涂敷有牛血清白蛋白的熒光乳膠微球(2 μ m)-銀納米粒子-抗-Hl單克隆抗體的熒光信號(hào)。
[0139]實(shí)驗(yàn)例4-3:確認(rèn)相互不同的亞型病毒與涂敷有牛血清白蛋白的熒光乳膠微球(latex beads,突光紅，2 μ m LB)-銀納米粒子(silver nanoparticle, 20nm AgNP)-抗 H5 病毒單克隆抗體(ant1-H5mAb)接合體的交叉反應(yīng)
[0140]使用通過(guò)比較例I的方法制備的磁性納米粒子(MNP，CMX)-抗H5單克隆抗體(ant1-H5mAb)接合體和利用實(shí)施例1_2的方法制備的涂敷有牛血清白蛋白的熒光乳膠微球(latex beads,突光紅，2 μ m LB)-銀納米粒子(silver nanoparticle, 20nm AgNP)-抗 H5病毒單克隆抗體(ant1-H5mAb)接合體,利用與上述實(shí)驗(yàn)例4_2相同的方法來(lái)使作為相互不同的亞型病毒的H1N1、H3N2、H5N2反應(yīng)后進(jìn)行分析。
[0141]其結(jié)果，如圖15所示，確認(rèn)到在H1N1、H3N2中沒(méi)有出現(xiàn)基于涂敷有牛血清白蛋白的熒光乳膠微球(2 μ m)-銀納米粒子-抗-H5單克隆抗體的熒光信號(hào)，只在H5N2中選擇性地出現(xiàn)涂敷有牛血清白蛋白的熒光乳膠微球(2 μ m)-銀納米粒子-抗-H5單克隆抗體的熒
光信號(hào)。
[0142]實(shí)驗(yàn)例5:利用涂敷有牛血清白蛋白的乳膠微球(undyed latex beads, LB)-金納米粒子(gold nanoparticle, AuNP)-抗體的 T 細(xì)胞(Tcell) (CD3)的分離
[0143]實(shí)驗(yàn)例5-1:利用T細(xì)胞的分離率來(lái)確認(rèn)抗體的固定化效率
[0144]將利用比較例2和實(shí)施例1-2的方法制備的乳膠微球(undyed latex bead, 0.9 μ mLB)-抗人體⑶3抗體(ant1-human⑶3Ab)接合體和涂敷有牛血清白蛋白的乳膠微球(undyed lates bead, 0.9 μ m LB)-金納米粒子(gold nanoparticle, 20nm AuNP)-抗 human⑶3抗體(ant1-human⑶3Ab)接合體溶液分別與血液混合,并在常溫下放置20分鐘。上述反應(yīng)液中添加相同體積的2%胎牛血清-磷酸鹽緩沖溶液(FBS-PBS)來(lái)攪拌均勻后，放在重密度介質(zhì)(density medium,聚鹿糖(Ficoll))上，在常溫下以2000rpm、分離(break off)條件，進(jìn)行30分鐘離心分離。離心分離后，回收位于聚蔗糖的重密度介質(zhì)血漿界限部分的細(xì)胞，利用流式細(xì)胞儀(FACS)，確認(rèn)T細(xì)胞(CD3)的存在與否及T細(xì)胞(CD3)的選擇性分離率(去除)，由此確認(rèn)乳膠微球中利用金納米粒子的抗體固定化方法的效果。如圖16所示，確認(rèn)到與將抗體直接固定到乳膠微球的方法相比，利用涂敷有牛血清白蛋白的乳膠微球(LB)-金納米粒子(gold nanoparticles, AuNP)-抗體接合體的情況下，T細(xì)胞(0)3)的分離(去除)有效性更高，由此確認(rèn)到抗體固定化效率增加了。
[0145]實(shí)驗(yàn)例6:利用涂敷有辣根過(guò)氧化物酶(HRP)的金納米粒子-金納米粒子抗體接合體的肌I丐蛋白I (Troponin I)分析
[0146]利用分配器(Dispensor，澤塔(Zeta)公司)，以SmM的間距在硝酸纖維素膜上分別涂敷0.lmg/ml濃度的抗小鼠免疫球蛋白G (IgG)抗體(對(duì)照線，Control line)和肌隹丐蛋白I (Troponin I)抗體(實(shí)驗(yàn)線，Test line)。以3.8mM的間距剪切所涂敷的硝酸纖維素膜來(lái)制造條傳感器(每傳感器的抗體涂敷量=38ng/條)。為了按不同濃度測(cè)定肌鈣蛋白I，將在上述實(shí)施例1?實(shí)施例3中制備的涂敷有辣根過(guò)氧化物酶(HRP)的金納米粒子-金納米粒子抗體接合體IX，在包含2%聚乙烯批咯燒酮(PVP, polyvinylpyrrolidone ;西格瑪(sigma))和2%表面活性劑(SurfactatelOG,菲茨杰拉德(Fitzgerald))的人體血清(西格瑪(sigma))溶液中以O(shè)?1000ng/ml的濃度混合肌I丐蛋白I (Troponin I)并放入96孔板(well plate)后，放入所制備的上述條傳感器并反應(yīng)10分鐘。將結(jié)束反應(yīng)的條重新放到分注磷酸鹽緩沖溶液的96孔板，清洗20分鐘。去除清洗完的條的試樣墊(sample pad),并用溶解有2mM魯米諾(Iuminol,西格瑪(sigma)), 0.5mM的p-香豆酸(p-coumaricacid,西格瑪(sigma))、2mM的過(guò)氧化氫(hydrogen peroxide)的0.1M的三輕甲基氨基甲燒鹽酸鹽(Tris-HCl，pH8.8)緩沖溶液20 μ I處理?xiàng)l后，利用高靈敏度化學(xué)發(fā)光儀(Chem1-Doc，美國(guó)伯樂(lè)(Bitj-RaCl)公司)測(cè)定化學(xué)發(fā)光信號(hào)120秒鐘，將其結(jié)果表示在圖17中。如圖17的實(shí)驗(yàn)線所示，在肌鈣蛋白I的0.1?1000ng/ml的濃度范圍內(nèi)，可確認(rèn)隨著肌鈣蛋白I的濃度增加，信號(hào)也增加。
[0147]以上，對(duì)本
【發(fā)明內(nèi)容】
的特定部分進(jìn)行了詳細(xì)的說(shuō)明，本領(lǐng)域普通技術(shù)人員應(yīng)當(dāng)理解，這些具體技術(shù)只是優(yōu)選的實(shí)施方式，本發(fā)明不局限于此。因此，本發(fā)明的實(shí)質(zhì)性的范圍應(yīng)根據(jù)發(fā)明要求保護(hù)范圍及它們的等同替代來(lái)定義。
[0148]產(chǎn)業(yè)上的可利用性
[0149]在本發(fā)明中，根據(jù)本發(fā)明的多功能生物材料接合體的制備方法利用兩種粒子來(lái)能夠防止納米粒子的沉淀并容易固定生物材料，且能夠制備具有多功能的生物材料接合體。并且，利用上述方法制備的多功能生物材料接合體可用于檢測(cè)微生物，可檢測(cè)至IO1Cfu濃度的微生物。
【權(quán)利要求】
1.一種多功能生物材料接合體的制備方法，其特征在于，包括: 步驟(a)，將蛋白質(zhì)涂敷于具有磁性或熒光特性的第一納米粒子； 步驟(b)，將具有金屬特性的第二納米粒子吸附于涂敷有蛋白質(zhì)的上述第一納米粒子來(lái)制備接合體；以及 步驟(C)，將生物材料吸附于上述接合體來(lái)制備多功能生物材料接合體。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的多功能生物材料接合體的制備方法，其特征在于，上述第一納米粒子選自包含乳膠、磁、二氧化硅、量子點(diǎn)及金屬納米粒子的組。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的多功能生物材料接合體的制備方法，其特征在于，上述第二納米粒子選自包含金、銀、銅、鉬及量子點(diǎn)的組。
4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的多功能生物材料接合體的制備方法，其特征在于，上述第一納米粒子的粒子大小大于第二納米粒子的粒子大小。
5.根據(jù)權(quán)利要求1所述的多功能生物材料接合體的制備方法，其特征在于，用于涂敷上述第一納米粒子的蛋白質(zhì)選自包含牛血清白蛋白、過(guò)氧化物酶、葡糖氧化酶、膽堿氧化酶、堿性磷酸酶、鏈霉親和素、脫脂乳、血清及肽的組。
6.根據(jù)權(quán)利要求 1所述的多功能生物材料接合體的制備方法，其特征在于，上述生物材料選自包含抗體、酶、脫氧核糖核酸、適配體、肽核酸及配體的組。
7.一種多功能生物材料接合體，其特征在于，在具有磁性或熒光特性的第一納米粒子涂敷有蛋白質(zhì)，在上述蛋白質(zhì)吸附有具有金屬特性的第二納米粒子，且在上述第二納米粒子吸附有生物材料。
8.根據(jù)權(quán)利要求7所述的多功能生物材料接合體,其特征在于,上述第一納米粒子選自包含乳膠、磁、二氧化硅、量子點(diǎn)及金屬納米粒子的組。
9.根據(jù)權(quán)利要求7所述的多功能生物材料接合體,其特征在于,上述第二納米粒子選自包含金、銀、銅、鉬及量子點(diǎn)的組。
10.根據(jù)權(quán)利要求7所述的多功能生物材料接合體,其特征在于,上述第一納米粒子的粒子大小大于第二納米粒子的粒子大小。
11.根據(jù)權(quán)利要求7所述的多功能生物材料接合體，其特征在于，用于涂敷上述第一納米粒子的蛋白質(zhì)選自包含牛血清白蛋白、過(guò)氧化物酶、葡糖氧化酶、膽堿氧化酶、堿性磷酸酶、鏈霉親和素、脫脂乳、血清及肽的組。
12.根據(jù)權(quán)利要求7所述的多功能生物材料接合體，其特征在于，上述生物材料選自包含抗體、酶、脫氧核糖核酸、適配體、肽核酸及配體的組。
13.—種生物傳感器，其特征在于，包含根據(jù)權(quán)利要求7所述的多功能生物材料接合體。
14.一種利用多功能生物材料接合體的微生物的高速檢測(cè)方法，其特征在于，包括: 步驟(a)，將多功能生物材料接合體及含有檢測(cè)對(duì)象微生物的試樣混合而反應(yīng)，上述多功能生物材料接合體中，在具有磁性或熒光特性的第一納米粒子涂敷有蛋白質(zhì)，在上述蛋白質(zhì)吸附有具有金屬特性的第二納米粒子，且在上述第二納米粒子吸附有與檢測(cè)對(duì)象微生物進(jìn)行特異性結(jié)合的抗體； 步驟(b)，使上述反應(yīng)液依次通過(guò)微生物凝聚用膜及微生物捕獲用過(guò)濾膜，來(lái)使未與微生物反應(yīng)的多功能生物材料接合體透過(guò)，并選擇性地分離出多功能生物材料接合體一微生物復(fù)合體；以及 步驟(C)，測(cè)定在上述微生物捕獲用過(guò)濾膜中捕獲的多功能生物材料接合體一微生物復(fù)合體的有無(wú)或多功能生物材料 接合體一微生物復(fù)合體的濃度。
【文檔編號(hào)】B82Y15/00GK104011545SQ201280050559
【公開(kāi)日】2014年8月27日 申請(qǐng)日期:2012年10月12日 優(yōu)先權(quán)日:2011年10月14日
【發(fā)明者】金珉坤, 成倫周, 卞妵英, 吳迎慶, 鄭曉庵 申請(qǐng)人:光州科學(xué)技術(shù)院, 韓國(guó)生命工學(xué)硏究院