專利名稱：拉曼活性分子位于納米粒子二聚體的結(jié)合部的二聚體核殼納米粒子、其用途及制備方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種納米粒子二聚體，其制備成使得拉曼活性分子位于由納米粒子構(gòu)成的二聚體的結(jié)合部，更具體地，涉及一種核殼納米粒子二聚體，在核表面結(jié)合寡核苷酸，并且由金殼或銀殼(shell)包圍所述核而形成。形成核的納米粒子是金納米粒子或銀納米粒子。本發(fā)明還涉及所述核殼納米粒子二聚體、其制備方法及用途。
背景技術(shù)：
對于來自生物樣品和其他樣品的單分子的高靈敏度的準(zhǔn)確的檢測可以廣泛應(yīng)用于醫(yī)學(xué)診斷、病理學(xué)、毒理學(xué)、環(huán)境取樣、化學(xué)分析及其他許多領(lǐng)域。為此，在過去的幾年中，在生物-化學(xué)領(lǐng)域中利用特定物質(zhì)標(biāo)記的納米粒子及化學(xué)物質(zhì)廣泛應(yīng)用于研究少量的合 成物質(zhì)和生物分子的代謝、分布及結(jié)合等。代表性的方法包括，利用放射性同位素的方法、利用有機(jī)熒光物質(zhì)的方法以及利用作為無機(jī)物的量子點(diǎn)(Quantum dots)的方法。利用放射性同位素的方法中，生物體中廣泛被發(fā)現(xiàn)的1Hj2Cj1Pj2S和127I等的放射性同位素3H、14C、32P、35S和125I作為放射性標(biāo)記物質(zhì)(Radioactive isotope)被廣泛使用。因?yàn)榉派湫酝凰睾头欠派湫酝凰鼐哂袔缀跸嗤幕瘜W(xué)性質(zhì)，所以可以任意替換；因?yàn)榉派湫酝凰氐姆派淠芰勘容^大，所以甚至可以用于少量的檢測，因此長期以來一直使用放射性同位素。但是，因?yàn)榉派湫酝凰禺a(chǎn)生對人體有害的輻射，不易于處理。而且，雖然放射性同位素的發(fā)射能量高，但是半衰期短，因此不宜長時(shí)間的保存或?qū)嶒?yàn)。作為放射性同位素的替代方案被廣泛使用的就是有機(jī)突光物質(zhì)(Organicfluorescent dyes)。有機(jī)熒光物質(zhì)若被特定波長激活，則發(fā)出具有固有波長的光。尤其是，隨著檢測方法變得越來越簡化，放射性物質(zhì)也呈現(xiàn)出檢測極限，從而需要長時(shí)間來檢測。相反，由于在適當(dāng)?shù)臈l件下有機(jī)熒光物質(zhì)的每個(gè)分子能夠發(fā)射成千上萬個(gè)光子，因此理論上甚至能實(shí)現(xiàn)單分子水平的檢測。但是，熒光物質(zhì)無法像放射性同位素那樣直接替換活性配體的元素。相反，有機(jī)熒光物質(zhì)只限于根據(jù)構(gòu)效關(guān)系更改對活性無太大影響的部分并連接到該部分。此外，這種突光標(biāo)記物質(zhì)隨著時(shí)間的推移，其突光強(qiáng)度變?nèi)?photobleaching),因?yàn)橛糜诩ぐl(fā)的光的波長非常窄并且發(fā)射的光的波長非常寬，因此不同的熒光物質(zhì)間存在干擾。而且，可以使用的熒光物質(zhì)的數(shù)量非常有限。半導(dǎo)體納米物質(zhì)的量子點(diǎn)由CdSe、CdS、ZnS和ZnSe等組成，根據(jù)大小和種類分別發(fā)射不同顏色的光。與有機(jī)熒光物質(zhì)相比，因?yàn)榫哂懈鼘挼募ぐl(fā)波長和更窄的發(fā)射波長，因此發(fā)射更多不同顏色的光。因此，近年來量子點(diǎn)作為用于克服有機(jī)熒光物質(zhì)的缺點(diǎn)的方法被廣泛使用。但是，具有毒性強(qiáng)且難以大規(guī)模生產(chǎn)的缺點(diǎn)。此外，雖然理論上可用的量子點(diǎn)的種類多，但實(shí)際上被使用的數(shù)量極少。為了解決這種問題，最近采用基于拉曼光譜和/或表面等離子共振的標(biāo)記物質(zhì)。其中，表面增強(qiáng)拉曼散射(SurfaceEnhanced Raman Scattering, SERS)是利用在金、銀等金屬納米結(jié)構(gòu)的粗糙(roughened)表面吸附分子時(shí)拉曼散射的強(qiáng)度急劇增加IO6-IO8倍以上的現(xiàn)象的光譜法。當(dāng)光穿過透明介質(zhì)時(shí)，一小部分光子偏離固有方向，這種現(xiàn)象稱為拉曼散射。隨著光被吸收以及電子被激發(fā)到更高的能級，一部分散射光具有與原始激發(fā)光不同的頻率，而且拉曼散射光譜的波長示出樣品內(nèi)的吸收光的分子的化學(xué)組成和結(jié)構(gòu)特性，因此結(jié)合目前以非?？斓乃俣劝l(fā)展的納米技術(shù)，拉曼光譜法可以進(jìn)一步發(fā)展為可以檢測單分子的高靈敏度的技術(shù)，尤其是，非常期待用作醫(yī)用傳感器時(shí)起非常重要的作用。這種表面增強(qiáng)拉曼散射(SERS)效果與等離子共振現(xiàn)象相關(guān)。由于金屬內(nèi)傳導(dǎo)電子的集體耦合，金屬納米粒子響應(yīng)于入射電磁輻射，呈現(xiàn)出明顯的光學(xué)共振。因此，金、銀、銅及其他特定金屬的納米粒子本質(zhì)上可以用作用于改善電磁輻射的集中效果的納米天線。這種位于粒子附近的分子對于拉曼光譜分析呈現(xiàn)出更高的靈敏度。因此，除了高靈敏度DNA分析，正在積極地進(jìn)行關(guān)于使用SERS傳感器進(jìn)行與各種疾病相關(guān)的基因、蛋白質(zhì)(生物標(biāo)記物)的早期診斷的研究。拉曼光譜法具有與其他分析法(紅外光譜法)不同的多種優(yōu)點(diǎn)。紅外光譜法可以獲得具有偶極矩變化的分子的強(qiáng)烈的信號，而拉曼光譜允許獲得甚至具有誘導(dǎo)極化率變化的非極性分子的強(qiáng)烈的信號。因此，幾乎所有的有機(jī)分子具有固有的拉曼位移(Raman Shift，cm—1)。此外，由于不受水分子干擾的影響，因此拉曼光譜更適用于檢測包括蛋白質(zhì)、基因等的生物分子(biomolecules)。然而，由于較低的信號強(qiáng)度，盡管研究經(jīng)歷了很長時(shí)間，但是尚未達(dá)到實(shí)用化水平。自從 所述表面增強(qiáng)拉曼散射被發(fā)現(xiàn)后就被不斷地研究，提出了可以檢測吸附熒光分子的納米粒子的無序的聚集體中單分子水平的信號的表面增強(qiáng)拉曼散射(Surface-EnhancedRaman Scattering, SERS)的報(bào)告(Science 1997, 275(5303), 1102;Phys rev Iett1997，78 (9)，1667)后，提出了針對利用各種納米結(jié)構(gòu)(納米粒子、納米殼、納米線)的SERS增強(qiáng)現(xiàn)象的研究的報(bào)告。為了利用這種高靈敏度的SERS現(xiàn)象開發(fā)生物傳感器，Mirkin研究小組最近成功實(shí)現(xiàn)了利用與DNA結(jié)合的金納米例子的高靈敏度DNA分析，這種格式的檢測極限為20fM (2002, science, 297，1536)。然而，基于具有拉曼活性分子(例如，羅丹明6G)的銀(Ag)納米粒子的鹽誘導(dǎo)聚集(salt-induced aggregation)的單分子SERS活性基質(zhì)的制備方法在首次研究以后沒有任何進(jìn)展。據(jù)報(bào)告僅不均勻(heterogeneous)聚集的膠體的一部分(少于1%)具有單分子SERS活性(J Phys Chem B 2002，106⑵，311)。像這樣，隨機(jī)不均勻(粗糙)的表面提供與SERS相關(guān)的許多有趣且必要的數(shù)據(jù)，但是因?yàn)榧幢闶潜砻嫘螒B(tài)學(xué)上的一個(gè)小的變化也會(huì)導(dǎo)致顯著的增強(qiáng)(enhancement)變化，因此這種策略本質(zhì)上不可能再現(xiàn)。最近，F(xiàn)ang等提出了關(guān)于SERS中的增強(qiáng)部位的分布的定量測量的報(bào)告。最密集的部位(EF>109)是總1，000，000部位中的64部位，但是這些部位對總SERS強(qiáng)度貢獻(xiàn)了 24%(Science, 2008, 321，388)。如果可以確保再現(xiàn)這種SERS信號可以最大化的結(jié)構(gòu)體，則可以成為可靠性非常高的有用的超高靈敏度的生物分子分析法，并且除了體外診斷法以夕卜，還會(huì)作為體內(nèi)成像技術(shù)非常有用。然而，傳統(tǒng)的對各種分析物的檢測方法通常采用在基板和/或支撐物上涂布的膠狀的金屬粒子，例如，聚集的銀納米粒子。這種布置通常允許以增強(qiáng)至大約IO6至IO8的靈敏度進(jìn)行SERS檢測，但是無法進(jìn)行如核苷酸等小分析物的單分子檢測。盡管SERS具有優(yōu)點(diǎn)，但是，不僅由于SERS現(xiàn)象的機(jī)制尚未被完全理解，而且還由于準(zhǔn)確定義的納米結(jié)構(gòu)的合成和控制上的困難，以及根據(jù)光譜測量時(shí)使用的光的波長和偏光方向的增強(qiáng)效率的變化等原因，面臨很多從再現(xiàn)性和可靠性層面需要解決的問題。這些問題作為在包括納米-生物傳感器的開發(fā)和商業(yè)化的SERS現(xiàn)象的應(yīng)用方面的巨大的課題依然存在。為了解決上述問題，目前迫切需要理解準(zhǔn)確定義的納米結(jié)構(gòu)(well-defined nanostructure)的光學(xué)性質(zhì)并基于該理解對SERS現(xiàn)象的精確的控制進(jìn)行研究。因此，Jeong、Proke、Schneider和 Lee 等提出了在金屬粒子二聚體(dimer)中在兩個(gè)以上的納米粒子之間形成非常強(qiáng)的電磁場，即熱點(diǎn)或填隙領(lǐng)域(hot spot或interstitial field),從而SERS信號被增強(qiáng)的報(bào)告。根據(jù)基于電磁原理的理論計(jì)算,預(yù)測SERS由于所述熱點(diǎn)(hot spot)增強(qiáng)至大約1012。因此，雖然拉曼檢測的增強(qiáng)的靈敏度在膠體粒子聚集體內(nèi)部顯然并不均勻，但是隨著是否存在熱點(diǎn)而改變。然而，對于這種熱點(diǎn)的物理結(jié)構(gòu)、已實(shí)現(xiàn)靈敏度的增強(qiáng)的納米粒子之間的距離范圍及增強(qiáng)靈敏度的分析物和聚集體納米粒子間的空間關(guān)系，尚未被提出。此外，聚集的納米粒子在溶液中本質(zhì)上是不穩(wěn)定的，因此對單分子分析物檢測的可再現(xiàn)性起到反作用。
此外，盡管已經(jīng)嘗試對金或銀的二聚體結(jié)構(gòu)的理論模擬和概念證明(proof-of-concept),尚未出現(xiàn)將單分子置于納米粒子之間的結(jié)合部的實(shí)際制備的先例。將金或銀納米粒子合成為具有SERS的良好定義的可再現(xiàn)的結(jié)構(gòu)仍然是具有挑戰(zhàn)性的技術(shù)課題。因此，本發(fā)明人致力于開發(fā)用于單個(gè)DNA檢測的具有高靈敏度和再現(xiàn)性的納米粒子結(jié)構(gòu)物的結(jié)果，通過將單個(gè)拉曼活性分子置于核殼結(jié)構(gòu)的二聚體納米粒子的結(jié)合部(junction)，并且調(diào)節(jié)殼的厚度以將所述二聚體納米粒子間的間隔距離調(diào)節(jié)至特定的范圍，開發(fā)出拉曼活性分子位于兩個(gè)納米粒子結(jié)合部的、核殼結(jié)構(gòu)的二聚體納米粒子，驗(yàn)證了所述二聚體納米粒子呈現(xiàn)出非常強(qiáng)的表面增強(qiáng)拉曼散射(Surface-Enhanced RamanScattering, SERS)信號，并且所述二聚體納米粒子為可再現(xiàn)性較高的熱點(diǎn)納米粒子，并且確認(rèn)到所述納米粒子的拉曼散射增強(qiáng)的SERS增強(qiáng)因子呈現(xiàn)出高達(dá)約2. 7X1012，從而完成本發(fā)明。

發(fā)明內(nèi)容
發(fā)明要解決的技術(shù)問題本發(fā)明的一個(gè)目的是提供一種具有位于納米粒子二聚體的結(jié)合部的拉曼活性分子的、核殼結(jié)構(gòu)的納米粒子二聚體。本發(fā)明的另一目的是提供一種上述納米粒子二聚體的制備方法。本發(fā)明的另一目的是提供一種利用所述納米粒子二聚體檢測分析物的方法。本發(fā)明的另一目的是提供一種用于檢測包括所述納米粒子二聚體的分析物的工具包。解決技術(shù)問題的技術(shù)手段根據(jù)本發(fā)明的一方面，本發(fā)明涉及一種拉曼活性分子位于由表面結(jié)合寡核苷酸的金核或銀核(core)及包圍所述核的金殼或銀殼(shell)所形成的兩個(gè)核殼納米粒子的結(jié)合部，并且具有所述兩個(gè)納米粒子通過寡核苷酸連接的結(jié)構(gòu)的納米粒子二聚體。更具體地，本發(fā)明的納米粒子二聚體由兩個(gè)納米粒子組成，各納米粒子由核(金或銀)及包圍該核的殼(金或銀)組成，寡核苷酸與各納米粒子的核表面結(jié)合并且暴露在殼的外部，所述納米粒子二聚體具有通過所述兩個(gè)寡核苷酸間的雜交而連接的結(jié)構(gòu)。此外，拉曼活性分子可以位于形成所述雜交的結(jié)合部。尤其是，在所述各納米粒子中，寡核苷酸的一端結(jié)合在核的表面，并且所述寡核苷酸的一部分暴露在殼的外部，可以通過所暴露的部分的序列形成二聚體。此時(shí)，暴露的兩個(gè)寡核苷酸相互雜交，或者可以通過與暴露的兩個(gè)寡核苷酸都可以雜交的寡核苷酸進(jìn)行雜交。本發(fā)明中術(shù)語“核”指的是在其表面上可以直接結(jié)合寡核苷酸的金屬粒子，優(yōu)選為金或銀。而且，本發(fā)明中術(shù)語“殼”指的是包圍所述核的金屬涂布層，結(jié)合在核表面的寡核苷酸的一部分位于殼的內(nèi)部。本發(fā)明中優(yōu)選使用金殼或銀殼。因此，在本發(fā)明的優(yōu)選實(shí)施例中，納米粒子二聚體選自由i)由金核及銀殼組成的兩個(gè)核殼納米粒子連接而成的納米粒子二聚體；ii)由銀核及金殼組成的兩個(gè)核殼納米粒子連接而成的納米粒子二聚體；iii)由金核及金殼組成的兩個(gè)核殼納米粒子連接而成的納米粒子二聚體；iv)由銀核及銀殼組成的兩個(gè)核殼納米粒子連接而成的納米粒子二聚體；以及V)由金核及銀殼組成的核殼納米粒子和由銀核及金殼組成的核殼納米粒子連接而成的納米粒子二聚體所構(gòu)成的組。最優(yōu)選地，本發(fā)明的納米粒子二聚體為由金核及銀殼組成的兩個(gè)核殼納米粒子連接而成的納米粒子二聚體。 上述本發(fā)明的核殼結(jié)構(gòu)的納米粒子二聚體可以為同二聚體(homodimer)或異二聚體(heterodimer)。同二聚體指的是由尺寸和結(jié)構(gòu)相同的兩個(gè)納米粒子連接而成的二聚體，異二聚體指的是由尺寸和結(jié)構(gòu)不同的兩個(gè)納米粒子連接而成的二聚體。形成根據(jù)本發(fā)明的表面增強(qiáng)拉曼散射納米-標(biāo)記粒子的中心的核粒子的直徑優(yōu)選為5nm至300nm,這是因?yàn)椋绻说闹睆叫∮?nm,則拉曼表面增強(qiáng)效應(yīng)降低，如果核的直徑超過300nm，則在生物學(xué)方面應(yīng)用時(shí)受到很多限制。更優(yōu)選地，核的直徑為IOnm至40nm。納米粒子可以大致呈球形，但是可以使用任意形狀和不規(guī)則形狀的納米粒子。所述核粒子表面引入納米殼，納米殼為核粒子表面賦予增強(qiáng)的拉曼散射(Ramanscattering)效應(yīng),有助于基于拉曼光譜法的分析。S卩，因?yàn)橐爰{米殼的核粒子的表面增強(qiáng)散射效應(yīng)(surface enhanced Raman scattering)非常強(qiáng)，因此具有可以獲得任何化學(xué)物質(zhì)的信號的優(yōu)點(diǎn)。優(yōu)選地，本發(fā)明的殼厚度為Inm至300nm,更優(yōu)選為Inm至20nm。此外，殼的厚度隨著核的尺寸和所使用的DNA的長度的增加可以成比例地增加。本發(fā)明的特征在于，一個(gè)以上的寡核苷酸被結(jié)合在核粒子的表面且被官能化。首先，在核A上,可以結(jié)合3’末端由硫醇被改性的一個(gè)以上的保護(hù)寡核苷酸及3’末端同樣由硫醇被改性的一個(gè)目標(biāo)捕獲寡核苷酸。另外，在核B上，可以結(jié)合5’末端由硫醇被改性的一個(gè)以上的保護(hù)寡核苷酸及5’末端同樣由硫醇被改性的一個(gè)目標(biāo)捕獲寡核苷酸。此外，本發(fā)明特征還在于，在所述核A表面上的被改性的目標(biāo)捕獲寡核苷酸及核B表面上的被改性的目標(biāo)捕獲寡核苷酸中的任意一個(gè)上具有被改性的拉曼活性分子。此外，通過核A上利用5’末端的結(jié)合、核B上利用3’末端的結(jié)合也可以完成本發(fā)明。本發(fā)明中術(shù)語“保護(hù)寡核苷酸”指的是結(jié)合在核粒子的表面，并且起到在穩(wěn)定核粒子使得目標(biāo)捕獲寡核苷酸可以很好地結(jié)合在核表面的同時(shí)保護(hù)表面的作用的寡核苷酸。本發(fā)明中術(shù)語“目標(biāo)捕獲寡核苷酸”指的是具有與目標(biāo)寡核苷酸互補(bǔ)的序列的寡核苷酸，核A的目標(biāo)捕獲寡核苷酸和核B的目標(biāo)捕獲寡核苷酸都與一個(gè)共同的目標(biāo)寡核苷酸雜交(hybridization)以形成納米粒子二聚體結(jié)構(gòu)。本發(fā)明中術(shù)語“目標(biāo)寡核苷酸”指的是包括與核A的目標(biāo)捕獲寡核苷酸和核B的目標(biāo)捕獲寡核苷酸都互補(bǔ)的序列，通過與各目標(biāo)捕獲寡核苷酸雜交，起到連接兩個(gè)目標(biāo)捕獲寡核苷酸以形成納米粒子二聚體結(jié)構(gòu)的橋梁作用的寡核苷酸，并且并非指利用本二聚體結(jié)構(gòu)的最終目標(biāo)分析物。本發(fā)明的保護(hù)寡核苷酸和目標(biāo)捕獲寡核苷酸可以在3’末端或5’末端被具有表面結(jié)合官能團(tuán)的化合物改性，通過表面結(jié)合官能團(tuán)附著在核粒子的表面。本發(fā)明中術(shù)語“具有表面結(jié)合官能團(tuán)的化合物”指的是為了將寡核苷酸附著在核粒子表面而在各寡核苷酸的3’末端或5’末端上連接的化合物。只要可以生成在溶液中不沉淀的小聚集體的納米粒子，具有表面結(jié)合官能團(tuán)的化合物的類型不會(huì)受限制。通過表面結(jié)合官能團(tuán)將納米粒子交叉結(jié)合的方法在本領(lǐng)域內(nèi)是公知的(參見Feldheim, TheElectrochemical Society Interface, Fall, 2001，pp. 22-25)。具有表面結(jié)合官能團(tuán)的化合物的一端保留連接到核粒子表面的表面結(jié)合官能團(tuán)，優(yōu)選為例如硫醇基或巰基(sulfhydryl,HS)的含硫基。所述反應(yīng)基作為乙醇或苯酚衍生物可以是具有由硫原子代替氧原子的化學(xué)式RSH的化合物?；蛘?，所述反應(yīng)基可以是分別具有化學(xué)式RSSR’或RSR’的硫酯(thiol ester)或二硫酯(dithiol ester)?；蛘?所述反應(yīng)基可以是氨基(-NH2)。此 夕卜，具有所述表面結(jié)合官能團(tuán)的化合物可以連接到例如-NH2、-C00H、-CH0、-NCO和環(huán)氧基等各種反應(yīng)基，該反應(yīng)基可以與DNA探針、抗體、寡核苷酸及氨基酸等生物分子反應(yīng)。此外，所述寡核苷酸在與具有表面結(jié)合官能團(tuán)的化合物相反的末端可以包括間隔序列，間隔序列在防止在核表面引入的殼覆蓋(covering)目標(biāo)捕獲寡核苷酸的目標(biāo)識別序列的同時(shí)提供可以維持適當(dāng)?shù)臍ず穸鹊目臻g。本發(fā)明中間隔序列的示例為A1(I-PEG。本發(fā)明種術(shù)語“拉曼活性分子”指的是當(dāng)本發(fā)明的納米粒子二聚體附著在一個(gè)以上的分析物上時(shí)使得拉曼檢測裝置可以容易地檢測及測量分析物的物質(zhì)。本發(fā)明中的特征在于，在核A表面上的被改性的目標(biāo)捕獲寡核苷酸及核B表面上的被改性的目標(biāo)捕獲寡核苷酸中的任意一個(gè)上具有被改性的拉曼活性分子。因?yàn)槔钚苑肿涌墒境鎏卣骼庾V，因此具有使得之后可以更有效地分析生物分子的優(yōu)點(diǎn)。拉曼光譜中可使用的拉曼活性分子包括有機(jī)分子或無機(jī)分子、原子、復(fù)合體或合成分子、染料、天然染料(藻紅蛋白等)、C6(I等有機(jī)納米結(jié)構(gòu)、巴基球、碳納米管、量子點(diǎn)、有機(jī)熒光分子等。具體地，作為拉曼活性分子的示例，包括FAM (羧基熒光素)、Dabcyl (4-二甲胺偶氮苯-4-羧酸)、TRITC (四甲基若丹明-5-異硫氰酸酯)、MGITC (異硫氰基-孔雀石綠)、XRITC (X-若丹明-5-異硫氰酸鹽)、DTDC (3，3-二乙基硫二碳碘化氰)、TRIT (四甲基若丹明異硫氰酸鹽)、NBD (7-硝基苯并-2-1，3- 二唑)、鄰苯二甲酸、對苯二甲酸、間苯二甲酸、對氨基苯甲酸、赤蘚紅、生物素、異輕基洋地黃毒苷(digoxigenin)、5-羧基-4’，5’ - 二氯-2’, 7’ - 二甲氧基、突光素、5-羧基_2，，4’，5’，7’ -四氯突光素、5-羧基突光素、5-羧基若丹明、6-羧基若丹明、6-羧基四甲基氨基酞菁、甲亞氨、青色素(Cy3、Cy3.5、Cy5)、黃嘌呤、琥珀酰熒光素、氨基吖啶、量子點(diǎn)、碳同素異形體、氰化物、硫醇、氯、溴、甲基、磷和硫，但并不僅限于此。使用的拉曼活性分子需要呈現(xiàn)出清晰的拉曼光譜，尤其需要能夠與不同類型的分析物結(jié)合或相關(guān)。優(yōu)選為包括菁系列熒光分子的Cy3、Cy3. 5,Cy5或FAM、Dabcyl、若丹明系列的熒光分子的有機(jī)熒光分子。有機(jī)熒光分子具有在拉曼分析時(shí)通過與使用的激發(fā)激光波長共振，可以檢測更高的拉曼信號的優(yōu)點(diǎn)。拉曼活性分子可以直接附著在分析物上，或可以通過各種鏈接化合物附著在分析物上。
本發(fā)明人確認(rèn)到只有在拉曼活性分子位于納米粒子二聚體的結(jié)合部(junction)的情況下才能檢測SERS信號。具體地，因?yàn)楹藲误w結(jié)構(gòu)中沒有熱點(diǎn)而且只存在一個(gè)拉曼活性分子，因此沒有檢測到SERS信號(圖3a-l、圖3a-2)。根據(jù)本發(fā)明的另一方面，本發(fā)明涉及一種利用所述拉曼活性分子標(biāo)記的核殼結(jié)構(gòu)的納米粒子二聚體的制備方法。更具體地，涉及一種包括下列步驟的納米粒子二聚體的制備方法，
I)分別制備核A及核B，所述核A的表面上結(jié)合有保護(hù)寡核苷酸及目標(biāo)捕獲寡核苷酸，所述核B的表面上結(jié)合有保護(hù)寡核苷酸及在末端上結(jié)合有拉曼活性分子的目標(biāo)捕獲寡核苷酸；2)通過使上述制得的核A及核B與目標(biāo)寡核苷酸雜交形成二聚體；以及3)在所述核A及核B的表面分別引入殼。第一步驟是分別制備表面結(jié)合有保護(hù)寡核苷酸和目標(biāo)捕獲寡核苷酸的核A及核B。本發(fā)明的具體實(shí)施例中，為了通過調(diào)節(jié)使得一個(gè)目標(biāo)捕獲寡核苷酸序列結(jié)合在核粒子表面，利用3’末端被硫醇改性的一個(gè)以上的保護(hù)寡核苷酸及一個(gè)目標(biāo)捕獲寡核苷酸等兩種寡核苷酸序列結(jié)合金核粒子A。金核粒子B也是由5’末端被硫醇改性的兩種寡核苷酸結(jié)合?；谝蕾囉诮鸷肆Ｗ颖砻娴墓押塑账岬募{米粒子尺寸的承載(loading)能力，所述兩種寡核苷酸序列的摩爾比在核A是99:1，在核B是199:1 (圖la)。重要的是，在核B上結(jié)合的目標(biāo)捕獲寡核苷酸序列的末端結(jié)合有具有拉曼信號功能的Cy3、FAM或Dabcyl。此外，為了去除未與目標(biāo)捕獲寡核苷酸序列(target capturing sequence)結(jié)合的單體粒子，凈化寡核苷酸改性的核A及核B,可以使用磁性(magnetic)分離技術(shù)。甲苯磺酰(tosyl)基磁珠可以(直徑Ιμπι，Invitrogen)被分別與核A的目標(biāo)捕獲序列和核B的目標(biāo)捕獲序列互補(bǔ)的胺改性的目標(biāo)寡核苷酸互補(bǔ)序列官能化。由于只有與目標(biāo)捕獲序列結(jié)合的核粒子進(jìn)行與磁珠的互補(bǔ)的雜交結(jié)合，因此反應(yīng)后可以在溶液中施加外部磁場，分離磁性納米粒子后，升溫至雙鏈DNA堿序列的熔融點(diǎn)(Tm)以上，從而分離與磁性納米粒子結(jié)合的核粒子。此外，所述步驟I中，還可以包括下列工藝分別制備核A和核B后，核A和核B的目標(biāo)捕獲寡核苷酸與具有互補(bǔ)序列的磁性微粒子進(jìn)行雜交反應(yīng)，從而僅分離核A和核B中已與目標(biāo)捕獲寡核苷酸結(jié)合的納米粒子。第二步驟是通過在上述制得的核A及核B中添加目標(biāo)寡核苷酸進(jìn)行雜交以形成二聚體的步驟。通過第一步驟中由磁珠分離及凈化的核粒子A及核粒子B的溶液與例如，O. 3MPBS內(nèi)的充足量的目標(biāo)寡核苷酸序列進(jìn)行雜交結(jié)合，可以合成所需的納米粒子二聚體。因此，根據(jù)本發(fā)明的二聚體合成方法可以以非常高的產(chǎn)率(709Γ809Ο合成二聚體。在第三步驟中，在核粒子表面引入納米殼粒子優(yōu)選通過在溶劑中使例如金核粒子和銀納米粒子的前驅(qū)體在10°c 100°C下反應(yīng)而引入。優(yōu)選地，所述銀納米粒子的前驅(qū)體選自AgNO3 *AgC104。只要包括金離子，如HAuCl4，可以使用任何化合物作為金納米粒子的前驅(qū)體。此外，將銀離子或金離子轉(zhuǎn)換為銀納米粒子或金納米粒子所需的還原劑可以使用對苯二酹(hydroquinone)、硼氫化鈉(NaBH4)、抗壞血酸鈉(sodium ascorbate)等,但并不僅限于此。形成納米殼的溶液優(yōu)選為水溶液(即使存在純凈水或磷酸鹽緩沖液也無妨)。此外，為了精確控制納米殼的厚度，可以添加穩(wěn)定劑(stabilizer)。因?yàn)槿绻鲜龇磻?yīng)溫度小于10°c，則形成銀納米粒子需要消耗太長的時(shí)間，如果超過100°C，則形成的銀納米粒子不均勻，因此優(yōu)選在所述范圍的溫度內(nèi)進(jìn)行反應(yīng)。根據(jù)反應(yīng)溫度，上述反應(yīng)時(shí)間可以調(diào)節(jié)至10小時(shí) 24小時(shí)。根據(jù)本發(fā)明的具有位于兩個(gè)納米粒子的結(jié)合部的拉曼活性分子的、核殼結(jié)構(gòu)的納米粒子二聚體通過在其表面或核的表面使得可以識別待檢測的分析物的生物分子進(jìn)行官能化，可以應(yīng)用于各種生物體分子的檢測。例如，待檢測的分析物可以為氨基酸、肽、多肽、蛋白質(zhì)、糖蛋白、脂蛋白、核苷、核苷酸、寡核苷酸、核酸、糖類、碳水化合物、寡糖、多糖、脂肪酸、脂質(zhì)、荷爾蒙、代謝物、細(xì)胞因子、趨化因子、受體、神經(jīng)遞質(zhì)、抗原、過敏原、抗體、基質(zhì)、輔助因子、抑制劑、藥物、藥學(xué)物質(zhì)、營養(yǎng)物、朊病毒、毒素、有毒物質(zhì)、爆炸性物質(zhì)、殺蟲劑、化學(xué)武器制劑、生物有毒制劑、放射性同位素、維生素、芳香雜環(huán)化合物、致癌劑、變異因子、麻醉劑、安非他明、巴比妥酸鹽、致幻劑、廢棄物或污染物。而且，分析物是核酸的情況下，所述核酸包括基因、病毒的RNA和DNA、細(xì)菌的DNA、真菌的DNA、哺乳動(dòng)物的DNA、cDNA、mRNA、RNA和DNA片段、寡核苷酸、合成
的寡核苷酸、改性的寡核苷酸、單雙鏈核酸、天然或合成核酸。此外，可以識別所述分析物且可以在納米粒子二聚體等的表面結(jié)合的生物分子的非限制性示例可以為抗體、抗體片段、基因工程抗體、單鏈抗體、受體蛋白質(zhì)、配體蛋白質(zhì)、酶、抑制蛋白、凝集素、細(xì)胞粘附蛋白、寡核苷酸、多核苷酸、核酸或適配子。而且，可以利用無機(jī)物涂布整個(gè)本發(fā)明的納米粒子二聚體。因?yàn)槿衾脽o機(jī)物整體涂布納米粒子二聚體，則結(jié)構(gòu)變型的可能性變小，因此可以穩(wěn)定地維持納米粒子二聚體的結(jié)構(gòu)，更有利于保管和使用。只要可以維持納米粒子二聚體的結(jié)構(gòu)并且不影響拉曼信號，所述無機(jī)物不受限制，作為一個(gè)示例，可以使用二氧化娃。根據(jù)本發(fā)明的另一方面，本發(fā)明提供一種利用本發(fā)明的所述納米粒子二聚體的分析物的檢測方法。更具體地，涉及一種包括下列步驟的分析物的檢測方法I)制備本發(fā)明的納米粒子二聚體；2)利用可以識別待檢測的分析物的生物分子對納米粒子二聚體的表面或核的表面進(jìn)行官能化；3)將所述納米粒子二聚體暴露在包括一個(gè)以上分析物的樣品中；以及4)利用激光激發(fā)(excitation)及拉曼光譜法檢測并確認(rèn)一個(gè)以上的分析物。優(yōu)選地，可以使用任一已知的拉曼光譜法檢測及確認(rèn)本發(fā)明的分析物，優(yōu)選可以使用表面增強(qiáng)拉曼散射法(SERS, Surface Enhanced Raman Scattering)、表面增強(qiáng)共振拉曼光譜法(SERRS, Surface Enhanced Resonance Raman Spectroscopy)、超拉曼和/或相干反斯托克斯拉曼光譜法(CARS, Coherent Anti-Stokes Raman Spectroscopy)。本發(fā)明中，術(shù)語“表面增強(qiáng)拉曼散射法(SERS)”指的是利用當(dāng)分子被吸附在粗糙處理的特定金屬表面或處于離表面幾百納米的距離內(nèi)時(shí)發(fā)生的一種拉曼散射的強(qiáng)度與一般拉曼散射強(qiáng)度相比增加IO6-IO8以上的現(xiàn)象的光譜法。術(shù)語“表面增強(qiáng)共振拉曼光譜法(SERRS)”指的是利用對于SERS活性表面的吸附物的激光激發(fā)波長的共振現(xiàn)象的光譜法。術(shù)語“相干反斯托克斯拉曼光譜(CARS)”指的是使固定可變的兩束激光入射到拉曼活性介質(zhì)，并且測量通過其結(jié)合獲得的反斯托克斯輻射的光譜的光譜法。
在更具體的實(shí)施方式中，本發(fā)明的所述分析物檢測方法可以是包括下列步驟的核酸的檢測方法I)制備本發(fā)明的納米粒子二聚體；2)利用與待檢測的核酸互補(bǔ)的生物分子在所述納米粒子二聚體的表面或核的表面進(jìn)行官能化；3)從樣品中提取、凈化及放大核酸；4)將所述放大的核酸的特定序列與核殼納米粒子二聚體進(jìn)行雜交反應(yīng)；以及5)對與所述納米粒子二聚體結(jié)合的核酸進(jìn)行拉曼光譜。
此外，利用相同類型的方法可以檢測例如樣品中存在的一種以上的單核苷酸多態(tài)性(SNP)或其他基因突變形態(tài)等關(guān)于核酸的其它信息，進(jìn)一步可以應(yīng)用于DNA測序。在這種實(shí)施方式中，拉曼活性基板可以與一個(gè)以上的拉曼檢測單元裝置可操作地結(jié)合。基于拉曼光譜法檢測分析物的幾種方法在本領(lǐng)域內(nèi)是公知的(例如，美國專利第6，002，471 號、第 6，040，191 號、第 6，149，868 號、第 6，174，677 號、第 6，313，914 號)。在SERS及SERRS中，對于吸附在諸如銀、金、鉬、銅或鋁等粗糙的金屬表面上的分子，拉曼檢測的靈敏度增強(qiáng)IO6倍以上。在美國專利第6，002，471號中示出拉曼檢測裝置的非限制性示例。由波長為532nm的頻率重疊的Nd: YAG激光器或波長為365nm的頻率重疊的Ti :藍(lán)寶石激光器生成激發(fā)光。可以使用脈沖激光束和連續(xù)激光束。激發(fā)光通過共焦光學(xué)器件及顯微鏡鏡頭，聚焦在含有一個(gè)以上的分析物的拉曼活性基板上。顯微鏡鏡頭及共焦光學(xué)器件收集從分析物發(fā)射的拉曼發(fā)射光，并且與單色器耦合以分離光譜。共焦光學(xué)器件包括雙色向?yàn)V光鏡(dichroicfilters)、抑制濾光片、共焦針孔、物鏡及鏡子的組合，并且用于減小背景信號。除了共焦光學(xué)器件之外，還可以使用標(biāo)準(zhǔn)全場(full field)光學(xué)器件。由包括通過接口與對信號進(jìn)行計(jì)數(shù)和數(shù)字化的計(jì)算機(jī)連接的雪崩光電二極管的拉曼檢測器檢測拉曼發(fā)射信號。在美國專利第5，306，403號中示出檢測裝置的另一示例，其中可以使用安裝有在單光子計(jì)數(shù)模式下操作的砷化鎵光電倍增管(RCA Model C31034或Burle IndustriesModel C3103402)的Spex型號(Spex Model) 1403的雙光柵光譜儀。激發(fā)源包括來自SpectraPhysics型號166的514. 5nm線気離子激光器和647. Inm線的氪(krypton)離子激光器(Innova 70,相干性)。其它激發(fā)源包括337nm的氮激光器(Laser Science Inc.(激光科學(xué)有限公司))、325nm的氦鎘激光器(Liconox)(美國專利第6，174，677號)、發(fā)光二極管、Nd: YLF激光器和/或各種離子激光器和/或染料激光器。利用帶通濾波器(Corion)將激發(fā)光凈化成光譜，聚焦在利用6X物鏡(Newport，Model L6X)的拉曼活性基板上。物鏡可以用于利用全息分光鏡(Kaiser Optical Systems, Inc. , Model HB647-26N18)激發(fā)分析物并且收集拉曼信號，使激發(fā)光及發(fā)射的拉曼信號成直角形狀。全息帶阻濾光片(Kaiser Optical Systems, Inc.)可以用于減小瑞利(Rayleigh)散射輻射。其他拉曼檢測器包括安裝有紅色增強(qiáng)的高靈敏度電荷耦合器件(RE-ICCD)檢測系統(tǒng)(Princeton Instruments)光譜儀(ISA, HR-320)。可以使用其他類型的檢測器，例如傅里葉變換光譜儀(基于邁克爾遜干涉儀)、帶電注射裝置、光電二極管陣列、InCaAs檢測器、電子倍增電荷耦合器件(CCD)、高靈敏度CCD和/或光電晶體管陣列。
本領(lǐng)域中公知的任一適合的形式和結(jié)構(gòu)的拉曼光譜法或相關(guān)方法可以用于檢測分析物，這包括普通拉曼散射、共振拉曼散射、表面增強(qiáng)拉曼散射、表面增強(qiáng)共振拉曼散射、相干反斯托克斯拉曼光譜、刺激拉曼散射、逆拉曼光譜法、刺激增益拉曼光譜法、超拉曼散射、分子光學(xué)激光檢驗(yàn)器(molecular optical laser examiner, MOLE)、拉曼微探針、拉曼顯微鏡法、共聚焦拉曼顯微分光計(jì)、3-D或掃描拉曼、拉曼飽和光譜法、時(shí)間分辨共振拉曼、拉曼解離光譜法或紫外拉曼顯微鏡，但并不僅限于此。根據(jù)本發(fā)明的特定實(shí)施方式，拉曼檢測裝置可以包括計(jì)算機(jī)。對于上述實(shí)施方式中使用的計(jì)算機(jī)的類型沒有限制。示例的計(jì)算機(jī)可以包括交互信息的總線和用于信息處理的處理器。計(jì)算機(jī)還可以包括RAM或其他動(dòng)態(tài)存儲(chǔ)設(shè)備，ROM或其他靜態(tài)存儲(chǔ)設(shè)備，以及數(shù)據(jù)存儲(chǔ)設(shè)備，如磁盤或光盤及相應(yīng)的驅(qū)動(dòng)。而且，計(jì)算機(jī)可以包括本領(lǐng)域內(nèi)公知的外圍設(shè)備，例如顯示器(如陰極射線管或液晶顯示器)、字母輸入設(shè)備(如鍵盤)、光標(biāo)指向裝置(例如，鼠標(biāo)、跟蹤球或光標(biāo)鍵)、通信裝置(用于與例如調(diào)制解調(diào)器、網(wǎng)絡(luò)接口卡或以太網(wǎng)、令牌環(huán)網(wǎng)或其他類型的網(wǎng)絡(luò)結(jié)合的接口裝置)。根據(jù)本發(fā)明的特定實(shí)施方式，拉曼檢測裝置可以和計(jì)算機(jī)可操作地結(jié)合。來自檢 測裝置的數(shù)據(jù)可以被處理器處理并且存儲(chǔ)在主存儲(chǔ)裝置。標(biāo)準(zhǔn)分析物的發(fā)射曲線上的數(shù)據(jù)也可以存儲(chǔ)在主存儲(chǔ)裝置或ROM。處理器可以比較來自拉曼活性基板的分析物的發(fā)射光譜，確認(rèn)樣品分析物的類型。處理器可以分析來自檢測裝置的數(shù)據(jù)，測量多種分析物的凈化和/或濃度。不同設(shè)置的計(jì)算機(jī)可以用于不同的目的。因此，在本發(fā)明的不同實(shí)施方式中系統(tǒng)的結(jié)構(gòu)可以不同。收集數(shù)據(jù)后，通常將數(shù)據(jù)傳送到分析數(shù)據(jù)的裝置。為了容易地進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，來自檢測裝置的數(shù)據(jù)通常使用上文所述的數(shù)字計(jì)算機(jī)來分析。計(jì)算機(jī)通常會(huì)被被適當(dāng)?shù)鼐幊?，使得不僅接收及存儲(chǔ)來自檢測裝置的數(shù)據(jù)，而且還分析和報(bào)告收集的數(shù)據(jù)。根據(jù)本發(fā)明的另一方面，本發(fā)明涉及一種包括本發(fā)明的納米粒子二聚體的用于檢測分析物的工具包。具體地，待檢測的分析物是核酸的情況下，工具包可以包括進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈反應(yīng)(RT-PCR)所需的要素，以放大樣品中所包括的核酸。除了為待檢測核酸特定的一對引物之外，RT-PCR工具包還可以包括試管或其他適當(dāng)容器、反應(yīng)緩沖液(各種pH值和鎂濃度)、脫氧核苷酸(dNTPs)、酶(例如，Taq-聚合酶和逆轉(zhuǎn)錄酶)、脫氧核糖核酸酶和核糖核酸酶的抑制劑、DEPC-水、無菌水等。而且，用作定量對照組的基因還可以包括特定的一對引物。此外，優(yōu)選地，本發(fā)明的工具包可以是包括執(zhí)行DNA芯片所需的必需要素的檢測工具包。DNA芯片工具包還可以包括基板及試劑、配方及酶，在所述基板上布置有基因或與基因片段對應(yīng)的互補(bǔ)脫氧核糖核酸(cDNA)，而所述試劑、配方及酶用于制備熒光標(biāo)記探針。此夕卜，基板還包括與定量對照組基因或其片段對應(yīng)的cDNA。在本發(fā)明的另一實(shí)施方式中，待檢測的分析物是蛋白質(zhì)的情況下，為了抗體的免疫檢測，工具包還包括基質(zhì)，適當(dāng)?shù)木彌_液、利用本發(fā)明的納米粒子二聚體標(biāo)記的第二抗體及著色劑等。上述基質(zhì)可以使用硝化纖維膜，聚乙烯樹脂合成的96孔板，聚苯乙烯樹脂合成的96孔板，聚苯乙烯樹脂及玻璃形成的載玻片。這種檢測工具包包括本領(lǐng)域中通常使用的工具及試劑等。這種工具/試劑包括合適的載體、可以生成可檢測信號的標(biāo)記物質(zhì)、溶劑、清洗劑、緩沖劑及穩(wěn)定劑等，但并不僅限于此。在標(biāo)記物質(zhì)是酶的情況下，可以包括可以測量酶活性的基質(zhì)及反應(yīng)終止劑。合適的載體可以是可溶性載體，例如，本領(lǐng)域中公知的生理學(xué)上允許的諸如PBS的緩沖液；也可以是不溶性載體，例如，聚苯乙烯、聚乙烯、聚丙烯、聚酯、聚丙烯腈、氟樹脂、交聯(lián)右旋糖酐、多糖、聚合物(例如磁珠，其中乳膠上鍍有金屬)、其他紙張、玻璃、金屬、瓊脂糖及其組合物，但并不僅限于此?？乖?抗體復(fù)合物的形成方法包括，組織免疫染色、放射免疫分析法(RIA)、酶聯(lián)免疫吸附測定法(ELISA)、免疫印跡法(Western blotting)、免疫沉淀分析法(immunoprecipitation assay)、免疫擴(kuò)散分析法(immunodiffusion assay)、補(bǔ)體結(jié)合試驗(yàn)法(complement fixation assay)、流式細(xì)胞術(shù)、蛋白質(zhì)芯片(protein chip)等,但并不僅限于此。有益效果根據(jù)本發(fā)明的具有位于兩個(gè)納米粒子結(jié)合部的拉曼活性分子的核殼納米粒子二 聚體，由于拉曼活性分子準(zhǔn)確位于兩個(gè)納米粒子的結(jié)合部并且拉曼活性分子和納米粒子表面間的距離由銀或金納米粒子準(zhǔn)確調(diào)節(jié)厚度，因此可以獲得非常強(qiáng)的表面增強(qiáng)拉曼散射(SERS)信號。而且，即使只有一個(gè)拉曼活性分子，也可以獲得強(qiáng)的拉曼信號。此外，合成所述核殼納米粒子二聚體的方法等為可以以非常高的純度合成二聚體的有用的方法，尤其是，可以通過適當(dāng)調(diào)節(jié)核A、核B的合成時(shí)的寡核苷酸的量，并利用磁性納米粒子凈化核A、核B，以高純度合成目標(biāo)納米結(jié)構(gòu)。而且，可以以納米級調(diào)節(jié)兩個(gè)納米粒子之間的間隙。因?yàn)樵摵藲ぜ{米結(jié)構(gòu)是在很大程度上放大拉曼信號的納米結(jié)構(gòu)，從而能夠很好地適用于DNA和與特定疾病的發(fā)生和惡化相關(guān)的蛋白質(zhì)(分子標(biāo)記物)等分析物的檢測、而且還可用于大規(guī)模的基因組序列分析、單核苷酸多態(tài)性(SNP)檢測、序列比較、基因分類分析、疾病關(guān)系及藥物開發(fā)。


圖I (a)及圖I (b)示出通過磁凈化、DNA雜交及銀殼形成過程的金納米粒子二聚體的合成過程的示意圖。用于探針A的保護(hù)序列為3’ -HS- (CH2) 3-AiozPEGi8-AAACTCTTTGCGCAC-5’，用于探針 A 的目標(biāo)結(jié)合序列為 3’ -HS- (CH2) ,-A，_PEG，-CTCCCTAATAACAAT-5，，且用于MMP (基質(zhì)金屬蛋白酶)-A的改性的序列為3’ -NH2- (CH2) ,-A^-PEG^-ATTGTTATTAGGGAG-5’ (Tm=38°C )。用于探針 B 的保護(hù)序列為 5’ -HS- (CH2) e-Aio^PEGig-AAACTCTTTGCGCAC-S'，用于探針 B 的目標(biāo)捕獲序列為 5’ -HS- (CHJ ,-Ar-PEG2-ATCCTTATCAATATTAAA-Cy3-3’，且用于MMP-B 的改性的序列為 5’ -NH2-(CH2)3-AlflZEE^rTTTAATATTGATAAGGAT-S' (Tm=40°C )。具有下劃線的序列是為了促進(jìn)銀殼形成而設(shè)計(jì)的間隔序列。目標(biāo)DNA序列為5’ -GAGGGATTATTGTTAAATATTGATAAGGAT-3’(炭疽菌序列)。圖I (c)示出用于識別來自各二聚體納米粒子的SERS熱點(diǎn)結(jié)構(gòu)的、利用校正的AFM、共焦拉曼光譜儀(激光焦點(diǎn)直徑為250nm)的實(shí)驗(yàn)裝置。圖2 (a)示出形成金納米粒子二聚體前和后的紫外-可見光譜及HR-TEM (高分辨率透射電鏡)圖像。圖2 (b)示出將銀殼引入金納米粒子二聚體前和后的紫外-可見光譜及HR-TEM圖像。圖2 (c)示出納米粒子的等離子共振(峰在約400nm處)，該等離子共振根據(jù)銀殼厚度變化。對應(yīng)于金-銀核殼二聚體結(jié)構(gòu)的HR-TEM圖像。圖中示出的核殼納米粒子的HR-TEM圖像c. Ia和c. Ib分別表示銀殼厚度為5nm和IOnm的金-銀核殼單體。c. 2、c. 3和c. 4是銀殼厚度分別為約3nm、約5nm和約IOnm的金-銀核殼異二聚體粒子。
圖3 (a)示出金-銀核殼單體及異二聚體納米粒子的AFM (原子力顯微圖，I μ mX I μ m)。圖3 (b)示出從金-銀核殼納米粒子的單體或二聚體獲得的校準(zhǔn)的SERS光譜。圖3 (C)示出從514. 5nm激發(fā)激光器、Is累積(Is accumulation),樣品100 μ W、激光焦點(diǎn)直徑250nm中獲得的所有光譜。拉曼光譜(紅線)是從由NaCl溶液所聚集的銀膠體中的Cy3改性的寡核苷酸獲得的，并且拉曼光譜(黑線)是在相同的條件下從無Cy3的寡核苷酸中獲得的。圖4示出各個(gè)所分析的金-銀核殼二聚體納米粒子呈現(xiàn)與具有單分子活性的Cy3對應(yīng)的SERS信號。圖4 (a)示出金-銀核殼二聚體的輕敲模式的AFM圖像(5 μ mX 5 μ m)(與圖2 (b) -2的銀殼厚度約為5nm，間距為Inm以下的情況對應(yīng))。圖4 (b)示出從各二聚體結(jié)構(gòu)中獲得的Cy3的表面增強(qiáng)拉曼光譜。這些是在激光波長為514. 5nm，激光功率約為80 μ W,激光焦點(diǎn)直徑約250nm,露光時(shí)間(integration time)為I秒下測量的圖5 Ca)及圖5 (b)示出累積時(shí)間Is中從相同的粒子中獲得的閃爍的SERS光譜，圖5 (c)示出從其它入射激光偏光中的金-銀核殼異二聚體獲得的SERS光譜，圖5 (d)示出對于Θ的1470CHT1及ΙδδΟαιΓ1拉曼光譜帶的綜合SERS強(qiáng)度的極坐標(biāo)系。這些是在激光波長為514. 5nm,激光功率約為40 μ W，激光焦點(diǎn)直徑約250nm，露光時(shí)間(integration time)為20秒下測量的圖6示出從利用由FAM和Dabcyl標(biāo)記的寡核苷酸改性的納米粒子二聚體獲得的SERS光譜。圖6 (a)示出溶液中由FAM標(biāo)記的寡核苷酸(Inm)及由Dabcyl標(biāo)記的寡核苷酸(Inm)的拉曼光譜。圖6 (b)示出由FAM標(biāo)記的金-銀核殼納米粒子二聚體(銀殼5nm)及由Dabcyl標(biāo)記的金-銀核殼納米粒子二聚體(銀殼5nm)的拉曼光譜。
具體實(shí)施例方式下文，為了幫助理解本發(fā)明示出優(yōu)選實(shí)施例。但是，下列實(shí)施例僅僅是為了更容易地理解本發(fā)明而提供的，并不限制本發(fā)明的內(nèi)容。實(shí)施例I :制備拉曼活性分子(Cy3)位于兩個(gè)納米粒子結(jié)合部的金-銀核殼納米粒子基于將目標(biāo)寡核苷酸結(jié)合至金納米粒子且進(jìn)一步根據(jù)銀前驅(qū)體量調(diào)節(jié)形成銀殼的DNA定向橋接方法合成(DNA-directed bridging method)拉曼活性金-銀核殼二聚體(圖 I)。首先，通過精確控制保護(hù)(protecting)寡核苷酸序列和目標(biāo)捕獲寡核苷酸序列的摩爾比并有效地凈化的步驟，獲得具有目標(biāo)寡核苷酸的高度凈化的金納米粒子二聚體結(jié)構(gòu)。由于金納米粒子(AuNP)表面及Cy3分子間的最大間距(d ；gap distance)仍保持7. 5nm,因此為了獲得放大的電磁性增強(qiáng)而需要減小間距。因?yàn)樵赟ERS檢測中銀增強(qiáng)的效果是金的數(shù)倍，因此引入銀納米殼。具體地，通過現(xiàn)有已知的改性方法(Chem. Comm. 2008，J. Phys. Chem. B2004，108, 5882-5888)以納米級調(diào)節(jié)銀納米殼，并且將銀納米殼涂布到金納米粒子二聚體的表面以減小納米粒子間的間距，進(jìn)而放大SERS信號。在0. 3MPBS溶液中存在作為穩(wěn)定劑的100 μ L聚(乙烯)吡咯烷酮和作為還原劑的50 μ L的L-抗壞血酸鈉[KT1M]的情況下，使250 μ M的金納米粒子二聚體溶液與多種量的AgN03[10_3M]在常溫下反應(yīng)3小時(shí)。分別使用30 μ L、40 μ L、和70 μ L的AgNO3 [IO^3M]溶液合成具有約3nm、約5nm和約IOnm的銀殼厚度的金-銀核殼異二聚體納米粒子。以這種方法，以約3nm、約5nm和約IOnm等納米單位成功調(diào)節(jié)銀殼厚度，可以獲得與目標(biāo)寡核苷酸結(jié)合的金-銀核殼異二聚體結(jié)構(gòu)。根據(jù)傳統(tǒng)的合成方法，為了通過調(diào)節(jié)使得一個(gè)目標(biāo)捕獲寡核苷酸在金納米粒子表面進(jìn)行改性，利用兩種3’末端-硫醇-改性的寡核苷酸序列對用于探針A的金納米粒子(15nm)進(jìn)行官能化(functionalize)。而且，同樣利用兩種5’末端-硫醇-改性的寡核苷酸序列對用于探針B的金納米粒子(30nm)進(jìn)行官能化?；诮鸺{米粒子表面的寡核苷酸的依賴于納米粒子大小的承載(loading)能力，兩種序列(保護(hù)序列/目標(biāo)捕獲序列)的摩爾比調(diào)節(jié)成在探針A為99:1且在探針B為199:1(圖I)。重要的是，對于探針B，在目標(biāo)捕獲寡核苷酸序列的末端結(jié)合作為拉曼標(biāo)記的Cy3。此外，為了去除未與目標(biāo)捕獲序列(targetcapturing s equence)結(jié)合的單體粒子,利用磁性(magnetic) 分離技術(shù)凈化寡核苷酸改性的探針A及探針B。甲苯磺?；男缘拇胖?直徑I μ m, Invitrogen)被分別與探針A的目標(biāo)捕獲序列和探針B的目標(biāo)捕獲序列互補(bǔ)的胺改性的目標(biāo)寡核苷酸互補(bǔ)序列官能化。只有與目標(biāo)捕獲序列結(jié)合的金納米粒子可以由磁珠分離。然后，凈化的探針A和探針B的溶液與O. 3M PBS中的足夠量的目標(biāo)寡核苷酸序列混合反應(yīng)。此外，通過與上述類似的方法，制備由拉曼活性分子FAM和Dabcyl分別標(biāo)記的寡核苷酸改性的金-銀核殼納米粒子二聚體。實(shí)施例2 :紫外可見光譜法(UV-visible spectroscopy)和HR-TEM圖像分析通過紫外可見光譜(UV-visible spectroscopy)和高分辨率透射電子顯微鏡(HRTEM)圖像確認(rèn)金納米粒子二聚體的形成(Cy3用作拉曼活性分子)(圖2)。紫外可見光譜在二聚體形成后示出一些紅移，這與之前Oaul Alivisatos等(An gewchem. 1999. 38 (12)，1808)的報(bào)告結(jié)果一致。圖2a示出金納米粒子二聚體的典型的HR-TEM圖像。最少200個(gè)粒子的分析結(jié)果發(fā)現(xiàn)25%的粒子為單體，65%的粒子為二聚體，10%以下的粒子為三聚體或四聚體或更高的多聚體。依據(jù)HR-TEM分析，金粒子間的粒子間距約為2 3nm。預(yù)計(jì)溶液狀態(tài)(0. 3PBS)中的納米粒子間的間距實(shí)際上比干燥狀態(tài)更長，約為15nm。而且,通過現(xiàn)有已知的改性方法(Chem. Comm. 2008，J. Phys. Chem. B 2004，108，5882-5888)將銀納米粒子以納米級調(diào)節(jié)的同時(shí)引入金納米粒子二聚體的表面以減小納米粒子間的間距，進(jìn)而放大SERS信號(參照實(shí)施例I)。在類似的條件下還從凈化的探針B溶液(30nmAuNP)合成具有約3nnTl0nm的銀殼厚度的金-銀核殼單體(圖2c的la、lb)。各溶液的紫外可見光譜(圖2b)根據(jù)銀殼的厚度在約400nm的等離子共振峰值被分離。圖2c示出各個(gè)金-銀核殼異二聚體的HR-TEM圖像，并且示出直徑為26nm - 36nm (圖2c_2)、30nm - 40nm(圖2c-3)、40nm - 50nm (圖2c_3)的兩個(gè)核殼納米粒子球形及銀殼厚度。兩個(gè)納米粒子間具有Inm以下的窄縫。圖2c-la、圖2c_lb還示出各個(gè)金-銀核殼單體的HR-TEM圖像，并且示出直徑為40nm (殼厚度=5nm，圖2c_la)、直徑為50nm (殼厚度=10nm，圖2c_lb)的各納米粒子的球形及銀殼厚度。然后，測量核殼納米粒子單體或異二聚體(Cy3用作拉曼活性分子)的SERS/AFM。傳統(tǒng)的方法中，將由反復(fù)的離心分離(8000rpm，20分鐘，三次)洗滌后的金-銀核殼異二聚體溶液的一份(20 μ L)旋轉(zhuǎn)涂布(spin coated)到以聚_L_賴氨酸涂布的玻璃表面上，并且利用超純水(nanopure water)多次洗漆后,在空氣中干燥。樣品制備后立即用于AFM及SERS測量。由安裝有倒置的光學(xué)顯微鏡(inverted optical microscope) (Axovert200，Zeiss)的AFM相關(guān)的納米拉曼顯微鏡記錄SERS光譜，并且通過另外自制的掃描控制器調(diào)整壓電(piezoe lectric) χ-y樣品掃描儀(Physik Instrument)。U1離子激光器(Melles Griot,US A)的514. 5nm線用作與單模光纖f禹合的激發(fā)源(excitation source)。彩色濾光片(分色鏡)(520DCLP, Chroma Technology Corp.)設(shè)置成在50nW至ImW中將激發(fā)(excitation)激光束導(dǎo)向油浸顯物鏡(oil-immersion microscope objective 顯微鏡)(X 100，I. 6NA, Zeiss),該油浸顯物鏡將激光束聚焦于蓋玻片上表面的衍射極限點(diǎn)(250nm)。使用 Nanoscope IV 控制器將 AFM (放映機(jī)，Digital Instruments Inc. , VeecoMetrology Group)安裝在微型機(jī)械臺。光學(xué)顯微鏡臺的頂端的輕敲模式AFM模塊與IOOnm的重疊精度的AFM地形圖像(topographical image)的拉曼信號相關(guān)。因?yàn)榧す饨拱吲cAFM探針中心完全匹配，因此對于AFM探針末端對稱地散射。在LN2冷卻的(_125°C)電荷稱合器件中收集背景拉曼信號。在一次采集、一秒間累積(accumulation)、400 μ W、500^-2000^1的范圍中記錄散射光譜。所有的數(shù)據(jù)是通過從Si減去背景信號而校正的基線。
實(shí)施例3 :金-銀核殼納米粒子的AFM (原子力顯微圖)分析圖3a示出典型的核殼單體及異二聚體納米結(jié)構(gòu)(Cy3用作拉曼活性分子)的擴(kuò)大的AMF (原子力顯微圖)圖像(I μ mX Ιμπι)。其形狀和直徑與HR-TEM分析結(jié)果一致。圖3b示出對圖3a的單個(gè)粒子的AFM圖像進(jìn)行矯正的SERS光譜。因?yàn)楹藲误w結(jié)構(gòu)中沒有熱點(diǎn)而只存在一個(gè)Cy3分子，因此對于銀殼厚度為5nm (圖3a_l)或IOnm (圖3a_2)的金-銀核殼單體未檢測到SERS信號。對于沒有銀殼的金二聚體或具有Inm以下間距的金二聚體也未檢測到SERS信號。這是因?yàn)樵?14. 5nm激光激發(fā)條件下的電磁增強(qiáng)不充足。殼厚度較薄的(小于3nm)圖3a-4的情況下，即使提高入射激光功率(約200 μ W)也未檢測到信號。這種結(jié)果表明較薄的銀層(layer)不能產(chǎn)生足夠的電磁增強(qiáng)。相反,殼厚度約為5nm (圖3a_5)的情況下，示出從位于納米粒子結(jié)合部的Cy3標(biāo)記的單個(gè)金-銀核殼二聚體檢測到相對較強(qiáng)的SERS信號。即使是低的強(qiáng)度(intensity),在514. 5nm的激光激發(fā)(excitation)中的指紋圖譜(fingerprint spectra)的HiOcnT1及ΙδδΟαιΓ1出現(xiàn)Cy3的特征峰值。與單分子SERS 研究(Science 1997. 275(5203), 1102, Phys rev Iett 1997，78 (9)，1667，Nano Iett2006，6 (I) 2173，N ano Iett DOI: 10. 1021/ni803621x)中使用的功率強(qiáng)度(intensity)比較時(shí)，在比較低的激光功率(100 μ W)及熱點(diǎn)部位內(nèi)，低強(qiáng)度(intensity)僅影響一個(gè)分子。而且，測量來自與金納米粒子上改性的寡核苷酸相同的其它種類的信號。圖3c示出在聚集的銀膠體中 Cy3 改性的寡核苷酸(5-HS-(CH2)6-A1Q-PEG18-ATCCTTATCAATATTAAA-Cy3-3’
，InM,紅線)的 SERS 光譜和無 Cy3 的寡核苷酸(5-HS-(CH2)6-A1(l-PEG18-ATCCTTATCAATATTAAA-3’，InM,黑線)比較的結(jié)果。圖3C (黑線)的SERS光譜示出由于豐富的腺嘌呤堿(Altl用作間隔序列)，腺嘌呤模式(734(^1 1320(^-1)具有優(yōu)勢，且其增強(qiáng)大于其它堿(JACS2008，130 (16)，5523)。而且，重要的是對于其它的DNA堿目前為止報(bào)告的最低的檢測極限是子微摩爾以下(sub-micromolar)范圍(JACS, 2006，128，15580)。但是，圖 3c 的 SERS 光譜(紅線)示出作為Cy3分子中發(fā)生的信號的1480011^15800^1上的相對強(qiáng)的信號(Analchem. 2004, 76，412-417)。然而，觀察到光譜位置隨著拉曼強(qiáng)度和時(shí)間變動(dòng)(光譜位置隨著時(shí)間波動(dòng))且各二聚體光譜不同(J. Phys. Chem. B 2002，106，8096)。因此，光譜圖案與現(xiàn)有報(bào)告不是完全符合。確認(rèn)到與銀殼的厚度無關(guān)，在實(shí)驗(yàn)條件下沒有金-銀核殼單體中的可檢測的SERS信號表明只有位于二聚體結(jié)構(gòu)的結(jié)合部的Cy結(jié)構(gòu)可以在1480011^15800^1中誘導(dǎo)SERS峰值。如殼厚度約為IOnm的核殼二聚體的拉曼光譜(圖3a_6)所示，與1480CHT1的其它Cy3峰值一起在734(^-^1320(^-1的腺嘌呤模式占優(yōu)勢。其它的納米粒子的拉曼散射強(qiáng)度在每一個(gè)試驗(yàn)中不維持特定的形式。厚的銀殼可以補(bǔ)償激發(fā)不合適的電磁增強(qiáng)的Cy3分子。實(shí)施例4 :根據(jù)金-銀核殼二聚體納米粒子的入射激光的偏光的SERS光譜分析如圖4a,圖4b所示,殼厚度約為5nm的大部分核殼二聚體納米粒子(Cy3用作拉曼活性分子)示出來自單個(gè)粒子的可檢測的SERS信號。考慮到入射激光(incident laserlight)不完全偏振至二聚體的粒子間軸(圖4a中的1、2、3、4、5)，垂直偏振的各二聚體納米粒子示出可檢測的SERS信號。然而，圖5c僅示出在1470CHT1的小的峰值，這是因?yàn)槎垠w的產(chǎn)生(取向)幾乎垂直于入射光。因此，發(fā)現(xiàn)具有優(yōu)化的殼厚度的核殼二聚體納米結(jié)構(gòu)可以為非常適用于單個(gè)DNA檢測的熱點(diǎn)結(jié)構(gòu)。 通過實(shí)驗(yàn)，已知在單分子檢測中發(fā)現(xiàn)開關(guān)閃爍(blinking) (FIG. 5a) (J. Phys.Chem. B2002, 106，8096)。無拉曼強(qiáng)度持續(xù)10秒后，若恢復(fù)拉曼強(qiáng)度，則產(chǎn)生周期性的“打開”時(shí)間。從存在信號的強(qiáng)場(intense field)到最終永遠(yuǎn)消失的期間，開關(guān)循環(huán)現(xiàn)象可以持續(xù)幾分鐘。而且，可以觀察到由于圍繞熱點(diǎn)的分子的運(yùn)動(dòng)，SERS強(qiáng)度以秒單位浮動(dòng)(fluctuation)。這種閃爍和浮動(dòng)現(xiàn)象與以前的文獻(xiàn)是一致的。圖5c及圖5d示出金-銀核殼二聚體的拉曼信號對入射激光的偏光的依賴性。在514. 5nm 的激發(fā)激光(excitation laser)、20s 的累積(accumulation)、樣品 40 μ W 下檢測到所有的光譜。當(dāng)入射激光被偏振至與二聚體的縱軸(longitudinal a xis)平行時(shí)，Cy3峰值會(huì)被最大化。當(dāng)激光從縱軸旋轉(zhuǎn)20度及40度時(shí)，Cy3逐漸減小。最后，當(dāng)激光偏振至于縱軸垂直(例如，90度及270度)時(shí)，Cy3峰值消失。根據(jù)下列公式測量二聚體結(jié)構(gòu)中在熱點(diǎn)的 1580cm-1 的增強(qiáng)因子(enha ncement factor, EF)。EF- (Isers X Nbulk) / (IbuikXNmolecule)Isers和Ibulk表示SERS及BULK光譜的相同的光譜帶的強(qiáng)度，Nbulk表示對于bulk樣品的bulk分子標(biāo)記的數(shù)量，Nmolecule表示SERS光譜中Cy3分子標(biāo)記的數(shù)量(Nm—=1)。由于在1580CHT1的帶域中出現(xiàn)最強(qiáng)的光譜帶，因此該光譜帶用作Isots和Ibulk強(qiáng)度。以這種方式，熱點(diǎn)的EF計(jì)算為2. 7X IO120另外，從由FAM和Dabcyl標(biāo)記的寡核苷酸改性的納米粒子二聚體測量SERS光譜的情況與Cy3相同，可以獲得高靈敏度的拉曼光譜。因此，可以確認(rèn)根據(jù)本發(fā)明的納米粒子二聚體的結(jié)構(gòu)及制備方法對一般拉曼活性分子有效。
權(quán)利要求
1.一種納米粒子二聚體，其特征在于， 拉曼活性分子位于兩個(gè)納米粒子的結(jié)合部，所述納米粒子分別具有核殼結(jié)構(gòu)且分別包括金核或銀核，寡核苷酸結(jié)合在所述金核或銀核的表面；以及金殼或銀殼，所述金殼或銀殼包圍所述金核或銀核，并且所述兩個(gè)納米粒子通過寡核苷酸連接。
2.如權(quán)利要求I所述的納米粒子二聚體，其特征在于，在各個(gè)所述納米粒子中，寡核苷酸的一端結(jié)合在核的表面，并且一部分所述寡核苷酸暴露在殼的外部。
3.如權(quán)利要求2所述的納米粒子二聚體，其特征在于，分別結(jié)合在所述兩個(gè)納米粒子表面的寡核苷酸包括保護(hù)寡核苷酸及目標(biāo)捕獲寡核苷酸。
4.如權(quán)利要求3所述的納米粒子二聚體，其特征在于，分別結(jié)合在所述兩個(gè)納米粒子表面的目標(biāo)捕獲寡核苷酸與目標(biāo)寡核苷酸形成雜交。
5.如權(quán)利要求I所述的納米粒子二聚體，其特征在于，所述寡核苷酸通過選自硫醇基、氨基和醇基所構(gòu)成的組中的任一表面結(jié)合官能團(tuán)結(jié)合在金納米粒子、銀納米粒子表面。
6.如權(quán)利要求5所述的納米粒子二聚體，其特征在于，所述寡核苷酸在所述表面結(jié)合官能團(tuán)和寡核苷酸之間包括間隔序列。
7.如權(quán)利要求I所述的納米粒子二聚體，其特征在于，所述納米粒子二聚體選自 i)由金核及銀殼組成的兩個(gè)核殼納米粒子連接而成的納米粒子二聚體； ii)由銀核及金殼組成的兩個(gè)核殼納米粒子連接而成的納米粒子二聚體； iii)由金核及金殼組成的兩個(gè)核殼納米粒子連接而成的納米粒子二聚體； iv)由銀核及銀殼組成的兩個(gè)核殼納米粒子連接而成的納米粒子二聚體；以及 V)由金核及銀殼組成的核殼納米粒子和由銀核及金殼組成的核殼納米粒子連接而成的納米粒子二聚體。
8.如權(quán)利要求I所述的納米粒子二聚體，其特征在于，所述核的直徑為5nnT300nm。
9.如權(quán)利要求8所述的納米粒子二聚體,其特征在于,所述核的直徑為10nnT40nm。
10.如權(quán)利要求I所述的納米粒子二聚體，其特征在于，所述殼的厚度為lnnT300nm。
11.如權(quán)利要求10所述的納米粒子二聚體,其特征在于,所述殼的厚度為lnnT20nm。
12.如權(quán)利要求I所述的納米粒子二聚體，其特征在于，所述拉曼活性分子選自由FAM、DabcyUTRIT (四甲基若丹明異硫氰酸鹽)、NBD (7_硝基苯并_2_1，3_ 二唑)、德州紅(TexasRed)染料、鄰苯二甲酸、對苯二甲酸、間苯二甲酸、焦油紫、甲酚藍(lán)紫、亮(brilliant)甲酚藍(lán)、對氨基苯甲酸、赤蘚紅、生物素、異輕基洋地黃毒苷(digoxigenin)、5-羧基-4’，5’ - 二氯-2’, 7’ - 二甲氧基、突光素、5-羧基_2，，4，，5，，7，-四氯突光素、5-羧基突光素、5-羧基若丹明、6-羧基若丹明、6-羧基四甲基氨基酞菁、甲亞氨、青色素、黃嘌呤、琥珀酰熒光素、氨基吖啶、量子點(diǎn)、碳納米管、碳同素異形體、氰化物、硫醇、氯、溴、甲基、磷、硫、菁染料(Cy3、Cy3. 5、Cy5)及若丹明(Rhodamine)所構(gòu)成的組。
13.如權(quán)利要求I所述的納米粒子二聚體，其特征在于，所述拉曼活性分子是有機(jī)熒光分子。
14.如權(quán)利要求I所述的納米粒子二聚體，其特征在于，將能夠識別待檢測的分析物的生物分子官能化在納米粒子二聚體的表面或核的表面。
15.如權(quán)利要求14所述的納米粒子二聚體，其特征在于，待檢測的所述分析物為氨基酸、肽、多肽、蛋白質(zhì)、糖蛋白、脂蛋白、核苷、核苷酸、寡核苷酸、核酸、糖類、碳水化合物、寡糖、多糖、脂肪酸、脂質(zhì)、荷爾蒙、代謝物、細(xì)胞因子、趨化因子、受體、神經(jīng)遞質(zhì)、抗原、過敏原、抗體、基質(zhì)、輔助因子、抑制劑、藥物、藥學(xué)物質(zhì)、營養(yǎng)物、朊病毒、毒素、有毒物質(zhì)、爆炸性物質(zhì)、殺蟲劑、化學(xué)武器制劑、生物有毒制劑、放射性同位素、維生素、芳香雜環(huán)化合物、致癌齊U、變異因子、麻醉劑、安非他明、巴比妥酸鹽、致幻劑、廢棄物及污染物。
16.如權(quán)利要求14所述的納米粒子二聚體，其特征在于，所述生物分子為抗體、抗體片段、受體蛋白質(zhì)、配體蛋白質(zhì)、酶、抑制蛋白、細(xì)胞粘附蛋白、寡核苷酸、多核苷酸、核酸或適配子。
17.如權(quán)利要求I所述的納米粒子二聚體，其特征在于，利用無機(jī)物整體涂布所述納米粒子二聚體。
18.如權(quán)利要求17所述的納米粒子二聚體，其特征在于，所述無機(jī)物為二氧化硅。
19.一種如權(quán)利要求I所述的納米粒子二聚體的制備方法，其特征在于，包括下列步驟 1)分別制備核A及核B，所述核A的表面上結(jié)合有保護(hù)寡核苷酸及目標(biāo)捕獲寡核苷酸，所述核B的表面上結(jié)合有保護(hù)寡核苷酸及目標(biāo)捕獲寡核苷酸，所述核B的目標(biāo)捕獲寡核苷酸的末端結(jié)合有拉曼活性分子； 2)通過使制得的所述核A及核B與目標(biāo)寡核苷酸雜交形成二聚體；以及 3)在所述核A及核B的表面分別引入殼。
20.如權(quán)利要求19所述的納米粒子二聚體的制備方法，其特征在于，還包括下列工藝在所述步驟I中分別制備核A和核B后，與磁性微粒子進(jìn)行雜交反應(yīng)，從而僅分離核A和核B與目標(biāo)捕獲寡核苷酸結(jié)合的納米粒子，其中，所述磁性微粒子具有與核A和核B的目標(biāo)捕獲寡核苷酸互補(bǔ)的序列。
21.如權(quán)利要求19所述的納米粒子二聚體的制備方法，其特征在于，所述殼的引入是通過在還原劑和穩(wěn)定劑存在的情況下使由核組成的二聚體和殼前驅(qū)體進(jìn)行反應(yīng)而實(shí)現(xiàn)的。
22.—種分析物的檢測方法，其特征在于，包括下列步驟 1)制備如權(quán)利要求I至18中任一項(xiàng)所述的納米粒子二聚體； 2)將能夠識別待檢測的分析物的生物分子官能化在所述納米粒子二聚體的表面或核的表面； 3)將所述納米粒子二聚體暴露在包括一個(gè)以上分析物的樣品中；以及 4)利用激光激發(fā)及拉曼光譜法檢測并確認(rèn)一個(gè)以上的分析物。
23.一種核酸的檢測方法，其特征在于，包括下列步驟 O制備如權(quán)利要求I至18中任一項(xiàng)所述的納米粒子二聚體； 2)將與待檢測的核酸互補(bǔ)的生物分子官能化在所述納米粒子二聚體的表面或核的表面； 3)從樣品中提取、凈化及放大核酸； 4)將所述放大的核酸的特定序列與核殼納米粒子二聚體進(jìn)行雜交；以及 5)利用拉曼光譜法檢測并確認(rèn)與所述納米粒子二聚體結(jié)合的核酸。
24.如權(quán)利要求23所述的核酸的檢測方法，其特征在于，所述核酸的檢測方法是用于診斷疾病的核酸的檢測方法。
25.如權(quán)利要求23所述的核酸的檢測方法，其特征在于，所述核酸的檢測方法是單核苷酸多態(tài)性(SNP)的檢測方法。
26.如權(quán)利要求22所述的分析物的檢測方法，其特征在于，所述拉曼光譜是表面增強(qiáng)拉曼光譜(SERS)、表面增強(qiáng)共振拉曼光譜(SERRS)、超拉曼和/或相干反斯托克斯拉曼光譜(CARS)。
27.如權(quán)利要求22所述的分析物的檢測方法，其特征在于，所述核酸包括基因、病毒的RNA和DNA、細(xì)菌的DNA、真菌的DNA、哺乳動(dòng)物的DNA、cDNA、mRNA、RNA和DNA片段、寡核苷酸、合成的寡核苷酸、改性的寡核苷酸、單雙鏈核酸、天然核酸及合成核酸。
28.一種用于檢測分析物的工具包，其特征在于，所述工具包包括如權(quán)利要求I至18中任一項(xiàng)所述的納米粒子二聚體。
全文摘要
本發(fā)明涉及一種納米粒子二聚體，在所述納米粒子二聚體中拉曼活性分子位于所述納米粒子二聚體的結(jié)合部，尤其涉及一種由核-殼納米粒子組成的納米粒子二聚體，所述核-殼納米粒子包括金核或銀核，在所述金核或銀核的表面上利用寡核苷酸結(jié)合；以及金殼或銀殼，所述金殼或銀殼包圍所述核。此外，本發(fā)明涉及一種所述核殼納米粒子二聚體、其制備方法及用途。
文檔編號B82B1/00GK102811943SQ201080060485
公開日2012年12月5日 申請日期2010年12月10日 優(yōu)先權(quán)日2009年12月11日
發(fā)明者徐寧德, 南佐旻, 林東權(quán), 全基錫 申請人:韓國化學(xué)研究院, 首爾大學(xué)校產(chǎn)學(xué)協(xié)力團(tuán)