] 3. 4 HE 染色
[0039] 選取標(biāo)本中部可明顯顯示下頒第一磨牙遠(yuǎn)中根根管、根尖孔的切片，放入染缸中。 將染缸放入60°C烤箱中烤片lh。在通風(fēng)櫥中快速將二甲苯I倒入染缸脫蠟20min，換二甲 苯II脫蠟 15min。標(biāo)本 100% I、100%II、95% I、95%11、90%、80%、70%下行梯度酒精入 水，每個(gè)梯度2-3min，細(xì)水流自來(lái)水沖洗5min。蘇木素染液染色l-2min，流水沖洗3min， PBS溶液浸泡IOmin返藍(lán)；伊紅染液染色l-2min，流水沖洗3min。70%、80%、90%、95% I、 95% II、100% I、100% II上行梯度酒精脫水，每個(gè)梯度倒進(jìn)倒出，放入通風(fēng)櫥中干燥。玻片 放入二甲苯中透明約15s后取出，滴加液態(tài)中性樹(shù)膠，用合適長(zhǎng)度的蓋玻片封片，在通風(fēng)櫥 的攤片板上，待中性樹(shù)膠凝固后即可鏡下觀察拍照。
[0040] 3. 5 抗酒石酸酸性磷酸酶（Tartrate-resistant acid phosphatase, TRAP)染色
[0041] 選取標(biāo)本中部可明顯顯示下頒第一磨牙遠(yuǎn)中根根管、根尖孔的切片，按3. 4所述 進(jìn)行烤片、脫蠟和下行梯度酒精入水。使用TRAP染色試劑盒（美國(guó)Sigma公司）進(jìn)行TRAP 染色。
[0042] 按TRAP染色試劑盒說(shuō)明書(shū)新鮮配制TRAP染液，EP管中依次加入5 μ L鄰氨基偶 氮甲苯和5 yL亞硝酸鈉溶液，輕柔混勻30s，靜置2min。加入提前預(yù)熱至37 °C的三蒸水 450 μ L后，分別依次加入萘酷AS-BI磷酸鹽溶液5 μ L、醋酸溶液20 μ L、酒石酸溶液10 μ L， 混勻避光備用（除酒石酸溶液成分外，用上述配方配制空白孵育液，作為陰性對(duì)照）。滴加 TRAP染液于標(biāo)本上，37°C避光孵育lh，流水沖洗5min。蘇木素染液染色l-2min，流水沖洗 3min。玻片置PBS浸泡IOmin返藍(lán)。將玻片于通風(fēng)櫥中避光晾干，二甲苯透明，中性樹(shù)膠封 片。玻片置通風(fēng)櫥內(nèi)過(guò)夜，光學(xué)顯微鏡下觀察，陽(yáng)性細(xì)胞胞質(zhì)呈深紅色/紫色，胞核呈藍(lán)色； 具有兩個(gè)或兩個(gè)以上胞核的TRAP陽(yáng)性細(xì)胞為破骨細(xì)胞。
[0043] 3. 6免疫組織化學(xué)染色
[0044] 選取標(biāo)本中部可明顯顯示下頒第一磨牙遠(yuǎn)中根根管、根尖孔的切片，按3. 4所 述進(jìn)行烤片、脫蠟和下行梯度酒精入水。滴加0.4%胃蛋白酶抗原修復(fù)液，37°C濕盒孵育 15-20min，PBS浸洗3次，每次3min。滴加3% H202, 37°C濕盒孵育20min以消除內(nèi)源性過(guò) 氧化物酶的活性，PBS浸洗3次，每次3min。滴加2. 5%的BSA溶液37°C封閉30min。滴加 用PBS稀釋的羊來(lái)源多克隆抗體RANKL抗體（1:200 ;美國(guó)Santa Cruz公司）或羊來(lái)源多 克隆抗體OPG抗體（1:200 ;美國(guó)Santa Cruz公司），空白對(duì)照則只滴加 PBS，4°C冰箱孵育 過(guò)夜。取出切片37°C孵育30min，PBS浸洗3次，每次5min。免疫組織化學(xué)染色所用抗羊試 劑盒及二甲基聯(lián)苯胺（Dimethylbenzidine，DAB)試劑盒，均購(gòu)置于北京中杉金橋生物技術(shù) 公司。分別滴加抗羊試劑盒試劑1，37°C孵育15min，PBS浸洗3次，每次5min。分別滴加抗 羊試劑盒試劑2, 37°C孵育15min，PBS浸洗3次，每次5min。取850 μ L三蒸水，將DAB試劑 盒中A、B、C試劑各取50 μ L，混勻后避光置常溫作為DAB工作液備用（每次顯色前新鮮配 制）。將上述DAB工作液滴加至切片。顯微鏡下觀察反應(yīng)情況，當(dāng)陽(yáng)性著色明顯而背景較淡 時(shí)，洗去DAB溶液，終止反應(yīng)，流水沖洗5min。蘇木素染液染色l-2min，流水沖洗3min。玻 片置PBS 浸泡 IOmin 返藍(lán)。玻片置 70%、80%、90%、95% I、95%II、100% I、100%11 酒精 內(nèi)上行梯度乙醇脫水各30-60s。玻片置通風(fēng)櫥中干燥，二甲苯透明，中性樹(shù)膠封片。玻片置 通風(fēng)櫥內(nèi)過(guò)夜，光學(xué)顯微鏡下觀察，陽(yáng)性細(xì)胞染成棕色。
[0045] 4.觀察指標(biāo)：
[0046] 4. 1小鼠根尖周骨破壞體積的變化情況
[0047] MicroCT掃描獲取多重二維圖像，然后利用計(jì)算機(jī)用VG STUDIO軟件進(jìn)行三維圖 像重建并計(jì)算下頒第一磨牙遠(yuǎn)中根根尖區(qū)骨破壞體積，每個(gè)樣本重復(fù)計(jì)算三次后取平均 值。結(jié)果見(jiàn)圖1和表1。
[0048] 4.2小鼠根尖周組織病理形態(tài)的變化情況
[0049] HE染色后，觀察小鼠根尖周組織的骨質(zhì)破壞情況和炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)情況。TRAP染色 后，觀察小鼠根尖周組織的破骨細(xì)胞數(shù)量和分布情況。在高倍視野下（400X)雙盲法隨機(jī) 選取根尖周牙槽骨區(qū)域內(nèi)的5個(gè)視野對(duì)破骨細(xì)胞進(jìn)行細(xì)胞計(jì)數(shù)，計(jì)算平均值。結(jié)果見(jiàn)圖2-4 和表1。
[0050] 4. 3小鼠根尖周組織RANKL的表達(dá)情況
[0051] 免疫組織化學(xué)染色后，觀察小鼠根尖周組織的RANKL表達(dá)情況，在高倍視野下 (400 X)雙盲法隨機(jī)選取根尖周牙槽骨區(qū)域內(nèi)的5個(gè)視野對(duì)RANKL陽(yáng)性細(xì)胞進(jìn)行細(xì)胞計(jì)數(shù)， 計(jì)算平均值。結(jié)果見(jiàn)圖5和表2。
[0052] 4. 4小鼠根尖周組織OPG的表達(dá)情況
[0053] 免疫組織化學(xué)染色后，觀察小鼠根尖周組織的OPG表達(dá)情況，在高倍視野下 (400 X)雙盲法隨機(jī)選取根尖周牙槽骨區(qū)域內(nèi)的5個(gè)視野對(duì)OPG陽(yáng)性細(xì)胞進(jìn)行細(xì)胞計(jì)數(shù)，計(jì) 算平均值。結(jié)果見(jiàn)圖6和表2。
[0054] 5.結(jié)果：
[0055] 5. 1小鼠根尖周骨破壞體積的變化情況
[0056] 如圖1和表1所示，14天，金雀異黃酮給藥組（25mg/kg)與模型對(duì)照組相比，骨破 壞體積明顯減少；28天，與模型對(duì)照組比，金雀異黃酮給藥組（25mg/kg)骨破壞體積顯著降 低。
[0057] 5.2小鼠根尖周組織病理形態(tài)的變化情況
[0058] 如圖2所示，開(kāi)髓14天，模型對(duì)照組有較多的破骨細(xì)胞出現(xiàn)，骨吸收加重，屬于急 性炎癥階段；開(kāi)髓14天金雀異黃酮給藥組與模型對(duì)照組相比，炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)和根尖周骨質(zhì) 破壞明顯減少。如圖3所示，開(kāi)髓28天，模型對(duì)照組炎癥趨于穩(wěn)定進(jìn)入慢性期；開(kāi)髓28天 金雀異黃酮給藥組與模型對(duì)照組相比，炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)合根尖周骨質(zhì)破壞顯著降低。如圖4 和表1所示，開(kāi)髓14天、28天金雀異黃酮給藥組分別與開(kāi)髓14天、28天模型對(duì)照組相比， 破骨細(xì)胞數(shù)目顯著降低。
[0059] 表1.金雀異黃酮（25mg/kg)對(duì)開(kāi)髓導(dǎo)致小鼠下頒第一磨牙遠(yuǎn)中根根尖區(qū)破骨細(xì) 胞及骨破壞體積的影響（土s，η = 5)
[0060]
【主權(quán)項(xiàng)】
1. 金雀異黃酮在制備用于防治根尖周病的藥物中的應(yīng)用。
2. 如權(quán)利要求1所述的應(yīng)用，其特征在于：金雀異黃酮在制備用于改善根尖周病灶骨 質(zhì)破壞的藥物中的應(yīng)用。
3. 如權(quán)利要求1所述的應(yīng)用，其特征在于：金雀異黃酮在制備用于減緩根尖周病灶炎 癥細(xì)胞浸潤(rùn)的藥物中的應(yīng)用。
4. 如權(quán)利要求1所述的應(yīng)用，其特征在于：金雀異黃酮在制備用于降低根尖周病灶核 因子kappaB受體激活劑配體表達(dá)水平的藥物中的應(yīng)用。
5. 如權(quán)利要求1所述的應(yīng)用，其特征在于：金雀異黃酮在制備用于促進(jìn)根尖周病灶骨 保護(hù)素表達(dá)的藥物中的應(yīng)用。
【專(zhuān)利摘要】本發(fā)明公開(kāi)了金雀異黃酮防治根尖周病的應(yīng)用。本發(fā)明通過(guò)體內(nèi)實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)金雀異黃酮可顯著抑制開(kāi)髓所導(dǎo)致的根尖周病變局部炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)和骨質(zhì)破壞；并通過(guò)降低RANKL表達(dá)水平、促進(jìn)OPG表達(dá)，動(dòng)態(tài)調(diào)節(jié)根尖周病灶局部RANKL/OPG比值，達(dá)到治療根尖周病的作用。上述結(jié)果表明金雀異黃酮是一種有效防治根尖周病的藥物，金雀異黃酮可用于制備防治根尖周病的藥物。
【IPC分類(lèi)】A61P1-02, A61K31-352
【公開(kāi)號(hào)】CN104873489
【申請(qǐng)?zhí)枴緾N201510294162
【發(fā)明人】朱玲新, 張潔, 陳馨, 彭彬
【申請(qǐng)人】武漢大學(xué)
【公開(kāi)日】2015年9月2日
【申請(qǐng)日】2015年6月1日